DK172818B1 - Antibiotisk polypeptid, fremgangsmåde til dets fremstilling samt dets anvendelse - Google Patents

Description

i DK 172818 B1

Opfindelsen angår et antibiotisk virkende poly-peptid, i det følgende omtalt som Epidermin, en fremgangsmåde til dets fremstilling ved hjælp af en over for dette stof resistent hidtil ukendt stamme af Sta-5 phylococcus epidermidis, den hidtil ukendte resistente stamme, antibiotiske præparatformer Indeholdende det aktive stof Epidermin og anvendelse af det aktive stof til bekæmpelse af infektionssygdomme.

Fra europæisk patentpublikation EP-A-0,027.710 10 er det kendt, at en særlig stamme af Staphylococcus epidermidis, nemlig Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 (deponeret hos the National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen) frembringer et lavmolekylært, antibiotisk aktivt polypeptid med en bred virkning på 15 grampositive kim, hvilket peptid lyserer bakterieceller.

Det er endvidere kendt, at stammen Staphylococcus epidermidis MF 205 (S.M,Taylor et al., Int.J.Mass Spec-trom. and Ion Physics £8, 161-164, 1983) ligeledes producerer et oligopeptid med virkning over for grampo-20 sitive bakterier. Det fremgår ikke af nævnte offentliggørelse, om denne stamme er identisk med ovennævnte stamme NCIB 11536.

Det har nu vist sig, at en resistent mutant af Staphylococcus epidermidis, der den 26. oktober 1984 er 25 deponeret hos "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" under nummer DSM 3095, og som er beslægtet med ovennævnte stamme NCIB 11536, efter en modificeret fremstillings- og oparbejdningsmetode frembringer det lignende antibiotisk, fortrinsvis på grampositive kim, virkende 30 polypeptid Epidermin, der ved sammenligning med produkterne fra Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 og MF 205 blandt andet udviser betydelige forskelle med hensyn til aminosyresammensætningen:

Sammenligning af bygningsdele:

Y

2 DK 172818 B1

Epidermin Produkter fra Staph.epidermidis _MF 205_NCIB 11536

Asn 1 - 5 Asx - 21

Glx - 31

Pro 1 11

Gly 2 22

Ala 2 2 1

Ile 2 2 1 10 .

Phe 2 21

Lys 2 21

Lan 2 - E-Me-Lan 1 -

Dhb 1 - 15 Tyr 1 1 S-(2-Aminovinyl)-D-cystein 1 X - 1-2 20 Dhb svarer til α, β-dehydroainirosrnørsyre, Asx og Glx betyder henholdsvis Asn/Asp og Gln/Glu.

Efter totalhydrolyse af Epidermin med 6N saltsyre (18 timer ved 110°C) viste den kvantitative amino-syreanalyse ved ionbytterchromatografi (standardprogram 25 med udstyret Biotronik LC 6000 E) følgende a-aroinosyre-sammensætning:

Asp (1,00), Pro (0,95), Gly (2,09), Ala (2,03),

Ile (2,03), Tyr (0,30), Phe (2,02) og Lys (2,00) (jfr.

I Fig.l) . Ved tilsætning af thioglycolsyre øgedes tyrosin- 30 indholdet i totalhydrolysatet til den vidtgående støkiometriske værdi på 0, 93.

Konfigurationen af proteinaminosyrerne fandtes ved gaschromatografi af pentafluorpropionyl-aminosyre-n-propylesteren fra totalhydrolysatet. Adskillelsen 35 foregik på den chirale stationære fase L-valin-tert.-—r butylamid-polysiloxan (Chirasil-Val). Ved sammenligning med en testblanding af aminosyrer med kendt konfigura- il 3 DK 172818 B1 w tion kunne de ovenfor anførte opbyggende dele tildeles L-konfigurationen (jfr.Fig.2) .

Til disse proteinaminosyrer kommer yderligere følgende ikke-proteinaminosyrer: Lanthionin (2), β-me-5 thyllanthionin (1) og α,β-dehydroaminosmørsyre (1). Heraf har lanthionin meso-konfiguration og β-methyllan-thonin 2S,3S,6R-konfiguration. Yderligere indeholder Epidermin som opbyggende del S-(2-aminovinyl)-D-cystein.

Den hidtil ukendte forbindelse Epidermin kan 10 karakteriseres ved følgende angivelser: 1. Natur: Farveløst pulver.

2. Opløselighed: Meget godt opløseligt i blandinger af vand/iseddike eller methanol/iseddike, opløseligt i lavere alkoholer, uopløseligt i chloroform, ace-15 tone, diethylether, petroleumsether.

3. Farvereaktion på silicagelplader: Ninhydrin^hlor/TEM (TDM* 4,4'-bis-(dimethylamlno)diphenylmethan), or-cin/svovlsyre, anisaldehyd/svovlsyre. Ødelæggelses-fri påvisning i UV-lys ved 254 ran og ved sprøjtning 20 med vand.

4. Tyndtlagschromatografi: Der anvendtes silicagel- færdigplader 60 F254 (Merck).

System A: Chloroform/methanol/17% ammoniak (2/2/1) rf - 0,73

System B: Chloroform/methanol/17% ammoniak (70/35/10) RF * 0,30

System C: n-Butanol/iseddeke/vand (4/1/1) RF * 0,05 5. HPLC: Se Fig.7.

6. Stabilitet: Stabilt fra pH=2 til pH=7, ved højere 30 pH-vardier indtræder stærkt aktivitetsfald.

7. Molmasse: I området 2160. Alt efter isoleringsmeto-der kan der som anioner være indeholdt f.eks. chlo-rid, acetat eller phosphat.

8. Ultraviolet absorptionsspektrum: I vandig opløsning 35 langbølget maksimum ved 267 nro (Fig.3).

v 4 DK 172818 B1 * 9. Infrarødt absorptionsspektrum; IR-spektrum af en prøve i en kaliumbromidtablet (Fig.4). i 10. Kernemagnetiske resonansspektre: ^H-NMR-spektrum: j Fig.5, ^C-NMR-spektrum: Fig.6.

^ Egnede fragmenter til sekvensbestemmelse af Epi- dermln vandtes ved tryptisk spaltning. Omsætningen med trypsin førte 1 løbet af kort tid til tab af antibiotisk aktivitet. Makroskopisk observeredes ved tryptisk spaltning et geléagtigt hvidt bundfald, der kunne fraskilles ved centrifugering. Supernatanten blev lyo-fillseret og gelchromatograferet på en Spehadex G-25 (dekstrangel fra firmaet Pharmacia) i 1%'s eddikesyre.

Den med ninhydrin, chlor/TDM og vand farvelige, kemisk homogene fraktion (i det følgende betegnet Pi) ^ viste sig som N-terminalt brudstykke fra den tryptiske spaltning af Epidermin (se nedenfor).

Det ekstremt hydrofobe, geléagtige bundfald bestod af flere kemiske komponenter, der ved den tryptiske spaltning opstod fra totalmolekylets C-terminale 20 brudstykke. Et kemisk homogent produkt (i det følgende betegnet P2) vandtes ved opløsning af bundfaldet i dimethyl formamid og efterfølgende gelchromatografi på Sephadex LH-20 (dekstrangel, fremstillet ved hydroxy-propylering ud fra Sephadex G-25, Pharmacia) med di-25 methylformamid som elueringsmiddel. P2 kunne påvises med vand, chlor/TDM og under UV-lys. Ninhydrin-reaktionen på P2 var negativ.

Aminosyreanalysen af fragmentet Pi viste følgende sammensætning: Pro (11, Lan (1), β-Me-Lan (1), Gly (1), 30 Ala (2), Ile (2), Phe (1), Ly3 (2). Da isoleucin ved dansylering af totalmolekylet blev bestemt som N-termi-nal aminosyre, og fragmentet P2 ikke indeholder isoleucin, må fragmentet pi være totalmolekylets N-terminale spaltningsprodukt. Den C-terminale aminosyre af 35 fragment PI må på grundlag af den tryptiske spaltning ] være lysln.

Til yderligere struktur-undersøgelse af Pi blev £-:¾

Ha Ρΐϋ 5 DK 172818 B1 den C-terminale aminosyre lysin fjernet enzymatisk ved hjælp af carboxypeptidase B (firma Boehringer Mannheim),

Det herved dannede fragment P12 kunne isoleres i ren form ved gelchromatografi på Sephadex G-25 (1% eddike** 5 syre). P12 består af følgende aminosyrer: Pro (1), Lan (1), Ø-Me-Lan (1), Fly (1), Ala (2), Ile (2), Phe (1),

Lys (1).

Svovlbroerne i thioetheraminosyrerne lanthionin og Ø-methyllanthionin forhindrer en sekvensanalyse 10 ifølge Edman. Ved omsætning af P12 med Raney-Ni W2 vindes et svovlfrit dodecapeptid. Herved overføres meso-Lan I D- og L-alanin, og Ø-methyllanthionin i D-amino-smørsyre og L-alanin. Dodecapeptid-sekvensen blev opklaret ved Edman-nedbrydning og FAB-spektrometri: 15 Ile1-Ala2-Ala3-Lys4-Phe5-Ile6-Ala7-Abu8-?ro9-Gly10-Ala1^-Ala12.

Forskellige undersøgelser vedrørende anbringelsen af svovlbroerne i fragment P12 viste følgende struktur: 20 I- S -1

Ile-Ala-Ala-Lys-Phe-Ile-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Ala

!-s_I

Det ved tryptisk spaltning vundne C-terminale brudstykke P2 kan karakteriseres som følger: Asn (1), 25

Lan (1), Gly (1), Phe (1), Tyr (1), α-ketosmørsyre og S-(2-aminovinyl)-D-cystein.

o-Ketosmørsyren stammer fra dehydroaminosmørsy-ren, der i totalmolekylets sekvens følger direkte efter lysin*3. Den tryptiske spaltning frigør aminogruppen 30 fra dehydroaminosmørsyren. Da dehydroaminosmørsyrer med frie aminogrupper er instabile, omlejres de blandt andet til σ-ketosyrer.

Det tryptiske fragment P2 er N-terminalt med a-ketosmørsyren blokeret (ninhydrinreaktion på P2 forløber 35 negativt). Foruden de ved totalhydrolyse og aminosyrea-nalyse identificerede aminosyrer lanthionin, glycin, phenylalanin, tyrosin og asparaginsyre indeholder P2 en 6 DK 172818 B1 yderligere bygningsdel, der ødelægges ved sur totalhydrolyse. Denne kunne karakteriseres ved hjælp af dens , signaler i ^C-NMR-spektrene for Epidermin (Fig.6) og j i fragmentet P2 (Fig.8).

5 En oplysning om den kemiske natur af denne amino syre fik man ved omsætning af P2 med Raney-Ni W2, hvor der opstod to hovedprodukter. Hos begge, ved præparativ HPLC isolerede produkter fandtes efter totalhydrolyse en yderligere D-alaninrest i aminosyrechromatogrammet, 10 hvilken rest opstod ved denne omsætning.

Strukturen af denne bygningsdel kunne opklares ved heterogen hydrogenering af det native antibioticum.

De fire reaktionsprodukter Hl, H2, H3 og H4 blev renset ved semipræparativ HPLC, totalhydrolyseret og under-15 kastet gaschromatografi på chiral stationær fase (Fig.15).

Herved optrådte, sammenlignet med chromatogrammet i Fig.2, hos Hl og H3 en yderligere spids, der over dens massespektrum blev identificeret som S-(2-aminoethyl)-D-cystein. I Epidermin var denne aminosyre indeholdt 20 som syrelabil bygningsdel S-(2-aminovinyl)-D-cystein.

De to, ud fra det C-terminale brudstykke P2 ved behandling med Raney-nikkel W2 dannede peptider P21 og P22 kunne ved aminosyreanalyse og gaschromatografi på Chirasil-Val karakteriseres som følger: 25

Reaktionsprodukter P21_ P22_

Aminosyreanalyse og gas- 2 D-Ala 1 D-Ala chromatografi på Chirasil-Val 1 L-Ala meso-Lan 1 L-Phe 1 L-Phe 30 1 L-Tyr 1 L-Tyr 1 L-Asp 1 L-Asp 1 Gly 1 Gly

Yderligere var begge produkter blokeret C-termi-25 nalt med ethylamin. S-(2-Aminovinyl)-D-cystein blev ved afsvovlning under samtidig hydrogenering spaltet i D-alanin og ethylamin.

lig Π tm 7 DK 172818 B1

Sekvensbestemmelse af det^ brofrie heptapeptid P21 (partialhydrolyse, 0,lN saltsyre, 93°C, 16 timer) viste følgende struktur: 5 H3C-CH2-CO-CO-Gly-D-Ala-L-Phe-L-Asn-D-Ala-L-Tyr-L-Ala-NHEt

Anbringelsen af den i P22 indeholdte meso-lan-thioninbro ifølge partialhydrolyse og diverse kemiske undersøgelser på enzymatiske fragmenter fra P21 og P22 var kun forenelig med følgende struktur for det ved tryptisk spaltning opståede fragment P2:

I s I

i c H,C-CH--CO-CO-Gly-Ala-Phe-Asn~Ala-Tyr-Ala-NH-CH 15 3 2 I || .

\-S-CH

Den formelle substitution af 2-ketosmørsyren, der blokerer P2 N-terminalen, med den i det native antibio-2ø ticum tilstedeværende aminosyre dehydrobutyrin oq en efterfølgende fragmentkondensation af de tryptiske peptider PI og P2 førte direkte til nedenstående sekvens for det heterodet tetracycliske peptidantibioticum Epi-dermin: ψ 8 DK 172818 B1

Struktur af det ribosomalt syntetiserede, heterodet cy-cliske docosapeptidantibioticum Epiderroin: meso-Lar.thionin CK,-S -CH,

I I

H-Ile-Ale-NK-CK-CO-Lys-?he-Ile-NK-CK-CO— \ (S) (R) CK, β-Methyllanchionin

10 I

(S) CH-S-:-CH,

Ί I

L NK-CK-CO-Pro-Gly-HN-CK-CO-Ala-Lys- (S) (R) 15 - CH-, meso-Lanthionin i » CK CK,-S----CK, II I m I il» L-KN-C-CO-Gly-K.V-CK-CO-Phe-Asr.-KN-CK-CO-Tyr-KK-CE-CO-'KK-CK 20 (I) (S) I (R) ||

ch2-S--CK

S- (2-Amincvinyl) -D-cystein

De N-terminalen nærmest-liggende halvdele af de 25 enkelte thioetheraminosyrer er hver D-konfigurerede (svarer til (S)-konfigurationen i R,S-nomenklaturen).

Opfindelsen angår således et homogent og dermed som rent betragtet produkt, betegnet Epidermln, og endvidere en fremgangsmåde til dets fremstilling, isole-30 ring og rensning.

Dyrkningen af producenten Staphylococcus epider-midis DSM 3095 foregår aerobt ved 37°C i et kompleks-medium med sammensætningen 2-4% kødékstrakt, 1-3% maltekstrakt og 0,25-1% CaCOj eller 0,25-0,5% Ca(OH)2» 35 (Ved procentangivelserne er der her og i det følgende, såfremt ikke andet er angivet, tale om vægtprocenter).

9 DK 172818 B1

Maksimet for antibiotisk aktivitet nås efter 18-23 timer.

Forsøg på berigelse af antibioticum'et blev for eksempel foretaget på kulturfiltratet fra 10 liters 5 dyrkningsbeholdere, idet effektiviteten af de enkelte trin blev undersøgt ved pladediffusionstesten. De aktive komponenter kunne beriges ved ekstraktion af det for celler og kalk befriede kulturfiltrat med n-butanol. Ekstraktionen med n-butanol lykkedes imidlertid kun ved 10 det naturlige slut-pH for kulturfiltratet på 8,0. En yderligere rensning kunne opnås ved fraskillelse af li-pidiske ledsagestoffer ved etherfældning. Hertil blev butanolekstrakten inddampet, lnddampnlngsresten blev opløst i methanol og indrørt i en fem gange så stor mængde 15 kold diethylether. Aktiviteten forblev derved fuldstændigt i bundfaldet (Skema i FIg.9).

En særligt egnet fremgangsmåde til berigelse er også adsorption af det centrifugerede kulturfiltrat på Amberlite XAD-8 eller beslægtede typer af denne polymer 20 på acrylesterbasis (firma Serva). Vedhæftningen af

Epidermin forgår herved ikke blot ved simpel adsorption, men ved kationbyttervirkning af frie acrylsyregrupper på harpiksen. Herfor taler det forhold, at de aktive komponenter kun kunne opløses fra harpiksen ved eluering 25 med me thanol/kone. HC1 (99:1). Det stærkt sure eluat skal før inddampningen i vakuum neutraliseres med ammoniak. Efter denne oparbejdning ved adsorption på Amberlite XAD-8 kunne der gives afkald på en efterfølgende omfældning af methanol/ether.

30 En isolering af Epidermin ved adsorption kan og så foregå direkte i kulturvæsken allerede under dyrkningen af mikroorganismen.

Stabilitetsteste og chromatografiske undersøgelser blev gennemført på lyofiliseret butanolekstrakt.

35 Inkubationen af ekstrakten med vandige opløsninger med forskellig pH-værdi gav fra pH 10 en stærk aftagen af aktivitet, men i området pH 2-7 er antibioticum'et stabilt.

10 DK 172818 B1 I tyndtlagschromatogrammet af den inddampede bu-tanolekstrakt fandtes adskillige, med forskellige sprøjtereagenser farvelige forbindelser, Parallet hermed gennemførte bioautogrammer gav vigtige oplysninger 5 om det hidtil ukendte aktive stofs natur. I sure og næsten alle neutrale systemer forbliver antibioticum'et ved tyndtlagschromatografi på silicagel 60 siddende ved start, mens chromatografi med alkalisk elueringsmiddel gav Rp-værdier mellem 0,3 og 0,75. Kombinationen af 10 bioautografi med tyndtlagschromatografi i alkaliske systemer viste en korrelation med en forbindelse, der kunne farves med ninhydrin.

Som resultat af disse for-forsøg kunne det fastholdes, at antibiticum'et er et stærkt basisk peptid, 15 der unddrog sig en yderligere rensning ved søjlechroma-tografi på silicagel 60, da det ikke kunne elueres fra søjlen med sure eller neutrale systemer.

Chromatografi af Amberlite XAD-eluatet eller af den for lipider befriede butanolekstrakt på Sephadex 20 LH-20 med methanol/eddikesyre (95:5) skilte et stort antal små peptider, aminosyrer og salte, indeholdt i mediet, fra antibioticum'et (Skema Fig.9).

Ved den efterfølgende multiplikative modstrømsfordeling ifølge Craig kunne de ved ekstraktionen af 25 antibioticum'et fra kulturfiltratet gjorte erfaringer anvendes. I en første væske-væske-fordeling med systemet n-butanol/ethylacetat/0,lN eddikesyre (3:1:3) forblev antibioticum'et siddende ved start. Ved den anden Craig-fordeling med det neutrale system 2-butanol/0,05N 30 ammoniumacetat (1:1) fandt man antibioticum'et i midten af apparaturet. Ammoniumacetat kunne atter fjernes ved lyofilisering i højvakuum.

Epidermin foreligger efter frysetørring som et i alle anvendte tyndtlagssystemer homogent pulver.

35 Mens rensningen ved fremgangsmåden ifølge den i europæiske patentansøgning 0.027.710 foregik ved frys- I nings-optønings-ekstraktion, fordampning af ekstrakti- I onsmidlet, ultrafiltrering, fældning med ammoniumsulfat,

Efl« 11 DK 172818 B1 ionbytter-chromatograf1 og gelfiltrering på Sephadex G-50 eller G-25 eller G-15 eller på Biogel P2, fører den omhandlede rensning til et homogent rent produkt ved adsorption af det centrifugerede kulturfiltrat på Amber-5 lite XAD-8, efterfulgt af en gelchromatografi på Sephadex LH-20 og derefter to gange modstrømsfordeling ifølge Craig. Isoleringen og rensningen ved fremgangsmåden i-følge ovennævnte europæiske patentansøgning og ifølge den omhandlede fremgangsmåde er således fuldstændigt 10 forskellige.

Yderligere forskelle fra den kendte fremgangsmåde ifølge ovennævnte EP-A-0.027.710 består i valget af den komplekse næringsopløsning. Mens den kendte næringsopløsning Hjerne-Hjerte-Infusion (37 g BHI/liter) kun 15 medførte et meget ringe antibioticum-udbytte, viste en næringsopløsning anvendt ifølge opfindelsen, bestående af 2-3% kødekstrakt, 1-3% sukker eller sukkeralkoholer, såsom maltekstrakt, maltose, galactose, lactose, mannit, glucose eller glycerol, og 0,25-1% calciumcar-20 bonat eller 0,25-0,5% calciumhydroxid, udmærkede resultater. Den bedste produktion blev opnået med en næringsopløsning med følgende sammensætning: 3% kødekstrakt, 2% maltekstrakt og 0,37% calciumhydroxid. Af alle C-kilder viste maltose efter maltekstrakt den bedste pro-25 duktion. Glucose skulle kun anvendes i forbindelse med andre C-kilder. Også kombinationen af lactose og maltose eller af galactose og maltose gav gode resultater. Alle andre sædvanlige C-kilder viste ingen eller kun en ringe produktion. Tilsætning af alle 20 aminosyrer som N-30 kilde i koncentrationer på 2 g/liter for hver bragte de samme resultater som kødekstrakten. Casaminosyre (firma Difco) egner sig som N-kilde kun ved tilsætning af tryptophan (l-2mM) og vitaminer. Som vitaminer egner sig (foretrukne koncentrationer i parentes): Biotin (0,006 35 mg/1), nicotinsyre (2,3 mg/1), thiamin (1,0 mg/1), py- rodoxin,HCl (12,0 mg/1), calciumpantothenat (1,2 mg/1).

12 DK 172818 B1

Dyrkningen foregår under god beluftning ved temperaturer mellem 34 og 37°C. Det bedste produktionsforløb opnås, når pH-værdien før dyrkningen ligger ved j 6,0-7,0. Ved fravar af carbonater eller hydroxider af 5 divalente kationer, såsom calciumcarbonat eller calcium-? hydroxid, finder der ingen produktion sted. Efter til sætning af for eksempel calciumcarbonat viser pH-værdi-en et karakteristisk forløb med fald ind i det sure område, og derved fandt ingen produktion sted. Ved påføl-10 gende stigning af pH-værdien ind i det svagt alkaliske område gik produktionen i gang. I stedet for calciumcarbonat kan der også anvendes magnesiumcarbonat, og calciumhydroxid gav bedre resultater end calciumcarbonat. Med 50 mM calciumhydroxid kunne produktionen sam-15 menlignet med 25 mM calciumcarbonat forøges noget. Ved stammens udnyttelse af C-kilder (sukker) sker der dannelse af organiske syrer, der kompleksdannes af bivalente kationer, hvorved der samtidigt sker en afpufring af mediet.

20 I Fig.10 er vist resultaterne vedrørende forløbet af antallet af levende kim og antibioticum-produktionen, udtrykt i ram hamningsring over for Micrococcus luteus ATCC 9341, for de omhandlede medier sammenlignet med Hjerne-Hjerte-Infusionsmedium (firma Difco) ifølge oven-25 nævnte europæiske patentskrift.

Ved hjælp af en justeringslinie fandtes ved pladediffusionstesten de nedenfor anførte aktivitetsstigninger på tidspunktet for produktionsmaksimum.

Aktiviteten i næringsopløsningen Hjerne-Hjerte-30 Infusion blev sat til 100%.

a) Hjerne-Hjerte-Infusionsagar 100% I b) 3% Kødekstrakt, 2% maltekstrakt, 25 mM calciumcarbonat 200% 35 c) 3% Kødekstrakt, 2% maltekstrakt, 50 mM calciumhydroxid 320% J.I -.iflf 13 DK 172818 B1

Disse angivelser viser ingen absolutte produktionsværdier. En sammenligning af de ved hjælp af pladediffusionstesten opnåede værdier viste imidlertid én-tydigt, at sammenlignet med den kendte arbejdsmetode op-5 nås ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen en signifikant stigning af udbytterne.

Den til fremstilling af Epidermin anvendte stamme er af Schleifer & Kloos (Int.J.Syst.Bact.25, 50-61 (1975)) karakteriseret som nedenfor angivet: 10

Gramfarvning : positiv

Cellestørrelse j diameter 0,5-0,8 ym

Kolonistørrelse : ca.l mm diameter

Koloniudseende : glat, skinnende, i midten ^ let ophøjet

Kolonifarve : grålig-hvid

Celler i kultur : ofte enkeltceller eller to sammen, sjældent større hobe 2Q Hæmolyse : på blodplader udstregede kulturer viste stærk hæmolyse

Anaerob vækst : stammen vokser også under anaerobe betingelser 25 Lysozym-sensibilitet : cellerne er op til 2 mg/fol resistente over far lysozym

Lysostaphin-sensibilitet j cellerne er allerede ved 20 yg/ml sensibile over for lysostaphin 2Q Epidermin-Resistens : påvist op til 1 mg/ml

Andre resistenser : i væskekultur viser stam men en udpræget resistens over for Streptomycin (op til 1 mg/ ml) og Spectinanycin (0,5 mg/ 35 ml)

Forhøjet NaCl-indhold : stammen vokser endnu godt ved 15 vægt% natriunchlorid.

14 DK 172818 B1

Kolonier eller udstregede kulturer er meget kla- i brige.

Udnyttelsen af forskellige C-kilder under syre-> dannelse og andre enzymreaktioner blev bestemt ved hjalp 5 af Api-Staph-systemet (firma Biomerieux, NOrtingen).

Dette system beror på en kombination af 20 biokemiske reaktioner, der kan føres tilbage til klassificeringen Ifølge KLOOS ft SCHLEIFER (J.Clin.Microbiol.

1, 82-88 (1975)).

10

Tabel I

C-kildeudnyttelse og andre enzymreaktioner C-kilde eller enzym Pro- Staph. epid. Staph.epid.

____dueer.t KioosfcSchleifer Aoi - Staph 15 Kontrol - D-Glucose + k.A. + D-Fructose + + + D-Mannose {+) (+) +

Maltose + + +

Lactose (+) (+) + D-Trehalose - D-Mannitol - xylitol - D-Melibiose - k.A.

Raffinose - k.A.

25 D-xylose -

Saccharose + + + "Ί Q- Methylelucesid - k.A.

j N-Acetylglucosarin - k.A. +

Nitratreduktion + ♦ * I ^ 3q Phosphatase + + +

Dannelse af acetylr.ethyl- + k.A. + carfcinol (Voces-?ros -.. kauerraaktion)

Areinindehydroiase - k.A. +

Urease + k.A. + 35 _ rn 11 .....m

«“'"WiliiiS

15 DK 172818 B1 + positiv reektion negativ reaktion (+) entydig positiv reaktion indtrader ferst noget senere + variabel egenskab 5 k. A. ingen angivelser

Stammen Staphylococcus epidermidis DSM 3095 blev podet over på små skrårør med et medium af følgende sammensætning: 10

Pepton 10 g

Dinatriumhydrophosphat 2 g Kødekstrakt 8 g

Glucose 10 g (separat autoklaveret)

Natriumchlorid 3 g 15 pH 7,2 g derefter inkuberet natten over ved 37°C og til slut ind-frosset ved -20°C. Til nye forsøg blev altid et frisk rør optøet, da der ved længere tids lagring ved 4°C er 20 observeret aktivitetstab.

I det følgende er fremstillingen af det antibiotiske stof Epidermin omtalt nærmere.

Dyrkningen kan gennemføres i dertil egnede rystekolber, men til fremstilling af større stofmængder 25 kan der anvendes en dyrkningsbeholder på 200 liter eller mere.

Til kolbeforsøg blev der anvendt 500 ml's Erlen-myerkolber med indstik i siden. Kolberne blev fyldt med 100 ml næringsopløsning og autoklaveret 20 minutter 30 ved 121°C. Som podemateriale tjente 1% af en 4 timer gammel forkultur. Inkubationen foregik ved 37°C på roterende rystemaskine ved 140 rpra.

Til dyrkning i 10 liters målestok blev dyrkningsbeholdere med 10 liters nytteindhold (Model MF-14 New 35 Brunswick, Scientific Co., New Brunswick, USA) fyldt med 9,9 liter næringsopløsning og autoklaveret 30 minutter ved 134°C. Efter afkøling blev der podet med 100 ml 16 DK 172818 B1 af en 4 timer gammel forkultur og dyrket ved 37°C, 0,6 i wm og 240 rpm for bladomrøreren. Den relativt stærke , skumdannelse blev modvirket ved gentagen tilsætning af i steril polyol.

. 5 Til dyrkning i 25 liters målestok blev en 25 li ters dyrkningsbeholder (type b 25, Braun/Melsungen med slagsystem) forsynet med 25 liter næringsopløsning under tilsætning af 3 ml polyol og steriliseret ved 121°C i 30 minutter. Som podemateriale tjente 300 ml af 10 en 4 timer gammel forkultur. Dyrkningen foregik ved 37°C, 0,6 wm og 1000 rpm.

Forløbet af en dyrkning i 10 liters målestok i en næringsopløsning, indeholdende 30 g kødekstrakt, 20 g maltekstrakt og 5 g calciumcarbonat i 1 liter, er vist 15 i Fig.ll. Intensiv vækst forbundet med udnyttelse af de tilbudte C-kilder under syredannelse kan ses af pH-vær-diens fald. Med alkaliseringens start kan antibioti-cum’et påvises i kulturfiltratet. Produktionen når sit maksimum efter 12-18 timer.

20 Til kontrol af dyrkningsforløbet blev der på forskellige tidspunkter under dyrkningen udtaget prøver sterilt. Prøverne blev vurderet for følgende: a) pH-Værdis Måling med et labor-pH-meter (Knick pH-mV-meter).

25 b) vækstforløb: Væksten kunne følges gennem stigningen i antallet af 1 levende kim. Hertil blev 0,5 ml sterilt udtaget kultur j fortyndet i saltopløsning, og heraf blev 0,1 ml ud- pladet på plader (medium; pepton 10 g, kødekstrakt 8 g, natriumchlorid 3 g, dinatriumhydrophosphat 2 g, glucose 10 g, til 1 liter). Efter 18 timers inkubation ved 37°C kunne enkeltkolonierne tælles, c) Antibioticum-koncentration:

Prøverne blev centrifugeret i en Eppendorf-centrifuge 3200 i 2 minutter, og 20 yl af supernatanten blev testet ved pladediffusionstesten.

Parallelt blev der frembragt en justeringskurve med kendte koncentrationer.

7s ' ΪΪ 17 DK 172818 B1

Efter at produktionsmaksimet var nået, blev kulturvæsken centrifugeret ved kontinuerlig centrifugering (centrifuge: Type LA 71b-4, Loher & Sohne, Ruhstorf/

Rott) med 1380 rpm. Hed henblik på optimal cellefra-5 skillelse skulle passagehastigheden holdes meget lav.

En første berigelse af de aktive komponenter blev, ved hjælp af den ovenfor omtalte adsorption på Amberlite XAD-8, opnået ifølge nedenstående Eksempel 1.

10 Eksempel 1 80 liter Kulturfiltrat blev hældt over ca. 8 liter Amberlite XAD-8. I gennemløbet kunne der ikke påvises nogen aktivitet. Ved efterfølgende vask med vand blev der heller ikke elueret nogen aktivitet. Derefter 15 blev der vakset med 13 liter methanol. I vaskevandet blev der ikke påvist nogen aktivitet. Elueringen foregik med methanol/saltsyre 99:1, hvorved der vandtes følgende fraktioner: 2q "Fraktion 1: 0,8 liter aktiv

Fraktion 2: 4,5 liter Hovedaktivitet

Fraktion 3: 2 liter aktiv

Fraktion 4: 2 liter ingen aktivitet

Fraktion 5: 1 liter ingen aktivitet 25

Fraktionerne blev testet tyndtlagschromatografisk for deres indhold af Epidermin, hvorefter de aktive fraktioner blev samlet og inddampet til tørhed på rotationsfordamper (81,2 g), inddampningsresten blev optaget i methanol/eddikesyre (95/5) (400 ml), uopløseligt mate-30 riale blev fracentrifugeret, og portioner på hver 50 ml blev gelchromatograferet på Sephadex LH-20 (søjle 100x5 cm, elueringsmiddel methanol/eddikesyre 95:5). Positive fraktioner blev samlet og inddampet (14,8 g).

Til multiplikativ fordeling ifølge Craig anvend-35 tes apparturer fra firmaet Labortec (Basel). En første adskillelse gennemførtes med et 50 ml*s apparatur i systemet n-butanol/ethylacetat/Ο,ΙΜ eddikesyre (3/1/3).

Den i den nedre fase (100 ml) opløste prøve (5 g) blev i 18 DK 172818 B1 underkastet følgende adskillelsesbetingelser; I Trintal: 160 5 Rystebevægelser/trin: 70 ' 5 Rysteintensitet: 45 • Adskillelsestid: 20 min.

Til den endelige rensning blev det vundne råprodukt (4,2 g) i portioner på hver 2 g opløst i den nedre fase af systemet 2-butanol/0,05N ammoniumacetat (50 ml) 10 og renset i et 10 ml's apparatur med 440 elementer.

Trintal: 440

Rystebevægelser/trin: 50

Rysteintensitet: 50

Adskillelsestid: 10 min.

De Epidermin-holdige elementer blev samlet, inddampet, optaget i vand og lyofiliseret flere gange i højvakuum. Det antibiotiske stof (2,6 g) viste sig homogent ved alle foretagne undersøgelser.

20

Under fremstillingen og isoleringen af Epidermi-net anvendtes pladediffusionstesten til den biologiske karakterisering, nemlig både til optagelse af virknings-spektret og til kontrol af produktion, oparbejdning og berigelse. Testen blev, som beskrevet af Zåhner og Haas, 25 Biology of antibiotics (Springer Verlag, Berlin-Heidel-berg-New York, 1972), gennemført i Petriskåle fra firma Greiner, Nurtingen, med filterrondeller med en diameter på 6 mm (Machetey & Nagel, Diiren) . Filterrondellerne blev befugtet med 20 yl af den pågældende test-30 væske, tørret ved stuetemperatur på en glasplade og anbragt på testpladerne. Testpladerne blev inkuberet ved 37°C, og efter ca. 16 timer blev væksthæmningen vurderet .

Som rutinetestkim tjente Streptococcus pyogenes 35 ATCC 8668 og, på grund af dens problemløse håndtering, Micrococcus luteus ATCC 9341.

IH SKI

! Ti r Ti 19 DK 172818 B1

Testpladerne med Streptococcus pyogenes ATCC 8668: Før fremstilling af testpladerne måtte testkimen podes frisk over på blodplader med mucin (medium: 500 ml agar pH 7,4, 160 ml mucinopløsning (10 vægti), 3,5 5 ml glucoseopløsning (50 vægti), 70 ml bedeblod).

Efter 15-18 timers inkubation ved 37°C blev der fremstillet en saltopløsningssuspension (E^g 0,5) , og 1 ml af denne suspension blev pipetteret til 100 ml næringssubstrat (medium: pepton 10 g, kødekstrakt 8 g, 10 natriurochlorid 3 g, Na2HP04 2 g, glucose 10 g til 1 liter, pH 7,2). De udhældte plader af 10 ml's portioner var holdbare nogle dage ved 4°C.

Testplader med Micrococcus luteus ATCC 9341:

En kultur fra natten over (medium: pepton lo g, 15 kødekstrakt 8 g, natriumchlorid 3 g, Na2HP04 2 g, glucose 10 g til 1 liter, pH 7,2) blev fortyndet til en ekstinktion på 1,0 ved 578 nm. Med 0,25 ml af denne suspension blev 100 ml agar podet, og 10 ml*s plader blev udhældt. Testpladerne kunne opbevares flere dage 20 ved 4°C.

Testplader til virkningsspektret:

Testplader med bakterier: a) Aerobt levende bakterier:

Kulturer fra natten over indførtes i de pågældende 25 testmedier, og pladerne blev fremstillet, som be skrevet for Micrococcus luteus ATCC 9341.

8) Aanaerobt levende bakterier:

Forkulturerne for Clostridium pasteurianum ATCC 6013 og Propionibacterium aenes DSM 1897 blev indført i 30 reagensglas, der til fortrængning af oxygenet blev fyldt med næringsopløsning op til vatproppen.

Med 3 ml forkultur blev 100 ml agar podet, og 10 ml' s plader blev udhældt.

Inkubationen foregik i Anaerobier-Topf (BBL-Gas Pak 35 100, Becton, Dickinson GmbH, Heidelberg) ved den i hvert enkelt tilfælde optimale temperatur.

20 DK 172818 B1

Testplader med gæragtigt voksende svampe: I rystekultur blev cellerne fremdyrket i det pågældende testmedium i 18-20 timer. Efter tælling i

Thoma-tællekammer blev testpladerne podet i en tæthed 5 på 106 organismer/ml agar.

Testplader med svampe og Streptomyceter:

Testorganismerne blev fremdyrket på små skrårør (medium:gærekstrakt 4 g, maltekstrakt 10 g, glucose 4 g til 1 liter) ved de pågældende temperaturer indtil 10 sporulation. Sporerne blev bortskyllet med 3 ml salt-opløsning-Tween 80 (1 dråbe Tween 80 til 100 ml saltopløsning) og indhældt i testplader.

Stoffet Epidermin har en udmærket antibakteriel aktivitet. Det virker navnlig godt over for en lang 15 række grampositive bakterier. Den antibakterielle virkning af Epidermin blev undersøgt ved sammenligning med virkningen af Nlsin (Nisin,jfr. blandt andet tysk Aus-legeschrift DE-A-2.000.818 eller britisk patentskrift GB-B-1.182.156). Por nogle vigtige, klinisk relevante 20 kim anvendtes der til sammenligning også fusidinsyre. Aktiviteten fandtes ved hjælp af pladediffusionstesten og ved bestemmelse af de minimale hæmningskoncentrationer.

a) Pladediffusionstest: 25 Ved pladediffusionstesten blev sensibiliteten af forskellige mikroorganismer over for Epidermin og Nisin testet. Tabel II viser, at begge antibiotica næsten udelukkende virker på grampositive bakterier. Der anvendtes Nisin med en aktivitet på 4000 enheder.

, 30

Tabel II

Sensibilitet over for Epidermin og Nisin. Angivelser i mm hæmningsring, koncentrationer 1 mg/ml og 0,5 mg/ml.

"i· 21 DK 172818 B1

Mikroorganismer Dyrkningsbetingelser Epidermin Nisin

Temp. Medium 1 0,5 1 0,5

Bakterier ^ Eubacteriales, grampositiv

Arthrobacter aureseens 27®C 5 8 Sp 9 8

Arthrobacter crystallopoietes 27®C 5 16 15 16 15

Arthrobacter globiformis 27®C 5 14 12 14 13

Arthrobacter oxydens 27eC 5 12 11 11 10 10 Arthrobacter pascens 27eC 5 13 12 14 13

Bacillus cereus 37®C 3 8 Sp

Bacillus pumilus 37eC 4 14 12 12 10

Bacillus subtilis ATCC 6051 37®C 4 12 11 9 8

Bacillus subtilis ATCC 6051 37®C 6 17 16 14 12 15 Bacillus subtilis ATCC 6633 37®C 4 14 11 9 8

Bacillus subtilis F 24-2 37°C 4 13 11 8 Sp

Bacillus subtilis A 14 37®C 4 12 10 9 Sp

Brevibacterium flavum 37®C 4 11 10 8 7

Clostridium pasteurianum 30®C 7 17 15 14 13

Clostridium sporogenes 37®C 8 10 ' 9 8 Sp

Corynebacterium spec. 27eC 4 15 13 9 8

Corynebacterium insidiosum 27eC 4 19 17 10 8

Corynebacterium rathayi 27®C 4 14 12 10 9

Micrococcus luteus ATCC 381 27eC 5 10 9

Micrococcus luteus ATCC 9341 27®C 2 21 20 17 16 25 Propionibacterium aenes 37"C 8 22 19 21 18

Sarcir.a lutea 37®C 5 15 14 15 14

Staphylococcus aureus Tu 202 37eC 4 13 10 10 9

Staphylococcus aureus DSM 683 37®C 4 11 9 Sp -

Staphylococcus aureus Pen.res 37®C 4 12 11 9 8

Staphylococcus cohnii 37®C 2 14 12 9 -

Streptococcus pyogenes 37®C 2 22 20 18 17

Eubacteriales, gramnegativ:

Proteus mirabilis 37*C 4 11 9 9 7 35 Proteus vulgaris 37®C 5 9 8 8 Sp 22 DK 172818 B1

Actinomycetales:

Streptomyces glaucescens 27*C 3 10 8 10 9 j Streptomyces violaceoruber 37*C 3 9 8-- 5 Streptomyces vicido- 37*C 3 11 10 98 cbromogenes (”) betyder, at der ikke indtrådte nogen virkning Sp « spor 10 b) Minimal hæmningskoncentration:

Den minimale hæmningskoncentration for klinisk relevante kim, angivet i yg/ml, blev i mikrotiterplader testet i følgende medium: 25 5 ml Na-Lactat, 5 g Na2SO^r 0,5 g KI^PO^, 0,1 g

MgClj, 5 g NH4C1, 10 g glucose, 50 yg calciumpantothe-nat, 50 yg thiamin, 0,25 yg folsyre, 50 yg Niacin, 25 yg p-aminobenzoesyre, 50 yg pyridoxin-hydrochlorid, 25 yg riboflavin i 1000 ml destilleret vand, 20 1 tabel III er vist de minimale hæmningskoncen trationer (ug/ml) af Epidermin og til sammenligning Nisin og fusidinsyre. Det anvendte Nisin havde en aktivitet p& 2500 enheder.

25 Tabel III

Minimal hamningskoncentration i yg/ml:

Epidermin Fusidinsyre Nisin

St. eoidermidls WG 99_ 2_ 4_128 30 Sc. pvooenes ATCC 8668_0.125__1_4

Sc. pneumoniae ATCC 6302_2 16 32

Me. luteus ATCC 159S7_0,25_0j_5_16

Hc. luteus ATCC 9341_-< 0,06 _0_l5_8

Cb. xerosis NCTC 9755_0,125__0,125_16 35 E.~ coli ATCC 11775_128__>128_>128 E. coll ATCC 9637_128_>128_>128

Propionib. aenes PC 904_0.06 . 0,5_32

Propionib. aenes ATCC 25746 0,25 1 64 •i i 23 DK 172818 B1

De i Tabel II nævnte medier er beskrevet nedenfor. Medierne blev efter indstilling af pH-værdien autoklaveret 20 minutter ved 121°C.

Mængdeangivelserne angår altid 1 liter vand. Ved 5 kemisk definerede medier anvendtes dedoniseret vand.

Medium: (2) Glucose-agar-medium:

Pepton 10 g Kødekstrakt 8 g 10 NaCl 3 g

Na2HP04 2 g

Glucose 10 g (separat autoklaveret)

Agar 20 g pH 7,2 15 (3) Gær-malt-medium: Gærekstrakt 4 g

Maltekstrakt 10 g

Glucose 4 g 20 A?ar 20 9 pH 7,3 (4) Oxoid-medium for bakterier: Kødekstrakt 10 g

Pepton 10 g 25 " NaCl 5 g

Agar 20 g PH 7,2 (5) Næringsvæske 8 g 30 (Firma Difco)

Agar 20 g PH 7,2 (6) Minimalmedium for bakterier (HOTTER et al., 1966): 35 D-Glucose 8 g

Di-ammoniumtartrat 4 g 24 DK 172818 B1

NaCl 5 g K2HP04 2 g

MgS04 X 7 H20 1 g 1 CaCl2 0,2 g 5 MnSo^ x H20 0,01 g

Ferrioxamin B 0,02 g

Agar 20 g pH 7,2 (7) Medium for Clostridium pasteurianum: Kødekstrakt 3 g Gærekstrakt 3 g

Maltekstrakt 3 g

Pepton 20 g D-Glucose 5 g

Ascorbinsyre 0,2 g

Agar 20 g ™ pH 7,0 (8) Brewer thioglycolatmedium for Propionibacterlum 20 aenes:

Thioglycolatmedium 40,5 g Agar 20 g pH 7,2 25 Epidermin tåles udmærket, og ved topisk anven delse er der ikke observeret nogen toxisk aktivitet.

Det er en stor fordel, at den resistente mutant Staphylococcus epldermidis DSM 3095 er resistent over for det af mutanten producerede Epidermin. Stammen NCIB 30 11536 har ikke en sådan resistens over for det af denne stamme producerede lavmolekylære antibiotieum. j Den hidtil ukendte klon DSM 3095 vandtes på føl gende måde:

Adaptationen gennemførtes i 100 ml1s Erlenmeyer-35 kolber med sideværts indstik og 10 ml næringsopløsning 25 DK 172818 B1 (Hjerne-Hjerte-Infusion). Startkulturen blev podet med 0,5 ml af en 12 timer gammel kultur. Til kolberne, der indeholdt stigende Epidermin-koncentrationer, tjente som podemateriale 0,5 ml af den hver gang forudgående, 5 godt groede kultur. Vurderingen af væksten foregik fotometrisk ved 578 nm. Kulturen, der ved en koncentration på 1,0 mg/ml af Epidermin i vsskekultur, endnu var groet godt, blev fortyndet i saltopløsning og udpladet på en plade, hvori der var indhældt 0,5 mg/ml af Epidermin.

10 Som sammenligningsværdi blev en ufortyndet 12 timer gammel kultur af den fra litteraturen kendte sammenlignings s tamme NCIB 11536 udpladet. Efter 24 timers inkubation ved 37°C viste der sig hos den til 10”® fortyndede adapterede kultur 94 enkeltkolonier. Den på plader 15 indeholdende 0,15 mg/ml af Epidermin ufortyndet udpla-dede sammenligningsstamme voksede stadig ikke efter 48 timers inkubation. De resistente kolonier blev udvalgt og udstreget i raster på plademedium 2. Efter en for-test for produktion ved udstikning af stykker med 20 en diameter på 5 mm og aktivitetstest på Micrococcus luteus ATCC 9341 blev producerende kloner testet i væskeroedium.

Sammenligning af den resistente stamme med den fra 25 litteraturen kendte stamme: a) Minimal hæmningskoncentration ved pladediffusionstest: På testplader ned de to stanmer fandtes de i Tabel IV anførte'minimale hæmningskoncentrationer.

30 Tabel IV

Minimale hæmningskoncentrationer af Epidermin ved pladediffusionstest med NCIB 11536 og DSM 3095.

Stamme^ pg/ml 35 ---- NCIB 11536 10 DSM 3095 > 1000 26 DK 172818 B1 b)__Vækst_02_produktign: Vækst- og produktionsforløb for de to stammer blev sammenlignet i næringsopløsning (3% kødekstrakt, ! 2% maltekstrakt, 0,37% Ca(0H)2). Se Pig. 12.

5 Vækstforløb: Bestemmelse af antal levende kim

Produktionsforløb: Aktivitet over for Micrococcus luteus ATCC 9341 ved pladediffusionstest.

Hos den resistente stamme observeres en bedre produktion.

10

Sl_.§SSSifeiiitS£-2JiS£_l2E_5Ei§S£lSi2»i-.f2£§l£§iii9§_Y5lSSi“ faser:

Forsøgene med egenhæmning af producentstammen med antibiocum'et og undersøgelsen af de udvalgte klo-15 ners resistens gennemførtes i biofotometer (Eppendorf-fotometer med cirkulationsautomat).

Disse forsøg kunne gennemføres detaljeret for eksempel som følger: A„f en 12 timer gammel kultur af Staphylococcus 20 epidermidis NCIB 11536 eller af den udvalgte resistente stamme DMS 3095 blev hver gang 0,5 ml podet over på frisk medium.

Disse kulturer fik lov at vokse højt Indtil en ekstinktion på 0,043 ved 578 nm (kuvetter med en lagtyk-25 kelse på 1 cm), hvorefter de blev fordelt i portioner på 7,5 ml i biofotometerets kuvetter (lagtykkelse 2 cm).

Tætheden af cellesuspensionen blev i biofoto-meteret indstillet på en transmission på 90%. Inkuba-30 tionen foregik ved 37°C og med maksimal beluftning.

Epidermin blev i form af vandig opløsning tilsat i forskellige vækstfaser.

Ved begge stammer blev der til at begynde med og i midten af den logaritmiske fase tilsat forskel-35 lige Epidermin-koncentrationer. Resultaterne er vist i fig. 13 og 14.

Med de hidtil testede koncentrationer kunne der hos den resistente stamme ikke observeres nogen •i

A

27 DK 172818 B1 lysis.

Det omhandlede antibioticum Epidermin udøver, ligesom den kulturvaske, hvorfra det er isoleret, en baktericid virkning, der fører til lysis af cellerne.

5 Hvad angår den baktericide virkning og det brede virkningsspektrum over for grampositive bakterier er det omhandlede polypeptid-antibioticum Epidermin særligt aktivt ved behandling af infektioner, der er forårsaget af grampositive bakterier. Epidermin er 10 særligt værdifuldt til bekæmpelse af hudinfektioner, såsom eksem, impetigo, cellulitis og navnlig acne.

Den udmærkede aktivitet over for nogle vigtige Propioni-bakterium-acnes-stammer er vist i tabellerne II og III.

Det kan siges, at Epidermin, der normalt fremstilles 15 af organismer, som koloniserer den menneskelige hud, udøver bedre aktivitet i henseende til beskyttelse af huden end andre sædvanlige antibiotics.

De ovennævnte farmaceutiske præparatformer, der indeholder det omhandlede antibioticum sammen med 20 farmaceutisk sædvanlige hjælpestoffer og bærestoffer, kan anvendes oralt, parenteralt, enteralt eller topisk.

Sådanne præparatformer, men navnlig topiske præparatformer, kan foreligge som opløsninger, emulsioner, geler, lotioner, salver, cremer eller puddere.

25 De følgende eksempler viser fremstilling af så danne farmaceutiske anvendelsesformer.

Eksempel 2

Tinktur 30 I 100 g tinktur er indeholdts

Epidermin 1,0 g

Ethanol (94,5 vol%) 56,0 g 1,2-propylenglycol 40,0 g

Demineraliseret vand 3,0 g 35

Fremstilling:

Epidermin opløses i blandingen af ethanol/1,2-propylenglycol/vand, hvorefter opløsningen steriliseres.

DK 172818 B1 28

Eksempel 3

Lotion I 100 g lotion er indeholdt: i Epidermin 1,00 g 5 1,2-propylenglycol 7,00 g

Alkyldimethylbenzylammpnium-chlorid (Benzalkon A®) 0,15 g

Sorbitanmonopalmitat (Splan 40 ®) 0,40 g

Sorbitamacrogolpalmitat 10 (Tween 40 ® ) 1,20 g 01iesyredecylester (Cetiol V ® ) 2,40 g

Blanding af cetyl- og λ stearylalkohol (Lanette 0 ^ 1,60 g

Cetylplamitat 0,80 g 15 Demineraliseret vand til 100 g

Fremstilling:

De ovennævnte mængder af alkyldimethylbenzyl-ammoniumchlorid, sorbitanmonopalmitat, sorbimacrogol-plamitat, oliesyredecyleter, cetyl- og stearylalkohol 20 og cetylplamitat indrøres i 75 ml vand, den filtrerede opløsning af Epidermin i 1,2-propylenglycol og det resterende vand indføres, og tinkturen homogeniseres.

Eksempel 4 2 5 Gel 100 g Gel indeholder:

Epidermin 9

Polyethylenglycolether af laurylalkohol (Brij 35® ) 1,0 g 1,2-propylenglycol 5,0 g 30 Acrylsyrepolymerisat (Carbopol 934 ®) 1,2 g p-Hydroxybenzoesyremethylester 1,6 g p-Hydroxybenzoesyrepropylester 0,4 g

Parfume q.s.

35 Natronlud til pH 6,5

Demineraliseret vand til 100 g i • 4

.....J

29 DK 172818 B1

Fremstilling:

De ovennævnte mængder af hjælpemidler indrøres i 75 ml vand. Epiderminet opløses i en blanding af 1,2- propylenglycol og det resterende vand, og denne opløs-5 ning indrøres ligeledes. Den færdige gel homogeniseres yderligere.

TegnlnqsforklarInger:

Fig. 1: Aminosyrechromatogram for det sure totalhydro- 10 lysat af Epidermin; Ninhydrin-farvning, λ = 570 nm.

Fig. 2: Gaschromatogram for N-pentafluorpropionyl- aminosyre-n-propylesteren af det sure total-hydrolysat af Epidermin på Chirasil-Val.

15 Temperaturprogram: 3 min. 85°C isotermt, der efter 4°C/min. til 200°C. Bæregas H2 (0,92 bar).

Fig. 3: UV-Spektrum for Epidermin i vand, pH 3 (C * 0,15 mg/ml).

20 Fig. 4: IR-Spektrum for Epidermin i en kaliumbromid- tablet.

Fig. 5: ^H-NMR-spektruro for Epidermin (20 mg/0,5 ml D~-dimethylformamid, 400,16 MHz).

Fig. 6: l'c-NMR-spektrum for Epidermin (40 mg/0,5 ml 25 12C, 2H-dimethylformamid, 100,6 MHz, 45360 impulser).

Fig. 7: HPLC-Chromatogram for Epidermin på u Bondapak (300x3,9 mm). Mobil fase: A * acetoni-tril/0,01M KH2P04 (10/90), B » acetonitril/ 30 0,01M KH2P04 (70/30); lineær gradient fra 10% B til 100% B på 30 minutter, strømningshastighed 2 ml/min.

Fig. 8: ^c-NMR-spektrum for fragmentet P2 (12 mg/0,5 ml 12C, 2H-dimethylformamid, 100,6 MHz, 35 38300 impulser).

Fig. 9: Isolering af Epidermin.

Fig. 10: Sammenligning af medierne i henseende til antal levende kim (fulde linier) og aktivitet 30 DK 172818 B1 over for Micrococcus luteus (stiplede linier), ▲ Hjerne-Hjerte-Infusion o 3% kødekstrakt, 2% maltekstrakt, 0,25% CaCO^ • 3% kødekstrakt, 2% maltekstrakt, 0,37% 5 Ca (OH) 2 >

Fig. 11: Forløb af en dyrkning i 10 liters målestok • pH-Forløb A- Antal levende kim o Aktivitet over for Streptococcus pyogenes 10 ATCC 8668.

Fig. 12: Sammenligning af fra litteraturen kendt stam me og resistent klon DMS 3095 i henseende til antal levende kim (fulde linier) og aktivitet over for Mikrococcus luteus ATCC 9341 (stip-15 lede linier).

o Stamme kendt fra litteraturen Æ. Resistent klon

Fig. 13: Epidermintilsætning i forskellige vækstfaser for Staphylococcus epidermidis NCIB 11536: 20 Kurve 1: Normalt vækstforløb

Kurve 2: Tilsætning af 10 yg/ml Epidermin ved begyndelsen af den logaritmiske fase fører til lysis.

Kurve 3: Tilsætning af 10 yg/ml Epidermin ved 25 midten af den logaritmiske fase fører lige ledes til lysis.

Kurve 4: Tilsætning af 2,5 yg/ml Epidermin ved midten af den logaritmiske fase fører, til vækstforhaling.

30 Fig. 14: Epidermintilsætning i forskellige vækstfaser for resistent klon DSM 3095:

Kurve 1: Normalt vækstforløb, identisk med stammen NCIB 11536.

Kurve 2: Tilsætning af 120 yg/ml Epidermin 35 ved begyndelsen af den logaritmiske fase medfører kun en ringe vækstforhaling.

Kurve 3: Tilsætning af 360 yg/ml Epidermin ved midten af den logaritmiske fase fører 31 DK 172818 B1 også her kun til en vækstforhaling.

Fig. 15: Gaschromatogram for N-pentafluorpropionyl- aminosyre-n-propylesteren af totalhydrolysatet af Hl på Chirasil-Val. Temperaturprogram: 5 3 min. 80°C isotermt, derefter 4°c/min.

til 200°C, bæregas Hj.

Claims (9)

32 DK 172818 B1

1. Natur: Farveløst pulver.

1. Antibiotisk aktivt polypeptid, betegnet Epidermin, kendetegnet ved« at det har følgende aminosyresammensætning: Asn (1), Pro (1)» Gly 5 (2), Ala (2), Ile (2)» Phe (2)« Lys (2), Lan (2), β- Me-Lan (1), Dhb (1), Tyr (1), S-(2-aminovinyl)-D-cystein (1) med følgende primærstruktur: meso-Lanthionin CH,- S - CH, I I H-Ile-Ala-NH-CE-CO-Lys-Phe-Ila-NH-CH-CO— (S) (R>

15 CH, fl-Methyllanthionin (S)CH-S-CH, Ί I UNK-CH-CO-Pro-Gly-HN-CH-CO-Ala-Lys- (S) (R> 20 ~_ <pH 3 meso-Lanthionin CH CK,- S -CH, || (SI I (2) -HN-C-CO-Gly-HN-CK-CO-Phe-Asn-KN-CE-CO-Tyr-HN-CH-CO-NE-CH 25 (Z) (S) I (£) || CK2-S - CH , S- (2-Aminovinyl)-D-cystein i hvorhos de nærmest N-terminus beliggende halvdele af j de enkelte thioetheraminosyrer hver har D-konfigura- 30 tion.

2. Opløselighed: Meget godt opløseligt i blandinger af vand/iseddike eller methanol/iseddike, opløseligt i lavere alkoholer, uopløseligt i chloroform, acetone, diethylether, petroleumsether.

2. Epidermin ifølge krav 1« kendetegnet ved, at det har følgende yderligere parametre:' 35 3» 33 DK 172818 B1

3. Fremgangsmåde til fremstilling, isolering og rensning af det antibiotiske stof Epidermin, ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at Staphylococcus epidermidis DSM 3095 dyrkes aerobt ved 34-37°C i en kompleks næringsopløsning bestående af 35 2-4% af en nitrogenkilde, såsom kødekstrakt, 1-3% af et sukker eller en sukkeralkohol som carbonkilde og 0,25-1% af et carbonat og/eller 0,25-0,5% af et hydroxid af et jordalkalimetal, hvorefter kulturvxsken, efter 34 DK 172818 B1 fjernelse af cellerne og uorganiske salte, til isolering af det dannede aktive stof, enten ekstraheres med n-butanol ved pH 8, hvorefter butanolekstrakten inddampes, inddampnlngsresten opløses i methanol, og 5 opløsningen ved etherfældning befries for de lipidiske ledsagestoffer, eller behandles med polymere på acryl-ester eller polystyren-basis, hvorhos det adsorberede Epidermin opløses fra harpiksen med methanol/konc. saltsyre (99:1), hvorefter opløsningen neutraliseres 10 med ammoniak og inddampes i vakuum, og de således vundne isolater til fraskillelse af yderligere lav-molekylære peptider, aminosyrer og salte gelchromato-graferes (Sephadex LH-20 med methanol/eddikesyre (95:5)) og derefter underkastes en multiplikativ 15 modstrømsfordeling ifølge Craig, ved hvilken der først foretages en væske-væske-fordeling med systemet n-butanol/ethylacetat/Ο,ΙΝ eddikesyre (3:1:3), hvorved Epidermin forbliver siddende ved start, og derefter ved en anden fordeling med det neutrale system 2-20 butanol/0,05N ammoniumacetat (1:1) opnås isolering af det rene Epidermin, og Epiderminet isoleres i form af farveløst pulver fra eluatet ved frysetørring.

3. Farvereaktion på silicagelplader: Ninhydrin, chlor/ TDM= 4,4'-bis-(dimethylamino)diphenylmethan), or-cin/svovlsyre, anisaldehyd/svovlsyre. Ødelæggelses-fri påvisning i UV-lys ved 254 nm og ved sprøjtning med vand.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der i dyrkningsmediet som nitrogen- 25 kilde indføres 2-4 vægts af en kødekstrakt, en blanding af alle 20 aminosyrer i aminosyre-koncentrationer på 2 g/liter for hver, eller 2-4% casamlnosyre i nærværelse af tryptophan, som carbonkilde indføres 1-3 vægt% maltekstrakt, maltose, galactose, lactose, mannit, 30 glucose, glycerol eller kombinationer af lactose med , maltose eller af galactose med maltose, endvidere 0,25-1 vægt% calciumcarbonat eller 0,25-0,5 vægt% calcium-hydroxid, og eventuelt yderligere tilsættes vitaminer, såsom biotin, nicotinsyre, thiamin, pyridoxin,HC1 og 35 calciumpantothenat, og pH-værdien før dyrkningen indstilles på 6,0-7,0, og produktionsforløbet følges ved løbende prøveudtagninger.

4. Tyndtlagschromatografi: Der anvendtes silicagel- færdigplader 60 F254 (Merc^) System A: Chloroform/methanol/17% ammoniak (2/2/1) RF = 0,73 System B: Chloroform/methanol/17% ammoniak (70/35/10) RF = 0,30 System C: n-Butanol/iseddeke/vand (4/1/1) RF = 0,05

5. Epidermin vundet ved fremgangsmåden ifølge 35 DK 172818 B1 krav 3.

5. HPLC: Se Fig.7.

6. Epidermin-frems ti Ilende og over for Epldennin resistent stamme# Staphylococcus epidermidis DSM 3095.

6. Stabilitet: Stabilt fra pH52 til pH=7, ved højere pH-værdier indtræder stærkt aktivitetsfald.

7. Stapylococcus epidermidis DSM 3095# 5 kendetegnet ved# at den har følgende karakteristika: Gramfarvning s positiv Cellestørrelse : diameter 0,5-0,8 ym Kolonistørrelse : ca.l mm diameter 10 Koloniudseende : glat, skinnende, i midten let ophøjet Kolonifarve : grålig-hvid Celler i kultur : ofte enkeltceller eller to sammen, sjældent 15 ' større hobe Hæmolyse : på blodplader udstregede kulturer viste stærk hæmolyse Anaerob vækst : stammen vokser også under 20 anaerobe betingelsef Lysozym-sensibilitet : cellerne er op til 2 mg/hil resistente over for lysozym Lysostaphin-sensibilitet : cellerne er allerede ved 20 gg/ml senslbile over for lysostaphin Epidermin-Resistens : påvist op til 1 mg/ml Andre resistenser : i væskekultur viser stam men en udpræget resistens over for Streptomycin (op til 1 mg/ ml) og Spectinanycin (0,5 mg/ ml) Forhøjet NaCl-indhold : stammen vokser endnu godt ved 15 vægt% natriumchlorid. hvorhos kolonierne eller de udstregede kulturer er klæbrige . 36 DK 172818 B1

7. Molmasse: I området 2160 (uden anioner}

8. Antibakterielle lægemiddelpræparater, kendetegnet ved, at de har et indhold af Epidermin ifølge krav 1 eller 2 foruden sari vanlige bære- og/eller hjælpestoffer.

8. Ultraviolet absorptionsspektrum: I vandig opløsning langbølget maksimum ved 267 nm (Fig.3).

9. Infrarødt absorptionsspektrum: IR-spektrum af en prøve i en kaliumbromidtablet (Fig.4).

10. Kernemagnetiske resonansspektre: 1H-NMR-spektrum: Fig.5, ^C-NMR-spektrum: Fig.6.

9. Anvendelse af Epidermin ifølge krav 1 eller 2, til bekaanpelse af bakterier. "v9 - «lU .m