KR870000062B1 - 포도상구균(Staphylococcus) 감염에 유효한 항생물질의 제조방법 - Google Patents

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Description

포도상구균(Staphylococcus) 감염에 유효한 항생물질의 제조방법

표피 포도상구균(S. epidermidis)배양균의 생육성과 혼탁도에 대한 본 발명의 신규 항생물질의 효과를 도시한 도표.

본 발명은 발효에 의해 포도상구균에 선택적으로 유효한 항생물질을 생성하는 박테리아균주, 이같은 균주를 사용하는 호기성 발효방법과 이 항생물질을 함유하는 발효생성물에 관한 것이다.

질병에 대한 인체의 자연방호 기구중의 하나인 정상적 세균상(細菌相)에 대한 효력은 없으나 특징의 병원미생물에 대해 유효한 한정 스펙트럼(narrowspetrum) 항생물질에 대한 연구가 오랫동안 실시되어 왔다. 수많은 공지 항생물질에 대해 높은 내성을 가지고 있으며 또 선택적인 살균균제를 필요로 하는 세균으로는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)과 표피 포도상구균(Staphylococcus epidermidis)과 같은 포도상구균을 들 수 있다.

이들 그람 양성세균은 상처 및 보철(補綴) 감염과 관계가 있고, 또 황색 포도상구균은 또한 광범위한 전신계(全身系) 및 국한성(局限性)질병과 관계가 있다.

클린다마이신(clindamycin), 겐타마이신(gentamicin), 티팜핀(rifampin)과 메티실린(methicillin)과 같은 많은 광범스펙트럼(broad spectrum)항생물질이 이들 세균에 대해 유효하기는 하지만 포도상구균감염등에 대해 선택적인 항미생물 활성을 갖는 항정 스펙트럼 항생물질은 개발되지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명의 한가지 목적은 황색 포도상구균 및 표피 포도상구균과 관련된 포도상구균 감염에 대해 선택적인 항미생물 활성을 갖는 한정 스펙트럼 항생물질의 제조방법과 이 항생물질을 함유하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 이 밖의 목적은 국소적 용도에 효과적일 뿐만 아니라 정상적인 세균에 대해 해를 주지 않고 또 이들의 제한된 흡수로 인해 특히 중환자의 경우 전신계독성의 위험을 방지할 수 있는 항생물질을 제공하는데 있다. 본 발명방법 및 조성물의 또 다른 목적 및 장점들은 별첨 도면과 관련하여 상세히 기술된 다음의 바람직한 실시상태로부터 명백히 알수 있을 것이다.

본 발명에 따라 미생물 로티아 멘토카티오사(Rothia dentocariosa)의 신규균주가 발견되었다. 이후 알.덴토카티오사(R. dentocariosa)의 하올랜드(Howland) 균주로 칭하게 되는 이 신균주는 인간 인두의 정상적인 호기성 세균상의 배양균으로부터 회수된다.

호기성 발효에 의해 이 새로운 균주는 본 명세서에서 "스타필로시딘(staphylocidin)"으로 칭하는 새로운 항생물질을 생산하는데, 이 항생물질은 한정 항생물질 스펙트럼을 갖고, 또 황색 포도상구군과 포도상구군을 포함하는 포도상구균에 대해 선택적인 항미생물 활성을 나타낸다.

하울랜드 균주의 순수 배양균은 기탁번호 ATCC 제31918호)한국과학기술원 기탁번호 KCTC81749)기탁일자 1983년 3월 31일로 미합중국 메이비랜드 로크빌 소재의 "the American Type Culture Collection"에 기탁하였다. ATCC의 영구 보관에 의해 살아있는 세균의 2차 배양균은 신청에 의해 분양받을 수 있다.

하올랜드 균주(ATCC 31918)가 심부(深部) 호기성 조건하에서 탄소, 질소 및 무기물질의 동화원(同化源)을 함유하는 수성 영양배지에서 발효에 의해 스타필로시딘을 생산한다는 사실이 발견되었다.

발효중 생성된 세포벽 또는 무레인(Murein) *을 포함하는 스타필로시딘-함유 생성물은 이어 공지된 분별방법(Park. J. T.와 Hancock, A. 저술의 "A Fractionation Procedure for Strdies of the Synthesis of Cell-Wall Mucopeptide and of other Polymers in Cells of Staphylococcus aureus" J.Gen, Micro. 22 : 249-258 [1960년 발행])에 의해 분리되고 회수된다.

* 문헌에서 미리 알수 있는 바와 같이 세포 우레인은 짧은 펩티드들을 통해 가교결합 글리칸 사상체들(glycan strands)로 구성되는 펩티도글리칸(peptidoglycan) 헤테로중합체이다(Schleifer, K. H.와 Kandl-er.)., 저술의 "Peptidoglycan Types of Bacterial Cell Walls and their Taxonomic Implications", Bact. Rev. 36 (4), 407-477페이지 [1972년 발행])황색 포도상구균과 표피 포도상구균에 대해 선택적으로 유효한 항생물질을 생상하기 위한 하울랜드 균주의 발효에 대하여는 두명의 본 발명자에 의해 "인두의 세균으로 부터의 항포도상구균 물질(물)"이라는 제목으로 1970년 4월 29일부터 5월 2일 사이에 개최된 미국 소아과 협회(the American Pediatric Society)와

소아과학 연구협회(The Society for Pediatric Research)의 심포지움에 제출된 연구논문에 언급하였다. 그러나, 하울랜드 균주는 그 연구논문에서 명명되지 않았으며, 또 어떠한 공공기관에 기탁된 바도 없으며, 스타필로시딘-함유 세포 무레인발효생성물의 분리, 회수 또는 특징에 대하여도 발표되지 않았다.

앞에서 알 덴토카리오사 "the American Type Culture Collection"에 ATCC 제17931호로 기탁된 프토토형 균주에 근거해서 명명되었다. Schleifer 등에 의해 표사된 세포 무레인의 전형적인 펩티도글리칸 구조를 근거로 하여, 알 덴토카리오사의 ATCC 17931균주로부터 제조된 무레인(이후 "ATCC무레인"으로칭함)은 다음 구조식 I에 도시된 반복단위들이 결합되어 있는 중합체 구조를 가지고 있다.

[구조식 1]

도시된 바와 같이, 따라서 ATCC무레인의 가상적인 중합체 구조는 N-아세틸굴루코사민과 N-아세틸무람산 반복단위, 펩티드단위와 펩티드단위를 다른 에티드단위와 연결시켜주는 펩티드내의 다리를 포함하는 탄수화물 골격으로 구성된다.

대부분의 세균에서의 탄수화물 골격은 구조식 I에 도시된 것과 유사하게 서로 교체되는 β-1,4-결합 N-아세틸글루코사민과 N-아세틸무람산 단위들로 구성된다.

현재까지 문헌에는 단지 6가지의 변이체(變異體)가 기술되었으며, 또 이같은 변이체의 각각은 N-아세틸무람산 잔기에서 변이되고 있다(Ghuysen, J, M. Shockman, G, D. 저술의 "Biosynthesis of Peptidoglycan" ["Bacterial Membranes and Walls", 37페이지 ; 1973년 Leive, L. New York : Marcel Dekker. Inc., 발행]).

그러나, 본 발명의 신규 하울랜드 균주의 발효에 의해 생성된 세포 무레인(이후 "하울랜드 무레인"으로 칭함)의 구조는 탄수화물 골격내의 N-아세틸무람산 단위의 치환과 펩티드내의 다리단위 조성에 있어서 ATCC무레인과 다른 것으로 믿어진다.

이 가설은 다음에 상세히 설명될 ATCC무레인과 하울랜드 무레인의 아미노산과 아미노당 분석에 근거를 두고 있다. 이같은 문석결과는 하울랜드 무레인이 글루코사민 함량에 대한 무람산의 비율이 ATCC무레인에서의 이들 잔기의 비율보다 약 1/3이하라는 것과 하울랜드 무레인은 ATCC무레인의 알라닌 함량의 약 1/2을 함유하는 것으로 나타났다. 전자의 사실은 펩티도귤리칸 각각의 탄수화물 골격구조에 차이가 있다는 것, 하울랜드 무레인의 N-아세틸무람산 단위에서의 아미노기들을 가지지 않는 당에 의한 추가 치환의 가능성을 시사한다. 후자의 사실은 각각 고분자들의 펩티드내 다리단위에 구조상의 차이가 있음을 시사한다.

전술한 바와 같이, 하울랜드 무레인의 정확한 화학적 구조는 현재로는 알수 없다. 그러나 이는 다음과 같은 사실, 즉 하울랜드 균주의 발효생성물으로부터 회수된 펩티드글리칸 중합체로 구성되고 최소한 약 2,000만 달론의 분자량을 가지며, 이후에 특정될 대략적인 아미노산과 아미노당 함유량을 갖게되며, 또 황색 포도상구균과 표피포도상구균을 포함하는 포도상구균에 대해 선택적으로 유효한 항생물질 스타필로시딘을 구성한다는 점에서 특징지울수가 있다.

현재까지 스타필로시딘이 구조적으로 특징지워진바 없다. 그러나 스타필로시딘은 하울랜드 무레인 고분자의 본질적인 부분인 것으로 믿어진다. 스타필로시딘이 하울랜드 무레인 중합체구조의 필수적인 부분이라는 증거는 하울랜드 무레인을 각종 점질분해효소와 반응시킴으로써 확인된다. 따라서 한편으로 하울랜드 무레인이 효소, 아밀라제, 리보뉴클레아제 A, 포스포리파제 A, 키노트립신, 프로나제 또는 트립신중 어느 하나로 처리되는 때는 항미생물 활성에 변화가 없게된다.

한편, 리소짐(N-아세틸무라미다제 활성을 가짐) 리소스타핀(N-아세틸글루코사미니다제와 N-아세틸무라밀-알라닌아미다제를 함유), 또는 바시디오미세레스 리싱 효소(N-아세틸무라밀-알라닌-아미다제를 함유)와 같은 무레인을 소화시킬 수 있는 효소들로 처리된 때는 하울랜드 무레인의 항미생물 활성이 파괴된다. 후자의 효소들은 하울랜드 무레인의 탄수화물 골격의 당 분자들 사이의 결합 또는 탄수화물 골격과 이의 펩티드단의 사이의 결합을 가수분해한다. 이러한 결과들을 근거로 하여 하울랜드 무레인의 무상의 탄수화물사술은 스타필로시딘의 활성에 필수적인 것이며, 따라서 항생물질은 하울랜드 무레인고분자의 필수적인 부분이라는 것을 알수 있다.

더우기, 스타필로시딘의 하울랜드 무레인과의 결합은 하울랜드 발효액을 세파덱스 G-75(Pharmacia Inc. 제품인 주상(珠狀)의 가교결합 덱스트란 흡착겔)컬럼을 통과시키고, 또 8M요소와 함께 고농도 염 농축용액(0.5 M KCl)으로 용리하거나 또는 발효액샘플을 1% 황산나트륨 도데실중에서 끓이고 또 이를 0.1% 황산나트륨 도데실로 용리한 후까지도 활성분획이 칼람의 공부피로부터 회수되는 겔여과 실험에 의해 시사되고 있다. 겔 칼람(구상 단백질의 3,000-80,000 M. W.의 분해범위를 가진)은 스타필로시딘-함유 분획을 분리하지 않기 때문에 스타필로시딘은 무레인 고분자와 공유결합되어 있을 것으로 사료된다.

전술한 바와 같이, 항생물질 스타필로시딘은 알. 덴트카리오사의 새로운 균주(하울랜드 균주)의 발효에 의해 생상된다. 스타필로시딘-함유 발효생성물은 하울랜드 무레인과 이의 활성소팬(특히 발효액에 존재하는)의 단리에 의해 수득된다. 스타필로시딘 그 자체는 하울랜드 무레인으로부터 분리되지는 않지만 이에 공유 결합되어 있고, 또 이의 고분자 구조의 일부라고 생각된다.

새로운 미생물과 이것을 배양하여 스타필로시딘-함유생성물들을 생산하는 방법의 바람직한 실시상태, 이들 생성물을 특징성우고 이의 선택적인 항미생물 활성을 제공하는 데이터 및 항생물질을 함유하는 생성물들의 사용방법에 대하여는 다음에 상세히 기술하고져 한다.

스타필로시딘-생산 세균

하울랜드 균주(ATCC 31918)은 그 형태와 생화학적 반응을 근거로 하여 The American Type Culture Collection에 의해 알. 덴로카리오사로 확인되었다. 따라서, 알. 덴로카리오사의 군주들은 글루코스, 말로스, 만노스, 멜레지로스, 살리신, 슈크로스 및 트레할로스로 부터의 카란라게 생성, 질산염 환원, 에스클린 가수분해 및 산생성에 대해 양성이라는 보고가 있었다(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 제8판).

뇌심장 침출(Difco BHI)발효액에 접종하고, 또 37℃에서 48시간 동안 생장시킨 후, 하울랜드 군주는 이들 각개 반응에 대해 양성이다. 유사하게 전세포(Whole-cell) 가수분해와 탄수화물 발효 최종 생성물의 분석의 결과 역시 알. 덴로카리오사와 일치한다.

하울랜드 군주는 또한 다음과 같은 특징들을 가지고 있다 : (a) BHI 아가에서 37℃로 72시간 동안 성장시킨 클로니의 형태 : 콜리니들은 매끄럽고 부드러우며 전체의 테두리가 회색을 띤 흰색이고, 각 클로니내의 각개의 세포들은 그람-양성이고 또 구간균성 형태이며, 사상체형태가 전혀 편입되지 않고 또 내산성도 아니다 ; (b) 전술한 바와 같이 37℃로 48시간 동안 생장시킨 후의 생화학적 반응(실험결과들은 반응개시 7일 후 측정한 것이다) :

(d) 전-세포 가수분해물 : 유일한 탄수화물로서 갈락토스이고, 디아미노피델산과 아라비노스는 아니다. (e) 탄수화물 발효 최종 생성물 : 유산과 호박산이고 프로피온산은 아니다.

하울랜드 균주의 형태와 생화학적 반응들은 실험 또는 반응을 위한 배양균의 성장정도에 따라 변화한다는 것을 알수 있다. 따라서 예를들면 성장조건이 다른 경우 배양균은 구간균성 형태뿐만 아니라 사상체를 갖는 세포들을 포함할 수도 있다.

[스타필로시딘-함유 생성물의 제조방법]

본 발명에 따라 하울랜드 균주 또는 이의 돌연변이체를 심부(深部) 호기성 조건하의 탄수화물, 질소 및 무기염의 동화원을 함유하는 수성 영양배지에서 스타필로 시딘에 실질적인 항균활성이 생성될때까지 배양한다. 스타필로시딘으로의 생물학적 전환을 위한 발효조건은 일반적으로 폭기심부발효에 해의 각종 항생물질들을 생산하는 공지된 방법에서 사용되는 것과 동일하다.

발효배지는 통상 영양소와 광물질을 함유한다. 적당한 영양소의 예로는 다당류나 전분류와 같은 탄소의 또는 글리세롤과 같은 폴리알콜류의 동화원을 들수 있다. 질소의 동화원은 단백질류, 단백질 가수분해물, 요소, 옥수수침지액, 펩톤, 증류주 가용성분(distillers solubles), 어류죽(fish meal) 및 기타 선행물질을 사용해서 공급할 수 있다. 보통 음이온과 양이온은 이들의 비독성 염류의 형태로 공급된다.

망간, 코발트, 아연, 구리등의 곡미량 원소들은 수돗물을 사용함으로서 또는 이들 곡미량원소들이 특히 풍부한 용액을 특별히 부가함으로서 상기 화합물중의 불순물로 수득된다. 수소이온농도, 온도, 시간, 통기율, 접종물이 제조, 살균, 접종 및 이와 유사한 발효의 기타 일반적인 조건들은 종래의 경우와 같으며 다른 접종물의 제조, 살균, 접종 및 이와 유사한 발효의 기타 일반적인 조건들은 종래의 경우와 같으며 다른 항생물질들의 제조에 사용되는 조건들과도 역시 유사하다.

발효는 하울랜드 균주의 배양균의 양호한 성장을 위해 필요로하는 일반적인 기간인 약 24시간 내지 72시간 동안통상적인 조건하에서 진행시킨다. 그리고 나서 예를들면, 모든 세포들의 수집, 트리클로로 아세트산과의 가열, 완충처리와 트립신으로 처리하는 박동의 방법(the methol of park)과 같은 무레인을 정제하는 방법에 의해 전미생물로부터 항생활성을 회수한다. 그렇지 않으면 하울랜드 무레인은 예를들면 트립신, 폴리옥시에틸렌에테르류(예를들면, "트리톤 X-100") 및 황산나트륨 도데실로 처리하는 공지의 기술에 의해서도 회수할 수 있다.

하울랜드 균주의 발효방법과 스타필로시딘-함유 하울랜드 무레인의 회수방법에 대해 특히 바람직한 실시예들을 다음에 기술하였다.

[실시예 1-BHI 배지발효에 의한 스타필로시딘의 제조]

강제통풍 배양기내에서 35℃로 통기하면서 가볍게 진탕시키는 뇌심장 침출발효액(Difco BHI)중에서 하울랜드 균주를 성장시킨다. 65시간 동안 배양한 후 30분동안 10,000G로 원심분리하여 세포들을 수집한 다음 증류수로 세 번 세척한다.

이 세포들은 10% 트리클로로아세트산에 현탁시킨 다음 95℃로 20분간 가열한다. 현탁액을 10,000G 로 20분간 원심분리하여 수득된 펠릿을 pH7.0의 0.1M인산염 완충액으로 5회 세척한다. 이 펠릿을 추가로 100마이크로그람/ml의 트립신을 함유하는 인산염완충액에 제현탁시킨 후, 그 현탁액을 37℃에서 2시간동안 배양한다. 하울랜드 무레인을 회수하여 증류수도 4회 세척한다. 수득된 물질은 다음에 표시한 바와같이 황색 포도상구균과 표피 포도상구균에 대해 탁월한 항미생물 활성을 나타내는 분말상의 물질이다.

[실시예 2-효모 엑스/슈크로스 배지발효에 의한 스타필로시딘의 제조]

하울랜드 균주를 탄소원으로서 4%의 시판용 효모엑스(Yeast Prodects Co.의 Ardamine Z)와 2% 슈크로스(CornProdects Co.의 Cerelose)를 함유하는 pH6.8의 배지에 배양하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같은 방법으로 배양한다. 무레인의회수방법은 실시예 에서와 같다.

[스타필로시딘-함유 생성물의 특성]

전술한 바와 같이 회수된 스타필로시딘 활성을 갖는 하울랜드 무레인은 전술한 바와 같이 펩티도글리칸 고분자로 구성되는 것처럼 보인다. 그러나, 하울랜드 무레인의 화학적 구조는 각각의 무레인들의 아미노산과 아미노 당함량의 변화에 의해 부분적으로 증명된 바와같이 ATCC무레인의 화학적 구조와는 다르다.

아미노산과 아미노 당함량은 Perkin-Elmer데이타 프로세서, 인터그레이터 및 마이크로프로세서로 접속된 0-프탈디알데히드 형광을 사용하는 마이크로보어(microbore)시스템-고감도 감지시스템(Durrum)으로 분석해서 측정하였다. 아미노산과 아미노 당의 정량치는 두 개의 무레인들의 크로마토그람과 인증된 표준의 크로마토그람과를 비교함으로서 얻어진다. 아미노산 함량은 24시간 동안 진공하의 110℃에서 6N HCl로 가수분해한 후 측정한다. 아미노당의 분석은 약산(mild acid)가수 분해(100℃의 2N HCl에서 2시간 동안)한후 실시한다.

다음과 같은 비교분석치들을 얻었다 :

[표 1]

하울랜드 무레인 스타필로시딘-함유 생성물은 박층 크로마토그라피 분석에 의해 보다 특징 지워지고 또 ATCC무레인과 구별된다. 이 분석은 다음과 같이 실시한다 : 200mg씩의 하울랜드 무레인과 ATCC 무레인 각각을 37℃의 수욕(水浴)에서 10mg의 리소짐, 10mg의 리소스타핀, 0.02% 아지드나트륨과 pH7.0의 0.01M 인산완충액과 함께 48시간 동안 배양한다. 무레인분해물을 10,000G로 20분간 원심분리하고 또 0.45미크론 필터로 여과한다.

여액을 동결 건조하고 또 0.5ml증류수에 제현탁시킨다. 세파덱스 G-10겔 (Pharmacia Inc. 제품, 주상의 가교결합 떽스트란 흡착 겔)을 오우토 클래브로 처리하고 또 제조원의 지시에 따라 칼람내에 채운다.

칼람에 살균 증류수를 통과시키고 또 41ml의 분획물을 수득한다. 페놀/황산 방법에 의한 탄수화물 분석으로 분획물내에 탄수화물이 존재한다는 것을 확인되었다. 그리고 나서, 분획물을 동결 건조하고 또 50ml의 증류수에 용해시킨다.

몇 개의 분획물, n-아세틸무람산 및 n-아세틸글루코사민을 불활성 실리카겔 G판상에 적가하고, 75 : 10 : 15 v/v/v의 이소프로판올/아세트산/물을 사용하여 한쪽으로 번지게 한다. 건조시킨 후, 이 판들에 5% 암모니아성 질산온을 산포시키고, 또 100℃로 10분간 또는 반점들이 명백하여 질때까지 가열한다.

[표 2]

R_f는 용매의 기동거래에 대한 화합물의 이동거래의 비율이다.

[스타필로시딘-함유 생성물의 항미생물 활성]

상기의 실시예 1에 기술된 것과 같은 방법으로 제조된 하울랜드 무레인 샘플의 항미생물 스펙트럼을 측정하고, 그와 유사하게 제조된 ATCC무레인의 스펙트럼과 비교한다.

다음 표 3에 요약된 실험들에 있어서 각각의 실험세균을 5%의 양(羊) 혈액을 첨가하거나 또는 첨가하지 않은(세균의 증류에 따라) 뇌심장 침출액에 접종하고, 37℃로 하룻밤 동안 배양한다. 하울랜드 무레인의 항미생물 농도는 특정실험세균의 5개 미만의 콜로니가 성장하는 5%의 양(羊) 혈액을 함유하는 뮐터힌톤 아가(Mueller Hinton agar) 1ml당 하울랜드 무레인의 μg수로 측정한다.

표 3에 수록된 바와같이 동일 농도의 ATCC무레인은 항미생물 효과를 나타내지 못하였다.

[표 3]

실험세균들은 양의 혈액과 함께 또는 그것없이 뇌심장 첨출액으로 또는 *표한 것은 pH 7.4의 인산완충 식염 용액으로 1/100으로 희석한다.

1) NK=죽지 않음.

2) 이 숫자들은 표시된 항미생물 농도에서 죽은 균주의 수를 의미한다.

황색 포도상구균에 대한 스타필로시딘-함유 생성물의 선택적 항미생물 효과의 부가적인 입증은 황색 포도샹구균의 세포벽 결핍 배양균(L-형태)에 대한 실험에 의해 얻을 수 있다. L-형태는 pH7.0의 0.05M트리스 HCl중에 용해시킨 5% NaCl용액, 20% 말혈청 및 900μg/ml의 매티실린을 함유하는 뇌심장 침출 아가에서 유발된다.

하울랜드 발효액(배양 65시간후)과 상기 실시예 1에 기술된 것과 같은 방법으로 제조된 하울랜드 및 ATCC무레인들의 샘플들을(40mg/ml) pH 7.0의 0.05M트리스 HCl중에 용해시킨 5% NaCl용액으로 1 : 10의 비율로 희석한다.

세포벽 결핍 황색 포도상구균 실험균주를 아가판상에 선상으로 길게 위치시킨다. 그리고나서, 20μl의 각종 실험용액(순수 완충액, 상기와 같이 제조된 하울랜드 발효액, 하울랜드 무레인과 ATCC무레인)을 아가판상에 적가한다. 37℃로 48시간 동안 배양한 후, 각 적가한 부분에서 깨끗한 넓이의 동급을 1 + (지활성)부터 4+(고활성)까지 매긴다.

다음 표 4에 나타낸 바와같이 하울랜드 발효액과 하울랜드 무레인은 모두 4+활성을 나타내는 반면, 완충액과 ATCC무레인 샘플은 활성을 나타내지 않았다.

[표 4]

표피 포도상구균의 배양균들에 대한 본 발명의 스타필로시딘-함유 생성물들의 항미생물 효과도 또한 증명될 수 있다. 다음에 기술된 바와 같이 스파틸로시딘은 표피 포도상구균에 대해 살균력 뿐만 아니라 용균력도 가지고 있다.

첫 번째 실험에서 하룻밤동안 배양한 표피 포도상구균을 BHI발효액에 접종한다. 상기 실시예1에 기술된 것과 같은 방법으로 65시간 동안 발효한 후 생성되고 또 1 : 100의 희석액은 4 + 항미생물 역가를 가지며, 또 1 : 400희석액은 1 + 항미생물 역가를 가지는 하울랜드 발효액을 4시간 동안 성장시킨 표피 포도상구균 배양균의 첫 번째 발효액 샘몰에 첨가한다.

그리하여 약 1 : 10의 표피 포도상구균과 하울랜드 발효액의 최종희석액을 첫 번째 발효액 샘몰로서 수득한다. 표피 포도상구균 발효액 샘몰내의 생세포농도(첨부도면의 곡선 2)와 표피 포도상구균 : 하울랜드 발효액 샘몰내의 생세포농도(첨부도면의 곡선 20)를 측정하여 도표에 표시한다. 유사하게 표피 포도상구균 발효액 샘몰(첨부도면의 곡선 4)과 표피 포도상구균 : 하울랜드 발효액 샘몰(첨부도면의 곡선 40)의 흡광도(620nm에서)를 측정하였다. 곡선 40에 도시된 흡수치를 하울랜드 발효액 그 자체의 광학효과에 대해 수정하면, 곡선 4와 40은 스타필로시딘-함유 하울랜드 발효액에 의한 표피 포도상구균의 붕괴에 따라 얻어지는 감소된 혼탁도만을 나타내게 된다. 도면에 도시된 바와 같이 표피 포도상구균 배양균의 생육성과 혼탁도를 하울랜드 발효액의 접종후 현저히 감소된다.

두 번째 실험에서 표피 포도상구균 균주에 대한 하울랜드 무레인의 활성을 ATCC무레인의 활성과 비교한다. 하울랜드와 ATCC무레인의 각종 희석액을 표피 포도상구균 균주의 발효액 현탁액 1ml에 부가한다.

이 샘몰들을 3시간 동안 격렬히 흔들며 35℃로 배양한다. 표 5에 표시된 바와 같이 ATCC무레인의 부가는 표피 포도상구균에 대한 하울랜드 무레인의 항미생물 활성을 경쟁적으로 억제한다는 것을 알 수 있다.

[표 5]

생쥐들을 이용한 예비 생체실험으로 본 발명에 따라 제조된 스타필로시딘-함유 분획물들이 숙주동물에 대해 이렇다할 독성을 나타내지 않는 다는 것이 또한 증명되 었다. 따라서, 하울랜드 균주의 발효에 의해 얻은 오우토클래브 처리하고 희석하지 않은 발효액 상용액을 사용하는 첫번째 실험에서, 복강내로 0.5ml의 실험물질을 24시간 내에 두번 주사한 13-15g의 생쥐들에서도 독성이 있다는 어떠한 증거도 입증되지 않았다.

또 다른 실험에서 하울랜드 균주의 준-개체군의 발효에 의해 회수된 세포 무레인은 사용된 실험조건하에서 어떠한 급성독성효과를 초래하지 않고 외과적-상처 감염된 생쥐의 조속한 처리에 의해 황색 포도상구균에 대해 활성을 가진다는 것을 보여준다.

스타필로시딘-은함유물질은 하울랜드 균주(ATCC 제31919호로 American Type Culture Collection에 기탁)의 조잡상 준-개체군으로 부터 제조된다.

조잡상 콜로니들을 건조하고 주름지게 하고, 또 불규칙한 칼날로 분쇄해주며, 이때 각 클로니내의 개개의 세포들은 여러가지 사상체의 형태는 물론 디프테리아군 및 구균의 형태들인 다형태성의 그람-양성 간상균들이었다.

이 세포들은 내산성이 아니다. 조잡상의 준-개체 군의 생화학적 반응성은 단지 조잡상의 포게스-프로스카우어 실험(Voges-Proskauer tast)에서 반응성이 약하다는 점이 다를뿐 층 배양균의 그것과 유사하고 또 타피노스와의 반응에 의해 산을 생성하였다. 조잡상 세포무레인은 하울랜드 무레인과 같은 한정된 선택적 항미생물 스펙트럼을 나타내지만 항미생물활성이 단지 약 1/10에 불과하다.

조잡상 세포무레인을 사용하여 위약(僞藥)물질보다는 활성이 극히 높지만 겐타마이신-함유 국소처방보다는 활성이 극히 낮다는 것을 생쥐실험에서 입증할 수 있었다.

[스타필로시딘-함유 생성물의 투여와 사용]

현재로서는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 제조된 스타필로시딘-함유 처방을 보통 포도상구균 또는 다른 이환성(罹患性) 세균으로 인한 국소적인 질환을 예방하거나 치료하기 위해 국소적으로 투여하는 것이 바람직하다. 이와 같이 국소적으로 사용하는 때에는 활성물질을 적당한 담체와 혼합해서 크림, 겔 또는 로숀과 같은 형태로 사용한다.

예를들면, 아크릴산 중합체(예컨대, B. F. Goodrich Corporation 제품의 Carbpol 940(0.2% 수성현탁액)와 같은 겔-기초 담체를 사용하는 것이 현재로는 바람직하다. 일반적으로, 약 1% 내지 50의 활성물질을 이같은 담체와 혼합하여 적당한 국소연고제를 제조할 수 있다. 이같은 국소제제들의 조제, 사용 및 투여방법은 공지된 사항이다.

황색 포도상구균과 표피 포도상구균에 대한 이러한 제제들의 항균작용 메카니즘에 대하여는 알려져 있지 않다. 그러나, (a) 무롤리틱(murolytic)효소 분해물로 부터의 데이타(활성을 위한 무자 탄수화물 결합들의 중요성을 입증), (b)스타필로시딘-함유 생성물이 세포벽 결핍세균을 죽인다는 사실, 또 (c) 활성 및 불활성 무레인들의 탄수화물 골격에서의 상이함을 보여주는 아미노산 분석치는 가능한 생물학적 메카니즘을 입증하고 있다.

세포벽에서의 반응을 포함하지 않고 무자 탄수화물 결합등을 포함하는 무레인생합성 단계는 지질담체 사이클에서 발생된다.

스타필로시딘을 함유하는 무레인 성분들이 불가역적으로 지질담체 분자와 결합하여 소단위들(subunits)이 세포질로 부터 세포막으로 또는 세포막으로 부터 세포벽으로의 전이를 막는 것이 가능하다. 본 발명이 전술한 가능한 반응메카니즘에 대한 가설에 의해 제한되지 않음은 물론이다.

Claims (6)

1. 심부 호기성 조건하에서 탄소, 질소 및 무기염류의 등화원을 함유하는 수성 영양배지에서, 항생물질 스타필로시딘(Staphylocidin)을 생산할 수 있는 ATCC 31918 (KTC 81749)로 특성 확정된 로티아 덴토카리오사(Rothia dentocariosa)의 생물학적 순수배양균을 스타필로시딘에 기인한 실질적인 항균 활성이 생성될 때까지 배양하여, 에스 아우레우스(S. aureus) 및 에스 에피데르미디스(S. epidermidis)를 포함하는 포도상구균류(Staphylococci)에 대해 선택적인 항미생물 활성을 갖는 한정-스펙트럼 항생물질 스타필로 시딘의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 발효액으로 부터 스타필로 시딘이 결합된 세포 무레인을 분리함으로서 스타필로 시딘-함유 생성물을 회수하게 되는 제조방법.
3. 제1항에 있어서 (a) 72시간 배양후 형태 ; 콜리니들이 매끄럽고 부드러우며 전체의 테두리가 회색을 뛴 흰색이고, 각 콜로니내의 각개 세포들은 그람-양성이고 형태는 구간근성(cocco-bacillary)이며, 어떤 사상체 형태(filamentous form)와 합체하지 아니하거나 내산성이며, (b) 48시간 후의 생물학적 반응 :

   

   (d)전-세포 가수분해물 : 유일한 탄수화물로서 갈락토오스이고, DAP와 아리비노스는 아님; 그리고 (e) 탄수화물 발효 최종 생성물 : 락트산과 석신산이고 프로피온산은 아닌 상기(a) 내지 (e)의 특성을 지닌 생물학적 순수배양균인 토리아 덴토카리오사, ATCC 31918 (KCTC 81749)을 심부 호기성 조건하에서 탄소, 질소 및 무기염류의 등화원을 함유하는 수성 양배지에서 스타필로시딘에 기인한 실질적인 항균활성이 생성될때 까지 배양하여, 에스 아우레우스 및 에스에피데르미디스를 포함하는 포도상구균류에 대해 선택적인 항미생물 활성을 갖는 한정-스펙트럼 항생물질 스타필로시딘의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 발효액으로 부터 스탈필로 시딘이 결합된 세포 무레인(cell murein)을 분리함으로서, 스타필로시딘-함유 생성물을 회수하게 되는 제조방법.
5. 제1항에 있어서 (a) 다음과 같은 대략적인 아미노산과 아미노당 함량을 가지는 펩티도글리칸 중합체를 포함 :

   

   (b) 리소짐과 리소스타핀으로 분해 후, 실리카겔 G판들 위의 이소프로판을 /아세트산/ 물 시스템의 박층 크로마토그라피에 의한 다음의 R_f값을 가짐;

   

   그리고, (C) 황색 포도상구균과 표피 포도상구균을 포함하는 포도상구균류에 대해 선택적으로 유효한 한정-스펙트럼(narrow-sectrum)항생물질 스타필로시딘이 결합되어 있는 상기(a) 내지 (c)의 특성을 지닌 세포무레인을 발효에 의해 생산 가능한, 생물학적 순수배양균 로티아 덴토카리오사, ATCC 31918 (KCTC 81749)을 심부호기성 조건하에서 탄소, 질소 및 무기염류의 등화원을 함유하는 수성 배양배지에서 스타필로시딘에 기인한 실질적인 항균활성이 생성될때까지 배양하여 에스 아우레스 및 에스 에피데르 미디스를 포함하는 포도상 구균류에 대해 선택적인 항생물 활성을 갖는 한정 스펙트럼 항생물질 스타필로시딘의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 발효액으로부터 스타필로시딘이 결합된 세포무레인을 분리함으로서 스타필로시딘-함유 생성물을 회수하게 되는 제조방법.