FI82073B - Framstaellningsfoerfarande foer epidermin, en antibiotisk polypeptid. - Google Patents

Description

1 82073

Antibioottisen polypeptidin, epidermiinin, valmistusmenetelmä -Framställningsförfarande för epidermin, en antibiotisk poly-peptid

Keksinnön kohteena on antibioottisesti vaikuttavan polypeptidin, jota seuraavassa kutsutaan epidermiiniksi, valmistusmenetelmä tätä ainetta vastaan resistentin uuden Staphylococcus epidermldis-kannan avulla.

Patenttijulkaisusta EP-A-0 027 710 tunnetaan, että eräs tietty Staphylococcus epidermidis-kanta, nimittäin Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 (talletettu National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, kokoelmaan) muodostaa pieni-molekyylistä, antibioottisesti vaikuttavaa polypeptidiä, jolla on laaja vaikutus gram-positiivisiin organismeihin ja joka lyysaa bakteerisoluja.

Edelleen on tunnettua, että Staphylococcus epidermidis MF 205 kanta (S.M. Taylor et ai., Int. J. Mass Spectrom. ja lon Physics 48., 161 - 164, 1983) myös tuottaa oligo-peptidiä, jolla on gram-positiivisten bakteereiden vastainen vaikutus. Julkaisusta ei käy selville, onko tämä kanta identtinen edellä mainitun NCIB 11536 kannan kanssa.

Nytteemmin on havaittu, että resistentti Staphylococcus epidermidis kanta, joka on talletettu 26.10.1984 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen"-kokoelmaan numerolla DSM 3095 ja joka on lähisukuinen edellä mainitun NCIB 11536 kannan kanssa, tuottaa modifioidun valmistus- ja jatko-käsittelymenetelmän jälkeen samantapaista, etupäässä gram-pos itiivisiin organismeihin antibioottisesti vaikuttavaa epidermiini-polypeptidiä, jolla Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 ja MR 205 kantojen tuotteisiin verrattuna on mm. huomattavia eroja aminohappokoostumuksessa: 2 82073

Rakenneosien verla jiu:

Lp;termiini Staph.epidermidis-tuotteet _______MF 205 _NCIB 11536

Asn 1 -

Asx - 21

Glx - 31

Pro 1 11

Gly 2 22

Ala 2 21

Ile 2 21

Phe 2 21

Lys 2 21

Lan 2 - β-Me-Lan 1 -

Dhb 1 -

Tyr 1 1 S -(2-Aminoviny yn ) -D-kysteiini 1 X - 1-2 -

Dhb on a , B-dehydroaminovoihappo , Asx ja Glx ovat Asn/flsp j' ja Gln/Glu.

6N suolahapolla suoritetun epidermiinin kokonaishydrolyysin jälkeen (18 tuntia 110°C:ssa) antoi ioninvaihtokromato-graafinen (vakio-ohjelma Biotronik LC 6000 E-laittee11a) kvantitatiivinen aminohappoanalyysi seuraavan a-amino-happokoostumuksen:

Asp (1,00), Pro (0,95), Gly (2,09), Ala (2,03), Ile (2,03), Tyr (0,30), Phe (2,02) ja Lys (2,00) (vrt. kuvio 1). Tio-glykolihappoa lisäämällä kasvni totaalihydrolysaatin tyro-siinipitoisuus lähes stokiömetriseen arvoon 0,93.

3 82073

Proteiiniaminohappojen konfiguraatio saatiin kokonaishydro-lysaatista pentafluoripropionyyli-aminohappo-n-propyyliesterin kaasukromatografialla. Erottaminen suoritettiin kiraalisessa L-valiini-tert — butyyliamidi-polysiloksaani-stationäärifaa-sissa (Chirasi1-Va1). Vertaamalla konfiguraatioltaan tunnettujen aminohappojen testiseokseen voitiin edellä annettujen rakenneosien konfiguraatioksi todeta L-muoto (vrt. kuvio 2) .

Näiden proteiiniaminohappojen lisäksi tulevat vielä seuraavat e i-p ro t. e i in ihapo t : Lantio niini (2), β-metyylilantionnni (1) ja α , β-dehydro am ι novoihappo (1); lantioniinilla on tällöin meso-konfiguraatio ja 3-me t yylila n t i oni n i 11 a 2S,3S,6R-konfiguraatio. lipidermiini sisältää lisäksi S-(2-aminovi-nyyli)-D-kysteiini-rakenneosaa.

Uusi epidermiini-yhdiste voidaan karakterisoida seuraavien tietojen avulla: 1. Luonne: väritön jauhe 2. Liukoisuus: liukenee erittäin hyvin vesi/jääetikka- :.· tai metanoli/jääetikka-seoksiin, liukenee alempiin alkoholeihin, ei liukene kloroformiin, asetoniin, di-• ·; etyylieetteriin, petrolieetteriin.

3. Värireaktio p i i happogeel i 1 e vy i 11 ä : ninhydriini, kloori/TDM (TDM=4,4'-bis-(dimetyyliamino)difenyylimetaani), orsiini/ rikkihappo, anisaldehydi/rikkihappo. Ei-hajoittava osoittaminen UV-valossa aallonpituudella 254 nm ja suihkuttamalla vedellä.

4. Uhu11 evykromatogra f ia : käytettiin piihappogeelivalmislevyjä 60 F^ (Merck).

Systeemi A: kloroformi/metanoli/ :: 17% ammoniakki (2/2/1) RF=0,73

Systeemi B: kloroformi/metanoli/ 17% ammoniakki (70/35/10) RF=0,30 I". Systeemi C: n-butanol i/jääetikka/vesi (4/1/1) RF = 0,05 4 82073 6. Stabiilisuus: Stabiili pH-arvoissa 2-7, korkeammissa pH-arvoissa aktiivisuus laskee voimakkaasti.

7. Moolimassa: noin 2160. Eristysmenetelmästä riippuen voidaan saada unionina, esimerkiksi kloridina, asetaattina tai fosfaattina.

8. Ultraviolettiabsorptiospektri: vesiliuoksessa pitkä-aaltoinen maksimi 267 nm (kuvio 3).

9. Infrapuna-absorptlospektri: näytteen IR-spektri kalium-bromi ditab letissa (kuvio 4).

10. Vdinmagneettiset resonanssispektrit ^H-NMR-spektri: kuvio 5, ^C-NMR-spektri: kuvio 6

Epidermiinin sekvenssointiin sopivia fragmentteja saatiin lohkaisemalla trypsiinillä. Reaktio trypsiinin kanssa pienensi nopeasti antibioottista aktiivisuutta. Makroskooppisesti todettiin trypsiinikasittelyssä hyytelömäinen valkoinen sakka, joka voitiin erottaa sentrifugoimalla. Supernatantti lyofilisoitiin ja geelikromatografoitiin 5ephadexG~25 geelillä (Pharmacia-yhtiön dekstraanigeeli) 1-prosenttisessa etikkahapossa. Ninhydriinillä, kloori/TDM:llä ja vedellä värjäytyvä, kemiallisesti yhtenäinen jae (josta seuraajassa käytetään merkintää Pl) osoittautui epidermiinin trypsiinikäsittelyn N-1erminaa 1iseksi palaksi (kts. jäljempänä).

Erittäin hydrofobinen, hyyte1ömäinen sakka muodostui useam-: masta kemiallisesta komponentista, jotka trypsiinillä pilkottaessa muodostuivat kokonaismolekyy1 in C-terminaalisesta palasta. Kemiallisesti yhtenäinen tuote (josta seuraavassa käytetään nimitystä P2) saatiin liuottamalla sakka dimetyyli-formamidiin ja sen jälkeen geelikromatografoimalla Sephadex LH-20 geelillä (dekstraanigeeli, joka on valmistettu hydroksi-propyloima11a Sephadex G-25 geelistä), Pharmacia) käyttämällä ajoaineena dimetyy1iformamidia . P2 voidaan detektoida veden, kloori/TDM:n ja UV-valon avulla. P2:n ninhydriini-reaktio on negatiivinen.

5 82073

Pl-palan am ino happoana 1yysi antoi seuraavan koostumuksen:

Pro (1), Lan (1). β-Me-Lan (1), Gly (1), Ala (2), lie (2), Phe (1), Lys (2). Koska kokonaismolekyylin dansy-lointikäsittelyn avulla N-terminaaliseksi aminohapoksi määritettiin isoleusiini ja koska P2-pala ei sisällä isoleusiinia, Pl-palan täytyy olla kokonaismolekyylin N-terminaalinen pilkkoutumistuote. Trypsiinikäsittelyn perusteella täytyy Pl-palan C-terminaalisen aminohapon olla lysiini.

Pl-palan rakenteen jatkoselvitystä varten poistettiin C-terminaalinen lyaiini-aminhappo entsymaattisesti karboksi-peptidaasin B avulla (Boehringer Mannheim). Tästä muodostunut P12-pala voitiiri eristää puhtaassa muodossa geelikromato-graafisesti Sephadex G-25 geelillä (1-prosenttinen etikka-happo). P12 muodostuu seuraavista aminohapoista: Pro (1), Lan (1), B-Me-Lan (1), Gly (1), Ala (2), Ile (2),

Phe (1), Lys (1 ) .

Lantioniini- ja S-metyy1ilantioniini-tioeetteriaminohappojen rikkisillat estävät Edman'in sekvenssianalyysin. Saattamalla * P12 reagoimaan Raney-Ni W2 katalyytin kanssa saadaan ··· rikitön dodekapept idi . meso-Lan muuntuu tällöin D- ja L-a 1 aniiniksi ja G-metyylilantioniini D-aminovoihapoksi ja L-alaniiniksi . Dodekapep tidisek venssi selvitettiin Edman'in hajotuksen ja FAB-spektrometriän avulla: Ι1θ1-Αΐ32-Αΐ33-Εγε^-Ρ·Ηθ5-Ι J.e6-Ala7-Abu8-pro9-Gly10-Ala1^-Ala^2.

P12-palan rikkisi1tojen järjestystä koskevat eri tutkimukset J a ntoivat seuraavan rakenteen: i-s-1 :*· Ile-Ala-Ala-Lys-Phe-Ile-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Ala '-S-1 » · 6 82073

Trypsiinilla pilkkomalla saatu C-terminaalinen P2-pala voidaan karakterisoida seuraavasti: Asn (1), Lan (1),

Gly (1), Phe (1), T \ j· (1), α-ketovoihappo ja S-(2-amino-vinyyli )-D-kystenni .

α-ketovqihappo on peräisin dehydroaminovoihaposta, joka kokonaismolekyylin sekvenssissä seuraa suoraan lysiini^-aminohappoa. Trypsiinipilkkominen vapauttaa dehydroaminovoi-hapon aminoryhmät; koska vapaita aminoryhmiä sisältävä dehydroaminovoihappo on pysymätön, ne toisiintuvat mm. α-ketohapoiksi.

α-ketovoihappo sa.lpaa N-terminaalisesti trypsiinipalan P2 (P2:n ninhydriinireaktio on negatiivinen). Totaali-hydrolyysillä ja aminohappoanalyysillä identifioitujen lantioniini-, glysiini-, fenyylialaniini-, tyrosiini-ja asp aragiinihappo-aminohappojen lisäksi P2-palassa on vielä rakenneosa, jonka kokonaishydroly ysi tuhoaa.

Tämä voidaan karakterisoida signaaliensa avulla epidermiinin "^C-ydinresonanssispekt reissä (kuvio 6) ja P2-fragmentissa (kuvio 8 ) .

Viite tämän aminohapon kemiallisesta luonteesta saadaan saattamalla P2 reagoimaan Raney-Ni W2 katalyytin kanssa, ! jolloin muodostuu kaksi päätuotetta. Kummassakin prepa- ; ratiivisella HPLC:llä eristetyssä tuotteessa on kokonais- hydrolyysin jälkeen aminohappokromatogrammissa vielä yksi D-alaniiniryhmä, jonka tämä reaktio on muodostanut.

Tämän rakenneosan rakenne voitiin selvittää hydraamalla heterogeenisesti natiivi antibiootti. Neljä reaktiotuotetta Hl, H2, H3 ja H4 puhdistettiin puolipreparatiivisella HPLC:llä, kokonaishydrolysoitiin ja kaasukromatografoitiin • kiraalisessa stationäärifaasissa (kuvio 15). Kuvion 2 kromatogrammiin verrattaessa näkyi tällöin H1:11 a ja H3:lla lisäpiikki, joka massaspektrinsä avulla identi-

II

7 82073 fioitiin S-(2-aminoetyyli)-D-kysteiiniksi. Tämä aminohappo oli epidermiinissä happolabiilina S-(2-aminovinyy1i)-D-kysteiini-rakenneosana.

Kummatkin C-terminaalisesta P2-palasta Raney-nikkeli W2-katalyyttikäsittelyllä syntyneet peptidit P21 ja P22 voitiin karakterisoida seuraavasti aminohappoana-lyysillä ja Chirasil-Val-kaasukromatografialla:

Reaktiotuotteet_P 21_P 22 _

Aminohappoanalyysi ja 2 D-Ala 1 D-Ala

Chirasil-Val-kaasu- 1 L-Ala meso-Lan kromatogfrafia 1 L-Phe lL-Phe 1 L-Tyr 1 L-Tyr 1 L-Asp 1 L-Asp 1 Gly 1 Gly

Lisäksi etyyliamiini salpasi kummatkin tuotteet C-termi-naalisesti. Samanaikaisella hydrauksella suoritetussa rikinpoistossa hajosi S-(2-aminovinyyli)-D-kysteiini D-alaniiniksi ja etyyliamiiniksi.

• 1

Sillattoman heptapeptidin P21 sekvenssointi (osittais- hydrolyysi; 0,1 N-suolahappo, 93°C, 16 tuntia) antoi ·;· seuraavan rakenteen: H3C-CiJ2-CO-CO-Gly-D-Ala-L-.Phe.-L-Asn-D-Ala-L-Tyr-L-Ala-NHEt

Palan P22 sisältämän meso-1antioni inisi1lan osittais-hydrolyysil.lä ja palojen P21 ja P22 entsymaattisten fragmenttien erilaisilla kemiallisilla tutkimuksilla saatu paikka voitiin yhdistää vain seuraavaan trypsiini-" käsittelyllä saadun P2-fragment in rakenteeseen e 82073 I- S -

H^C-CHj-CO-CO-Gly-Ala-Phe-Asn-Al.a-Ty r-Ala-NH-CH

L-S- CH

P2 N - te rm inaa 1 i se s t i salpaavan 2-ketov/oihapon formaalinen substituointi natiivissa antibiootissa olevalla dehydro-butyriini-aminohapolla ja trypsiinipeptidien Pi ja P2 seuraava palojen kondensointi johti suoraan heterodet-tetrasyk 1isen epidermiini-peptidiantibiootin seuraavaan sekvenssi in :

Ribosomaa 1isesti syntetisoidun, heterodet-syklisen EPIDERMIINI-dokosapeptidiantibiootin rakenne: s 82073 meso-1 ant ion i i n i ch2 - S -CH2

I I

H-Ile-Ala-NH-CH-CO-Lys-Phe-Ile-NH-CH-CO-- (S) (R) CH3 β-metyy1i1 ant ioniini (S)CH - S - CH2 — NH-CH-CO-Pro-G1y-NH-CH-CO-A1a-Lys - (S) (R) Γ - " 11 —— ..il I ' CH3 meso-1 ant ioniini CH CH2 ------- s--— CH2 (S) (2)

— NH-C-CO-Gly-HN-CH-CO-Phe-Asn-HN-CH-CO-Tyr-HN-CH-CO-NH-CH

(1) (S) I (r) ||

CH2--S - CH

S-(2-ami no v i nyy 1 i )-D-kystei ini

Yksittäisten bioeetteriaminohappojen lähellä N-päätä sijaitsevat puolet ovat kulloinkin D-konfiguraatiossa (vastaa R,S,-nomenk1atuurin (S)-konfiguraatiota).

Keksinnön kohteena on siten yhtenäisen ja siten puhtaaksi katsottavan, epidermiiniksi kutsutun tuotteen valmistusmenetelmä.

.! Staphylococcus epidermidis DSM 3095 tuottajaa kasvatetaan i0 82073 aerobisesti 37°C:ssa rikkaalla alustalla, jonka koostumus on 2 - 4 % lihauutetta, 1 - 3 % ma 1la suutetta ja 0,25 -1 % kalsiumkarbonaattia tai 0,25 - 0,5 % kalsiumhydroksidia. (Prosenttiluvut tarkoittavat tässä ja aina myöhemminkin painoprosentteja, ellei toisin ole mainittu.) Suurin antibioottiaktiivisuus saavutetaan 1Θ - 23 tunnin kuluttua.

Antibiootin rikä stamis tutkimukset suoritettiin esimerkiksi 10 litran fermenttorista saadulla viljelmäsuodoksella, jolloin yksittäisten vaiheiden tehokkuus tutkittiin malja-diffuusiotestillä. Aktiiviset komponentit voitiin rikastaa uuttamalla n-butanolilla viljelmäsuodos, josta solut ja kalkki oli poistettu, n-butanoliuutto onnistui kuitenkin vain viljelmäsuodoksen luonnonmukaisessa loppu-pH-arvossa 8,0. Jatkopuhdistus voitiin suorittaa erottamalla mukana seuraajat lipidiaineet eetterisaostuksen avulla. Tätä varten butanoliuute haihdutettiin, jäännös liuotettiin metanoliin ja mukaan sekoitettiin viisinkertainen määrä kylmää dietyylieetteriä. Aktiivisuus jäi tällöin kokonaan sakkaan (kuvion 9 kaavio).

Erityisen sopiva rikastamismenetelmä on myös sentrifugoidun : viljelmäsuodoksen adsorbointi akryyliesteripohjäiseen : Amberlite XAD-8 tai tämän kanssa lähisukuiseen polymeeriin · (Serva). Epidermiini ei tällöin kiinnity hartsiin yksin kertaisen adsorption kautta vaan vapaiden akryylihappo-ryhmittymien kationinvaihtovaikutuksen kautta. Tätä tukee se seikka, että aktiivinen komponentti voitiin irroittaa hartsista vain eluoimalla metanoli/väkevällä suolahapolla (99:1).. Vahvasti hapan eluaatti on neutraloitava ammoniakilla ennen haihduttamista tyhjössä. Myöhempi saostaminen metanoli/ eetteristä voitiin jättää tämän jatkokäsittelyn jälkeen pois adsorboimalla Amberlite XAD-8-hartsiin.

^ Epidermiinin eristäminen adsorboimalla voidaan suorittaa myös jo mikro-organismin kasvattamisen aikana suoraan il 82073 viljelyliuoksessa.

Stabii1isuuste stit ja kromatograafiset tutkimukset suoritettiin lyo fi1isoidu1la butanoliuutteella. Tuotteen inku-bointi eri pH-arvoisten vesiliuosten kanssa pienensi pH-arvosta 10 lähtien voimakKaasti aktiivisuutta, mutta antibiootti on kuitenkin stabiili pH-alueella 2-7.

Haihdutetun butanoliuutteen ohutlevykromatogrammeissa oli lukuisia eri suihkutusreagensseilla värjääntyviä yhdisteitä. Näiden rinnalla antoivat suoritetut bioauto-grammit tärkeitä viitteitä uuden tehoaineen luonteesta. Happamissa ja lähes kaikissa neutraaleissa järjestelmissä jää antibiootti voimakkaasti alkukohtaan piihappogeelillä 60 ohutlevykromatografiassa, kun taas kromatografia alkali-silla ajoaineilla antoi Rp-arvoja välillä 0,3 ja 0,75. Bioautografiän ja ohutlevykromatografiän yhdistelmä aikalisissä järjestelmissä korreloi yhdisteen kanssa, joka voitiin värjätä ninhydriinillä.

Näiden esikokeiden tuloksena voitiin vahvistaa, että kyseessä oleva antibiootti on vahvasti emäksinen peptidi, *: mikä esti jatkokäsittelyn py1väskromatograafisesti piihappo geelillä 60, koska sitä ei voitu eluoida pylväästä happamilla tai neutraaleilla järjestelmillä.

Amberlite XAD-eluaatin tai butanoliuutteen, josta lipidit on poistettu, kromatografia Sephadex LH-20 hartsilla metanoli/etikkahapolla (95:5) erotti suuren joukon pieniä peptidejä, aminohappoja ja suoloja antibiootin mediumista (kuvion 9 kaavio).

Seuraavissa Craig'in monistavissa vastavirtauutoissa voitiin käyttää hyödyksi kokemuksia, jotka saatiin anti-; biootin uutossa vi1jelmäsuodoksesta. Antibiootti jäi alkuun ensimmäisessä neste-neste-uutossa n-butanoli/ etikkahappo/0,1 N etikkahappo (3:1:3) järjestelmällä.

12 82073

Toisessa Craig'in uutossa neutraalilla 2-butano 1i/0,05 N ammoniumasetaatti (1:1) järjestelmällä löytyi antibiootti laitteen keskiosasta. Ammoniumasetaatti voitiin jälleen poistaa lyofilisoimalla suur tyhjössä.

Pakkaskuivauksen jälkeen epidermiini saatiin kaikissa käytetyissä ohutlevyjärjestelmissä yhtenäisenä jauheena.

Eurooppalaisen patenttihakemuksen 0 027 710 menetelmän mukaisessa puhdistuksessa käytettiin pakastus-sulatus-uuttoa, uuttoaineen haihdutusta, ultrasuodatusta, ammoniumsulfaat-tisaostusta, ioninvaihtokromatografia a ja geelisuodatusta Sephadex G-50 tai G - 2 5 tai G -15 hartsilla tai Biogel P2 geelillä, kun taas keksinnön mukaisessa puhdistuksessa päästään yhtenäiseen puhtaaseen tuotteeseen adsorboimalla sentrifugoitu vi 1 jelmäsuodos Amberlite XAD-8 hartsiin, sen jälkeen geelikromatografoimalla Sephadex LH-20 geelillä ja tämän jälkeen suorittamalla kaksi kertaa Craig'in vastavirtauutto. Edellä mainitun eurooppalaisen patenttihakemuksen menetelmän ja keksinnön mukaisen menetelmän eristäminen ja puhdistaminen ovat siten täysin erilaisia.

Edellä mainitun patenttijulkaisun EP-A-0.027.710 mukaiseen tunnettuun menetelmään verrattuna erona on edelleen rikkaan ravintoliuoksen valinta. Kun tunnettu Brain Heart Infusion : (37 g BHI/1) tuotti vain hyvin vähäisiä antibioot tisaantoja, erittäin hyviä tuloksia saatiin keksinnön mukaisella ravintoliuoksella, joka sisälsi 2 - 4 ?ί li ha uutetta, 1-3/¾ sokeria tai sokerialkoholia, kuten mallasuutetta, maltoosia, galaktoosia, laktoosia, manniittia, glukoosia, glyseriiniä ja 0,25 - 1 % kaisiumkarbonaattia tai 0,25 -0,5 % kalsiumhydroksidia. Paras tuotto saatiin ravinto-liuoksella, jolla oli seuraava koostumus: 3 % lihauutetta, 2 % mallasuutetta ja 0,37 % kalsiumhydroksidia. Kaikista *· hiililähteistä paras tuotto oli maltoosilla mallasuutteen * jälkeen. Glukoosia voitiin käyttää vain muiden hiililähteiden i3 82073 yhteydessä. Myös laktoosin ja maltoosin tai galaktoosin ja maltoosin yhdistelmä antoi hyviä tuloksia. Kaikilla muilla tavanomaisilla hii1i1 ähtei11ä ei saatu mitään tai vain hyvin alhainen tuotto. Kaikkien 20 aminohapon lisäys typpilähteenä kulloinkin 2 g/1 konsentraatiossa antoi samat tulokset kuin lihauute. Casamidoacid (Difco) sopii typpilähteeksi vain lisättäessä tryptofaania (1-2 mM) ja vitamiineja. Vitamiineiksi sopivat (parhaana pidetyt konsentraatiot): biotiini (0,006 mg/1), nikotiinihappo (2,3 mg/1), tiamiini (1,0 mg/1), pyridoksiini .HC1 (12,0 mg/1), kalsiumpantotenaatti (1,2 mg/1).

Fermentointi tapahtui ilmastamalla hyvin lämpötiloissa välillä 34 ja 37°C, Paras tuoton kehittyminen saadaan, kun fermentaation pH-arvo 6,0 - 7,0. Mitään tuottoa ei tapahdu, jos kahdenarvoisten kationien karbonaatteja tai hydroksideja, kuten kalsiumkarbonaattia tai kalsium-hydroksidia ei ole mukana. Esimerkiksi kalsiumkarbonaatin lisäämisen jälkeen pH-arvo muuttuu tunnusomaisesti laskien happamelle alueelle, jolloin mitään tuottoa ei tapahdu.

Kun pH-arvo sen jälkeen nostetaan heikosti alkaliselle alueelle, tuotto alkaa. Kalsiumkarbonaatin asemesta voidaan käyttää myös magnesiumkarbonaattia. Kalsiumhydroksidilla ' : saatiin parempia tuloksia kuin kalsiumkarbonaatilla.

50 mM kalsiumhydroksidilla voitiin tuottoa vielä hieman parantaa verrattuna 25 mM kalsiumkarbonaattiin. Kun kanta käyttää hiililähteitä (sokeria), se muodostaa orgaanisia happoja, jotka kahdenarvoiset kationit kompleksoivat, jolloin samanaikaisesti tapahtuu alustan puskuroitumisen häviämistä.

Kuviossa 10 on annettu tulokset elävien organismien määrän :. kehittymisestä ja antibiootin tuoton kehittymisestä ilmoi- tettuna estovyöhykkeen mm:nä Micrococcus luteus ATCC .1 9341 kantaa vastaan. Keksinnön mukaisia alustoja on verrattu V. edellä mainitun eurooppalaisen patenttijulkaisun Brain 14 82073

Heart Infusion alustaan (Difco).

Kaiibrointisuoran avulla saadaan levydi f fuusiotestissä seuraajassa annetut aktiviisuuden kasvut tuoton maksimin ajankohtaan asti.

Brain Heart Infusion ravintoliuoksen aktiivisuudeksi otettiin 10U %.

a) Brain Heart infusion Agar 100 % b) 3 % Lihauute, 2 ·ό mallasuute, 25 mM ka 1siumkarbonaa11i 200 % c) 3 % Lihauute, 2 % mallasuute, 50 mM kalsiumhydroksidi 320 % Nämä tulokset eivät ole mitään absoluuttisia tuottoarvoja. Levydiffuusiotestin avulla vertaamalla saadut arvot osoittavat kuitenkin yksiselitteisesti, että toimimalla keksinnön mukaisella tavalla voitiin saantoja merkittävästi parantaa verrattuna tunnettuun tapaan.

Epidermiinin valmistamiseksi käytetty kanta karakterisoidaan seuraavasti Schleifer & Kloos'in mukaisesti (Int. J.

: Syst. Bact. 2_5, 50-61 (1975 ): ‘ Gram-värjäys : positiivinen

Solujen koko : Läpimitta 0,5-0,8 um

Pesäkkeiden koko : n. 1 mm läpimitta

Pesäkkeiden ulkomuoto : Sileä, kiiltävä, keskeltä hieman koholla

Pesäkkeiden väri : harmahtava - valkoinen

Solut viljelmässä : Usein yksittäisiä soluja tai kahden ryhmiä, harvoin - suurempia parvia

Hemolyysi : Merimaljoille sivellyillä ^ viljelmillä esiintyy voi makasta hemolyysiä

II

82073

Anaerobinen kasvu : Kanta kasvaa myös anaero bisissa olosuhteissa

Lysotsyymi herkkyys : Solut ovat lysotsyymille resistenttejä 2 mg/ml asti

Lysostafiini-herkkyys : Solut ovat lysostafiinille herkkiä jo 20 ug/ml konsentraa-tiossa

Epidermiini-resistenttiys : osoitettavissa 1 mg/ml asti

Muut resis ten111ydet : Nesteviljelmässä kannalla on selvä resistenttiys streptomysiiniä (1 mg/ml asti) ja spektrinomysiiniä (0,5 mg/ml) vastaan

Suurempi NaCl-pitoisuu : Kanta kasvaa vielä hyvin aina 15-painopro s en11iseen natriumkloridiin asti.

Pesäkkeet tai sivellyt viljelmät ovat erittäin liimamaisia.

Eri hiililähteet arvioitiin haponmuodostuksen avulla ja muut entsyymireakt lot määritettiin Api - S taph-j är j es te lmän (Biomerieux, Niirtingen) avulla.

iämä järjestelmä perustuu 20 biokemiallisen reaktion yhdistelmään. Nämä reaktiot voidaan johtaa Kloos &

Schleifer'in luokitteluun ( J . Clin. Microbiol. 1^, 82-Θ8 ( 1975)) .

i6 82073

Taulukko I: C-lähteen arviointi ja muut entsyymireaktiot

Tuot- Staph, epid. Staph.epid.

C-lähde tai entsyymi taja _ _ _____Kloos&Schleifer Api - Staph

Kontrolli D-glukoosi + k.A. + D-fruktoosi + + · + D-mannoosi (+) (+) +

Maltoosi + + +

Laktoosi ( + ) + O-trenaloosi D-mannitoli “

Ksylitoli D-melibioosi ~ k.A.

Raffinoosi ~ k.A.

D-ksyloosi -

Sakkaroosi + + + a-metyyliglukosidi. · k.A.

N-asetyyliglukosamiini - k.A. . +

Nitraatin pelkistys + + + ► ' Fosfataasi + + +

Asetyylimetyylikarbinolin + k.A. + muodostuminen (Voges-" Proskauer-reaktio)

Arg ini inidehy drolaas i - k.A. +

Ureaasi + k. A. +, + positiivinen reaktio negatiivinen reaktio : (+) selvä positiivinen reaktio tapahtuu vasta myöhemmin + vaihteleva ominaisuus K.A. ei tulosta i7 82073

Staphylococcus epidermidis DSM 3095 kanta si 1rroste11iin vinopintaputkiin, jonka alustan koostumus oli

Peptoni 1q g

Dinatriumvetyfosfaattι 2 g

Lihauute 8 g

Glukoosi Gi0g (autoklavoidaan erikseen)

Keittosuola 3 g PH 7,2 inkuboitiin yön yli 37°C:ssa ja sen jälkeen pakastettiin -20°C:ssa. Uusia koe-eriä varten sulatettiin aina uusi putki, sillä aktiivisuustappioita havaittiin säilytettäessä pidempään 4°C:ssa.

Seuraavassa on kuvattu tarkemmin epidermiini-antibiootin valmistusta :

Fermentaatio voidaan suorittaa tähän sopivissa raviste-lupulloissa. Suurempien ainemäärien valmistamiseksi voidaan myös käyttää 20U 1 tai suurempaa fermenttoria.

Pullokokeissa käytettiin sivuputkella varustettuja 500 ml E r le nmey e r-p u 11 o j a . Pullot täytettiin 100 mlrlla ravinto- ' liuosta ja autoklavoitiin 20 minuuttia 121°C:ssa. Siir- ·"; rosteena käytettiin 1 ?ί 4 tunnin vanhaa esi viljelmää.

Inkubointi suoritettiin 37°C:ssa pyörivässä ravistelijassa nopeudella 140 kierr./min.

10 litran fermentointia varten fermenttor iin, jonka hyö-tytilavuus oli 10 1 (malli MF-14 New Brunswick, Scientific Co., New Brunswick, USA) täytettiin 9,9 litralla ravin-toliuosta ja autoklavoitiin 30 minuuttia 134°C:ssa. Jääh-··' dyttämisen jälkeen siirrostettiin 100 mlrlla 4 tunnin vanhaa esiviljelmää ja fermentoitiin 37°C:ssa, ilmastus 0,6 vvm ja le vysekoi ttimen nopeus 240 kierr./min. Suhteel- ie 82073 lisen voimakas vaahdon muodostus estettiin lisäämällä toistuvasti steriiliä polyolia.

2 5 litran mitassa fermentointi suoritettiin 25 litran fermenttorissa (tyyppi b 25, Braun/Mlsungen, jossa Umwurf-sekoitusjärjestelmä) käyttämällä 25 1 ravintoliuosta, johon oli lisätty 3 ml polyolia, ja steriloitiin in situ 30 minuuttia 121°C:ssa. biirrosteena käytettiin 300 ml 4 tunnin vanhaa esiviljelmää. Fermentointi suoritettiin 37°C:ssa, ilmastus 0,6 vvm ja sekoitusnopeus 1000 kierr./min.

Kuviossa 11 on esitetty fermentaation kulku 10 litran mitassa ravintoliuoksessa, joka sisälsi 30 g lihauutetta, 20 q mallasuutetta ja 5 g kalsiumkarbonaattia 1 litrassa. pH-arvon laskusta voidaan havaita voimakas kasvu, johon liittyy käytetyn hiililähteen kuluminen ja hapon muodostuminen. Antibiootti voidaan osoittaa viljelmäsuodoksesta ai ka 1isoinnin alussa. Tuotto saavuttaa maksiminsa 12-18 tunnin kuluttua.

Fermentaation kulun kontrolloimiseksi otettiin steriilistä näytteet fermentaation eri aikoina. Näytteet tutkittiin seuraavasti : ' a) pH-arvo:

Mittaus pH-laboratoriomittari11a (Knick pH-mV-mittari) b ) Kasvun kulku:

Kasvua voitiin seurata elävien organismien määrän lisääntymisen avulla.

Tätä varten laimennettiin 0,5 ml steriilisti otettua viljelmää suolaliuokseen ja tästä maljattiin 0,1 ml maljoille (alusta: peptoni 10 g, lihauute 8 g, keittosuola 3 g, : dinatriumvetyfosfa a11i 2 q, glukoosi 10 g 1 1 kohti).

*. Inkuboitiin 18 tuntia 37°Cjssa, minkä jälkeen yksittäis- *. pesäkkeet laskettiin.

li 82073 c) Antibiootin konsentraatio: Näytteitä sentrifugoitiin 2 minuuttia Eppendorf 3200 sentrifuugissa ja 20 ui supernatanttia testattiin malja-diffuusiotestissä.

Rinnalla määritettiin kalibrointikäyrä käyttämällä tunnettuja konsentraatioita.

Tuoton maksimin saavuttamisen jälkeen kasvatusneste sentri-fugoitiin jatkuvatoimisen sentrifuugin (sentrifuugi: tyyppi LA 71b-4, Loher & Söhne, Ruhstorf/Rott) nopeudella 1380 kierr./min. Solujen optimaalista erottamista varten täytyi läpivirtausnopeus pitää erittäin alhaisena. Aktiivinen komponentti rikastettiin sivulla 10 esitetyllä adsorptiolla Amberlite XAD-8 hartsiin seuraavan esimerkin 1 mukaisesti:

Esimerkki 1 80 litraa viljeimäsuodosta johdettiin noin 8 litran läpi Amberlite XAD-8 hartsia. Läpivirtauksessa ei voitu havaita mitään aktiivisuutta. Aktiivisuutta ei myöskään eluoitunut seuraajassa vesipesussa. Tämän jälkeen pestiin 13 litralla metanolia. Pesuvedestä ei voitu havaita mitään aktiivisuutta. Eluointi suoritettiin metano1i/suolahapolla 99:1, jolloin saatiin seuraavat jakeet:

Jae 1: 0,8 1 aktiivinen : Jae 2: 4,5 1 pääaktiivisuus :: Jae 3:2 1 aktiivinen

Jae 4:2 1 ei aktiivisuutta

Jae 5:1 1 ei aktiivisuutta

Jakeista testattiin epidermiinipitoisuus ohutlevykroma-" tograafisesti, minkä jälkeen aktiiviset jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin pyöröhaihduttimessa kuiviin (81,2 g).

! 1 Jäännös otettiin metanoli/etikkahappoon (95/5) (400 ml), liukenemattomat ainekset erotettiin sentrifugoima1la « 20 82073 ja geelikromatografoiti in 50 ml erissä Sephadex LH-20 hartsilla (pylväs 100x5 cm, ajoaine metano1i/etikkahappo 95:5). Positiiviset jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin (14,8 q).

Craig'in monistavassa uutossa käytettiin Labortec-yhtiön (Basel) laitteita. Ensimmäinen erottaminen suoritettiin 50 ml:n laitteella n-butanoii/etikkahappoesteri/0,1 M etikkahappo (3/1/3) järjestelmässä. Alafaasiin (100 ml) liuennut näyte (5 g) erotettiin seuraavissa olosuhteissa:

Vaiheiden määrä: 160

Ravisteluliikkeet/vaihe: 70

Ravistelun voimakkuus: 45

Erotusaika: 20 min.

Loppupuhdistusta varten saatu puhdistamaton tuote (4,2 g) liuotettiin 2 g:n erinä 2-butanoii/0,05 N ammoniumasetaatti (50 ml) järjestelmän alafaasiin ja puhdistettiin 10 ml:n laitteessa, jossa oli 440 elementtiä.

Vaiheiden määrä: 440

Ra v i s t e 1 u 1 i ik ke e t / va ihe : 50

Ravistelun voimakkuus: 50 ! Erotusaika: 10 min.

: Epidermiinia sisältävät elementit yhdistettiin, haihdu tettiin, otettiin veteen ja lyo fi1isoitiin useita kertoja suurtyhjössä. Antibiootti (2,6 g) osoittautui yhtenäiseksi kaikissa suoritetuissa tutkimuksisa.

Epidermiinin valmistamisen ja eristämisen aikana käytettiin biologiseen karakterisoitiin ma 1jadiffuusiotestiä, so. vaikutusspektrin ottamiseen sekä tuoton, jatkokäsittelyn . ja rikastamisen kontrolloimiseen. Testi suoritettiin teoksessa: Zähner ja Maas, Biology of antibiotics (Springer 21 82073

Verlag, Berlin-Heidelberg-New TYork, 1972), Greiner-yhtiön, Niirtingen, petrimaljoilla, jotka oli varustettu halkaisijaltaan 6 mm suodatinkiekoilla (Macherey & Nagel, Diiren). Suodatinkiekot kostutettiin 20 ui :11a kyseistä testattavaa nestettä, kuivattiin huoneen lämpötilassa lasilevyn päällä ja laitettiin te stima1joi1le. Testimaljoja inkuboitiin 37°C:ssa ja kasvun estyminen luettiin noin 16 tunnin kuluttua.

Rutiininomaisena testiorganismina oli Streptococcus pyogenes ATCC 8668 ja ongelmattoman käsittelynsä vuoksi Micrococcus luteus ATCC 9341.

Testimaljat, joissa Streptococcus pyogenes ATCC 8668: Testiorganismi oli siirrostettava juuri ennen testimaljojen valmistusta musiiniu sisältäville venmaljoille /alusta: 500 ml Agar pH 7,4, 160 ml musiiniliuos (10 paino-fo) , 3,5 ml glukoosiliuos (50 paino-%), 70 ml oinaanveri/. Inkuboitiin 15-18 tuntia 37°C:ssa ja sen jälkeen valmistettiin suo la 1iuossuspensio (E 0,5) ja tätä suspensiota pipetoitiin 1 ml 100 ml:aan ravintoalustaa (alusta: peptoni 10 g, lihauute 8 g, keittosuola 3 g, Na^HPO^ 2 g, glukoosi ·' 10 g 1 l:ssa, pH 7,2). 10 ml:n erinä valetut maljat säilyivät muutaman päivän 4°C:ssa.

" Testimaljat, joissa Micrococcus luteus ATCC 9341: :: Yön yli vanha viljelmä (alusta: peptoni 10 g, lihauute 8 g, keittosuola 3 g, Na^HPO^ 2 g, glukoosi 10 g 1 l:ssa, pH 7,2) laimennettiin 1,0 ekstinktioon aallonpituudella 578 nm. 100 ml:aan agaria laitettiin 0,25 ml tätä suspensiota ja valettiin 10 ml:n maljoiksi. Testimaljoja voitiin säilyttää useita päivää 4°C:ssa.

Testimaljat vaikutusspektriä varten: :* Testimaljat, joissa bakteereita: 22 82073 a) Aerobisesti elävät bakteerit:

Von vanhoja viljelmiä kasvatettiin kyseisissä testialustoissa ja maljat valmistettiin samalla tavoin kuin Micrococcus luteus ATCC 9341 maljat.

β ) Anaerobisesti elävät bakteerit:

Clostridium pasteurianum ATCC 6013 ja Propinibacterium acnes DSM 1897 kantojen esiviljelmiä kasvatettiin reagenssi-laseissa, jotka hapen syrjäyttämiseksi oli täytetty ravinto-liuoksella vanutulppiin asti. 3 ml:lla esiviljelmää siirros-tettiin 100 ml agaria ja valettiin maljoiksi 10 ml erinä. Inkubointi suoritettiin anaerobiastiassa (BBL-Gas Pak 100, Becton, Dickinson GmbH, Heidelberg) kulloinkin optimaalisessa lämpötilassa.

Testimaljat, joissa hiivamaisesti kasvavia sieniä:

Soluja kasvatettiin ravisteluviljelmässä 18-20 tuntia kulloinkin käytetyssä testialustassa. Thoma-laskentakammiossa suoritetun laskemisen jälkeen testimaljat siirrostettiin tiheyteen 10^ organιsm ia/ml agaria.

Testimaljat, joessa sieniä ja streptomyseettejä : Testiorgamsmeja kasvatettiin vinopintaputkilla (alusta: hiivauute 4 g, maJJasuute 10 g, glukoosi 4 g 1 1:s s a ) vastaavissa lämpötiloissa itiöitymiseen asti. Itiöt lietet-tiin 3 ml:aan suolaliuos-Tween 80 seosta (1 pisara Tween : 80 ja 100 ml suolaliuosta) ja kaadettiin testimaljoille.

Epidermiinillä on erittäin hyvä bakteereidenvastainen tehokkuus; se vaikuttaa erityisen hyvin monia gramposi-tiivisia bakteereita vastaan. Epidermiinin antibakteerista vaikutusta verrattiin nisiinin vaikutukseen (nisiini vrt. mm. DE-A-2 000 818 tai GB-B-1 182 156); eräillä tärkeillä, kliinisesti relevanteilla organismeilla vertailuun otettiin mukaan myös fusidiinihappo. Teho määritettiin ma 1jadif fuusiote stin avulla ja määrittämällä pienin esto- 11 konsentraatio.

23 82073 a) Maijadiffuusiotesti:

Maljadiffuusiotestissä testattiin eri mikro-organismien herkkyys epidermiiniä ja nisiiniä vastaan. Taulukko 2 osoittaa, että molemmat antibiootit vaikuttavat lähes yksinomaan grampositiivisiin bakteereihin. Nisiiniä käytettiin 40000 yksikön aktiivisuudessa.

« 24 82073

Taulukko 2; Herkkyys epidermiinia ja nisiiniä vastaan Luvut estovyohykkeen mm, konsentraatio 1 mg/ml ja 0,5 mg/ml . . .. u , , ,, , Epidermiini Nisiini

Mikro-organism.it Kasvatusolosuhteet r Lämp. Alusta 1 0,5 1 0,5

Bakteerit

Eubacteriales,_grampositiiviset

Arthrobacter aurescens 27°C 5 8 Sp ' 9 8

Arthrobacter crystallopoietes 27°C 5 16 i5 16 15

Arthrobacter globiformis 27°C 5 14 12 14 13

Arthrobacter oxydans 27°C .5 12 11 11 10

Arthrobacter pascens 27°C 5 13 12 14 13

Bacillus cereus 37°C 3 8 Sp

Bacillus pumilus 37°C 4 14 12 12 10

Bacillus subtilis ATCC 6051 37°C 4 12 11 9 8

Bacillus subtilis ATCC 6051 37°C 6 17 16 14 li

Bacillus subtilis ATCC 6633· 37°C 4 14 11 9 8

Bacillus subtilis F 24-2 37°C 4 13 11 8 Sp : Bacillus subtilis A 14 37°C 4 12 10 9 Sp ·; Brevibacterium flavum 37eC 4 11 10. 8 7

Clostridium pasteurianum 30°C. 7 17 15 14 13 :. Clostridium sporogenes 37°C 8 10 9 8 Sp

Corynebacterium spec. 27°C 4 15 13 9 8

Corynebacterium insidiosum 27eC 4 19 17 10 8

Corynebacterium rathayi 27eC 4 14 12 10 9

Micrococcus luteus ATCC 381 27eC 5 10 9

Micrococcus luteus ATCC 9341 2-7eC 2 21 20 17 16

Propionibacterium acnes 17eC 8 22 19 21 18

Sareina lutea 37°C 5 15 14 15 14

Staphylococcus aureus Tu 202 37°C .4 13 10 10 9 . a I · 25 82073

Staphylococcus aureus DSM 683 37°C 4 11 9 Sp -

Staphylococcus aureus Pen.res 37°C 4 12 11 9 8

Staphylococcus cohnii 37°C 2 14 12 9 -

Streptococcus pyogenes 37°C 2 22 20 18 17

Eubacteriales, gramnegatid'viset

Proteus mirabilis 37°C 4 11 9· 9 7

Proteus vulgaris 37°C · 5 9. 8. 8 Sp

Actinomycetales :

Streptomyces glaucescens 27eC 3 10 8 . 10 9

Streptomyces violaceoruber 37°C 3 98--

Streptomyces virido- 37°C 3 11 10 98 chromogenes (-) merkitsee, että vaikutusta ei ollut;

Sp = hieman ': b) Pienin estokonsentraatio: ·. Kliinisesti relevanteille organismeille tutkittiin pienin I estokonsentraatio }jg/ml:na mikrotiitterilevyllä seuraavassa * alustassa : 5 ml Na-laktaatti, 5 g Na2S0^, 0,5 g KH P0^, 0,1 g MgCl2, 5 g NH^Cl, 10 g glukoosi, 50 /jg kalsiumpantotenaatti, 50 /ug tiamiini, 0,25 yug foolihappo, 5 yug niasiini, 25 jjg p-aminobentsoehappo, 50 /jg pyridoksiini-hydrokloridi, *. 25 /jg ribof laviini, 1000 ml Aqua dest.

- ·

Taulukossa 3 on esitetty vertailuna epidermiinin, nisiinin ja fusidiinihapon pienimmät es tokonsent ra a t io t (jjg/ml).

Tällöin käytetyn nisiinin aktiivisuus oli 2500 yksikkö.

• · I · > · 26 82073

Taulukko 3 :

Pienin estokonsentraatio, ;

Epidermiini Fusidilinihappo Nisiini

St. epidermidis WG 99_2_4_128

Sc. pyogenes ATCC 8668_0,125_1_4

Sc. pneumoniae AT CC 6302_2__16_32

Mc. luteus ATCC 15957_ 0,25_Q , 5_16

Mc. luteus ATCC 9341_^ 0,06_q , 5_8

Cb. xerosis NCTC 9755__0,125_0,125__16 E. coli ATCC 11775_ 128_>128_>128 E. coli ATCC 9637_128_>128_>128

Propionib. acnes PC 904_Q,Q6_q, 5_ 32

Propionib. acnes ATCC. 25746 0/25 1 64

Seuraavassa on kuvattu taulukossa 2 annettuja alustoja.

·. pH-arvon säätämisen jälkeen alustoja autoklavoitiin 20 *. minuuttia 121°C:ssa.

’ Annetut määrät koskevat 1 1 vettä. Kemiallisesti määri- • tellyissä alustoissa käytettiin demineralisoitua vettä.

Alusta : (2) Glukoosi-agar-alusta:

Peptoni 10 g ”, Lihauute 8 g l' NaC 1 3 g

Na2HP04 2 g

Glukoosi 10 g (autoklavoitiin erikseen) J Agar 20 g pH 7,2 • » t 27 82073 (3) Hiiva-m allas-alusta:

Hiivauute A g

Mallasuute 10 g

Glukoosi A g

Agar 20 g pH 7,3 (A) Oxoid-alusta bakteereille: L ihauute 10 g

Peptoni 10 g N a C1 3 g

Agar 20 g pH 7,2 (3) Ravintoliemi 8 g (Di fco )

Agar 20 g pH 7,2 (6) Minirnialusta bakteereille (HUTTER et ai., 1966): D-glukoosi 8g di-ammoniumtartraatti A g

NaCl 5 g k2hp°a 2 g • : MgSO^ x 7 H20 1 g

CaC12 0,2 g *: MnS04 x H20 0,01 g

Ferrioksamiini Θ 0,02 g

Agar 20 g pH 7,2 • 1 I * 28 8 2 0 7 3 (7) · Alusta Clostridium pasteurianumille: L ihauute 3 g

Hiivauute 3g

Mallasuute 3g

Peptoni 20 g D-glukoosi 5 g

Askorbiinihappo 0,2 g

Agar 20 g pH 7,0 (8) Panimo-tiog1ykolaattialusta Propionibacterium acnesille:

Tioglykolaattlalusta AO,5 g

Agar 20 g pH 7,2

Epidermiinin siedettävyys on erittäin hyvä. Tooppisessa käytössä ei voitu todeta mitään toksisia vaikutuksia.

Erittäin suuri etu on, että resistentillä Staphylococcus epidermidis DSM 3U95 mutantilla on resistenttiys tuottamaansa epidermiiniin nähden. NCIB 11536 kannalla ei ole mitään tällaista resistenttιyttä sen tuottamaa pienimolekyylistä antibioottia vastaan.

1 Uusi klooni DSM 3095 saatiin seuraavasti: : Adaptointi suoritettiin 100 ml:n Erlenmeyer-pulloissa, jotka oli varustettu sivuputkella ja joissa oli 10 ml ravintoliuosta (Brain Heart Infusion). Lähtöviljelmä siirros-tettiin 0,5 ml.-lla 12 tunnin vanhaa viljelmää. Pulloissa, jotka sisälsivät kasvavia epidermiini-konsentraatioita, ·**. käytettiin siinosteena 0,5 ml kulloinkin annettua, hyvin - - kasvavaa viljelmää. Kasvun arviointi suoritettiin fotomet- .. risesti aallonpituudella 578 nm. Viljelmä, joka oli vielä kasvanut hyvin nesteviljelmässä epidermiinin 1,0 mg/ml konsentraatiossa, laimennettiin suolaliuoksella ja maljattiin ·. maljalle, johon oli laitettu 0,5 mg/ml epidermiiniä. Vertai- 2» 82073 luarvona maljattiin kirjallisuudesta tunnetun NCIB 11536 vertailu kannan laimentamatoh, 12 tuntia vanha viljelmä. 37°C:ssa suoritetun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen oli ID'6 laimennetussa adaptoidussa viljelmässä 94 yksittäis-pesäkettä. Laimentamaton, 0,15 mg/ml epidermiiniä sisältäville maljoille maljattu vertai1ukanta ei kasvanut 48 tunnin inkuboinnin jälkeen. Resistenttipesäkkeet selektoitiin ja rasterisiveltiin alustan 2 maljoille. Tuotto esitestate iin i poistamalla halkaisijaltaan 5 mm palat ja testaamalla aktiivisuus Micrococcus luteus ATCC 9341 kannalla, minkä jälkeen tuottava klooni testattiin ne stea1 usta 11 a .

Resistentin kannan vertailu kirjallisuudesta tunnettuun kantaan: a. ) Pienin estokonsentraatio ma 1jadif fuusiotestissä^

Kummallakin kannalla tendyistä testimaljöistä saatiin taulukossa 4 annetut pienimmät estokonsentraatiot.

Taulukko 4: Epider (niinin pienin estokonsentraatio malja-dif fuusiotestissä NCIB 11536 ja D5M 3095 *· kannoilla.

Kanta ^jg/ml NCIB 11536 10 DSM 3095 > 1000 b. ) Kasvu ja tuotto: ‘‘ Kasvun ja tuoton kehittymistä kummallakin kannalla verrattiin ] ' ravintoalustassa ( 3 % lihauutetta, 2% mallasuutetta, 0,37%

Ca(0H) ). Kts. kuvio 12.

30 82073

Kasvun kehittyminen: Elävien organismien määrän määrittäminen Tuoton kehittyminen: Aktiivisuus Mcrococcus luteu.s ATCC 9341 kantaa vastaan ma 1jadiffuusiotestissä.

Resistentillä kannalla havaitaan parempi tuotto.

c.) Herkkyys epidermiinilie eri kasvuvaiheissa:

Kokeet, joissa tutkittiin tuottajakannan omaa estymistä antibiootin vaikutuksesta j? selektoidun kloonin resis-tenttiyttä, suoritettiin biophotometer-laitteessa (Eppendorf-fotometri, jossa kierrätysautomaatti ) .

Nämä kokeet voidaan suorittaa yksityiskohtaisemmin esimerkiksi seuraavasti :

Tuoreelle alustalle sii rrostettiin kulloinkin 0,5 ml 12 tuntia vanhaa Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 kannan tai selektoidun resistentin DMS 3095 kannan viljelmää.

Näiden viljelmien annettiin kasvaa 0,043 ekstinktioon asti aallonpituudella 578 nm (kyvetit, joiden kerrospaksuus : 1 cm), minkä jälkeen ne jaettiin 7,5 ml:n erinä Biophoto- • meter-1 ai11een kyvetteihin (kerrospaksuus 2 cm).

Solususpension tiheys säädettiin Biophotometer-laitteessa 90% transmissioon. Inkubointi suoritettiin 37°C:ssa ja ilmastamalla maksirnaal isesti. Epidermiiniä lisättiin vesi- liuoksena eri kasvuvaiheisiin.

Kumpaakin kantaa käytettäessä lisättiin logaritmisen faasin alkuun ja keskiosaan eri konsentraatioita epidermiiniä. Tulokset on annettu kuvioissa 13 ja 14.

Viimeksi testatuilla konsentraatioi11a ei voitu havaita mitään lyysautumistä resistentillä kannalla.

5i 82073

Keksinnön mukaisella epidermiini-antibiootilla, kuten myös viljelyliuoksella, josta se eristettiin, on bakte-nsidinen vaikutus, joka aiheuttaa solujen lyysaantumisen.

Bakteris idisen vaikutuksen ja grampositiiv1 s ia bakteereita vastaan kohdistuvan leveän vaikutusspektrin vuoksi on keksinnön mukainen epidermiini-polypeptidi-antibiootti erityisen tehokas hoidettaessa infektioita, jotka gram-positiiviset bakteerit ovat aiheuttaneet. Epidermiini on erityisen arvokas torjuttaessa ihoinfektioita, kuten ekseemaa, märkärupea, selluliittia ja erityisesti aknea. Taulukoissa 2 ja 3 on osoitettu erittäin hyvä teho eräitä tärkeitä Propionibakterium-acnes-kantoja vastaan. Voidaan sanoa, että epidermiinillä, jota ihmisen ihon organismit normaalisti tuottavat, on parempi ihoa suojaava aktiivisuus kuin muilla tavanomaisilla antibiooteilla.

Jo mainittuja farmaseuttisia valmistemuotoja, jotka sisältävät keksinnön mukaista antibioottia yhdessä farmaseuttisesti tavanomaisten apuaineiden ja kantajien kanssa, voidaan antaa oraalisesti, parente raa 1isesti , enteraalisesti tai tooppisesti. Tällaiset valmistusmuodot voivat olla kuitenkin erityisesti tooppisia valmistemuotoja, kuten liuokset, • · emulsiot, geelit, lotionit, salvat, emulsiovoiteet tai ! puuterit.

: : Seuraavat esimerkit kuvaavat tällaisten farmaseuttisten käyttömuotojen valmistusta: 32 8 2 0 7 3

Esimerkki 2 T inktuura 100 g tinktuuraa sisältää:

Epidermiini 1,0 g

Etanoli (04,5 til.-Ä) 56,0 g 1.2- propy1eeniglyko 1i 40,0 g

Vesi, demine ra 1 isolLu 3,0 g

Valmistus :

Epidermiini liuotetaan etanoli/1,2-propyleeniglykoli/vesi-seokseen, minkä jälkeen liuos sterii1isuodatetaan.

Esimerkki 3

Liuos 100 g liuosta sisältää: *. Epidermiini 1,00 g 1.2- propy leeniglykoli-alkyylidimetyylibentsyyliammonium- ; kloridi (Benzalkon 0,15 g : Sorbitaanimonopalmi taatt i (Span 40^^ 0,40 g (O ) : Sorbimakrogolpalmi taatt i (Tu/een 40' ') 1,20 g Öljyhappododekyyliesteri (Cetiol V^^) 2,40 g Setyyli- ja stearyylialkoholin seos (Lanette 0^^) 1,60 g

Setyylipalmitaatti 0,80 g

Demineralisoitu vesi ad 100 g

Valmistus: : Edellä mainitut määrät alkyylidimetyylibentsyyliammonium-

II

33 82073 kloridia, sorb i Laanimonopalmitaatt ia , sorbimakrogol-palmitaattia, dljyhappodekyy1iesteriä, setyyli- ja stearyy-lialkoholia ja setyy1ipaImitaattia sekoitetaan 75 ml:aan vettä, tähän sekoitetaan mukaan epidermiinin suodatettu liuos 1,2-propyleeniglykolissa ja lopussa vedessä ja tinktuura homogenisoidaan.

Esimerkki 4

Geeli 10C g geeliä sisältää:

Epidermiini l,0g

Lauryylialkoholin poly- et y 1 een i gl y ko 1 lee 11 er l (Brij 25^^ 1,0 g 1,2-propy1 e enig 1yk o 11 5,0 g

Akryy1ihappopolymeri saatti

Carbopol 934 ^^) 1,2 g p-hydroksibentsoehappometyyliesteri 1,6 g p-hydroksibentsoehappopropyyliesteri 0,4 g . Parfyymi q.s.

Natriumhydroksidi ad pH 6,5

Demineralisoituvesi ad 100 g

Valmistus:

Annetut määrät apuaineita sekoitetaan 75 ml:aan vettä; epidermiini liuotetaan 1,2-propyleeniglykolin ja lopun vesimäärän seokseen ja tämä liuos sekoitetaan mukaan; valmis geeli homogenisoidaan vielä.

Kuvioiden selitykset

Kuvio 1: Epidermiinin happaman kokonaishydrolysaatin amino-. happokromatogrammi; ninhydriini-värjäys, A =570 nm.

* 34 82073

Kuvio 2: Epidermi min happaman kokona istiydro ly saa t in N- pentafluoripropionyyli-aminohappo-n-propyyliesterin Chirasil-Val-kaasukromatogrammi. Lämpötilaohjelma: 3 min. 85°C isotermi, sen jälkeen 4°C/min. -200°C asti; kantajakaasu H 2 (0,92 bar).

Kuvio 3: Epidermiinj.ii Ul/-spektri vedessä, pH 3 (C=0,15 mg/ml).

Kuvio 4: Epidermiimn infrapunaspektri kaiiumbromiditable-t i ssa.

Kuvio 5: Epidermiinin ^H-ydinresonanssispekt.ri (20 mg/0,5 ml D^-dimetyyliformamidi, 400,16 MHz).

Kuvio 6: Epidermiinin ^C-ydinresonanssispektri (40 mg/0,5 ml 12C, 2H-dimetyyliformamidi, 100,6 MHz, 45360 pulssi ) .

Kuvio 7: Epidermiinin HPLC-kromatogrammi u Bondapak C :11a la (300x3,9 mm). Liikkuva faasi: A=asetonitriili/0,01 M KH P0ft (10/90), B=asetonitriili/0,01 M KH2P0^ (70/30); lineaarinen gradientti 10% Bssta 100% . B:iin, 30 min., ajonopeus 2 ml/min.

Kuvio 8: P2-fragmentln ^^C-ydinresonanssispektri (12 mg/0,5 ml 2ll-dim e tyyli formamidi, 100,6 MHz, 38300 pulssi).

Kuvio 9: Epidermiinin eristäminen.

Kuvio 10: Alustojen vertailu elävien organismien määrän (yhtenäiset viivat) ja Micrococcus luteus kannan [ vastaisen aktiivisuuden (katkoviivat) perusteella A Brain Heart Infusion : 03% lihauute 2% mallasuute 0,25% CaCO^ #3% lihauute 2% mallasuute 0,37% Ca(0H)2 35 82073

Kuvio 11: PermenLaution kulku 10 litran mitasssa g pH:n kulku ^elävien organismien määrä 0 aktiivisuus Streptococcus pyogenes ATCC 8668 kantaa vastaan.

Kuvio 12: Kirjallisuudesta tunnetun kannan ja resistentin DSM 3095 kloonin vertailu elävien organismien määrän (yhtenäiset viivat) ja Micrococcus luteus ATCC 9341 vastaisen aktiivisuuden (katkoviivat) perusteella .

0 kirjallisuudesta tunnettu kanta X resistentti klooni

Kuvio 13: Epidermiinin lisäys Staphylococcus epidermidis NE iti .11336 kannan eri kasvuvaiheisiin: Käyrä 1: kasvun normaali kulku Käyrä 2: epidermiinin 10 /ug/ml lisäys logaritmisen vaiheen alkuun johtaa lyysautumiseen.

Käyrä 3: epidermiinin 10 yg/ml lisäys logaritmisen vaiheen keskellä johtaa myös lyysaan-tumiseen.

Käyrä 4: epidermiinin 2,5 jig/ml lisäys logaritmisen vaiheen keskellä johtaa kasvun hidastumiseen.

; Kuvio 14: Epidermiinin lisäys resistentin DSM 3095 kloonin eri kasvuvaiheisiin: Käyrä 1: kasvun normaali kulku, identtinen NCIB 11536 kannan kanssa.

Käyrä 2: epidermiinin 120 fig/ml lisäys logaritmisen ♦. vaiheen alkuun hidastaa kasvua vain vähän.

Käyrä 3: epidermiinin 360 jjg/ml lisäys logaritmisen vaiheen keskellä johtaa myös nyt vain * kasvun hidastumiseen.

36 82073

Kuvio 15: H Ι-kokonaishydroly saatin N-pentafluoripropionyyli-aminohappo-n-propyyliesterin Chirasil-Val-kaasu-kromatogrämmi. Lämpötilaohjelma : 3 min. 80°C

isotermi, sen jälkeen 4°C/min. 200°C asti, kan- tajkaasu H ^ .

Il

Claims (2)

37 82073

1. Luonne: väritön jauhe;

2. Liukoisuus: liukenee erittäin hyvin vesi/jääetikka- tai metanoli/jääetikka-seoksiin, liukenee alempiin alkoho-leihin, ei liukene kloroformiin, asetoniin, dietyyli-eetteriin, petrolieetteriin;

3. Värireaktiot piihappogee1i1evyi11ä: ninhydriini, kloori/TDM (TDM = 4,4'-bis-(dimetyy1iamino)difenyy1i-metaani), orsiini/rikkihappo, anisaldehydi/rikkihappo. Piihappogeelivalmislevyjä 60 F254 (Merck). Systeemi A: k 1 oroformi/metano 1 i/179s ammoniakki (2/2/1) RF = 0,73 Systeemi B: k 1oroformi/metano1i/17¾ ammoniakki (70/35/10) RF = 0,30 Systeemi C: n-butanoli/j&äetikka/vesi (4/1/1) RF = 0,05

5. HPLC: kts. kuvio 7;

6. Stabiilisuus: stabiili pH-a1uee11 a 2-7, korkeammissa pH-arvoissa tapahtuu voimakasta aktiivisuuden laskua;

7. Moolimassa: noin 2160 (ilman anioneja);

8. Ultraviolettiabsorptiospektri: vesiliuoksessa pitkä-aaltoinen maksimi 267 nm (kuvio 3);

9. Infrapuna-absorptiospektri: Näytteen IR-spektri kalium-bromiditableteissa (kuvio 4);

10. Ydinmagneettiset resonanssispektrit 1H-NMR spektri: kuvio 5, 13C-NMR-spektri: kuvio 6, tunnettu siitä, että Staphylococcus epidermidis DSM 3095 kantaa kasvatetaan aerobisesti 34 - 37°C:ssa rikkaassa ravintoliuoksessa, joka sisältää 2 - 4 % lihauutetta, 1 - 3 % sokeria tai sokeria 1 koho 1ia, joka muodostuu mallasuut-teesta ja/tai maltoosista, ja lisäksi mahdollisesti laktoosista ja/tai ga1aktoosista ja/tai glukoosista ja/tai manniitista ja/tai g 1 yseriinistä, ja 0,25 - 1 % ka 1 siumkarbonaattia tai II 39 8 2 0 7 3 0,25 - 0,5 % ka 1 siumhydroksidia, solujen ja epäorgaanisten suolojen poistamisen jälkeen viljely liuos muodostuneen tehoaineen eristämisen jälkeen joko uutetaan n-butano1i11 a pH-arvossa 8, butanoliuute haihdutetaan, jäännös liuotetaan metanoliin ja liuoksesta poistetaan mukana seuraavat lipidi-aineet eetterisaostuksen avulla tai käsitellään akryy1iesteri-tai po1ystyreenipohjäisi 1 la polymeereillä, jolloin absorboitunut epidermiini irrotetaan hartsista metano1i/väkeväl1ä suolahapolla (99:1), minkä jälkeen liuos neutraloidaan ammoniakilla ja haihdutetaan tyhjössä, ja näin saadusta eristeestä erotetaan muut pienimolekyyliset peptidit, aminohapot ja suolat geelikro-matografoimal1 a (Sephadex LH-20 metano1i/etikkahapo11 a (95:5)) ja sen jälkeen suoritetaan Craig'in monistava vastavirtauutto, jossa tehdään ensin neste-neste-uutto n-butano1i/etikkahappo-esteri/0,1 N etikkahappo (3:1:3) järjestämällä, jossa epidermiini pysyy alussa, ja sen jälkeen epidermiini eristetään toisessa uutossa neutraalilla 2-butano1i/0,05 N ammoniumase-taatti (1:1) järjestelmällä, ja epidermiini eristetään eluaatista pakkaskuivaamalla värittömänä jauheena.

1. Menetelmä valmistaa antibioottisesti tehokasta epider-miiniksi kutsuttua polypeptidiä, jolla on seuraava aminohappokoostumus: Arn (1), Pro (1), Gly (2), Ala (2), Ile (2), Phe (2), Lys (2), Lan (2), 0-Me-Lan (1), Dhb (1), Tyr (l),S-(2-aminovinyyli)-D-kysteiini (1) ja seuraava primäärirakenne: meso-'lantioniini CH-,- S - CH0 I I H-Ile-Ala-NH-CH-CO-Lys-Phe-Ile-NH-CH-CO— (S) (R) CH^ β-.metyy lilantioniini (S) CH- S-CH2 L-NH-CH-CO-Pro-Gly-HN-CH-CO-Ala-Lys- 'V (S) (R) ·.·. <pH2 meso- lantioniini CH CH*- S -CH* f (S) | (Z) -HN-C-CO-Gly-HN-CH-CO-Phe-Asn-HN-CH-CO-Tyr-HN-CH-CO-NH-CH (Z) (S) I (R) Il CH2-S - CH S-(2-.aminovinyyli)-D-kysteiini m m m * 38 82073 jolloin yksittäisten tioeetteriaminohappojen N-päätä lähellä olevilla puoliskoilla on kulloinkin D-konfiguraatio, ja seuraavat muut parametrit:

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentaatioväliaineen typpi1ähteenä käytetään 2-4 painoprosenttia lihauutetta tai kaikkien 20 aminohapon seosta kulloinkin 2 g/1 aminohappokonsentraatiossa tai 2 - 4 % Cas-aminohappoa tryptofaanin ja vitamiinien kuten biotiinin, nikotiinihapon, tiamiinin, pyroksiini.hydrokloridin ja ka 1 siumpantotenaatin 1änsäol1essa, hii1ilähteinä 1 - 3 painoprosenttia ma 11asuutetta tai maltoosia, mahdollisesti laktoosia ja/tai galaktoosin ja/tai manniitin ja/tai glukoosin ja/tai glyseriinin lisäyksenä, 0,25 - 1 painoprosenttia kaisi umkarbonaatt i a tai 0,25 - 0,5 painoprosenttia kalsiumhydrok-sidia fermentaation pH-arvoksi säädetään 6,0 - 7,0 ja tuoton kehittymistä seurataan ottamalla jatkuvasti näytteitä. 40 82073