JPS60239424A - 抗腫瘍性物質ｓｐｆ―１０００及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な抗腫瘍性組成物８ＰＦｉ０００及びそ
の製法に関するものである。

従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。

また、溶連菌の菌体を破砕抜水または塩類溶液で有効成
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（特公昭３８−１６４７）、溶連菌
を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解酵
素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画す
る方法（英国特許第１１６５８６５号）溶連菌の菌体を
破砕抜水不溶性物質を採堆し１、核酸分解酵素および蛋
白分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）な
どが知られている。

このように、ストレプトコツカス属細菌そのものもしく
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくけ水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくけ菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりし
て全体を分画し力ければ々らｋかった。

このような処理では、精製は複線となり、有効成分の単
離はきわめて困難であった。実際忙分離し、有効成分と
して測定された例では分子量２００．０００の蛋白質が
知られている（特公昭４８−４３８４１、特開昭５１−
４４６１７）Ｋ過ぎない。

本発明者らは、先に１ストレプトコツカス属細菌の生産
する抗腫瘍性有効成分をめて鋭意研究した結果、ストレ
プトコツカス属細菌を培養するに際し、培養中の適当な
時期にペニシリン又はその関連物質を添加して培養し、
各種菌体生産物を菌体外に排出せしめる方法ストレプト
コツカス属に属する生理活性物質生産菌を増得する方法
およびこの細菌を培養し、生理活性物質を生産する方法
などを見出すに至ったのである。また、このようＫして
得られた生理活性物質８ＰＦ−１および８ＰＦ−２、抗
腫瘍性組成物５ＰＦ−１００は培養ろ液から精製、分離
し、いずれも新規物質乃至は新規組成物と認められたの
である。

本発明者らは、更に一段とすぐれた抗腫瘍性有効成分を
ストレプトコツカス属に属する生理活性物質生産菌にめ
て詳細なる研究を行った結果、卓越した抗腫瘍性を有す
る全く新規な抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１ｏｏｏ’ｅ培養
液中に見出した。本発明の抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０
００は培養中菌体外に排出され、培養液中に蓄積される
ので、菌体を濾過して除去し、培養炉液を精製すればよ
いので、分離はかなり容易なものとなる。

本発明の抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００は培養液中に
排出されるとともに、分子量が５００〜１５．０００と
比較的小さいことＫよって特長づけられる。

従来、溶連菌関連の抗腫瘍性物質で、培養液中に蓄積さ
れたものは々く、また分子量数万以下のものは知られて
おらず、本発明者らにより初めて知り得たもので、本発
明の抗腫瘍性組成物５ＰＦ−ｉｏｏｏｕ元素分析、呈色
反応、比旋光度等からペプチド様物質からなる組成物と
認められるが、紫外ｍ吸収スペクトルで特異彦極大吸収
があり、従来広く知られた抗腫瘍性物質などとも明らか
に相異する物質であって、組成物として新規なものと認
められるものである。

本発明は、ストレゾトコツカス属に属する抗腫瘍性組成
物８ＰＦ−１０００生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍
性組成物８ＰＦ−１０００を採をすることを特徴とする
抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００の製法を包含するもの
である。

本発明においては、ストレゾトコツカス属に属する抗腫
瘍性組成物５ＰＦＩ　０００生産菌が広く使用される。

この細菌の培養物は高分子透過性大腸菌変異株ＭＰ−２
（ＦＦＩＲＭ−Ｐ５４５２）（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｌｏｔ
、　Ｃｈｅｍ、、４３．３７１−５７８（１９７９）Ｘ
以下ＭＰ−２という）の生育阻止能を有する特徴の菌で
あり、下記の菌株があげられる。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｙｃｅｓ　Ａ
ＴＣＣ２１０６０ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、
　Ａ、ＴＣＣ２１５９７ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　
ｐｙｏｇｅＫｅｓ　ＡＴＣＣ２１５４６ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅＫｅｓ　ＡＴＣＣ２１５４７
ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅ？Ｌｅｓ　Ａ
ＴＣＣ２１５４Ｂこれら菌株は、培養液中で嫌気的に培
養される。

培養液は肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・ハ
ート骨インフュージョン培地（ＢＨＩ培地）等の天然培
地がよぐ用いられるが、ストレヅトコツカス属細菌が有
効に生育する培地であれば炭素源、窒素源を含んだ一般
培地も使用することができる。培養はｐＨ５，０〜８．
０、好ましくは６．１〜Ｚ２で６０〜４０℃、好ましく
は３５〜３７℃で嫌気的に静置培養をおこ々うのが一般
的であるが、攪拌培養等の方法も採用することができる
。

本発明においては、培養中の適当力時期にペニシリン又
はその関連物質を添加することが、抗腫瘍性組成物８Ｐ
Ｆ−１００００皐得に重要な役割をはたすことＫなる。

ペニシリン又はその関連物質の添加時期Ｆ１３７℃の培
養で対数増殖期にか＼つた後３〜２０時間の間、特に５
〜１０時間が好ましい。その後１〜２０時間、好ましく
Ｆｉ５〜１５時間そのまま培養を続けることによって、
培養液中に抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００ｆｔ多量蓄
積させることができる。ペニシリン又はその関連物質と
してはすでに知られたペニシリンと類似の作用をもつ関
連物質であればいかなるものでもよいが、ペニシリンＧ
が普通用いられる。添加量はペニシリンＧで１００〜５
．０００単位／ＩＩｔｌ培養液、好ましくは５００〜１
５００単位／ｄ培養液程度で十分である。

得られた培養液は、遠心分離によって菌体を除去し、ろ
液に硫酸アンモニウムを添加し、５０〜９０％飽和度の
両分を分増して得られた沈澱物を燐酸緩衝液又は安定剤
全加えた燐酸緩衝液に溶解する。

この水溶液をイオン交換体あるいはゲル濾過剤と接触せ
しめて、精製を繰返し、ＭＰ−２に対する抗菌活性を有
しかつ溶血性を呈しない両分を分取する。

イオン交換体としてはイオン交換樹脂、イオン交換セル
ローズ、イオン交換セファデックス（ファルマシア社製
）、ハイトロキシルアパタイト等が用いられ、ゲル濾過
剤としてはトヨバールＨＷ５０ＦまたはＨＷ、５０８Ｆ
（東洋曹達（社）製）、セファデックス（ファルマシア
社製）等が用いられる。前記のようにして得られた水溶
液をこれらのイオン交換体またはゲル濾過剤を充填した
カラ五に１適当力速度で通過せしめるか、あるいはイオ
ン交換体を入れた一定容器中に１一度にその水溶液を加
えて、これらの処理剤と有効物質を接触させる。溶出は
適当力場濃度と−の緩衝液を用いて行なう。イオン交換
体、ゲル濾過剤は２種以上組合わせて用いることもでき
る。たとえばＤ′ＢＡＲセファデックスに吸着させ、次
いで溶出した液を更にトヨパールＨＷ５０ＦＫ通して精
製効果を上げることができる。

ＭＰ−２に対し抗菌活性を有しかつ溶血性を呈しない画
分を更にイオン交換体あるいはゲル濾過剤と接触せしめ
て、精製効率を上げると抗菌活性画分と非抗菌活性画分
に分画される。この非抗菌活性画分が抗腫瘍性組成物８
ＰＦ−１０００含有液であり、これを凍結乾燥すると淡
黄色の粉末となる。イオン交換体としてはＤＥＡＢ）ヨ
パール６５０（東洋曹達（株）製）、ＱＡＢセファデッ
クスＡ−２５（７アルマシア社製）等が用いられ、ゲル
濾過剤としてはトヨバールＨＷ５０ＦまたはＨＷ４０Ｆ
（東洋曹達（株）製）等が用いられも前記のようにして
得られた非抗菌活性画分をこれらのイオン交換体又はゲ
ル濾過剤を充填したカラムに１適当々速度で通過せしめ
るか、あるいはイオン交換体を入れた一定容器中に一度
にその画分を加えて、これら処理剤と有効物質を接触さ
せる。

溶出は適当々塩濃度と…の緩衝液を用いて打力う。

イオン交換体、ゲル濾過剤は２種以上組合わせて用いる
こともできる。たとえばＤＥＡＦ！）ヨパール６５０に
吸着させ、次いで溶出した液を更にトヨバールＨＷ４０
Ｆに通すと、精製効率は更に向上する。

実施例１で得られた本発明の抗腫瘍性組成物５ＰＦ−１
０００はペプチド性物質で、その理化学的性質は次に示
す通りである。

１、　元素分析 ２、分子量 ゲル炉適法による測定では、分子量約５００〜１５，０
００である。

３、分解点 本物質は１５０℃で褐変し、２００℃に々ると黒色とな
り分解する。

４、　比旋光度 〔α］ｐ＝−５．０°〜−５０．０°（Ｃ＝１．０Ｏ）
５、紫外線吸収スペクトル 本物質の０．１％の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
１図に示される。２７５ｎｍに吸収極大がみられ特徴的
である。

６、　赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。

Ｚ　溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノールには一部溶
解し、ｎ−プロパツール、ｎ−プタノール、インブタノ
ール、ｎ−へキサン、クロロホルム、アセトン、メチル
イソブチルケトン、エチルエーテル等の溶剤には難溶又
は不溶である。

８、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の１．０％水溶液の−は６．５である。

９　物質の色 淡黄色粉末状であろう １０、呈色反応 ニンヒドリン反応　十 ビュウレット反応　十 ローリ−反応　十 モーリッシュ反応　− デイシエ反応　− アンスロン反応　− システィン硫酸反応　− １１、安定化 本物質はＬ−システィン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ
）、グリセロール、アルブミン、グロブリン、α−およ
びβ−サイクロデキストリン、硫酸アン七ニウム、食塩
等の添加によって安定化される。

次忙本発明における抗菌活性及び溶血性は次の様忙して
測定する。

抗菌活性 測定にはＭＰ−２を使用して、ＭＰ−２に対する生育阻
止能をもって抗菌活性の指標とする。また、この原理を
利用した鵜高法（Ｊ、　ｏｆ　Ａｕｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
。

工５．　１３１９〜１！＋２５　（１９８２））にょシ
、生理活性物質の単位を決定する。

すなわち、バクト・アンチパイオチックメディアム３（
ディフコ社製）１．７５％、寒天１．３チより成る培地
（Ｍ３培地）を１２０’Ｃ１１５分加熱殺菌し、２０ｄ
ずつシャーレに分注し、放冷してプレート培地を調製す
る。

一方、ペプトン０．５％、肉エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．５％、寒天０．８チより成る培地を１２０℃
、１５分加熱殺菌する。その後４２℃の悟温槽に保ち、
培地の温度が４２℃になったらあらかじめ５７℃で１７
時間培養したＭＰ−２菌を１ｄ中に１０４個の細胞が存
在するように培地中に加える。ピペットによって２−ｔ
−採申し、あらかじめ作製して置いたＭ５培地表面上に
加え、すばやく均一にひろげ固化させる。次いで被験液
を適当に希釈して、その溶液０．０５−をペーパー・デ
ィスク（直径８１１１１）　（東洋濾紙（株）製）にし
み込ませる。このペーパー・ディスクを前記作製プレー
ト上に置き、６７℃で１７時間培養し、被験物質によっ
てできる阻止円の観察して抗菌活性を検査し、阻止円の
直径１０諺を与える被験物質の生理活性を測定し、一単
位（１ｕ）と定義する。

溶血性 測定には血液寒天培地を使用する。この培地はポリペプ
トン１１／、肉エキス０．６ｇ、寒天２．４ｇ、塩化ナ
トリウム１．７Ｊｌ蒸溜水１８０ｄに溶解し、…を７．
　ＯＫ調節して、１２０℃、１５分間加熱殺菌する。そ
の後約５０℃に冷却ｐてから、無菌的に脱繊馬血液１０
１ｄを加え、２０ｄずつシャーレに分注し、放冷してプ
レート培地を調製する。

この培地に被験物質を塗布し、−夜放置後溶血斑を観察
して、被験物質の溶血性を判定する。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃＩＩｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　Ａ
ＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地１００１１１１！に接種
して３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液
を第１表に示す培地Ａ１ノに接種し、種培養と同一条件
で嫌気的に前培養を行った。

第１表　培地人 肉エキス　０．５％ ポリペプトン　１．０％ 酵母エキス　０．２５チ カザミノ酸　０．２５チ 塩化ナトリウム　０．５チ ｐＨ＝６．．８ １０１ジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｊを投入して１
２０℃、１□０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、
前培養液１ノを接種し、５７℃、１５．５時間、ｐＨ６
，８，３００回転／分で攪拌しながら嫌気的に培養する
。次いでペニシリンＧ１，０００単位／　ｍｌ培養液に
なるように添加して、培養を更に５時間継続した。得ら
れた培養液を遠心分離Ｋかけて、菌体を除去した。

培養ろ液には硫酸アンモニウムを添加し、５０〜９０％
飽和度で沈澱する両分を分取した。この沈澱物はＭＰ−
２の生育を阻止する生理活性物質′１５０Ｘ１０’ｕを
含有していた。この沈澱物を、安定剤Ｌ−システィンを
少量含む１×１０−ｔＭ１ｐＨ７，０の燐酸緩衝液（Ｉ
Ｇ（、ＰＯ４−Ｎａ、ＨＰＯ，）　３００ｔｅｌに溶解
し、この水溶液をＤＥＡＤセルローズカラム（５×７０
ｃｍ）Ｋ吸着させた後、０．６Ｍ塩化す）　ｌ）ラムを
含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出させ、１１
１．りＸ１０’ｕの生理活性画分を分取した。この生理
活性画分をＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム（２
，６Ｘ７０傭）に吸着させ、次いで上記燐酸緩衝液中の
塩化す）　ｌ）ラム濃度を直線的に上昇させて溶出を行
ない、９９．２ｘ１０’Ｕの生理活性区分を分取した。

更に１この溶出液を濃縮し、ゲル濾過剤トヨパールＨＷ
５０Ｆカラム（２，６ｘｌｏ　０ｃＩＩＬ）Ｋ加えて、
ゲルｒｐ過を性力い、これを凍結乾燥すれば、！＋４．
５ｘｊＯ’ｕの生理活性物質の凍結乾燥標品１６７０〜
を得た。

この標品を燐酸緩衝液に溶解した後ＤＢＡＦｔ）コパー
ル６５０力１ラム（２６，４ｘ４５α）Ｋ吸着させ、次
いで上記燐酸緩衝液中の塩化す）　＋）ラム濃度を直線
的に上昇させて溶出を行い、非抗菌活性画分を分取して
、凍結乾燥し抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００１１５９
ｗ９を得た。

この抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００を被験物質とした抗
腫瘍活性試験は実致例１および２に示す。

実施例２ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴ
ＣＣ２１０６０を第２表に示す培地Ｂを用いて、実施例
１と同様に（２て培養した。この培養Ｆ液を実施例１と
同様に精製して、抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００１７
３０■を得た。

第２表　培地Ｂ 肉エキス　１チ ポリペプトン　１％ 酵母エキス　０．２５チ 塩化ナトリウム　０．１％ …＝６．７ 実施例６ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｕｅｓ　ＡＴ
ＣＣ２１０６０を第６表に示す培地Ｃを用いて、実施例
１と同様にして培養した。この培養ろ液を実施例１と同
様にして精製して、抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００５
０００Ｗｖを得た。

第６表　培地Ｃ・ マルトース　１チ 肉エキス　１％ ポリペプトン　１チ 酵母エキス　０．２５チ 酸性第−燐酸カリウム　０．１％ 硫酸マグネシウム　０．０５チ 塩化ナトリウム　０．５％ ｐＨ＝６．５ 実験例１ ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｋおける被検薬の抗腫瘍活性測定試
験は細胞阻害度測定法にもとづいて実施した。

腫瘍細胞と１１．てはＬ　−５１７Ｂ　Ｙ（Ｌｅｕｋｅ
ｍｉａ）　ｆ用い、これを１０チＦＣ８添加ＲＰＭ１１
６４０培地（５ｗｖ／ｌカナマイシン含有）に懸濁し念
。

この培養液０．４５ｍをファルコン２０５Ｂチューブに
注加し、細胞数が１　ｘ　１０”　ｃｅｌｌ／１ｕｂｅ
　になるようにした。次いでこの培養液に所定量の被検
薬（抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００ｔＱ、０５ｍの培
養液に溶解）を注加して、′５７℃で５　％　Ｃｏｔ存
在下に培養した。被検薬を添加して４８時間後にトリバ
ンプルーによる染色をおこない、次式により細胞阻害度
を算出した。

実施例１で得られた抗腫瘍性組成物５ＰＦ−１０００を
被検薬とした結果を第４表に示す。

第４表　細胞阻害度（チ） ８ＰＦ−１０００（ＩＩ／ｌＪ）　Ｌ−５１７ＢＹ２．
０　５５．５ １、０　２１．０ 実験例２ ｉｎ　ｖｉｖｏにおける被検薬の抗腫瘍活性試験はｃＲ
Ｊ−ＣＤ−１（ＩｃＲ系、雄性、７週齢）マウスを使用
して実施した。

腫瘍細胞としてＦｉ　８ａｒｃｏｍａ　−１８０腹水癌
細胞を用い、これをＨａｎｋ溶液忙浮遊させ、マウスの
腹腔内ＫＯ，１ｍ１ｊ（細胞数２　Ｘ　１０’　ｃｅｌ
ｌｍ　）接種した。

この腫瘍細胞接種後、１日１回５日間連続して被検薬の
所定量を腹腔内に投与して、その生存数を観察したつ 実施例１で得られた抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１０００を
被検薬とした結果を第５表に示す。

第５　表　８ＰＦ−１０００の抗腫瘍活性−マウスの生
存数一 対照　８７８　Ｂ、／８８／８２／８　Ｑ／８　Ｑ／８
０、５　８／８８／８　Ｂ／８８／８８／８７／８

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性組成物８ＰＦ−１００００，１ｑｂ水
溶液の紫外線吸収スペクトルを示し、第２図は同じく赤
外線吸収スペクトルを示す。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 手続補正書 昭和５９年９月２１日 特許庁長官殿 １、事件の表示 特願昭５９−９５６７８ ２、発明の名称 抗腫瘍性組成物５ＰＦ−１０００及びその製法６、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　名古屋市名東区植園町１丁目２４番６号氏名　
鵜　高　重　三（ほか２名） ４、代理人 住　所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目１９番１４号
５、補正により増加する発明の数　なし＆補正の対象 発明の名称及び明細書 Ｚ補正の内容 （１、発明の名称を 「抗腫瘍性物質５ＰＦ−１，０００及びその製法」と補
正する。 （２）明細書全文を別紙のとお夛補正する。 明　細　書 １、発明の名称 抗腫瘍性物質５ＰＦ−１０００及びその製法２、特許請
求の範囲 （１）下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性物質８ＰＦ
−１０００゜ １、　元素分析 Ｃ：５３．９１　％　〜５１．５５％、Ｈ：　５．８７
−〜４．８４％、 Ｎ：１２．８６％〜１１．４７％ ２、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量約 ５００・〜１５２口００である。 ３、分解点 本物質は、１５０℃で褐変し、２００ ℃になると黒色となシ分解する。 ４、比旋光度 〔α〕甘ユニー５．０°〜−−５０，０°”　（Ｃ＝１
．０Ｏ）５、紫外線吸収スペクトル 本物質の０．１−の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
１図に示される。２７５ｎｍに吸収極大がみられ、特徴
的であ る。 ６、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 ｌ　溶剤に対する溶解性 水に９溶であるが、メタノール、エタ ノールには一部溶解し、ｎ−プロパツ ール、ｎ−ブタノール、インブタノー ル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、ア セトン、メチルイソブチルケトン、エ チルエーテル等の溶剤には難溶又は不 溶である。 ８、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の１．０％水溶液のｐ）（は６．５である。 ９　物質の色 淡黄色粉末状である。 １０、呈色反応 ニンヒドリン反応　十 ビュウレット反応　十 ローリ−反応　十 モーリッシュ反応　− デイシエ反応　− アンスロン反応　− システィン硫酸反応　− １１、安定化 本物質はＬ−システィン、ジチオマレ イトール（ＤＴＴ’）、グリセロール、アルブミン、グ
ロブリン、α−および β−ナイクロデキストリン、硫酸アン モニウム、食塩等の添加によって安定 化される。 （２）ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍す質５ＰＦ
−１０００生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性物質８
ＰＦ−１０００を採取することを特徴とする抗腫瘍性物
質８ＰＦ−１０００の製法。 （３）ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質８Ｐ
Ｆ−１０００生産菌を培養するに際し、培養中の適当な
時期に４ニジリン又はその関連物質を添加して培養する
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍
性物質５ＰＦ−１０００の製法。 ３、発明の詳細な説明 本発明は、新規な抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００及びそ
の製法に関するものである。 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すてに制癌剤として使
用されている。 また、溶連菌の菌体を破砕漬水または塩類溶液で有効成
分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱と
して、回収する方法（％公ｌ＠６８−１６４７）、溶連
菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解
酵素によシ、溶菌し、活性画分を水溶性区分として分画
する方法（英国特許第１１６５８６５号）溶連菌の菌体
を破砕抜水不溶性物質を採取し、核酸分解酵素および蛋
白分解酵素で処理する方法（特開昭５５−７０１４）な
どが知られている。 このように、ストレプトコツカス属細菌そのものもしく
はその菌体成分に抗腫瘍活性があることは広く知られて
いるのであるが、従来知られたものは、菌体もしくは水
溶性もしくは水不溶性高分子細胞構成物質であるに過ぎ
なかった。菌体もしくは菌体内から有効成分を単離しよ
うとすれば、菌体を溶菌したシ１機械的に破砕したシし
て全体を分画しなければならなかった。 このような処理では、精製は複雑となり、有効成分の単
離はきわめて困難であった。実際に分離し、有効成分と
して測定された例では分子量２００．０００の蛋白質が
知られている（特公昭４８−４５８４１．％開昭５１−
４４６１７）に過ぎない。 本発明者らは、先に、ストレプトコツカス属細菌の生産
する抗腫瘍性有効成分をめて鋭意研究した結果、ストレ
プトコツカス属細菌を培養するに際し、培養中の適当な
時期にハニシリン又はその関連物質を添加して培養し、
各種菌体生産物を菌体外に排出せしめる方法、ストレプ
トコツカス属に属する生理活性物質生産菌を取得する方
法およびこの細菌を培養し、生理活性物質を生産する方
法などを見出すに至りだのである。また、このようにし
て得られた生理活性物質５ＰＦ−１おヨヒ５ＰＦ−２、
抗腫瘍性物質８ＰＦ−１００は培養ｐ液から積装、分離
し、いずれも新規物質と認められたのである。 本発明者らは、更に一段とすぐれた抗腫瘍性有効成分を
ストレプトコツカス属に属する生理活性物質生産菌にめ
て詳細なる研究を行った結果、卓越した抗腫瘍性を有す
る全く新規な抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００を培養液中
に見出した。本発明の抗腫瘍性物質５ＰＦ−１０００は
培養生菌体外に排出され、培養液中に蓄積されるので、
菌体を濾過して除去し、培″＃ｐ液を精製すればよいの
で、分離はかなシ容易なものとなる。 本発明の抗腫瘍性物質５ＰＦ−１０００は培養液中に排
出されるとともに、分子量が５００〜１５．０００と比
較的小さいことによって特長づけられる。 従来、溶連菌関連の抗腫瘍性物質で、培養液中に蓄積さ
れたものはなく、また分子量数万以下のものは知られて
おらず１本発明者らによ）初めて知９得たもので、本発
明の抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００は元素分析、呈色反
応、比旋光度等からペプチド様物質からなる組成物と認
められるが、紫外線吸収スペクトルで特異な極大吸収が
あり、従来広く知られた抗腫瘍性物質などとも明らかに
相異する物質であって、物質として新規なものと認めら
れるものである。 本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
８ＰＦ−１０００生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
物質８ＰＦ−１０００を採取することを特徴とする抗腫
瘍性物質８ＰＦ−１０００の製法を包含するものである
。 本発明においては、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性物質１９ＰＦ−１０００生産菌が広く使１　用され
る。この細菌の培養物は高分子透過性大腸菌変異株ＭＰ
−２（ＦＷ几Ｍ−Ｐ５４３２）（’Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４３．３７１−３７８（１９７
９））（以下ＭＰ−２という）の生育阻止能を有する特
徴の菌であり、ド記の菌株があげられる。 ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴ
ＣＣ２１０６０、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、
　ＡＴＣＣ２１５９７ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１５４６ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ２１５４７ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴＣ
Ｃ２１５４Ｂこれら菌株は、培養液中で嫌気的に培養さ
れる。 培養液は肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・ハ
ート・インフュージョン培地（ＢＨＩ培地）等の天然培
地がよく用いられるが、ストレプトコツカス属細菌が有
効に生育する培地であれば炭素源、窒素源を含んだ一般
培地も使用することができる。培養は肯５．０〜８．０
、好ましくは６．１〜Ｚ２で３０〜４０℃、好ましくは
５５〜３７℃で嫌気的に静置培養をおこなうのが一般的
であるが、撹拌培養等の方法も採用することができる。 本発明においては、培養中の適当な時期にはニジリン又
はその関連物質を添加することが、抗腫瘍性物質Ｓ、Ｐ
Ｆ−１０００の取得に重要な役割をはたすことになる。 ｏ　ニシリ／又はその関連物質の添加時期は３７℃の培
養で対数増殖期吟か＼つた後５〜２０時間の間、特に５
〜１０時間が好ましい。その後１〜２０時間、好ましく
は３〜１５時間そのまま培養を続けることによって、培
養液中に抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００を多量蓄積させ
ることができる。スニシリン又はその関連物質としては
すでに知られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物質
であればいかなるものでもよいが、べ二シ＋７７Ｇが普
通用いられる。添加量ははニジリンＧで１００〜５．０
００単位／ｄ培養液、好ましくは６００〜１，５００単
位／　ｍｌ培養液程度で十分である。 得られた培養液は、遠心分離によって画体を除去し、炉
液に硫酸アンモニウムを添加し、５０〜９０チ飽和度の
画分を分取して得られた沈澱物を燐酸緩衝液又は安定剤
を加えた燐酸緩衝液に溶解する。 この水溶液をイオン交換体あるいはゲルー過剤と接触せ
しめて、精製を繰返し、ＭＰ−２に対する抗菌活性を有
しかつ溶血性を呈しない両分を分取する。 イオン交換体としてはイオン交換樹脂、イオン交換セル
ローズ、イオン交換セファデックス（ファルマシア社製
）、ハイトロキシルアノぐタイト等が用いられ、ゲル濾
過剤としてはトヨパールＨＷ５ＤＦまたはＩ（Ｗ５０８
　Ｆ　（東洋曹達（社）製）、七フ゛アデツクス（ファ
ルマシア社製）等が用いられる。前記のようにして得ら
れた水溶液をこれらのイオン交換体またはゲル濾過剤を
充填したカラムに、適当な速度で通過せしめるか、ある
いはイオン交換体を入れた一定容器中に、一度にその水
溶液を加えて、これらの処理剤と有効物質を接触させる
。溶出は適当な塩濃度と囲の緩衝液を用いて行なう。イ
オン交換体、ゲル濾過剤は２種以上組合わせて用いるこ
ともできる。たとえばＤＥＷセファデックスに吸着させ
、次いで溶出した液を更にトヨパールＨＷ５０Ｆに通し
てｆ／に効果を上げることができる− ＭＰ−２に対し抗菌活性を有しかつ溶血性を呈しない両
分を更にイオン交換体あるいはゲル濾過剤と接触せしめ
て、精製効率を上げると抗菌活性画分と非抗菌活性画分
に分画される。この非抗菌活性画分が抗腫瘍性物質８Ｐ
Ｆ−１０００含有液であり、これを凍結乾燥すると淡黄
色の粉末となる。 イオン交換体としてはＤＲＡＷ）ヨパール６５０（東洋
曹達（株）製）、ＱＡＥセファデックスＡ−２５（７ア
ルマシア社製）等が用いられ、ゲル濾過剤としてはトヨ
パールＨＷ５０ＦまたはＨＷ４０Ｆ（東洋曹達（株）製
）等が用いられる。前記のようにして得られた非抗菌活
性画分をこれらのイオン交換体又はゲルテ過剤を充填し
たカラムに、適当な速度で通過せしめるか、あるいはイ
オン交換体を入れた一定容器中に一度にその画分を加え
て、これら処理剤と有効物質を接触させる。 溶出は適当な塩濃度と−の緩衝液を用いて行なう。 イオン交換体、ゲル濾過剤は２種以上組合わせて用いる
こともできる。たとえばＤＦｉＡＢ）ヨパール６５０に
吸着させ、次いで溶出した液を更にトヨパールＨＷ４０
　Ｆに通すと、精製効率は更に向上する。 実施例１で得られた本発明の抗腫瘍性物質５ＰＦ−１０
００はペプチド性物質で、その理化学的性質は次に示す
通りである。 １、　元素分析 Ｃ：５３．９１％〜５１．５５％ Ｈ：　５．８７−〜４．８４％ Ｎ：１２．８６チ〜１１．４７％ ２、分子量 ゲルｐ過法による測定では、分子量約 ５００〜１５　、ＯＤＤである。 ３、分解点 本物質は１５０℃で褐変し、２００℃になると黒色とな
夛分解する。 ４、比旋光度 （（１）２０　：：　５．　Ｑ°−５０，０°　（Ｃ＝
１．００）５、紫外線吸収スペクトル 本物質の０．１チの水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
１図に示される。２７５ｎｍに吸収極大がみられ特徴的
である。 ６、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 ｌ　溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノールには一部溶
解し、ｎ−プロパツール、ｎ−ブタノール、インブタノ
ール、ｎ−へキサン、クロロホルム、アセトン、メチル
イソブチルケトン、エチルエーテル等の溶剤には離溶又
は不溶である。 ８、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の１．０チ水溶液の…は６．５である。 ９　物質の色 淡黄色粉末状である。 １０、呈色反応 ニンヒドリン反応　十 ビュウレット反応　十 ローリ−反応　十 モーリッシュ反応　− デイシエ反応　− アンスロン反応　− システィン硫酸反応　− １１、安定化 本物質はＬ−７ステイ／、ジチオスレイトール（ＤＴＴ
　）、グリセロール、アルプミ／、グロブリン、α−お
よびβ−サイクロデキストリン、’ｒＡｄｌアンモニウ
ム、食塩等の添加によって安定化される。 次に本発明における抗菌活性及び溶血性は次の様にして
測定する。 抗菌活性 測定にはＭＰ−２を使用して、ＭＰ−２に対する生育阻
止能をもって抗菌活性の指標とする。また、この原理を
利用した鵜高法（Ｊ、　ｏｆＡ？Ｌｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
、５５，１５１９〜１６２５（１９８２））によシ、生
理活性物質の単位を決定する。 すなわち、バクト・アンチパイオチツクメディアム３（
ディフコ社ｍ）１．７５％、寒天１．５チよシ成る培地
（Ｍ５培地）を１２０℃、１５分加熱殺菌し、＞ｏｄず
つシャーレに分注し、放冷してプレート培地を調製する
。 一方、ベソトノ０．５％、肉エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．３％、寒天０．８チより成る培地を１２０℃
、１５分加熱殺丙する。その後４２℃の恒温槽に保ち、
培地の温度が４２℃になったらあらかじめ６７℃で１７
時間培養したＭＰ−２菌を１１１Ｉｌ中に１０４１ｖＡ
の細胞が存在するように培地中に加える。ピペットによ
って２ｄを採取し、あらかじめ作製して置いたＭ５培地
表面上に加え、すばやく均一にひろげ固化させる。次い
で被験液を適当に希釈して、その溶液０．．０５７ｄを
ペーパー・ディスク（直径８１１１Ｋ）（東洋ｐ紙（株
）製）にしみ込ませる。このは−パー・ディスクを前記
作製プレート上に置き、５７℃で１７時間培養し、被験
物質によってできる阻止円の観察して抗菌活性を検査し
、阻止円の直径１０朋を与える被験物質の生理活性を測
定し、一単位（１ｕ）と定義する。 ｌ　溶血性 測定には血液寒天培地を使用する。この培地はポリにゾ
トン１１．肉エキス０．６ｇ、寒天２．４ｇ、塩化ナト
リウム１．７ｇを蒸溜水１８０ゴに溶解し、−を７．ｎ
ｔ／ｃ調節して、１２０℃、１５分間加熱殺菌する。そ
の後約５０℃に冷却してから、無菌的に脱繊馬血液１０
ゴを加え、２３ｍ／ずつシャーレに分注し、放冷してプ
レート培地を調製する。 この培地に被験物質を塗布し、−夜放置後溶血斑を観察
して、被験物質の溶血性を判定する。 次に本発明の実施例を示す。 実施例１ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴ
ＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地１ｏｏＷＬｌに接種して６
７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液を第１
表に示す培地Ａｌｌに接種し、種培養と同一条件で嫌気
的に前培養を行った。 第１　表　培地Ａ 肉エキス　０．５チ ポリペプトン　１．０％ 酵母エキス　０２５チ カザミノ酸　０．２５チ 塩化ナトリウム　０．５％ 困＝６８ １０１ｕヤーフアーメンターに培地Ａ８１を投入して１
２０℃、１０分間加熱殺菌後、６７℃まで冷却して、前
培養液１１を接種し、３７℃、１５．５時間、−６，８
，６００回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養する。次
いでペニシリンＧ１．０００単位／１１Ｌｌ培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。得られ
た培養液を遠心分離にかけて、菌体を除去した。 培養Ｐ液には硫酸アンモニウムを添加し、５０〜９０％
飽和度で沈澱する自分を分取した。この沈澱物はＭＰ−
２の生育を阻止する生理活性物質１５０Ｘ１０’ｕを含
有していた。この沈澱物を、安定剤Ｌ−７ステインを少
量含むｌＸ１０−２Ｍ、ｐｉ−１７，０の燐酸緩衝液（
ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４）　５００ｄに溶解１−
１この水溶液をＤＥＡＥセルローズカラム（５Ｘ７０α
）Ｋ吸着させた後、０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む上記
燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出させ、１１１゜３　
Ｘ　１０’　ｕの生理活性画分を分取した。この生理活
性画分をＤＲＡＷセファデックスＡ−２５カラＡ　（２
−Ａ　ｘ　７０ａｎ　）Ｋｒｌｋ着させ、次いで上目己
燐酸緩衝液中の塩化す）　ＩＪウム濃度を直線的に上昇
させて溶出を行ない、９９，２Ｘ　１０’　ｕの生理活
性区分を分取した。更に、この溶出液を＃縮し、ゲル濾
過剤トヨパールＨＷ５０Ｆカラム（２，６Ｘｊ　００ｃ
Ｒ）に加えて、ゲル濾過を行ない、これを凍結乾燥すれ
ば、３４．３Ｘ　１０’Ｕの生理活性物質の凍結乾燥標
品１６７０■を得た。 この標品を燐酸緩衝液に溶解した後ＤＥＡＥトヨパール
６５０カラム（２６，４ｘ　４５ｃｍ）に吸着させ、次
いで上記燐酸緩衝液中の塩化す）　ＩＪウム濃度を直線
的に上昇させて溶出を行い、非抗菌活性画分を分取して
、凍結乾燥し抗腫瘍性物質５ｐＦ−１０００１１３９ダ
を得た。 この抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００を被験物質とした抗
腫瘍活性試験は実験例１および２に示す。 実施例２ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴ
ＣＣ２１０６０を第２表に示す培地Ｂを用いて、実施例
１と同様にして培養した。この培養Ｆ液を実施例１と同
様に精製して、抗腫瘍性物質５ＰＦ−１０００１７３０
Ｒｙを得た。 第　２　表　培地Ｂ 肉エキス　１％ ポリにプトン　１チ 酵母エキス　０．２５チ 塩化ナトリウム　０．１％ …＝６．７ 実施例６ ａｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　ＡＴ
ＣＣ２１０６０を第６表に示す培地Ｃを用いて、実施例
１と同様にして培養した。この培養Ｆ液を実施例１と同
様にして精製して、抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００３０
００ダを得た。 第５　表　培地Ｃ マルトース　１チ 肉エキス　１チ ポリはプトン　１％ 酵母エキス　０．２５　％ 酸性第一燐酸カリウム　０．１％ 蝋酸マグネシウム　０．０５％ 塩化ナト−リウム　０．５％ −二６．５ 実験例１ ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける被検薬の抗腫瘍活性測定試験
は細胞阻害度測定法にもとづいて実施した。 腫瘍細胞としてはＬ　−５１７Ｂ　Ｙ　（Ｌｅｕｋｅｍ
ｉａ　）を用い、これを１０％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ　１
６４０培地（５１９／／カナマイシン含有）に懸濁した
。 この培養液０．４５　ｍ／をファルコン２０５８チュー
ブに注加し、細胞数がＩ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｌｊ　
／　ｔｕｂｅになるようにした。次いでこの培養液に所
定量の被検薬（抗腫瘍性物質ＳＰＦ’−１０００を［］
、Ｑ５ｍの培養液に溶解）を注加して、６７℃で５　％
　ＣＯ，存在下に培養した。被検薬を添加して４８時間
後にトリバンプルーによる染色をおこない、次式により
細胞阻害度を算出した。 実施例１で得られた抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００を被
検薬とした結果を第４表に示す。 第　４　表　細胞阻害度＠） ８ＰＦ’−１０００Ｃ■／ｍ１）Ｌ−５１７８Ｙ２．０
　５５．５ １、０　２１．０ 実験例２ ｉｎ　ｖｉｖｏにおける被検薬の抗腫瘍活性試験はＣＲ
Ｊ−ＣＤ−１（ＩＣ几系、雄性、７週齢）マウスを使用
して実施した。 腫瘍細胞としてはＳａｒｃｏｍａ　−１８０腹水癌細胞
を用い、これをＨａｎｋ溶液に浮遊させ、マウスの腹腔
内にＱ、　１ｍｌ　（細胞数２　Ｘ　１０’　ｅｅｌｓ
　）接種した。 この腫瘍細胞接種後、１日１回５日間連続して被検薬の
所定量を腹腔内に投与して、その生存数を観察した。 実施例１で得られた抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００を被
検薬とした結果を第５表に示す。 第　５　表　８ＰＦ−１０００の抗腫瘍活性−マウスの
生存数〜 日　数 投与量（＋ｖ）　０　１０　１５　２０　２５　３０対
照　８／８　８／８８／８　２／８　Ｄ／８　０／８０
、ｓ　８／８　Ｂ／８８／８８／ｓ　８．／ｓ　７／ｓ
４、図面の簡単な説明 第１図は抗腫瘍性物質８ＰＦ−１００００，１チ水溶液
の紫外線吸収スはクトルを示し、第２図は同じく赤外線
吸収スペクトルを示す。 代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性組成物８Ｐ
   Ｆ−１０００゜ １、　元素分析 ２、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量約 ５００〜１５．ＯＤＤである。 ３、分解点 本物質は、１５０℃で褐変し、２００ ℃になると黒色と々り分解する。 ４、比旋光度 ［α］ｆｉ’＝−５．０°〜−５Ｑ、θ°（Ｃ＝１．０
   ０）５、紫外線吸収スペクトル 本物質の０．１チの水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
   １図に示される。２７５ｎｍに吸収極大がみられ、特徴
   的である。 ６、赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 ｌ　溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、エタノール、エタ ノールには一部溶解し、ｎ−プロパツ ール、ｎ−ブタノール、イソブタノー ル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、アセトン、メチルイ
   ソブチルケトン、エチ ルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶 である。 ８、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の１．０チ水溶液のｐＨは６．５である。 ９　物質の色 淡黄色粉末状である。 １０、呈色反応 ニンヒドリン反応　十 ピュウレット反応　十 ローリ−反応　十 モーリッシュ反応　− デイシエ反応　− アンスロン反応　− システィン硫酸反応　− １１、安定化 本物質はＬ・−システィ／、ジチオマレイトール（ＤＴ
   Ｔ）、グリセロール、 アルブミン、グロブリン、α−および β−サイクロデキストリン、硫酸アン モニウム、食塩等の添加によって安定 化される。
2. （２）ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性組成物８
   ＰＦ−１０００生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性組
   成物８ＰＦ−１０００ｔｌ−採をすることを特徴とする
   抗腫瘍性物質８ＰＦ−１０００の製法。
3. （３）ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性組１　放
   物５ＰＦ−１０００生産薗を培養するに際し、培養中の
   適当な時期にペニシリン又はその関連物質を添加して培
   養することを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
   抗腫瘍性組成物５ＰＦ−１０００の製法。