JPH0155276B2

JPH0155276B2 -

Info

Publication number: JPH0155276B2
Application number: JP59095678A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; Hideo Kamyama; Junichi Taniguchi; Keiji Adachi
Original assignee: Shikishima Boseki KK
Current assignee: Shikishima Boseki KK
Priority date: 1984-05-15
Filing date: 1984-05-15
Publication date: 1989-11-22
Also published as: JPS60239424A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規な抗腫瘍性物質SPF−1000及び
その製法に関するものである。従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38−
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許第
1163865号）溶連菌の菌体を破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55−7014）などが知られてい
る。このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質が知られている（特公昭48−
43841、特開昭51−44617）に過ぎない。本発明者らは、先に、ストレプトコツカス属細
菌の生産する抗腫瘍性有効成分を求めて鋭意研究
した結果、ストレプトコツカス属細菌を培養する
に際し、培養中に適当な時期にペニシリン又はそ
の関連物質を添加して培養し、各種菌体生産物を
菌体外に排出せしめる方法、ストレプトコツカス
属に属する生理活性物質生産菌を取得する方法お
よびこの細菌を培養し、生理活性物質を生産する
方法などを見出すに至つたのである。また、この
ようにして得られた生理活性物質SPF−１および
SPF−２、抗腫瘍性物質SPF−100は培養液か
ら精製、分離し、いずれも新規物質と認められた
のである。本発明者らは、更に一段とすぐれた抗腫瘍性有
効成分をストレプトコツカス属に属する生理活性
物質生産菌に求めて詳細なる研究を行つた結果、
卓越した抗腫瘍性を有する全く新規な抗腫瘍性物
質SPF−1000を培養液中に見出した。本発明の抗
腫瘍性物質SPF−1000は培養中菌体外に排出さ
れ、培養液中に蓄積されるので、菌体を過して
除去し、培養液を精製すればよいので、分離は
かなり容易なものとなる。本発明の抗腫瘍性物質SPF−1000は培養液中に
排出されるとともに、分子量が500〜15000と比較
的小さいことによつて特長づけられる。従来、溶連菌関連の抗腫瘍性物質で、培養液中
に蓄積されたものはなく、また分子量数万以下の
ものは知られておらず、本発明者らにより初めて
知り得たもので、本発明の抗腫瘍性物質SPF−
1000は元素分析、呈色反応、比旋光度等からペプ
チド様物質からなる組成物と認められるが、紫外
線吸収スペクトルで特異な極大吸収があり、従来
広く知られた抗腫瘍性物質などとも明らかに相異
する物質であつて、物質として新規なものと認め
られるものである。本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性物質SPF−1000生産菌を培養し、培養物から
抗腫瘍性物質SPF−1000を採取することを特徴と
する抗腫瘍性物質SPF−1000の製法を包含するも
のである。本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性物質SPF−1000生産菌が広く使用さ
れる。この細菌の培養物は高分子透過性大腸菌変
異株MP−２（FERM−P5432）（Agric.Biol.Chem.、43、371〜378（1979））（以下MP−２という）の生育阻止能を有する
特徴の菌であり、下記の菌株があげられる。 streptococcus pyogenes ATCC 21060 streptococcus sp. ATCC 21597 streptococcus pyogenes ATCC 21546 streptococcus pyogenes ATCC 21547 streptococcus pyogenes ATCC 21548 これら菌株は、培養液中で嫌気的に培養され
る。培養液は肉エキス培地、酵母エキス培地、ブレ
イン・ハート・インフユージヨン培地（BHI培
地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレプ
トコツカス属細菌が有効に生育する培地であれば
炭素源、窒素源を含んだ一般培地も使用すること
ができる。培養はPH5.0〜8.0、好ましくは6.1〜
7.2で30〜40℃、好ましくは35〜37℃で嫌気的に
静置培養をおこなうのが一般的であるが、撹拌培
養等の方法も採用することができる。本発明においては、培養中の適当な時期にペニ
シリン又はその関連物質を添加することが、抗腫
瘍性物質SPF−1000の取得に重要な役割をはたす
ことになる。ペニシリン又はその関連物質の添加
時期は37℃の培養で対数増殖期にかヽつた後３〜
20時間の間、特に５〜10時間が好ましい。その後
１〜20時間、好ましくは３〜15時間そのまま培養
を続けることによつて、培養液中に抗腫瘍性物質
SPF−1000を多量蓄積させることができる。ペニ
シリン又はその関連物質としてはすでに知られた
ペニシリンと類似の作用をもつ関連物質であれば
いかなるものでもよいが、ペニシリンＧが普通用
いられる。添加量はペニシリンＧで100〜3000単
位／ml培養液、好ましくは300〜1500単位／ml培
養液程度で十分である。得られた培養液は、遠心分離によつて菌体を除
去し、液に硫酸アンモニウムを添加し、50〜90
％飽和度の画分を分取して得られた沈澱物を燐酸
緩衝液又は安定剤を加えた燐酸緩衝液に溶解す
る。この水溶液をイオン交換体あるいはゲル過剤
と接触せしめて、精製を繰返し、MP−２に対す
る抗菌活性を有しかつ溶血性を呈しない画分を分
取する。イオン交換体としてはイオン交換樹脂、イオン
交換セルローズ、イオン交換セフアデツクス（フ
アルマシア社製）、ハイドロキシルアパタイト等
が用いられ、ゲル過剤としてはトヨパール
HW50FまたはHW−50SF（東洋曹達（社）製）、
セフアデツクス（フアルマシア社製）等が用いら
れる。前記のようにして得られた水溶液をこれら
のイオン交換体またはゲル過剤を充填したカラ
ムに、適当な速度で通過せしめるか、あるいはイ
オン交換体を入れた一定容器中に、一度にその水
溶液を加えて、これらの処理剤と有効物質を接触
させる。溶出は適当な塩濃度とPHの緩衝液を用い
て行なう。イオン交換体、ゲル過剤は２種以上
組合わせて用いることもできる。たとえばDEAE
セフアデツクスに吸着させ、次いで溶出した液を
更にトヨパールHW50Fに通して精製効果を上げ
ることができる。 MP−２に対し抗菌活性を有しかつ溶血性を呈
しない画分に更にイオン交換体あるいはゲル過
剤と接触せしめて、精製効率を上げると抗菌活性
画分と非抗菌活性画分に分画される。この非抗菌
活性画分が抗腫瘍性物質SPF−1000含有液であ
り、これを凍結乾燥すると淡黄色の粉末となる。
イオン交換体としてはDEAEトヨパール650（東洋
曹達(株)製）、QAEセフアデツクスＡ−25（フアル
マシア社製）等が用いられ、ゲル過剤としては
トヨパールHW50FまたはHW40F（東洋曹達(株)
製）等が用いられる。前記のようにして得られた
非抗菌活性画分をこれらのイオン交換体又はゲル
過剤を充填したカラムに、適当な速度で通過せ
しめるが、あるいはイオン交換体を入れた一定容
器中に一度にその画分を加えて、これら処理剤と
有効物質を接触させる。溶出は適当な塩濃度とPH
の緩衝液を用いて行なう。イオン交換体、ゲル
過剤は２種以上組合わせて用いることもできる。
たとえばDEAEトヨパール650に吸着させ、次い
で溶出した液を更にトヨパールHW40Fに通すと
精製効率は更に向上する。実施例１で得られた本発明の抗腫瘍性物質SPF
−1000はペプチド性物質で、その理化学的性質は
次に示す通りである。１元素分析Ｃ：53.91％〜51.55％Ｈ：5.87％〜4.84％Ｎ：12.86％〜11.47％２分子量ゲル過法による測定では分子量約500〜
15000である。３分解点本物質は150℃で褐変し、200℃になると黒色
となり分解する。４比旋光度〔α〕²⁰ _D＝−5.0゜〜−50.0゜（Ｃ＝1.00）５紫外線吸収スペクトル本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは第１図に示される。275nmに吸収極大が
認められ特徴的である。６赤外線吸収スペクトル第２図に示される。 3120cm^-1、2400cm^-1、1640cm^-1、1400cm^-1、
1300cm^-1、1150cm^-1、540cm^-1 に吸収が認められる。７溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール
には一部溶解し、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタ
ノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、アセトン、メチルイソブチルケト
ン、エチルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶
である。８塩基性、酸性、中性の区別本物質の1.0％の水溶液のPHは6.5である。９物質の色淡黄色粉末状である。 10 呈色反応ニンヒドリン反応＋ビユウレツト反応＋ローリー反応＋モーリツシユ反応 − デイシエ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化本物質はＬ−システイン、ジチオスレイトー
ル（DTT）、グリセロール、アルブミン、グロ
ブリン、α−およびβ−サイクロデキストリ
ン、硫酸アンモニウム、食塩等の添加によつて
安定化される。次に本発明における抗菌活性及び溶血性は次の
様にして測定する。抗菌活性測定にはMP−２を使用して、MP−２に対す
る生育阻止能をもつて抗菌活性の指標とする。ま
た、この原理を利用した鵜高法（J.of
Antibiotics、35、1319〜1325（1982）にり、生理
活性物質の単位を決定する。すなわち、バクト・アンチバイオチツクメデイ
アム３（デイフコ社製）1.75％、寒天1.3％より成
る培地（M3培地）を120℃、15分加熱殺菌し、20
mlずつシヤーレに分注し、放冷してプレート培地
を調製する。一方、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、ナトリ
ウム0.3％、寒天0.8％より成る培地を120℃、15
分加熱殺菌する。その後42℃の恒温槽に保ち、培
地の温度が42℃になつたらあらかじめ37℃で17時
間培養したMP−２菌を１ml中に10⁴個の細胞が
存在するように培地中に加える。ピペツトによつ
て２mlを採取し、あらかじめ作製して置いたM3
培地表面上に加え、すばやく均一にひろげ固化さ
せる。次いで被験液を適当に希釈して、その溶液
0.05mlをペーパー・デイスク（直径８mm）（東洋
紙(株)製）にしみ込ませる。このペーパー・デイ
スクを前記作製プレート上に置き、37℃で17時間
培養し、被験物質によつてできる阻止円の観察し
て抗菌活性を検査し、阻止円の直径10mmを与える
被験物質の生理活性を測定し、一単位（1u）と
定義する。溶血性測定には血液寒天培地を使用する。この培地
は、ポリペプトン1g、肉エキス0.6g、寒天2.4g、
塩化ナトリウム1.7gを蒸溜水180mlに溶解し、PH
を7.0に調節して、120℃、15分間加熱殺菌する。
その後約50℃に冷却してから、無菌的に脱繊馬血
液10mlを加え、20mlずつシヤーレに分注し、放冷
してプレート培地を調製する。この培地に被験物質を塗布し、一夜放置後溶血
斑を観察して、被験物質の溶血性を判定する。次に本発明の実施例を示す。実施例１ streptococcus pyogenes ATCC 21060をBHI
培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養をお
こなつて得た種培養液を第１表に示す培地A1
に接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培養を
行つた。第１表培地Ａ肉エキス 0.5％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％カザミノ酸 0.25％塩化ナトリウム 0.5％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.8、300回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンG1000単位／ml培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて、菌体を除去
した。培養液には硫酸アンモニウムを添加し、50〜
90％飽和度で沈澱する画分を分取した。この沈澱
物はMP−２の生育を阻止する生理活性物質150
×10⁴uを含有していた。この沈澱物を、安定剤Ｌ
−システインを少量含む１×10^-2M、PH7.0の燐
酸緩衝液（KH₂PO₄−Na₂HPO₄）300mlに溶解
し、この水溶液をDEAEセルローズカラム（５×
70cm）に吸着させた後、0.3M塩化ナトリウムを
含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出さ
せ、111.3×10⁴uの生理活性画分を分取した。こ
の生理活性画分をDEAEセフアデツクスＡ−25カ
ラム（2.6×70cm）に吸着させ、次いで上記燐酸
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇さ
せて溶出を行ない、99.2×10⁴uの生理活性区分を
分取した。更に、この溶出液を濃縮し、ゲル過
剤トヨパールHW50Fカラム（2.6×100cm）に加
えて、ゲル過を行ない、これを凍結乾燥すれ
ば、34.3×10⁴uの生理活性物質の凍結乾燥標品
1670mgを得た。この標品を燐酸緩衝液に溶解した後DEAEトヨ
パール650カラム（26.4×45cm）に吸着させ、次
いで上記燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直
線的に上昇させて溶出を行い、非生理活性画分を
分取して、凍結乾燥し抗腫瘍性物質SPF−1000
1139mgを得た。この抗腫瘍性物質SPF−1000を被験物質とした
抗腫瘍活性試験は実験例１および２に示す。実施例２ streptococcus pyogenes ATCC 21060を第２
表に示す培地Ｂを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この培養液を実施例１と同様に精製
して、抗腫瘍性物質SPF−1000 1730mgを得た。第２表培地Ｂ肉エキス１％ポリペプトン１％酵母エキス 0.25％塩化ナトリウム 0.1％ PH＝6.7 実施例３ streptococcus pyogenes ATCC 21060を第３
表に示す培地Ｃを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この培養液を実施例１と同様にして
精製して、抗腫瘍性物質SPF−1000 3000mgを得
た。第３表培地Ｃマルトース１％肉エキス１％ポリペプトン１％酵母エキス 0.25％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％塩化ナトリウム 0.5％ PH＝6.5 実験例１ in vitroにおける被検薬の抗腫瘍活性測定試験
は細胞阻害度測定法にもとづいて実施した。腫瘍細胞としてはＬ−5178Y（Leukemia）を用
い、これを10％FCS添加RPMI1640培地（５mg／
カナマイシン含有）に懸濁した。この培養液
0.45mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細胞
数が１×10⁵cell／tubeになるようにした。次い
でこの培養液に所定量の被検薬（抗腫瘍性物質
SPF−1000を0.05mlの培養液に溶解）を注加し
て、37℃で５％CO₂存在下に培養した。被検薬を
添加して48時間後にトリパンブルーによる染色を
おこない、次式により細胞阻害度を算出した。細胞阻害度（％）＝(A)一各実験群の細胞数／対照群の
細胞数(A)×100 実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF−1000を
被検薬とした結果を第４表に示す。第４表細胞阻害度（％） SPF−100（mg／ml）Ｌ−5178Y 2.0 55.3 1.0 21.0 実験例２ in vivoにおける被検薬の抗腫瘍活性試験は
CRJ−CD−１（ICR系、雄性、７週齢）マウスを
使用して実施した。腫瘍細胞としてはSarcoma−180腹水癌細胞を
用い、これをHank溶液に浮遊させラマウスの腹
腔内に0.1ml（細胞数２×10⁶cells）接種した。この腫瘍細胞接種後、１日１回５日間連続して
被検薬の所定量を腹腔内に投与して、その生存数
を観察した。実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF−1000を
被検薬とした結果を第５表に示す。【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性物質SPF−1000 0.1％水溶液
の紫外線吸収スペクトルを示し、第２図は同じく
赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性物質
SPF−1000。１元素分析Ｃ：53.91％〜51.55％Ｈ：5.87％〜4.84％Ｎ：12.86％〜11.47％２分子量ゲル濾過法による測定では、分子量約500〜
15000である。３分解点本物質は150℃で褐変し、200℃になると黒色
となり分解する。４比旋光度〔α〕²⁰ _D＝−5.0゜〜−50.0゜（Ｃ＝1.00）５紫外線吸収スペクトル本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは、275nmに吸収極大が認められる。６赤外線吸収スペクトル 3120cm^-1、2400cm^-1、1640cm^-1、1400cm^-1、
1300cm^-1、1150cm^-1、540cm^-1 に吸収が認められる。７溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール
には一部溶解し、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタ
ノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、アセトン、メチルイソブチルケト
ン、エチルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶
である。８塩基性、酸性、中性の区別本物質の1.0％の水溶液のPHは6.5である。９物質の色淡黄色粉末状である。 10 呈色反応ニンヒドリン反応＋ビユウレツト反応＋ローリー反応＋モーリツシユ反応 − デイシエ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化本物質はＬ−システイン、ジチオスレイトー
ル（DTT）、グリセロール、アルブミン、グロ
ブリン、α−およびβ−サイクロデキストリ
ン、硫酸アンモニウム、食塩等の添加によつて
安定化される。２ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF−1000生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
物質SPF−1000を採取することを特徴とする抗腫
瘍性物質SPF−1000の製法。３ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF−1000生産菌を培養するに際し、培養中の適
当な時期にペニシリン又はその関連物質を添加し
て培養することを特徴とする特許請求の範囲第２
項に記載の抗腫瘍性物質SPF−1000の製法。