JPH0155274B2

JPH0155274B2 -

Info

Publication number: JPH0155274B2
Application number: JP59072865A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; Hideo Kamyama; Junichi Taniguchi; Keiji Adachi
Original assignee: Shikishima Boseki KK
Current assignee: Shikishima Boseki KK
Priority date: 1984-04-13
Filing date: 1984-04-13
Publication date: 1989-11-22
Also published as: JPS60218323A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な抗腫瘍性物質SPF−100及び
その製法に関するものである。従来、溶連菌の生菌体を弱毒化して製剤化した
ものは、すでに制癌剤として使用されている。また、ストレプトコツカス・ピオゲネスの菌体
を破砕後水または塩類溶液で有効成分を抽出し、
有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱として、
回収する方法（特公昭38−1647）、溶連菌を溶菌
酵素、リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解
酵素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分とし
て分画する方法（英国特許第1163865号）などが
知られている。このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水可溶性もしくは不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。このような処理
によれば、精製は複雑となり、有効成分の単離は
きわめて困難であつた。実際に分離し、有効成分
として測定された例では分子量150000の蛋白質が
知られている。（特公昭48−43841）本発明者らは、よりすぐれた抗腫瘍性有効成分
を溶連菌に求めて鋭意研究した結果、全く新規な
抗腫瘍性物質SPF−100を培養液中に見出すに至
つたのである。本発明の抗腫瘍性物質SPF−100は培養中菌体
外に排出され、培養液中に存在するようになるの
で、菌体を過して除去し、培養液を精製すれ
ばよいので、単離はかなり容易なものとなる。本発明の抗腫瘍性物質SPF−100は培養液中に
排出されるとともに、分子量が約500〜25000であ
ることによつて特長づけれる。従来、溶連菌関連の抗腫瘍性物質で、培養液中
に蓄積されたものではなく、また分子量も数万以
下のものは知られておらず、本発明の抗腫瘍性物
質SPF−100は全く新規な物質と認められる。また、本発明の抗腫瘍性物質SPF−100は、元
素分析、呈色反応等からペプチド性物質と認めら
れるが、紫外線吸収スペクトルで特異な吸収があ
り、従来広く知られた抗腫瘍活性物質などとも明
らかに相違する物質であつて、物質として新規な
ものと認められるものである。本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性物質SPF−100生産菌を培養し、培養物から
抗腫瘍性物質SPF−100を採取することを特徴と
する抗腫瘍性物質SPF−100の製法を包含するも
のである。本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性物質SPF−100生産菌が広く使用さ
れるが、その一例としてストレプトコツカス・ピ
オゲネス（Streptococcus pyogenes）
ATCC21060があげられる。培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌が有効に生育する培地であれ
ば炭素源、窒素源等含んだ一般培地も使用するこ
とができる。培養はpH5.0〜8.0、好ましくは6.1〜7.2で30〜
40℃好ましくは35〜37℃であり嫌気的に静置培養
をおこなうのが一般的であるが、その他撹拌培養
等の変法も採用することができる。本発明においては、培養中の適当な時期にペニ
シリン又はその関連物質を添加することが、抗腫
瘍性物質SPF−100の取得に重要な役割をはたす
ことになる。ペニシリン又はその関連物質の添加時期は37℃
の培養で対数増殖期にかかつて後３〜20時間の
間、特に５〜10時間が好ましい。その後１時間及
至20時間好ましくは３〜15時間そのまま培養を続
けることによつて、培養液中に抗腫瘍性物質SPF
−100を多量蓄積させることができる。ペニシリン又はその関連物質としてはすでに知
られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物質で
あればいかなるものでもよいが、ペニシリンＧが
普通用いられる。添加量はペニシリンＧで100〜
3000単位／ml、好ましくは300〜1500単位／ml培
養液程度で十分である。得られた培養液は、遠心分離によつて菌体を除
去し、液に硫安を添加し50〜90％飽和度の画分
を分散して得られた沈澱物を安定剤を加えた緩衝
液に溶解する。抗腫瘍性物質SPF−100含有液は凍結状態で又
は凍結乾燥して保存することができる。この物質
は必要に応じてイオン交換体あるいはゲル過剤
と接触せしめてさらに精製することができる。イ
オン交換体としてはイオン交換樹脂、イオン交換
セルローズ、イオン交換セフアデツクス（フアル
マシア社製）等が用いられ、ゲル過剤として
は、トヨパールHW50FまたはHW−50SF（東洋
曹達(株)製）、セフアデツクス（フアルマシア社製）
等が用いられる。またカルシウムホスフエートゲ
ルはそのままでも使用できるが、ハイドロキシル
アパタイトの形で使用するのが便利である。前記
のようにして得られた物質の水溶液をこれらのイ
オン交換体又はゲル過剤を充填したカラムに、
適当な速度で通過せしめるか、あるいはイオン交
換体又はゲル過剤を入れた一定容器中に一度に
その水溶液を加えて、これらの処理剤と有効物質
を接触させる。溶出は適当な塩濃度とpHの緩衝
液を用いて行なう。イオン交換体、ゲル過剤又
はカルシウムホスフエートゲルは２種以上組合わ
せて用いることもできる。たとえばDEAEセフア
デツクスと接触させ、溶出した液を更にトヨパー
ルHW50Fまたは50SFと接触させそして溶出を行
なうと、更に精製の効果を上げることができる。実施例８で得られた本発明の抗腫瘍性物質SPF
−100はペプチド性物質で、凍結乾燥すると淡黄
色の粉末となる。次に、抗腫瘍性物質SPF−100の理化学的性質
を示す。１元素分析Ｃ：46.42％〜43.69％Ｈ： 5.94％〜 4.85％Ｎ：11.42％〜 9.50％２分子量ゲル過法による測定では、分子量約500〜
25000である。３分解点本物質は160℃で褐変し、200℃になると黒色
となり分解する。４比旋光度〔α〕²⁰ _D＝＋45.0゜（ｃ＝1.00）５紫外線吸収スペクトル本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは第１図に示される。257nm、265nm、
280nm、287nmおよび325nmに吸収がみられ、
特徴的である。６赤外線吸収スペクトル第２図に示される。 1760cm^-1、1630cm^-1付近、1500cm^-1付近、
1400cm^-1付近、1070cm^-1 に吸収が認められる。７溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール
には一部溶解し、ｎ−ブタノール、イソブタノ
ール、ｎ−プロパノール、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、アセトン、メチルイソブチルケト
ン、エチルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶
である。８塩基性、酸性、中性の区別本物質の1.0％水溶液のpHは6.5である。９物質の色淡黄色粉末状である。 10 呈色反応ニンヒドリン反応＋ビユウレツト反応＋モーリツシユ反応 − デイシエ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化本物質はＬ−システイン、ジチオスレイトー
ル（DTT）、グリセロール、アルブミン、グロ
ブリン、α−およびβ−サイクロデキストリ
ン、（NH₄）₂SO₄、食塩等の添加によつて安定
化される。次に本発明の実施例を示す。なお実施例における抗腫瘍性物質SPR−100の
活性単位の測定は鵜高法（Journal of
Antibiotics vol35No.10 1319〜1325OCT 1982）
によつた。測定には高分子透過性大腸菌変異株
MP−２（FERM−P5432）（Agric.Biol.Chem.43
371（1979））を使用してMP−２に対する抗菌活
性を指標としてバイオ・アツセイする。すなわち、パクト・アンチバイオチツクメデイ
アム（デイフコ社製品）1.75％、寒天1.3％より
成る培地（M₃培地）を120℃、15分加熱殺菌し、
20mlずつシヤーレに分注し、放冷してプレート培
地を調製する。一方、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、
NaCl0.3％、寒天0.8％より成る培地を120℃、15
分加熱殺菌する。その後42℃の恒温槽に保ち、培
地の温度が42℃になつたらあらかじめ37℃で17時
間培養したMP−２菌を１ml中に10⁴個の細胞が
存在する様に培地中に加える。ピペツトによつて
２mlを採取し、あらかじめ作製して置いたM₃培
地表面上に加え、すばやく均一にひろげ固化させ
る。抗腫瘍性物質SPF−100を含む被験液を適当
に希釈して、その溶液0.05mlをペーパー・デイス
ク（直径８mm）（東洋紙）にしみ込ませる。こ
のペーパー・デイスクを前記作製プレート上に置
き、37℃で17時間培養し、抗腫瘍性物質SPF−
100によつてできる阻止円の大きさを測定する。
阻止円の直径10mmを与えるSPF−100の濃度を１
単位（1μ）と定義する。実施例１次の組成の培地Ａ９を用いた。肉エキス１％ポリペプトン１％酵母エキス 0.25％カザミノ酸 0.25％ NaCl 0.1％ pH＝6.9 Streptococcus pyogenes ATCC21060をBHI
培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養おこ
なつた種培養液10mlを培地A1に接種し、種培
養と同一条件で前培養する。この培養液を培地
A8に接種し、10のジヤーフアーメンターを
用いて37℃、11.5hr300rpmで撹拌しながら嫌気
的に培養後、ペニシリンG1000単位／mlを添加
し、更に培養を5hr継続する。得られた培養液を
遠心分離し、菌体を除去した。培養液には抗腫瘍性物質SPF−100が256単
位／ml含有されていた。実施例２次の組成の培地Ｂ９を用いた。肉エキス 1.0％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％ NaCl 0.1％ pH＝7.0 Streptococcus pyogenes ATCC21060を実施
例１と同様に前培養した培養液１を培地B8
に接種し、10ジヤーフアーメンターを用いて37
℃、11hr300rpmで撹拌しながら嫌気的に培養後、
ペニシリンG800単位／mlを添加し、更に培養を
5hr継続する。得られた培養液を遠心分離し、菌
体を除去した。培養液には抗腫瘍性物質SPF−100が351単
位／ml含有されていた。実施例３次の組成の培地９を用いた肉エキス１％ポリペプトン１％酵母エキス 0.25％カザミノ酸 0.25％ pH＝6.2 Streptococcus pyogenes ATCC21060を実施
例１と同様に前培養した培養液１を培地C8
に接種し、10ジヤーフアーメンターを用いて37
℃、14hr300rpmで撹拌しながら嫌気的に培養後、
ペニシリンG1000単位mlを添加し、更に培養を
5hr継続する。得られた培養液を遠心分離し菌体
を除去した。培養液には抗腫瘍性物質SPF−100が298単
位／ml含有されていた。実施例４次の組成の培地D9を用いた。肉エキス 0.5％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％カザミノ酸 0.25％ NaCl 0.5％ pH＝6.5 Streptococcus pyogenes ATCC21060を実施
例１と同様に前培養した培養液１を培地D8
に接種し、10ジヤーフアーメンターを用いて37
℃、15.5hr300rpmで撹拌しながら嫌気的に培養
後、ペニシリンG1200単位／mlを添加し、更に培
養を5hr継続する。得られた培養液を遠心分離し、
菌体を除去した。培養液には抗腫瘍性物質SPF−100が285単
位／ml含有されていた。実施例５次の組成の培地９を用いた。酵母エキス 3.0％ pH＝6.5 Streptococcus pyogenes ATCC21060を実施
例１と同様に前培養した種培養液１を培地E8
に接種し、10ジヤーフアーメンターを用いて
37℃、15hr300rpmで撹拌しながら嫌気的に培養
後、ペニシリンG1000単位／mlを添加し、更に培
養を5hr継続する。得られた培養液を遠心分離し、
菌体を除去した。培養液には抗腫瘍性物質SPF−100が182単
位／ml含有されていた。実施例６下記の培地９を用いた。マルトース 0.3％肉エキス 2.0％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％ pH＝7.0 Streptococcus pyogenes ATCC21060を実施
例１と同様にして前培養した培養液１を培地
F8に接種し、10ジヤーフアーメンターを用
いて、37℃、10.5hr30rpm撹拌しながら嫌気的に
培養後、ペニシリンG1000単位／mlを添加し、更
に培養を5hr継続する。得られた培養液を遠心分
離し、菌体を除去した。培養液には抗腫瘍性物質SPF−100が250単
位／ml含有されていた。実施例７下記の培地Ｇ９を用いた。肉エキス 1.0％ポリペプトン 1.0％ NaCl 0.5％ pH＝7.0 Streptococcus pyogenes ATCC21060を実施
例１と同様にして前培養した培養液１を培地
G8に接種し、10ジヤーフアーメンターを用
いて、37℃、15hr300rpm撹拌しながら嫌気的に
培養後、ペニシリンG1000単位／mlを添加し、更
に培養を5hr継続する。得られた培養液を遠心分
離し、菌体を除去した。培養液には抗腫瘍性物質SPF−100が200単
位／ml含有されていた。実施例８実施例４の培養で得た培養液５は抗腫瘍性
物質SPF−100を143×10⁴単位含有していた。培養液には硫安を添加し50〜90％飽和度の画
分を分取して沈澱物を得た。この沈澱物は抗腫瘍
性物質SPF−100を118×10⁴単位含有していた。この沈澱物全量を安定剤含有緩衝液300mlに溶
解し、溶解液をDEAE−セルロースカラム（５×
70cm）に加え、抗腫瘍性物質SPF−100を吸着さ
せた。これに0.3M NaCl溶液を用いて段階的に
溶出させ、活性部分を分取する。得られた活性は
102.2×10⁴単位であつた。活性部分をDEAE−セフアデツクスＡ−25のカ
ラム（2.6×70cm）に加え、活性部分を吸着させ、
これに燐酸緩衝液中の食塩濃度を直線的に上昇さ
せつつ溶出を行い、活性部分を分取する。得られ
た活性は79.3×10単位であつた。更に、この溶出液を濃縮しゲル過材トヨパー
ルHW−50Fのカラム（2.6×100cm）に加えて吸
着させ、次いで１／100Mリン酸緩衝液
（KH₂PO₄−Na₂HPO₄）で溶出し、活性画分を分
取し、これをSPF−100とした。得れた活性は
71.1×10⁴単位であつた。ここに得られた溶出液を凍結乾燥し抗腫瘍性物
質SPF−100の淡黄色粉末1780mgを得た。実施例８で得た抗腫瘍性物質SPF−100を被媒
薬として、in vitro、in vitro in vivo、in vivo
それぞれの実験に供し、抗腫瘍活性について効果
を確認した。試験例１（in vitro試験） in vitroにおける被験薬の抗腫瘍活性測定試験
に細胞生長度測定法にもとづき実施した。癌細胞としてはＰ−388およびＬ−
1210Lymphoma（リンパ腫）（DBA／２系マウス
同系移植腫瘍をin vitroで継代培養）を用い、こ
れをそれぞれ10％FCS添加RPMI1640培地（５×
10^-5M2−メルカプトエタノール、50mg／カナ
マイシン含有）に懸濁する。この培養液１mlをフ
アルコン3047プレートに注入し、癌細胞が５×
10⁴cells／wellになるようにする。ついでこの培
養液に所定量の被験薬（0.1mlの培養液に溶解又
は懸濁）を注入して、37℃で５％CO₂存在下に培
養する。被験薬注入後48時間経過してから生体染
色（ニグロシンＢを使用）を行ない、次式により
細胞生長度を算出した。細胞生長度＝各実験群の細胞数／対照群の細胞数×
100 この結果を第１表に示す。

【表】試験例２（in vitro in vivo試験） in vitro in vivoにおける試験薬の抗腫瘍活性
試験はddy系雌性、４又は５週齢マウスを使用し
て実施した。癌細胞としてはエーリツヒ腹水癌細胞を用い、
これをKRP緩衝液に懸濁し、次いで被験薬の所
定量を混合して37℃で60分又は80分インキユベー
トする。この液0.2ml（癌細胞４×10⁶cells又は８
×10⁶cells）をマウス１個体当り１日１回７日間
連続して腹腔内に接種して、これらのマウスの生
存数を観察した。この結果を第２表及び第３表に
示す。

【表】第２〜５表において、表示は生存数／使用
数を示す。

【表】試験例３（in vivo試験） in vivoにおける被験薬の抗腫瘍活性試験は
CRJ−CD−１（ICR）系、雄性、７週齢マウスを
使用して実施した。癌細胞としてSarcoma−180腹水癌細胞を用
い、これをHank溶液に浮遊させ、マウスの腹腔
内に0.1ml（癌細胞２×10⁶cells）接種した。この癌細胞接種前１日１回５日間又は前後に１
日１回、前に５日間、後に５日間連続して被験薬
の所定量を腹腔内に投与して、その生存数を観察
した。その結果を第４表および第５表に示す。

【表】

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性物質SPF−100 0.1％水溶液
の紫外線吸収スペクトルを示し、第２図は同じく
赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性物質
SPF−100。１元素分析Ｃ：46.42％〜43.69％Ｈ： 5.94％〜 4.85％Ｎ：11.42％〜 9.50％２分子量ゲル濾過法による測定では分子量約500〜
25000である。３分解点本物質は160℃で褐変し200℃になると黒色と
なり分解する。４比旋光度〔α〕²⁰ _D＝＋45.0゜（Ｃ＝1.00）５紫外線吸収スペクトル本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは、257nm、265nm、280nm、287nmおよ
び325nmに吸収が認められる。６赤外線吸収スペクトル 1760cm^-1、1630cm^-1付近、1500cm^-1付近、
1400cm^-1付近、1070cm^-1 に吸収が認められる。７溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノール
には一部溶解し、ｎ−ブタノール、イソブタノ
ール、ｎ−プロパノール、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、アセトン、メチルイソブチルケト
ン、エチルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶
である。８塩基性、酸性、中性の区別本物質の1.0％の水溶液のpHは6.5である。９物質の色淡黄色粉末状である。 10 呈色反応ニンヒドリン反応＋ビユウレツト反応＋モーリツシユ反応 − デイシエ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化本物質はＬ−システイン、ジチオスレイトー
ル（DTT）、グリセロール、アルブミン、グロ
ブリン、α−およびβ−サイクロデキストリン
（NH₄）₂SO₄、食塩等の添加によつて安定化さ
れる。２ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF−100生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
物質SPF−100を採取することを特徴とする抗腫
瘍性物質SPF−100の製法。３ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF−100生産菌を培養するに際し、培養中の適
当な時期にペニシリン又はその関連物質を添加し
て培養することを特徴とする特許請求の範囲第２
項に記載の抗腫瘍性物質SPF−100の製法。