SE461532B - Cancermotverkande och immunaktiverande aemne (spf-100) - Google Patents

Description

461 532 10 15 20 25 30 35 2 1 Såsom ovan beskrivits har det varit välkänt att streptokocker själva eller några ingreidenser därav uppvisar en tumöricid aktivitet. De konventionellt kända substanserna är emellertid endast bakteriekroppar eller lösliga eller olösliga polymerbestàndsdelar av celler. För att isolera en aktiv ingrediens från en bakterie är det nödvändigt att bakteriolysera eller mekaniskt mala bakterien för att fraktionera det hela.

Dessa behandlingar kan komplicera reningen så att isoleringen av en aktiv ingrediens är mycket svàr.

Ett exempel pà en aktiv ingrediens som faktiskt iso- lerats och bestämts är ett protein med en molekylvikt av 150 OO0 (jfr japanska patentpublikationen nr 43841/1973).

Sammanfattning av uppfinningen Vi har ansett att rening av olika bakteriella produkter som alstras av streptokocker kan förenklas till en avsevärd utsträckning genom uttömning av dessa produkter utanför bakteriekroppen under loppet av odlingen och att mer användbara fysiologiskt aktiva substanser därigenom vidare kan hittas. Som ett resultat av vår forskning ur ovannämnda synvinkel har vi lyckats uttömma en bakteriell produkt utanför bakteriekroppen genom att tillsätta penicillin under loppet av odlingen.

Sålunda tillhandahåller föreliggande uppfinning ett sätt som omfattar tillsättning av penicillin eller besläktade substanser vid en lämplig tidpunkt under loppet av odling av Streptocoecus pyogenes och isolering av en substans benämnd SPF-lO0 från den sålunda erhållna kulturbuljongen.

SPF*lOO är en ny substans. Den uppvisar ett brett spektrum av molekylvikter och kan klassificeras i en lágmolekylär fraktion benämnd SPF-l och en högmo- lekylär fraktion benämnd SPF-2.

Kort beskrivning av ritningarna Fig l visar ett ultraviolett absorptionspektrum av en O,l% vattenhaltig lösning av SPF-lOO, medan 10 15 20 25 30 35 " 461 532 3 fig 2 visar ett infrarött absorptionsspektrum av SPF-100.

Fig 3 visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av en 3,3% vattenhaltig lösning av SPF-l, medan fig 4 visar ett infrarött absorptionsspektrum av SPF-1.

Fig 5 visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av en O,2% vattenhaltig lösning av SPÉ-2, medan fig 6 visar ett infrarött absorptionsspektrum av SPF-2.

Detaljerad beskrivning av föredragna utföringsformer SPF-100 uppvisar en direkt cancermotverkande effekt och en immunoaktiverande effekt.

I sättet enligt föreliggande uppfinning uttömmes en bakteriell produkt utanför kroppen och in i mediet.

Därför kan den isoleras genom en tämligen förenklad metod, dvs genom avfiltrering av bakteriekropparna och rening av den filtrerade kulturbuljongen.

Man har känt till ett sätt som omfattar odling av en streptokock och försvagning av den erhållna bakterien genom behandling med penicillin. Man har emellertid aldrig rapporterat ett sätt som omfattar uttömning av en bakteriell produkt utanför kroppen genom tillsättning av penicillin under loppet av od~ lingen.

Vid sättet enligt föreliggande uppfinning kan vilken som helst streptokock användas. Exempel på bakterier är följande: Streptococcus pyogenes ATCC 21060; Streptococcus sp. ATCC 21597; Streptococcus pyogenes ATCC 21546; Streptococcus pyogenes ATCC 21547; och Streptococcus pyogenes ATCC 21548.

Naturliga medier, såsom köttextrakt-medium, jäst- extrakt-medium och hjärna-hjärta-infusions-medium (BHI-medium) har ofta använts, ehuru vanliga medier innehållande kol-kvävekällor kan användas så länge som streptokocker effektivt kan odlas däri.

Streptokocker kan odlas under lämpliga betingel- ser, vid ett pn av 6,0 till 8,0, (företrädesvis 6,8 461 53-2 10 15 20 25 30 35 4 till 7,2) och en temperatur av 30 till 40°C,-(före- trädesvis 35 till 37°C). I allmänhet användes en ana- erob och statisk kultur, ehuru någon annan metod inbe- gripande omrörd kultur kan användas.

Enligt föreliggande uppfinning tillsättes penicil- lin'eller besläktade substanser vid en lämplig tid- punkt under loppet av odlingen för att uttömma olika användbara substanser som alstrats av bakterien utan- för bakteriekroppen, varigenom dessa produkter acku-0 muleras i mediet.

Varje besläktad substans som är känd för att uppvisa en liknande effekt som penicillin kan användas, ehuru vanligen Penicillin -G eller Cephalosporin C användes. Penicillin G användes i en mängd av 100 till 7000 enheter/ml av mediet och företrädesvis l0OO till 5000 enheter/ml av mediet. Cephalosporin C an- vändes i en mängd av 10 till 4000 pg/ml av mediet och företrädesvis 100 till 1500 mg/ml av mediet.

Pencillín eller besläktade substanser kan till- sättas 3 till 15 h, företrädesvis 5 till 10 h, efter initiering av den logaritmiska tillväxtfasen när bak- terien odlas vid 3700. Fortsättning av odlingen i l till 20 h, företrädesvis 5 till 15 h, därefter gör det möjligt att ackumulera en stor mängd av en bak- teriell produkt i mediet.

Den sålunda erhållna kulturbuljongen centrifugeras 7 för avlägsnande av bakterien och ammoniumsulfat sättes till filtratet. Efter àtervinnande av fraktioner med 50 till 90% av mättnadsgraden löses den erhållna fäll- ningen i en buffertlösning innehållande ett stabilise- ringsmedel. I Den erhållna lösningen innehållande SPF-100 kan lagras i en frusen eller lyofiliserad form. Denna substans kan vidare renas genom att den bringas 1 kontakt med en jonbytare eller ett gelfiltreringsma- 10 15 20 25 30 35 461 532 5 terial. Jonbytare, såsom ett jonbytarharts, än jon- bytarcellulosa eller jonbytar-Sephadex (en produkt från Pharmacia AB) och gelfiltreringsmaterial, såsom Toyopearl HW-SOF eller HW-SOSF (en produkt från Toyo Soda Kabushikí Kaisha) eller Sephadex (en produkt från Pharmacia AB) kan användas. Därtill kan kalcium- fosfatgel användas som sådan, ehuru,det är lämpligt att använda den i form av hydroxylapatit. En vatten- haltig lösning av substansen som erhållits på ovannämnda sätt kan få passera genom en kolonn i vilken dessa jonbytare eller gelfiltreringsmaterial satsas i en lämplig mängd. Alternativt kan den vattenhaltiga lös- ningen införas i en behållare som innehåller dessa jonbytare eller gelfiltreringsmaterial på en gång för att bringa den aktiva substansen i kontakt med behandlingsmaterialen. Eluering kan utföras med en buffertlösning som har en lämplig saltkoncentration och ett lämpligt pH-värde. Två eller flera jonbytare, gelfiltreringsmaterial eller kalciumfosfatgel kan kombineras om så önskas. Exempelvis kan en lösning av SPF-100 elueras genom att den bringas i kontakt med DEAE-Sephadex och därefter kan eluatet vidare elueras genom att det bringas i kontakt med Toyopearl HWSOF eller SOSF för att därigenom erhålla en förbättrad reningseffekt.

SPF-100 enligt föreliggande uppfinning, som erhål- les i Exempel 8, vilket kommer att nedan beskrivas, är en peptidliknande substans-och blir ett blekgult pulver när det lyofilieras.

Fysikalisk-kemiska egenskaper hos den tumöricida kompositionen SPF-100 är följande: l. Elementaranalys C: 46,42 till 43,69 %, H: 5,94 till 4,85 %, och N: 11,42 till 9,50 %. 461 532 10 20 25 30 35 I 2. Molekylvikt Ungefär 500 till 25 OOO såsom bestämts genom gelfiltrering. 3. Sönderdelníngsgunkt Den blir brun vid IGOOC och svart vid ZOOOC och sönderdelas. 4. Sgecifik rotation [ago = + 4s,o° (c = 1,oo). 5. Ultravíolett absorptionsspektrum Pig l visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av en 0,l% vattenhaltig lösning, vilket karaktärise- ras av absorptionerna vid 257, 265, 280, 287 och 325 nm. 6. Infrarött absorptionsspektrum Fig 2 visar ett infrarött absorptionsspektrum. 7. Löslighet i lösningsmedel Den är löslig i tvätten, aewis 165119 i metamn och etanol samt svârlöslig eller inte alls löslig i lösningsmedel inbegripande n-butanol, isobutanol, n-propanol, n-hexan, kloroform, aceton, metylisobu- tylketon och etyleter. 8. Aciditet pH-värdet för en 1,0% vattenhaltig lösning är 6,5. 9- Essm Blekgult pulver 10. Färgreaktioner ninhydrin-reaktion: +, biuret-reaktion: +, Molisch-reaktion -, Dische-reaktion: -, antronreaktion: -, och cysteinsulfatreaktion: -. ll. Stabilitet Den kan stabiliseras genom tillsättning av L-cyste- in, ditiotreitol (DTT), glycerol, albumin, globulin, af och B-cyklodextrin. (NH4)2S04, koksalt eller lik- nande. 10 15 20 25 30 35 461 532 7 Nu skall exempel på utföringsformer av förelig- gande uppfinning beskrivas.

I följande exempel bestämdes aktivitetsenheten hos SPF-100 genom Udaka's metod, se Journal of Anti- biotics, Vol. 35, No. lO, l3l9-1325 (Okt., 1982).

Aktiviteten bioanalyserades med användning av en makro- molekyl-permeabel mutant av en kolonbacill MP-2 (FERM- -P5432) (se Agric. Biol. Chem., Vol. 43, p. 371 (1979)) med ledning av den antibakteríella aktiviteten mot MP-Z . _ Med andra ord ett medium (dvs M3~medium) beståen- de av 1,75% Bact Antibiotic medium 3 (en produkt fràn Difco) och 1,3% agar steriliserades genom upphettning till 12006 i l5 min. Därefter hälldes 20 ml portioner av mediet i Petri-skålar och de fick kallna för fram- ställning av plattmedium.

A andra sidan steriliserades ett medium bestående av O,5% pepton, O,5% köttextrakt, O,3% NaCl och O,8% agar genom upphettning till l20°C i 15 min. Sedan placerades det i en termostat vid 42°C. När mediets temperatur nådde 4206, sattes MP-2, som hade odlats vid 37°C i 17 h, till mediet vid en koncentration av 104 celler/ml. Två milliliter av mediet uppsamlades med en pipett och sattes på ytan av M3-mediet, som tidigare framställts. Sedan utspreds det tillförda mediet omedelbart homogent och stelnade.

En testlösning innehållande SPF-100 späddes pà lämpligt sätt. En pappersskiva (diameter 8 mm), en produkt från Toyo Roshi Co., Ltd) vättes med den sålun- da erhàllna lösningen. Därefter placerades denna pap- persskiva på den ovan preparerade plattan och odlades i 17 h vid 3706 för bestämning av diametern hos den ínhiberingszon som resulterade från SPF-100. Därefter definierades den koncentration av SPF-100 vid vilken inhiberingszonens diameter var 10 mm som en enhet (1 u). 461 532 EXBMPEL 1 \ 9 liter medium A med följande sammansättning användes: Köttextrakt l % 5 Polypepton 1 % Jästextrakt 0,25 % Kasaminosyror 0,25 % och (syrahydro- lyserat kasein) lo NaCl 0 , l % (pH = 6,9). 100 ml av ett BHI-medium inokulerades med Strep- tococcus pyogenes ATCC 21060 och underkastades en statisk odling under 8 h vid 37°C för erhållande av 15 en ympkulturvätska. Sedan inokulerades 1 liter av mediet A med 100 ml av den sålunda erhållna ympkul- turvätskan och underkastades en förkultivering under samma betingelser som de för ympkulturvätskan. Därefter inokulerades 8 liter av mediet A med den sålunda erhåll- ZO na kulturvätskan och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min under 11,5 h vid 3700. Sedan tillsattes 1000 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes under ytterligare 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centri- 25 fugerades för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 256 u/ml SPF-leo. ' EXEMPEL 2 9 liter medium B med följande sammansättning 30 användes: Köttextrakt 1,0 % Polypeptøn 1,0 % Jästextrakt 0,25 % och NaCl 0,1 % (pH = 7,0). 35 10 15 20 25 30 35 461 532 9 8 liter av medium B inokulerades med 1 fiiter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes ATCC 21060 förkultiverats på samma sätt som beskrivits i Exempel 1 och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min under 11 n via 37%. sedan tilisattes soo u/ml penicillin G och odlingen fortsattes under ytterliga- re 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugera- des för avlägsnande av bakterien. .

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 351 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 3 9 liter medium C med följande sammansättning användes: Köttextrakt l % Polypepton 1 % Jästextrakt 0,25% och Kasaminosyror 0,25 % (pH = 6,2. 8 liter av mediet C inokulerades med l liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes ATCC 21060 hade förkultiverats på samma sätt som be- skrivits i Exempel 1 och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min i 14 h vid 3706. Sedan tillsattes 1000 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i ytterligare 5'h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugerades för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 298 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 4 9 liter medium D med följande sammansättning användes: Köttextrakt 0,5 % Polypepton 1,0 % 461 10 15 20 25 30 35 532 10 Jästextrakt 0,25 % \ _Kasaminosyror 0,25 % och NaC1 0,5 % (pH = 6,5) 8 liter av medium D inokulerades med l liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes ATCC 21060 förkultiverats pá samma sätt som beskrivits i Exempel 1 och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min under 15,5 n vid 37°c. Därefter tillsattes 12øo u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i ytterliga- re 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugera- des för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 285 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 5 9 liter medium B med följande sammansättning användes: Jästextrakt 3,0 % (pH = 6,5) 8 liter av mediet E inokulerades med I liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococeus pyegenes ATCC 21060 hade förkultiverats på samma sätt som be- skrivits i Exempel l och odlades anaerobt under omrëring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 3oo r/min 1 lsln vid s7°c. Därefter tillsattes iooo e/mi penicillin G och odlingen fortsattes i ytterligare 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugerades för avlägsnande av bakterien._ 7 Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 182 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 6 9 liter medium F med följande sammansättning användes: 10 15 20 25 30 35 461 552 11 I Maltos 0,3 % Köttextrakt 2,0 % Polypepton 1,0 % och Jästextrakt 0,25 % (pH = 7,0). 8 liter av mediet F inokulerades med 1 liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes ATCC 21060 hade förkultiverats på samma sätt som be- skrivits i Exempel l och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av zoo r/min under 1o,s h via 37%.. Därefter tillsattes 1000 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i yt- terligare 5 h. Den erhàllna kulturbuljongen centri- fugerades för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 250 u/ml SPF-lO0« EXEMPEL 7 9 liter medium G med följande sammansättning användes: Köttextrakt l,O % Polypepton 1,0 % och NaCl 0,5 % (pä = 7,0). 8 liter av mediet G inokulerades med I liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes ATCC 21060 hade förkultiverats på samma sätt som.be~ skrivits i Exempel 1 och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min i 15 h vid 3706. Därefter tillsattes 1000 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i ytterligare 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugerades för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 200 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 8 9 liter medium H med följande sammansättning användes: 461 10 15 20 25 30 35 53-2 12 Köttextrakt 1,0 % _ Polypepton 1,0 % Jästextrakt 0,25 % Kasaminosyror 0,25 % och NaC1 0,1 % (pH = 7,0) 8 liter av mediet H inokulerades med 1 liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus spa ATCC 21597 hade förkultiverats pá samma sätt som beskrivits i Exempel 1 och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min under ll h vid 37°C. Därefter tillsattes 1000 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i ytterligare 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugerades för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 250 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 9 9 liter medium I med följande sammansättning användes: Köttextrakt 0,5 % Folypepton 1 % Jästextrakt 0,25 % Kasaminosyror 0,25 % och NaCl 0,1 % (pH = 6,5). 8 liter av mediet I inokulerades med l liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes- ATCC 21546 hade förkultiverats på samma sätt som be- skrivits i Exempel 1 och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min i ll h vid 3706. Därefter tillsattes 1000 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i ytterligare 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugerades för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 340 u/ml SPF-100. 10 15 20 25 30 35 "~ 461 532 13 EXEMPEL 10 ' 9 liter medium J med följande sammansättning användes: Köttextrakt 2,0 % Polypepton l,0 % Jästextrakt 0,25 % Kasaminosyror 0,25 % och NaCl 0,5 % (pH = 6,5) 8 liter av mediet J inokulerades med 1 liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes ATCC 21547 hade förkultiverats på samma sätt som be- skrivits i Exempel l och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min under 8 h vid 37°C. Därefter tillsattes 1500 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i yt- terligare 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centri- fugerades för avlägsnande av bakterien.

Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 320 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 11 , 9 liter medium K med följande sammansättning användes: Maltos 0,3 % Polypepton l,0 % och Jästextrakt o,25 % (pa = e,s>. 0 8 liter av mediet K inokulerades med 1 liter av en ympkulturvätska i vilken Streptococcus pyogenes ATCC 21548 hade förkultiverats på samma sätt som be- skrivits i Exempel 1 och odlades anaerobt under omröring i en skakfermentor (10 liter) vid en hastighet av 300 r/min i 5 h vid 3706. Därefter tillsattes 1000 u/ml penicillin G och odlingen fortsattes i ytterligare 5 h. Den erhållna kulturbuljongen centrifugerades för avlägsnande av bakterien. 461 532 lO 15 20 25 30 35 14 , Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 270 u/ml SPF-100.

EXEMPEL 12 5 liter av den filtrerade kulturbuljongen som erhållits vid odlingen i Exempel 4 innehöll l43xlO4 u SPF-100.

Ammoniumsulfat sattes till den filtrerade kul- turbuljongen och en fraktion av 50 till 90% mättnads- grad återvanns för erhållande av en fällning. Denna fä11ning innehöli 11sx1o4 u sPF-1oo.

Hela fällningen löstes i 300 ml av en fosfatbuf- fertlösning, och den sålunda erhållna lösningen inför- des i en DEAE-cellulosakolonn (5x7O cm) för att däri- genom absorbera SPF-100. Sedan eluerades den steg- vis med en 0,3M NaCl lösning för att fraktionera den aktiva fraktionen. Den sålunda erhållna aktiviteten var l02,2xlO4 u.

Därefter infördes den aktiva fraktionen i en DEAE-Sephadex A-25 kolonn (2,6x7O cm) för att absor- bera den aktiva fraktionen. Därefter eluerades den medan koncentrationen av koksalt i fosfatbuffertlös- ningen höjdes lineärt för att återvinna den aktiva fraktionen. Den sålunda erhållna aktiviteten var 79,3x1o4 u.

Dessutom_koncentrerades eluatet och infördes i en kolonn (2,6xlO0 em) av ett gelfiltreringsmate- rial Toyopearl HW-SOF för absorption. Därefter elue- rades den medlen l/100 M fosfatbuffertlösning (KHZPO4-Na2HPO4) för âtervinnande av en aktiv frak- tion, vilken beteeknades SPF-100. Den sålunda erhåll- na aktiviteten var 7l,lxlO4 u.

Det sålunda erhållna eluatet lyofiliserades för erhållande av 1780 mg SPF-100 i form av ett blekgult pulver. 10 15 20 25 30 461 532 15 Det i Exempel 12 erhållna SPF-100 underkastades test in vítro, in vitro/in vivo samt in vivo som ett testagens för att undersöka dess tumörícida effekt. ïggtgggrgggLl (in vitro test) Testagensets tumöricida aktivitet in vitro be- stämdes i enlighet med bestämningen av graden av cell- tillväxt.

P-388 och L-1210 Lymfom erhållna genom subodling av isologiskt implanterade tumörer av DBA/tvà linjer möss användes såsom cancerceller. Dessa lymfom suspen- derades i respektive fall i ett RPMI 1640 medium inne- hållande 5xlO_5 kanamycin och därtill sattes 10% FCS. Sedan injice- rades l ml av detta medium i en Falcon 3047 platta M 2-merkaptoetanol och 50 mg/liter vid en koncentration av cancerceller av 5xlO4 cel- ler/brunn. Därefter injicerades en särskild mängd av testagenset, som hade lösts eller suspenderats i 1 ml av mediet, i det ovannämnda mediet och odlades i närvaro av 5% C02 vid 3706. 48 h efter injiceringen av testagenset utfördes vital färgning med nigrosin och graden av celltillväxt bestämdes genom följande ekvation: g Antal celler i varje Grad av celltillväxt (%) = testgrugg X 100 ' Antal celler i kon- trollgruppen Tabell l visar resultatet. 4(51 10 15 20 25 30 35 5352 16 TABELL 1 Grad av celltillväxt (%) Dos ag SPF-100 Lymfom (x 10 u) P-388 L-1210 4,7 92,0 98,6 9,3 83,9 94,6 18,6 78,2 68,0 37,2 57,2 49,2 ¶§§§§§empel_2 (in vitro/in vivo test) Testagensets tumöricida aktivitet in vitro/in vivo bestämdes med användning av ddy-honmöss som var 4 eller 5 veckor gamla.

Ehrlich ascites-cancerceller, som användes såsom cancerceller, suspenderades i en KRP-buffertlösning, varefter det hela blandades med en särskild mängd* av testagenset och inkuberades i 60 eller 80 min i 37°C. Mössen inokulerades intraperitonealt med 0,2 ml portioner (0,2 ml/mus) av mediet innehållande 4x1O6 eller 8xl06 cancerceller för observation av antalet vitala möss. Tabellerna 2 och 3 visar resultaten.

- TABELL 2 Tumöricid aktivitet hos SPF-100 (antal vitala möss) (ddy-honmus som var 5 veckor qammal) P23 ____D°S (ul 9 E lä Q lå Kontroll (O) 8/8 8/8 7/8 1/8 0/8 o,s2s X 102 s/s s/s s/e 6/s 3/8 10 X 102 s/a s/s s/a 6/s 2/s 10 15 20 25 30 35 -~ 461 552 17 1 I tabellerna 2 till 5 anger siffrorna antalet vitala möss/antalet använda möss.

TABELL 3 Tumöricid aktivitet hos SPF-100 (antal vitala möss) (ddy-honmöss som var 4 veckor gamla) PÉE 29§ (El Q lg lå 29 åå Kamran (o) a/s a/s- z/s o/s o/a zo X lo? s/ß s/8 8/8 8/s 6/s E§§§eëeæBel_å (in vivo test) Testagensets tumöricida aktivitet in vivo bestämdes med användning av CRJ-CD-l (ICR) hanmöss som var 7 veckor gamla. _ Sarcoma-180 ascites-cancerceller, vilka användes såsom cancerceller. suspenderades i en Hank's lösning.

Därefter inokulerades mössen intraperitonealt med 0,1 ml portioner av suspensionen innehållande 2xl06 cancerceller.

En särskild mängd av testagenset administrerades intraperitonealt ät mössen en gäng per dag under fem på varandra följande dagar innan inokulering av can- cerceller eller en gång per dag under respektive fem på varandra följande dagar innan och efter inokuleringen av cancerceller för att observera antalet vitala möss; Tabellerna 4 och 5 visar resultaten. 4651 10 15 20 25 'ao 35 5152 18 \ TABELL 4 Tumöricid aktivitet hos SPF-100 (antal vitala möss) (administrerat före inokulerinqen) Dag __.___D°S (u) Q i lQ lå ”2_0_ .ZÃ Kontroll (O) 8/8 8/8 8/8 2/8 O/8 1 X 102 s/a a/s s/a s/a 4/s 1øo X 102 s/8 s/8 s/8 4/s 2/s TABELL 5 (administrerat före och efter inokuleringen) Dag Dos (ul Q lg Lä gg gå Kontroll (O) 8/8 8/8 8/8 3/8 l/8 1 X 102 s/s s/s s/s 1/8 4/s zo X 102 s/e s/e 1/s 5/s 2/s EXEMPEL 13 1000 mg SPF>l00 som erhållits på samma sätt som beskrivits i Exempel 8 i form av ett blekgult pulver löstes i 30 ml av en fosfatbuffertlösning och hälldes i en SEPHADEX A-25 kolonn (2,6x70 cm) för att absor- bera SPF-lO0. Sedan eluerades den medan koncentra- tionen av koksalt i fosfatbuffertlösningen höjdes lineärt för erhållande av en aktiv fraktion. Därefter koncentrerades hela den erhållna aktiva fraktionen till 5 ml och hälldes i en kolonn av ett gelfiltre- ringsmaterial Toyopearl HW-SOF (2xlOO cm) och eluera- 10 15 20 25 30 35 " 461 532 19 des med en fosfatbuffertlösning för erhållande av en aktiv fraktion innehållande en substans med en molekylvikt av ca 500 till ca 7000. Den aktiva frak- tionen lyofiliserades för erhållande av 350 mg av ett vitt pulver, vilket benämdes SPF-1.

De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos SPF~l var följande: 1. Elementaranalys C: 41,26 % H: 4,91 % N: 6,52 % 36,64 % 4,10 % 5,40 % 2. Molekylvikt Ungefär 500 till 7000 såsom bestämts genom gel- filtrering. 3. Sönderdelningsgunkt Det blev brunt vid 17006 och svart vid 200°C och sönderdelades. 4. Sgecifik rotation [MÉG = + 63,3 - e4,3-° (c = 1,04). 5. Ultraviolett absorptionsspektrum Fig 3 visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av en 3,3% vattenhaltig lösning, vilken.karaktåriseras av absorptioner vid 257, 265, 280 och 287 nm. 6. Infrarött absorptionsspektrum Fig 4 visar ett infrarött absorptionsspektrum. 7. Löslighet i lösningsmedel Det var lösligt i vatten, men olösligt i lösnings- medel inbegripande metanol, etanol, n~butanoI, ísobu- tanol, n-propanol, n-hexan, kloroform, aceton, metyl- isobutylketon och etyleter. 8. Aciditet pH-värdet för en 0,85% vattenhaltig lösning var 6,5. 9- Eeem Vitt pulver 461 10 15 20 25 30 35 5 5-2 20 10. Färgreaktioner 1 ninhydrin-reaktion: +, biuret-reaktion: +, Molisch-reaktion -, Dische-reaktion: -, antronreaktion: -, och cysteinsulfatreaktion: -. 11. stabilitet Det kan stabiliseras genom tillsättning av L-cyste- in, ditiotreitol (DTT), glycerol, albumin, globulin, (NH4)2S04, koksalt eller liknande.

EXEMPEL 14 _ _ På samma sätt som beskrivits i Exempel 13 erhölls en aktiv fraktion innehållande en substans med en molekylvikt av ca 7000 till ca 25 OOO. Den aktiva fraktionen lyofiliserades för erhållande av 380 mg av ett blekgult pulver som betecknades SPF-2.

De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos SPF-2 var följande: l. Elementaranalys C: 53,64 % H: 5,98 % och N: 11,63 % 48,57 % 5,02 % 10,50 % 2. Molekylvikt Ungefär 7000 till 25 OOO såsom bestämts genom gelfiltrering. 3. Sönderdelningsgunkt Det blev brunt vid l60°C och svart vid 200°C och sönderdelades. 4. Sgecifik rotation 20 _ o _ Éulb _ +30,7 (c - 1.00). 5. Ultraviolett absorptionsspektrum Fig 5 visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av en O,2% vattenhaltig lösning, vilket karaktäriseras 10 15 20 25 30 35 ~~ 461 532 21 av absorptioner vid 257, 265, 273, zso, 287 Ben 325 mn. 6. Infrarött absorptionsspektrum Fig 6 visar ett infrarött absorptionsspektrum. 7. Löslighet i lösningsmedel Det var lösligt i vatten, delvis lösligt i metanol och etanol samt svàrlösligt eller olösligt i lösnings- medel inbegrípande n-butanol, isobutanol, n-propanol, n-hexan, kloroform, aceton, metylisobutylketon och etyleter. 8. Aciditet pH-värdet för en l,0% vattenhaltig lösning var 6,5. 9- Esm Blekgult pulver 10. Färgreaktioner ninhydrin-reaktion: +, biuret-reaktion: +, Molisch-reaktion -, Dische-reaktion: -, antronreaktion: -, och cysteinsulfatreaktion: -. ll. Stabilitet Det kan stabiliseras genom tillsättning av L-cyste- in, ditíotreitol (DTT), glycerol, albumin, globulin, u- och B-cyklodextrin, (NH4)2S04, koksalt eller lik- nande.

EXEMPEL IS, 5 liter av den filtrerade kulturbuljongen som erhölls i Exempel 8 :enades på samma sätt som beskri- vits i Exempel 12 för erhållande av 1460 mg av ett blekgult, pulverformigt SPF-100. 1000 mg av pulvret behandlades för erhållande av 330 mg SPF-l på samma sätt som i Exempel l3 och 370 mg SPF-2 på samma sätt som i Exempel 14. 461 552 10 15 20 25 30 22 EXEMPEL 16 ” 5 liter av den filtrerade kulturbuljongen som erhållits i Exempel 9 renades på samma sätt som be- skrivits i Exempel 12 för erhållande av 1650 mg av ett blekgult, pulverformigt SPF-100. 1000 mg av pulvret behandlades för erhållande av 315 mg SPF-1 på samma sätt som i Exempel 13 och 390 mg SPF-2 på samma sätt som i Exempel 14.

EXEMPEL 17 ' 3 liter medium L med följande sammansättning användes: BHI (pH = 7,4) 100 ml av ett BHI-medium inokulerades med Strep- 3,7 % tococcus pyogenes ATCC 21060 och underkastades en statisk odling i 8 h vid 37°C för erhållande av en ympkulturvätska. 300 ml av ympvätskan inokulerades i 3 liter av mediet L och odlades anaerobt under om- röring i en 3 liter kolv vid 37°C i 11,5 h. Därefter tillsattes 500 pg/ml Cephalosporin C och odlingen fortsattes i ytterligare 5 h. Den erhållna kulturbul- jongen centrifugerades för avlägsnande av bakterien- Den filtrerade kulturbuljongen innehöll 120 u/ml SPF-100. 3 liter av den filtrerade kulturbuljongen renades på samma sätt som beskrivits i Exempel 12 för erhållan- de av 530 mg av ett blekgult, pulverformigt SPF-100. 500 mg av pulvret behandlades för erhållande av 110 mg SPF-1 på samma sätt som i Exempel 13 och 160 mg SPF-2 på samma sätt som i Exempel 14.

Claims (5)

10 15 20 25 30 -- 461 532 23 PATENTKRAV

1. Substans benämnd SPF-100 omfattande en låg- molekylär fraktion benämnd SPF-l och en högmolekylär fraktion benämnd SPF-2 vilken substans átervunnits ur en kulturbuljong av Streptococcus pyogenes och som har följande'fysikalisk-kemiska egenskaper: (1) Elementaranalys C: 46,42 till 43,69 %, H: 5,94 till 4,85 %, och N: 11,42 till 9,50 %. (2) Molekvlvikt Ungefär 500 till 25 000 såsom bestämts genom gelfiltrering. (3) Sönderdelningsgunkt Den blir brun vid l60°C och svart vid 200°C och sönderdelas. (4) Sgecifik rotation [alšo = + 45,0° (c = 1,00). (5) Ultraviolett absorptionsspektrum Fig«l visar ett ultraviolett spektrum av en 9,l% vattenhaltig lösning, vilken karaktäriseras av absorp- tioner vid 257, 265, 280, 287 och 325 nm. (6) Infrarött absorptionsspektrum Fig 2 visar ett-infrarött absorptionsspektrum. (7) Löslighet i lösningsmedel Den är löslig i vatten, delvis löslig i metanol och etanol samt svårlöslig eller olöslig i lösningsmedel inbegripande n-butanol, isobutanol, n-propanol, n-hexan, kloroform, aceton, metylisobutylketon och etyleter. (8) Aciditet pH-värdet för en l,0% vattenhaltig lösning är 6,5. (9) Egrm Blekgult pulver 461 53-2 10 15 20 25 30 35 24 (10) Färgreaktioner \ ninhydrin-reaktion: +, biuret-reaktion: +, Molisch-reaktion -, Dische-reaktion: -, antronreaktion: -, och _ cysteinsulfatreaktion: -. Stabilitet Den kan stabiliseras genom tillsättning av L-cyste- in, ditiotreitol (DTT), glycerol, albumin, globulin, (NH4)2SO4, koksalt eller liknande.

2. Förfarande för framställning av SPF-100 som (ll) u- och B-cyklodextrin, definierats i kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att en Streptococcus pyogenes som valts från den grupp som består av Streptococcus pyogenes ATCC 21060 sp. ATCC 21597 pyogenes ATCC 21546 pyogenes ATCC 21547 och pyogenes ATCC 21548 odlas i ett medium som innehåller kolkällor eller Streptococcus Streptococcus Streptococcus Streptococcus kvävekällor och näringsämneskälïor under anaeroba betingelser vid ett pH av 6,0-8,0 vid 30-40°C; penicillin G tillsättes i en mängd av 100 till 7000 enheter/ml av mediet eller cefalosporin C tillsättes i en mängd av 10 till 4000 pg/ml av mediet 3-15 h efter initiering av den logaritmiska tillväxtfasen; odlingen fortsättes i 1-20 h; och substansen benämnd SPF-100 átervinns ur kulturbuljongen.

3. Lågmolekylärfraktion, benämnd SPF-l, av substan- sen SPF-l00 som definierats i kravet l, k ä n n e - t e c k n a d därav, att den har följande fysikalisk- kemiska egenskaper: (1) Vßlementaranalys C: 41,26 till 36,64 %| H: 4,91 till 4,10 %, och N: 6,52 till 5,40 % 10 15 20 25 30 35 ~- 467 532 25 1 (2) Molekylvikt Ungefär 500 till 7000 såsom bestämts genom gel- filtrering. (3) Sönderdelningsgunkt Det blev brunt vid l70°C och svart vid 200°C och sönderdelades. (4) Sgecifik rotation [a]š° = + 63,3 - e4,3° (C = 1,04). (5) Ultraviolett absorptionsspektrum Fig 3 visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av en 3,3% vattenhaltig lösning, vilken karaktäriseras av absorptioner vid 257, 265, 280 och 287 nm. (6) Infrarött absorptionsspektrum Fig 4 visar ett infrarött absorptionsspektrum. (7) Löslighet i lösningsmedel Det var lösligt i vatten, men olösligt i lösnings- medel inbegripande metanol, etanol, n-butanol, isobu- tanol, n-propanol, n-hexan, kloroform, aceton, metyl- isobutylketon och etyleter. (8), Aciditet pH-värdet för en 0,85% vattenhaltig lösning var 6,5. (9) 5953 " Vitt pulver Färgreaktioner ninhydrin-reaktion: +, (10) biuret-reaktion: +, Molisch-reaktion -, Dische-reaktion: -, antronreaktion: e, och cysteinsulfatreaktiona -f Stabilitet Det kan stabiliseras genom tillsättning av L-cyste- (ll) in, ditiotreitol (DTT), glycerol, albumin, globulin, (NH4)2SO4, koksalt eller liknande.

4. Högmolekylär fraktion, benämnd SPF-2, av substan- sen SPF-l00 som definierats i kravet 1, k ä n n e - 461 532 10 15 20 25 30 35 26 t e c k n a d därav, att den har följande”fysika1isk- kemiska egenskaper: (1) Elementaranalys C: 53,64 till 48,57 %, H: 5,98 till 5,02 %, och N: 11,63 till 10,50 % Molekylvikt Ungefär 7000 till 25 000 såsom bestämts genom gelfiltrering. (3) Sönderdelningsgunkt Det blev brunt vid l60°C och svart vid 200°C och sönderdelades. (4) Sgecifík rotation [a]å° = +3o,7° Ultraviolett absorptionsspektrum (2) (SI Fig 5 visar ett ultraviolett absorotionsspektrum av en 0,2% vattenhaltig lösning, vilket karaktäriseras av absorptioner vid 257, 265, 273, 280, 287 och 325 nm. (6ï Infrarött absorptionsspektrum _ Pig 6 visar ett infrarött absorptionsspektrum. (7ï Löslighct i lösningsmedel _Det var lösligt i Vatten, delvis lösligt i metanol och etanol samt svárlösligt eller olösligt i lösnings- g medel inbegripande n-butanol, isobutanol, n-propanol, n-hexan, kloroform, aceton, metylisobutylketon och etyleter. (B) Aciditet pH-värdet för en 1,0% vattenhaltig lösning var 6,

5. (9ï Form Blekgult pulver (10) Färgreaktioner ninhydrin-reaktion: +, biuret-reaktion: *I Molisch-reaktion -, Dische-reaktion: -1 antronreaktion: -, och cysteinsulfatreaktionz -. 461 532 27 1 (ll) Stabilitet Det kan stabiliseras genom tillsättning av L-cyste- in, ditiotreitol (DTT), glycerol, albumin, globulin, u- och B-cyklodextrin, (NH4)2SO4, koksalt eller lik- 5 nande.