DE3428017A1 - Spf-100 und verfahren zu seiner herstellung

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Description

Claims

DE3428017A1

Publication number: DE3428017A1
Application number: DE19843428017
Authority: DE
Inventors: Keiji Itami Hyogo Adachi; Junichi Toyonaka Osaka Taniguchi; Shigezo Nagoya Aichi Udaka; Hideo Kawanishi Hyogo Ueyama
Original assignee: Shikibo Ltd
Current assignee: Shikibo Ltd
Priority date: 1983-08-01
Filing date: 1984-07-30
Publication date: 1985-03-28
Also published as: CH663033A5; FR2550223B1; KR850002276A; FR2550223A1; CA1237085A; GB2146028B; GB2146028A; NL8402388A; GB8418745D0; US4656037A; SE461532B; SE8403914D0; SE8403914L

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Kultivieren von Streptokokken, bei dem ein aktiver Bestandteil des Bakteriums aus dem Körper ausgebracht wird'.

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, das die Zugabe von Penicillin oder verwandten Substanzen während des Verlaufs des Kultivierens des Bakteriums zum Ausbringen einer vom Bakterium produzierten Substanz aus dem Körper, um dadurch das Produkt im Medium anzusammeln, umfaßt.

Ferner ist es ein Ziel der Erfindung, SPF-100 bereitzustellen, das einen direkten krebstötenden Einfluß und einen immunoaktivierenden Einfluß ausübt.

Geschwächter, vitaler Streptococcus pyogenes ist bereits zur Formulierung eines Karzinostatikums verwendet worden.

Zudem war ein Verfahren bekannt, bei dem S. pyogenes-Körper vermählen, ein aktiver Bestandteil daraus mit Wasser oder einer Salzlösung extrahiert und ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wurde, um dadurch einen tumoriziden Bestandteil als eine Fällung zu gewinnen (s. die veröffentlichte Japanische Patentanmeldung Nr. 1647/1963), und ein weiteres Verfahren, bei dem S. pyogenes mit einer Lysokinase, wie

_ 5 —

Lysozym, oder Cellulase oder einer Proteinase bakteriolysiert und die aktive Fraktion als wässrige Phase fraktioniert wird (s. GB-PS 1 163 865).

Wie oben beschrieben, war es gut bekannt, daß Streptokokken selbst oder manche ihrer Bestandteile eine tumorizide Aktivität entwickeln würden. Die herkömmlicherweise bekannten Substanzen jedoch sind bloße Bakterienkörper oder lösliche oder unlösliche Polymerbestandteile von Zellen. Um einen aktiven Bestandteil aus einem Bakterium zu isolieren, ist es notwendig, das Bakterium zu bakteriolysieren oder mechanisch zu zerkleinern, um das Ganze zu fraktionieren. Diese Behandlungen könnten die Reinigung so komplizieren, daß die Isolierung eines aktiven Bestandteils sehr schwierig ist. Ein Beispiel für einen aktiven Bestandteil, der tatsächlich isoliert und bestimmt worden ist, ist ein Protein vom Molekulargewicht 150 000 (s. die veröffentlichte Japanische Patentanmeldung Nr. 43841/1973).

Diesseits wurde die Überlegung angestellt, daß eine Reinigung verschiedener von Streptokokken produzierter bakterieller Produkte durch Ausbringen aus den Körpern im Verlauf des Kultivierens beträchtlich vereinfacht werden könnte und daß ferner mehr brauchbare physiologisch aktive Substanzen dadurch gefunden werden könnten. Als Ergebnis der Forschungsarbeiten unter dem vorerwähnten Gesichtspunkt ist es nun gelungen, ein bakterielles Produkt aus dem Körper durch

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Zugabe von Penicillin während des Verlaufs des Kultivierens auszubringen.

So schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem Penicillin oder verwandte Substanzen an einem geeigneten Punkt während des Verlaufs des Kultivierens zugegeben und SPF-1OO aus der so erhaltenen Kulturbrühe isoliert wird.

SPF-1OO ist eine neue Substanz, die bislang nicht bekannt war. Sie zeigt einen breiten Molekulargewichtsbereich und kann, in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht, in SPF-1 und SPF-2 klassifiziert werden.

Fig. 1 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum einer 0,1%igen wässrigen Lösung von SPF-100, während Fig. 2 ein IR-Absorptionsspektrum von SPF-100 zeigt.

Fig. 3 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum einer 3,3%igen wässrigen Lösxmg 170T1 SPF-1, während Fig. 4 ein IR-Absorptionsspektrum von SPF-1 zeigt.

Fig. 5 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum einer 0,2%igen wässrigen Lösung von SPF-2, während Fig. 6 ein IR-Absorptionsspektrum von SPF-2 zeigt.

SPF-100 entwickelt eine direkte cancerizide und eine immunaktivierende Wirkung. ι

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Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein bakterielles Produkt aus dem Körper und in das Medium gebracht. Daher kann es nach einer recht vereinfachten Methode, d.h. durch Abfiltrieren der Bakterienkörper und Reinigen der filtrierten Kulturbrühe, isoliert werden.

Bekannt war ein Verfahren, bei dem ein Streptococcus kultiviert und das erhaltene Bakterium durch Behandeln mit Penicillin geschwächt wird. Es ist jedoch nie über ein Verfahren berichtet worden, bei dem ein Bakterienprodukt durch Zugabe von Penicillin während des Verlaufs der Kultivierung aus dem Körper gebracht wurde.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann irgend einer der Streptokokken verwendet werden. Beispiele für die Bakterien sind folgende:

Streptococcus pyogenes ATCC 21060, Streptococcus sp. ATCC 21597,

Streptococcus pyogenes ATCC 21546, Streptococcus pyogenes ATCC 21547 und Streptococcus pyogenes ATCC 21548.

Natürliche Medien, wie Fneischextraktmedium, Hefeextraktmedium und Hirn-Herz-Infusionsmedium (BHI-Medium) sind häufig verwendet worden, wenngleich allgemeine Medien, die Quellen für Kohlenstoff oder Stickstoff enthalten, verwendet werden können, so lange die Streptokokken darin effektiv wachsen.

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Streptokokken können unter geeigneten Bedingungen, d.h. bei einem pH von 6,0 bis 8,0 (vorzugsweise 6,8 bis 7,2) und einer Temperatur von 30 bis 40 C (vorzugsweise 3 5 bis 37 C) gezüchtet werden. Im allgemeinen wird eine anaerobe und statische Kultur angewandt, wenngleich manch andere Methode, darunter eine gerührte Kultur, angewandt werden kann.

Erfindungsgemäß werden Penicillin oder verwandte Substanzen an einem geeigneten Punkt während des Verlaufs des Kultivierens zugegeben, um verschiedene brauchbare, vom Bakterium produzierte Substanzen aus seinem Körper auszubringen und dadurch diese Produkte im Medium anzureichern.

Jede verwandte Substanz, die dafür bekannt war, einen ähnlichen Effekt wie den von Penicillin zu entwickeln, kann verwendet werden, wenngleich gewöhnlich Penicillin G oder Cephalosporin C verwendet wird. Penicillin G wird in einer Menge von 100 bis 7000 E/ml Medium und bevorzugt 1000 bis 5000 E/ml Medium verwendet. Cephalosporin C wird in einer Menge von 10 bis 4000 pg/ml Medium und vorzugsweise 100 bis 1500 ug/ml Medium verwendet.

Penicillin oder verwandte Substanzen können 3 bis 15 h, vorzugsweise 5 bis 10 h nach Beginn der logarithmischen Wachstumsphase, wenn das Bakterium bei 37 C kultiviert wird, umgesetzt werden. Weiteres Kultivieren für 1 bis 20 h, vorzugsweise 5 bis 15h danach würde es ermöglichen, eine große Men

ge eines bakteriellen Produkts im Medium anzureichern.

Die so erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen, und Ammoniumsulfat wird dem Filtrat zugesetzt. Nach dem Gewinnen von Fraktionen mit 50 bis 90%igem Sättigungsgrad wird der erhaltene Niederschlag in einer einen Stabilisator enthaltenden Pufferlösung gelöst.

Die erhaltene, SPF-100 enthaltende Lösung kann in gefrorener oder lyophilisierter Form aufbewahrt werden. Diese Substanz kann ferner durch Zusammenbringen mit einem Ionenaustauscher oder Gelfiltrationsmaterialien gereinigt werden. Ionenaustauscher, wie Ionenaustauschharze, eine Ionenaustauscherzellulose oder Ionenaustauscher-Sephadex (ein Produkt der Pharmacia AB) und Gelfiltrationsmaterialien, wie Toyopearl HW-50F oder HW-50SF (ein Produkt der Toyo Soda Kabushiki Kaisha) oder Sephadex (ein Produkt der Pharmacia AB) können verwendet werden. Außerdem kann Calciumphosphatgel als solches verwendet werden, wenngleich es bequem ist, es in Form von Hydroxylapatit zu verwenden. Eine wässrige Lösung der nach der vorerwähnten Weise erhaltenen Substanz kann durch eine Säule laufen gelassen werden, in der diese Ionenaustauscher- oder Gelfiltrationsmaterialien angemessen enthalten sind. Andererseits kann die wässrige Lösung in einen diese Ionenaustauscheroder Gelfiltrationsmaterialien enthaltenden Behälter eingebracht werden, um die aktive Substanz gleich mit den behandelnden Materialien zusammen zu bringen. Die Elutioh kann mit einer Pufferlösung geeigneter Salzkonzentration und geeigneten

pH-Werts durchgeführt werden. Zwei oder mehr Ionenaustauscher, GeIfilrationsmaterialien oder Calciumphosphatgel können, wenn gewünscht, kombiniert werden. Beispielsweise kann eine Lösung von SPF-1OO durch Zusammenbringen mit DEAE Sephadex eluiert und dann das Eluat durch Zusammenbringen mit Toyopearl HW5OF oder 5OSF weiter eluiert werden, um dadurch eine verbesserte Reinigungswirkung zu erzielen.

Das in Beispiel 8 erhaltene erfindungsgemäße SPF-100, wie nachfolgend weiter beschrieben/ ist eine Peptid-ähnliche Substanz und wird nach dem Lyophilisieren ein blaßgelbes Pulver.

Physikalisch-chemische Eigenschaften der tumoriziden Zusammensetzung SPF-100 sind folgende:

(1) Elementaranalyse:

C: 46,42 bis 43,69 %,

H: 5,94 bis 4,85 % und

N: 11,42 is 9,50 %.

(2) Molekulargewicht:

Etwa 5OQ bis 25 OQO_f bestimmt durch Gelfiltration.

(3) Zersetzungspunkt:

Wird braun bei 160⁰C und schwarz bei 200°C und zersetzt

(4) Spezifische Drehung:

foiJ²% = + 45,0° (C = 1,00).

(5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Fig. 1 zeigt ein UV-Spektrum einer 0,1%igen wässrigen Lösung, das sich durch Absorptionen bei 257, 265, 280, 287 und 325 nm auszeichnet.

(6) Infrarot-Absorptionsspektrum:

Fig. 2 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum.

(7) Löslichkeit in Lösungsmitteln:

Sie ist löslich in Wasser, teilweise löslich in Methanol und Ethanol und kaum oder nicht löslich in Lösungsmitteln einschließlich n-Butanol, Isobutanol, n-Propanol, n-Hexan, Chloroform, Aceton, Methyl-isobutylketon und Ethylether.

(8) Azidität:

Der pH-Wert einer 1,0%igen wässrigen Lösung ist 6,5.

(9) Form:

Blaßgelbes Pulver.

(10) Farbreaktionen:
Ninhydrin-Reaktion: +,
Biuret-Reaktion:·+,
Molisch-Reaktion: -,
Dische-Reaktion: -,
Anthron-Reaktion: - und
Cysteinsulfat-Reaktion: -.

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(11) Stabilität:

Sie kann durch Zugabe von L-Cystein, Dithiothreitol (DTT), Glycerin, Albumin, Globulin, α'- und ß-Cyclodextrin, (NH^)₃SO₄, gewöhnliches Salz oder dergleichen stabilisiert werden.

Nachfolgend sind Beispiele erfindungsgemäßer Ausführungsform gegeben.

In den folgenden Beispielen wurde die Aktivitätseinheit von SPF-100 nach der Methode von Udaka, s. Journal of Antibiotics, Band 35, Nr. 10, 1319 bis 1325 (Oktober. 1982) bestimmt. Die Aktivität wurde durch die Verwendung einer Makromolekül-permeablen Mutante eines Kolon-Bazillus MP-2 (FERM-P5432) (siehe Agric. Biol. Chem., Band 43, S. 371 (1979)) mit der Führung der antibakteriellen Aktivität gegenüber MP-2 biogetestet.

Das soll bedeuten, ein Medium (d.h. M3-Medium) aus 1,75 % Bact Antibiotic-Medium 3 (ein Produkt von Difco) und 1,3 % Agar wurde durch 15 min Erhitzen auf 120°C sterilisiert. Dann wurden 20 ml-Portionen des Mediums in Petrischalen gegossen und konnten sich abkühlen, um Plattenmedien herzustellen.

Andererseits wurde ein Medium aus 0,5 % Pepton, 0,5 % Fleischextrakt, 0,3 % NaCl und 0,8 % Agar durch 15 min Erhitzen auf 120°C sterilisiert. Dann wurde es in einen Thermostat bei

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42°C gebracht. Wenn die Temperatur des Mediums 42°C erreichte, wurde MP-2, das 17h bei 37 C kultiviert worden war, zu dem

4
Medium in einer Konzentration von 10 Zellen/ml gegeben. 2 ml des Mediums wurden mit einer Pipette gesammelt und auf die Oberfläche des M3-Mediums, das zuvor hergestellt worden war, gebracht. Dann wurde das zugesetzte Medium sofort homogen gesprüht und verfestigt. Eine das SPF-100 enthaltende Testlösung ' wurde geeignet verdünnt. Eine Papierscheibe (Durchmesser 8 mm, ein Produkt von Toyo Roshi Co., Ltd.) wurde mit der so erhaltenen Lösung befeuchtet. Anschließend wurde diese Papierscheibe auf die oben hergestellte Platte gebracht und 17h bei 37°C kultiviert, um den Durchmesser der sich aus dem SPF-100 ergebenden Hemmzone zu bestimmen. Dann wurde die Konzentration des SPF-100, bei der der Durchmesser der Hemmzone 10 mm war, als eine Einheit (1 E) definiert.

Beispiel 1

9 1 Medium A folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt 1 %

Polypepton 1 %

Hefeextrakt 0,25 %

Casamino-Säuren 0,25 % und

NaCl 0,1 %
(pH = 6,9)

100 ml eines BHI-Mediums wurden mit Streptococcus pyogenes

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ATCC 21060 beimpft und einer statischen Kultivierung für 8 h bei 37 C unterworfen, um eine Impfkulturflüssigkeit zu erhalten. Dann wurde 1 1 des Mediums A mit 100 ml der so erhaltenen Impfkulturflüssigkext beimpft und unter den gleichen Bedingun-

gen wie die Impfkulturflüssigkeit einer Vorkultivierung unterzogen. Anschließend wurden 8 1 des Mediums A mit der so erhaltenen Kulturflüssigkeit beimpft und anaerob unter Rühren in einem Glasgefäßfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM für 11,5 h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 256 E/ml an SPF-1OO. Beispiel 2

9 1 Medium B folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt	1,0 %
Polypepton	1 ,0 %
Hefeextrakt	0,25 % und
NaCl	0,1 %
(pH = 7,0)

8 1 des Mediums B wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21080 in ähnlicher Weise vorkultiviert worden war, wie in Beispiel 1 be-

schrieben, und anaerob unter Rühren in einem Glasgefäßfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM für 11h

bei 37 C kultiviert. Dann wurden 800 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 351 E/ml an SPF-100.

Beispiel 3

9 1 Medium C folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt	1	^%
Polypepton	1	%
Hefeextrakt	0,	25 und
Casamino-Säuren	0,	25 %
(pH = 6,2)

8 1 des Mediums C wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21060 ähnlich wie im Beispiel 1 beschrieben vorkultiviert worden war, und anaerob unter Rühren in einem Glasgefäßfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM 14h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium ζμ entfernen.

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Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 298 E/ml an SPF-100. Beispiel 4

9 1 Medium D folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt 0,5 %

Polypepton 1,0 %

Hefeextrakt 0,25 %

Casamino-Säuren 0,25 % und

NaCl 0,5 % .

(pH = 6,5)

8 1 Medium D wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit ■ beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21060 ähnlich
Beispiel 1 vorkultiviert worden war und anaerob unter Rühren
in einem Glaskolbenfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM 15,5 h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1200 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um
das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 285 E/ml an SPF-100. Beispiel 5

9 1 Medium E folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

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Hefeextrakt - 3,0 %
(pH = 6,5)

8 1 Medium E wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21060 ähnlich Beispiel 1 vorkultiviert worden war, und anaerob unter Rühren in einem Glaskolbenfermenter (10 1) mit einer Geschwindigkeit von 300 UpM 15 h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 182 E/ml an SPF-100. Beispiel 6

9 1 Medium F folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Maltose	0,3 %
Fleischextrakt	2,0 %
Polypepton	1,0% und
Hefeextrakt	0,25 %
(pH = 7,0)

8 1 des Mediums F wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21060 ähn-

i lieh Beispiel 1 vorkultiviert worden war, und anaerob unter

Rühren in einem Glaskolbenfermenter (10 1) bei einer Geschwin-

EPO COPY Jl

digkeit von 300 UpM 10,5 h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 250 E/ml an SPF-100. Beispiel 7

9 1 Medium G folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt 1,0 %

Polypepton 1,0 % und

NaCl 0,5 %
(pH = 7,0)

8 1 Medium G wurden mit 1 1 Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21060 ähnlich Bei-· spiel 1■vorkultiviert worden war, und anaerob unter Rühren in einem Glaskolbenfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM 15h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt:. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 200 E/ml an SPF-100.

Beispiel 8

9 1 Medium H folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt	1,0 %
Polypepton	1,0 %
Hefeextrakt	0,25 %
Casamino-Säuren	0,25 % und
NaCl	0,1 %
(pH = 7,0)

8 1 Medium H wurden mit -1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus sp. ATCC 21597 ähnlich Beispiel 1 vorkultiviert worden war, und anaerob unter Rühren in einem Glasgefaßfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM 11h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 250 E/ml an SPF-100. Beispiel 9

9 1 Medium I folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt 0,5 % ι

Polypepton 1, %

Hefeextrakt 0,25 %

Casamino-Säuren. 0,25 % und

NaCl 0,1 %
(pH = 6,5)

8 1 Medium I wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21546 ähnlich Beispiel 1 vorkultiviert worden war, und anaerob unter Rühren in einem Glasgefäßfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von UpM 11 h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 340 E/ml an SPF-100. Beispiel 10

9 1 Medium J folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Fleischextrakt 2,0 %

Polypepton 1,0%

Hefeextrakt 0,25 %

Casamino-Säuren 0,25 % und

NaCl 0,5 %
(pH = 6,5)

8 1 Medium J wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21547 ähnlich Beispiel 1 vorkultiviert worden war, und anaerob unter Rühren in einem Glasgefäßfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM 8 h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1500 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 320 E/ml an SPF-100. Beispiel 11

9 1 Medium K folgender Zusammensetzung wurden verwendet:

Maltose 0,3 %

Polypepton 1,0 % und

Hefeextrakt 0,2.5 %
(pH = 6,8)

8 1 Medium K wurden mit 1 1 einer Impfkulturflüssigkeit beimpft, worin Streptococcus pyogenes ATCC 21548 ähnlich Beispiel 1 vorkultiviert worden war, und anaerob unter Rühren in einem Glasgefäßfermenter (10 1) bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM 5 h bei 37°C kultiviert. Dann wurden 1000 E/ml Penicillin G zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgesetzt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterien zu entfernen.

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Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 270 E/ml an SPF-1OO.

Beispiel 12

5 1 der filtrierten Kulturbrühe, erhalten beim Kultivie-

4 ren in Beispiel 4, enthielten 143 χ 10 E an SPF-1OO.

Ammoniumsulfat wurde zu der filtrierten Kulturbrühe gegeben, und ein Anteil von 50 bis 90 % im Sättigungsgrad wurde gewonnen, um eine Fällung zu erhalten. Dieser Niederschlag enthielt 118 χ 10⁴ E an SPF-100.

Der gesamte Niederschlag wurde in 300 ml einer Phosphatpufferlösung gelöst und die so erhaltene Lösung in eine DEAE-Cellulose-Säule (5 χ 70 cm) eingebracht, um das SPF-100 zu adsorbieren. Dann wurde es mit einer 0,3 m NaCl-Lösung stufenweise eluiert, um die aktive Fraktion zu fraktionieren. Die

4 so erhaltene Aktivität war 102,2 χ 10 E.

Dann wurde die aktive Fraktion in eine DEAE-Sephadex A-25-Säule (2,6 χ 70 cm) eingebracht, um die aktive Fraktion zu adsorbieren. Es wurde dann eluiert, wobei die Konzentration an gewöhnlichem Salz in der Phosphatpufferlösung linear erhöht wurde, um die aktive Fraktion zu gewinnen. Die so erhaltene Aktivität war 79,3 χ 10 E.

Weiter wurde das Eluat eingeengt und in eine Säule (2,6 χ 100 cm) mit einem Gelfiltrationsmaterial, Toyopearl

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HW-5OF, zur Adsorption eingebracht. Anschließend wurde mit 1/100 m Phosphatpufferlösung (KH₂PO₄-Na₂HPO₄) eluiert, um

eine aktive Fraktion zu gewinnen, die als SPF-100 bezeichnet

4 wurde. Die so erhaltene Aktivität war 71,1 χ 10 E.

Das so erhaltene Eluat wurde lyophilisiert, um 1780 mg SPF-100 in Form eines blaßgelben Pulvers zu erhalten.

Das in Beispiel 12 erhaltene SPF-100 wurde in vitro-, in vitro/in vivo- und in vivo-Tests als Testmittel zur Prüfung der tumoriziden Wirkung unterworfen.

Testbeispiel 1 (in vitro-Test)

Die tumorizide Aktivität des Testmittels in vitro wurde nach der Bestimmung des Grades des Zellwachstums bestimmt.

P-388 und L 1210-Lymphome, erhalten durch Subkultur isolog implantierter Tumore von DBA/2-Linien-Mäusen wurden als Krebszellen verwendet. Diese Lymphome wurden jeweils in einem RPMI 1640-Medium suspendiert, das 5 χ 10 M 2-Mercaptoethanol und 50 mg/1 Kanamycin enthielt und dem 10 % FCS zugesetzt wurde. Dann wurde 1 ml dieses Mediums in eine Falcon

4 3047-Platte in einerKonzentration der Krebszellen von 5x10 Zellen/Vertiefung injiziert. Anschließend wurde eine spezielle Menge des Testmittels, das in 1 ml des Mediums gelöst oder suspendiert war, in das oben genannte Medium eingespritzt und in Gegenwart von 5 % CO₂ bei 37°C kultiviert. 48h nach der

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Injektion des Testmittels wurde vitale Verfärbung mit Nigrosin durchgeführt, und der Grad des Zellwachstums wurde durch folgende Gleichung bestimmt:

Anzahl der Zellen in jeder Testgruppe

Grad des Zellwachstums (%) = _: χ 100

Anzahl der Zellen in der Kontrollgruppe

Tabelle I zeigt das Ergebnis.

	an	Grad des	Tabelle I	P-388	L1210
	² E)	SPF-100	Zellwachstums (%)	92,0 83,9 78,2 57,2	98,6 94,6 68,0 4 9,2
Dosis			' Lymphom
(x 10
4,7 9,3 18,6 37,2

Testbeispiel 2 (in vitro/in vivo-Test)

Die tumorizide Aktivität des Testmittels in vitro/in vivo wurde durch Verwendung von weiblichen ddy-Mäusen im Alter von 4 oder 5 Wochen bestimmt.

Ehrlich-Ascites-Krebszellen, die als Krebszellen verwendet wurden, wurden in einer KRP-Pufferlösung suspendiert,

dann mit einer bestimmten Menge des Testmittels zusammengemischt und 60 oder 80 min bei 37°C inkubiert. Die Mäuse wur-

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den xntraperxtoneal mit Ό,2 ml-Portionen (0,2 ml/Maus) des Mediums beimpft, das 4 χ 10 oder 8 χ 10 Krebszellen enthielt, um die Anzahl vitaler Mäuse zu beobachten. Die Tabellen II und III zeigen die Ergebnisse.

	0	10	Tag	20	vitaler 5 Wochen)
Tabelle II	8/8 8/8 8/8	8/8 8/8 8/8	15	1/8 6/8 6/8
		7/8 8/8 8/8		25
Tumorizide Aktivität von SPF-100 (Anzahl Mäuse, weibliche ddy-Mäuse im Alter von		0/8 3/8 2/8
Dosis (E)

Kontrolle (0) 0,625 χ 10² 10 χ 10²

In den Tabellen II bis V geben die Zahlen die Anzahl vitaler Mäuse/Anzahl verwendeter Mäuse an.

Tabelle III

Tuinorizide Aktivität von SPF-100 (Anzahl vitaler Mäuse, weibliche ddy-Mäuse im Alter von 4 Wochen)

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Testbeispiel 3 (in vivo-Test)

Die tumorizide Aktivität des Testmittels in vivo wurde durch Verwendung von männlichen CRJ-CD-1 (ICR)-Mäusen im Alter von 7 Wochen bestimmt.

Sarcom-180-Ascites-Krebszellen/ die als Krebszellen verwendet wurden, wurden in Hank'scher Lösung suspendiert. Dann wurden die Mäuse mit 0,1 ml-Portionen der Suspension, die 2 χ 10 Krebszellen enthielt, intraperitoneal beimpft.

Eine bestimmte Menge des Testmittels wurde den Mäusen einmal täglich für fünf aufeinander folgende Tage vor dem Einimpfen der Krebszellen oder einmal täglich für jeweils fünf aufeinander folgende Tage vor und nach dem Einimpfen der Krebszellen intraperitoneal verabreicht, um die Anzahl vitaler Mäuse zu beobachten. Die Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse.

Tabelle IV

Tumorizide Aktivität von SPF-100 (Anzahl vitaler Mäuse,· verabreicht vor dem Beimpfen)

Dosis (E)	0	10	Tag	20	25
	8/8 8/8 8/8	8/8 8/8 8/8	15	2/8 5/8 4/8	0/8 4/8 2/8 t
Kontrolle (E) 1 χ 10² 100 χ 10²		8/8 8/8 8/8

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Tabelle V

(verabreicht vor und nach dem Beimpfen)

Dosis (E)	(O)	-	0	10	Tag	20	25
		8/8	8/8	15	3/8	1/8
Kontrolle		8/8	8/8	8/8	7/8	4/8
1 χ 1O²	3	8/8	8/8	8/8	5/8	2/8
20 χ 10²			7/8
Beispiel 1

1000 mg des SPF-100, erhalten ähnlich Beispiel 8, in Form eines blaßgelben Pulvers, wurden in 30 ml einer Phosphatpufferlösung gelöst und in eine Sephadex A-25-Säule (2,6 χ 70 cm) gegossen, um das SPF-100 zu adsorbieren. Dann wurde es eluiert, wobei die Konzentration gewöhnlichen Salzes in der Phosphatpufferlösung linear erhöht wurde, um eine aktive Fraktion zu erhalten. Anschließend wurde die ganze aktive Fraktion auf 5 ml eingeengt und in eine Säule mit Gelfiltrationsmaterial, Toyopearl HW-50F (2 χ 100 cm) gegossen und mit einer Phosphatpufferlösung eluiert, um eine aktive Fraktion zu erhalten, die eine Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa 500 bis etwa 7000 enthielt. Die aktive Fraktion wurde lyophilisiert, um 350 mg eines weißen Pulvers zu erhalten, das als SPF-1 bezeichnet wurde.

t Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des SPF-1 waren

wie folgt:

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1. Elementaranalyse:

C: 41,26 %, H: 4,91 % und N: 6,52 %

SS ί

36,64 % 4,10 % 5,40 %.

2. Molekulargewicht:

Etwa 500 bis 7000, wie durch,GeIfiltration bestimmt.

3. Zersetzungspunkt:

ο

Es wurde braun bei 170 C und schwarz bei 200 C und

zersetzte sich.

4. Spezifische Drehung:

/<*/²D = + 63,3 bis 64,3° (c = 1,04)

5. UV-AbsorptionsSpektrum:

Fig. 3 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum einer 3,3%igen wässrigen Lösung, das sich durch die Absorptionen bei 257, 265, 280 und 287 nm auszeichnet.

6. IR-Absorptionsspektrum:

Fig. 4 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum.

7. Löslichkeit in Lösungsmitteln:

Es war löslich in Wasser, aber unlöslich in Lösungsmitteln einschließlich Methanol, Ethanol, n-Butanol, Isobutanol, n-Propanol, η-Hexan, Chloroform, Aceton, Methylisobutylketon und Ethylether.

8. Azidität:

Der pH-Wert einer 0,85 %igen wässrigen Lösung war 6,5.

9. Form:

Weißes Pulver

10. Farbreaktionen:

Ninhydrin-Reäktion: +,
Biuret-Reaktion: +,
Molisch-Reaktion: -,
Dische-Reaktion: -,
Anthron-Reaktion: - und
Cysteinsulfat-Reaktion: -.

11. Stabilität:

Es kann durch Zusatz von L-Cystein, Dithiothreitol (DTT), Glycerin, Albumin, Globulin, (NH₄)₂SO₄, gewöhnliches Salz oder dergleichen stabilisiert werden.

Beispiel 14

Ähnlich wie in Beispiel 13 beschrieben wurde eine aktive Fraktion erhalten, die eine Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 bis etwa 25000 enthielt. Die aktive Fraktion wurde lyophilisiert, um 380 mg eines blaßgelben Pulvers zu erhalten, das als SPF-2 bezeichnet wurde.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des SPF-2 waren wie folgt: " _;

1. Elementaranalyse:

C: 53,64 %, H: 5,98 % und N: 11,63 %

5 S ί ^l

48,57 % 5>02 % 10,50 %..

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2. Molekulargewicht:

Etwa 7000 bis 25000, wie durch Gelfiltration bestimmt.

3.'Zersetzungspunkt:

Es wurde braun bei 160°C und schwarz bei 200°C und zersetzte sich.

4. Spezifische Drehung:

/kJ²D = + 30,7° (c = 1,00).

5. UV-Absorptionsspektrum:

Fig. 5 zeigt ein UV-Absorptionsspektrum einer 0,2%igen wässrigen Lösung, das sich durch die Absorptionen bei 257, 265, 273, 280, 287 und 325 nm auszeichnet.

6. IR-Absorptionsspektrum:

Fig. 6 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum.

7. Löslichkeit in Lösungsmitteln:

Es war löslich in Wasser, teilweise löslich in Methanol und Ethanol und kaum oder nicht löslich in Lösungsmitteln einschließlich n-Butanol, Isobutanol, n-Propanol, n-Hexan, Chloroform, Aceton, Methylisobutylketon und Ethylether.

8. Azidität:

Der pH-Wert einer 1,0%igen wässrigen Lösung war 6,5.

9. Form:

Blaßgelbes Pulver.

10. Farbreaktionen:

ι Ninhydrin-Reaktion: +,

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Biuret-Reaktion: + ,
Molisch-Reaktion: -,
Dische-Reaktion: -,
Anthron-Reaktion: - und
Cysteinsulfat-Reaktion: -.

11. Stabilität: -

Es kann durch Zusatz von L-Cystein, Dithiothreitol (DTT), Glycerin, Albumin, Globulin, et- und ß-Cyclodextrin, (NH. ) ~SO · , gewöhnliches Salz oder dergleichen stabilisiert werden.

Beispiel 15

5 1 der in Beispiel 8 erhaltenen filtrierten Kulturbrühe wurden in ähnlicher Weise, wie in Beispiel 12 beschrieben, gereinigt, um 1460 mg eines blaßgelben pulvrigen SPF-1OO zu erhalten.

1000 mg des Pulvers wurden behandelt, um 330 mg SPF-1 wie in Beispiel 13 und 370 mg SPF-2 wie in Beispiel 14 zu erhalten.

Beispiel 16

5 1 der in Beispiel 9 erhaltenen filtrierten Kulturbrühe wurden ähnlich, wie in Beispiel 12 beschrieben, gereinigt, um 1650 mg eines blaßgelben pulvrigen SPF-100 zu erhalten.

t 1000 mg des Pulvers wurden behandelt, um 315 mg des SPF-

_&POCOPY §

1 wie in Beispiel 13 und 390 mg des SPF-2 wie in Beispiel zu erhalten.

Beispiel 17

3 1 Medium L der folgenden Zusammensetzung wurden verwendet:

BHI ' 3,7 %
• (pH = 7,4)

100 ml BHI-Medium wurden mit Streptococcus pyogenes ATCC 21060 beimpft und einer statischen Kultivierung für 8h bei 37°C unterworfen, um eine Impfkulturflüssigkeit zu erhalten. 300 ml der Impfflüssigkeit wurden in 3 1 Medium L eingeimpft und anaerob unter Rühren in einem 3 1-Kolben bei 3 7°C für-11,5 h kultiviert. Dann wurden 500 pg/ml Cephalosporin C zugesetzt und das Kultivieren weitere 5 h fortgeführt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um das Bakterium zu entfernen.

Die filtrierte Kulturbrühe enthielt 120 E/ml SPF-100.

3 1 der filtrierten Kulturbrühe wurden ähnlich, wie in Beispiel 12 beschrieben, gereinigt, um 530 mg eines blaßgelben pulvrigen SPF-100 zu erhalten.

500 mg des Pulvers wurden behandelt, um 110 mg SPF-1 wie

in Beispiel 13 und 160 mg SPF-2 wie in Beispiel 14 zu erhalten.

Leerseite -

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Kontrolle
20 χ 10²

H. Hering PATENTANWÄLTE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS MANDATAIRES EUROPEENS AGREES Telefon (089) 8573722 8573799 Telex 524303 xpert cable: expertla München: Dr. rer. nat. D. Thomsen Dipl.-Ing. H. Hering Frankfurt/M.: Dipl.-Ing. W. Weinkauf D-8033 Planegg (Kr. München) Bahnhofstraße 7 D - 8000 München Post-Box 701929 30. Juli 1984 UDAKA, Shigezo Nagoya/Japan FURUKAWA, Keiichiro Tokyo/Japan SHIKIBO LTD. Osaka/Japan SPF-1OO und Verfahren zu seiner Herstellung Patentansprüche

1. Substanz, als SPF-1OO bezeichnet, mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: (1) Elementaranalyse:

C: 46,42 bis 43,69 %, ^l

H: 5,94 bis 4,85 % und

copy m

N: 11,42 bis 9,50 %

(2) Molekulargewicht:

Etwa 500 bis 25 000, bestimmt durch Gelfiltration.

(3) Zersetzungspunkt:

Wird braun bei 160°C und schwarz bei 200°C und zersetzt sich. '■'-

(4) Spezifische Drehung:

fuJ²$ = + 45,0° (c = 1,00)

(5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Fig. 1 zeigt ein UV-Spektrum einer 0,1 %igen wässrigen Lösung, das sich durch Absorptionen bei 257, 265, 280, und 325 nm auszeichnet.

(6) Infrarot-Absorptionsspektrum:

Fig. 2 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum.

(7) Löslichkeit in Lösungsmitteln:

(8) Azidität:

Der pH-Wert einer 1,0%igen wässrigen Lösung ist 6,5.

(9) Form:

Blaßgelbes Pulver.

(10) Farbreaktionen:

ι Ninhydrin-Reaktion: +

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Biuret-Reaktion: +
Molisch-Reaktion: Dische-Reaktion: Anthron-Reaktion: Cysteinsulfat-Reaktion: -

(11) Stabilität:

Sie kann durch Zugabe von L-Cystein, Dithiothreitol (DTT), Glycerin, Albumin, Globulin, *- und ß-Cyclodextrin, (NH. J^SO,, gewöhnliches Salz oder dergleichen stabilisiert werden.

2. Substanz SPF-1OO nach Anspruch 1, klassifiziert in SPF-1 und SPF-2.

3. Verfahren zur Herstellung von SPF-1OO unter Kultivieren eines Streptococcus und Gewinnen der SPF-100 genannten Substanz aus der Kulturbrühe.

4. Verfahren nach Anspruch 3, umfassend die Zugabe von Penicillin oder verwandten Substanzen zur Kulturflüssigkeit während des Verlaufs des Kultivierens eines Streptococcus-Bakteriums, das die tumorizide Substanz SPF-100 produziert.

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