CH663033A5

CH663033A5 - Substance-melange dite ''spf-100'' et procede pour sa preparation.

Info

Publication number: CH663033A5
Application number: CH3684/84A
Authority: CH
Inventors: Shigezo Udaka; Hideo Ueyama; Junichi Taniguchi; Keiji Adachi
Original assignee: Shigezo Udaka; Furukawa Keiichiro; Shikibo Ltd
Priority date: 1983-08-01
Filing date: 1984-07-30
Publication date: 1987-11-13
Also published as: SE8403914D0; NL8402388A; SE461532B; GB8418745D0; FR2550223A1; DE3428017A1; SE8403914L; FR2550223B1; US4656037A; GB2146028A; GB2146028B; CA1237085A; KR850002276A

Description

La présente invention concerne une substance-mélange, dite «SPF-100», qui présente une action cancéricide directe, ainsi qu'une action d'immuno-activation.

L'invention concerne également un procédé de préparation de cette substance-mélange, dite «SPF-100», ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend l'adjonction de pénicilline ou de substances apparentées dans le milieu liquide de culture, au cours de la culture d'une bactérie du genre Streptocoque, produisant la substance tu-moricide dite «SPF-100», et la récupération de la substance dite «SPF-100» à partir du bouillon de culture libéré des corps bactériens.

On a déjà utilisé la bactérie vivante, à l'état atténué, Streptococcus pyogenes, pour la formulation d'un agent carcinostatique.

En outre, on connaît un procédé comprenant le broyage de corps de S. pyogenes, l'extraction d'un ingrédient actif, à partir de ceux-ci, au moyen d'eau ou d'une solution saline, et l'adjonction d'un solvant organique de façon à récupérer un ingrédient tumoricide à l'état de précipité (voir demande de brevet japonais publiée N° 1647/ 1963), ainsi qu'un autre procédé comprenant la bactériolyse de S. pyogenes au moyen d'une lysokinase, telle que le lysozyme ou bien d'une cellulase ou d'une protéinase, et la séparation de la fraction active sous la forme d'une phase aqueuse (voir brevet britannique N° 1163 865).

Comme décrit ci-dèssus, il est bien connu que les streptocoques eux-mêmes, ou certains ingrédients qui en proviennent, manifestent une activité tumoricide. Toutefois, les substances connues consistent simplement en corps bactériens ou en constituants polymères solu-bles ou insolubles des cellules. Pour isoler un ingrédient actif d'une bactérie, il est nécessaire d'effectuer la bactériolyse ou un broyage mécanique de la bactérie afin de la fractionner dans son ensemble. Ces traitements sont susceptibles de compliquer la purification, de sorte que l'isolement d'un ingrédient actif est très difficile. A titre d'exemple d'ingrédient actif qui a été effectivement isolé et déterminé, on peut citer une protéine ayant un poids moléculaire de 150000 (voir demande de brevet japonais publiée N° 43841/1973).

La présente invention résulte de l'idée que la purification de différents produits bactériens provenant des streptocoques pourrait être considérablement simplifiée en provoquant la libération de ces produits à l'extérieur des corps au cours de la culture, et que des substances physiologiquement actives encore plus utiles pourraient ainsi être découvertes. Au cours de recherches entreprises conformément à cette idée, il a effectivement été possible de provoquer la libération d'un produit bactérien à l'extérieur du corps par adjonction de pénicilline au cours de la culture.

Ainsi, la présente invention porte également sur un procédé comprenant l'adjonction de pénicilline, ou de substances apparentées, à un moment approprié, au cours de la culture, et l'isolement de la substance dite «SPF-100» à partir du bouillon de culture ainsi obtenu.

La substance dite «SPF-100» est une substance nouvelle, inconnue jusqu'à présent.

Elle présente une gamme étendue de poids moléculaires, et elle peut être classée sous l'une des deux formes dites «SPF-1» et «SPF-2», selon son poids moléculaire.

L'invention sera mieux comprise grâce à la description détaillée qui va suivre, en se référant au dessin annexé, dans lequel:

la figure 1 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1% de la substance dite «SPF-100»;

la figure 2 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la substance dite «SPF-100»;

la figure 3 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 3,3% delà substance dite «SPF-1»;

la figure 4 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la substance dite «SPF-1 »;

la figure 5 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,2% de la substance dite «SPF-2», et la figure 6 représente un spectre d'absorption dans l'infrarouge de la substance dite «SPF-2».

La substance dite «SPF-100» présente une action cancéricide directe, ainsi qu'une action d'immuno-activation.

Conformément au procédé selon la présente invention, un produit bactérien est libéré à l'extérieur du corps et il se trouve présent dans le milieu. Par conséquent, il peut être isolé par un procédé notablement simplifié, c'est-à-dire en séparant les corps bactériens par filtration et en purifiant le bouillon de culture filtré.

On connaît un procédé comprenant la culture d'un streptocoque et l'atténuation de la bactérie ainsi obtenue par traitement au moyen de pénicilline. Cependant, on n'a jamais décrit un procédé comprenant la libération d'un produit bactérien à l'extérieur du corps par adjonction de pénicilline au cours de la culture.

On peut utiliser dans le procédé selon la présente invention n'importe quel streptocoque. A titre d'exemple des bactéries qui peuvent être utilisées, on peut citer les suivantes:

Streptococcus pyogenes ATCC 21060;

Streptococcus sp. ATCC 21597 ;

Streptococcus pyogenes ATCC 21546;

Streptococcus pyogenes ATCC 21547, et

Streptococcus pyogenes ATCC 21548.

On peut utiliser comme milieu de culture des milieux de culture naturels tels qu'un milieu de culture provenant d'extrait de viande, un milieu de culture provenant d'extrait de levure et un milieu de culture provenant d'infusion de cerveau et de cœur (milieu de culture BHI), bien que l'on puisse également utiliser des milieux de culture universels contenant des sources de carbone ou d'azote, à condition que la croissance des streptocoques s'y produise de manière efficace.

On peut effectuer la culture des streptocoques dans des conditions appropriées, c'est-à-dire à un pH de 6,0 à 8,0 (de préférence 6,8 à 7,2) et à une température de 30 à 40° C (de préférence 35 à 37e C). En général, on utilise un procédé de culture anaérobie et statique, bien que l'on puisse également employer d'autres procédés, tels que la culture sous agitation.

Conformément à l'invention, on procède à l'adjonction de pénicilline, ou de substances apparentées, à un instant approprié au cours de la culture, de façon à libérer différentes substances utiles produites par la bactérie à l'extérieur du corps, de sorte que ces produits s'accumulent dans le milieu.

On peut utiliser toute substance apparentée à la pénicilline et présentant une action similaire à celle de la pénicilline, bien que l'on utilise habituellement de la pénicilline G ou de la céphalosporine C. On utilise la pénicilline G en quantités correspondant à 100 à 7000 unités/ml du milieu et, de préférence, à 1000 à 5000 unités/ml du milieu. On utilise la céphalosporine C en quantités de 10 à 4000 g/ml du milieu et, de préférence, de 100 à 1500 g/ml du milieu.

On peut procéder à l'adjonction de pénicilline ou de substances apparentées 3 à 15 heures, de préférence 5 à 10 heures, après le début de la phase de croissance logarithmique, lorsque la culture des bactéries est effectuée à 37° C. La continuation de la culture pendant 1 à 20 heures, de préférence 5 à 15 heures, après ce moment, permettrait d'accumuler une grande quantité de produits bactériens dans le milieu.

On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin de séparer la bactérie, et l'on ajoute du sulfate d'ammonium au filtrat. Après récupération de fractions correspondant à un degré de saturation de 50 à 90%, on dissout le précipité obtenu dans une solution tampon contenant un agent de stabilisation.

On peut conserver la solution obtenue, qui contient la substance dite «SPF-100», sous forme congelée ou lyophilisée. On peut procéder à une purification plus poussée de cette substance par mise en contact avec un échangeur d'ions ou un agent de filtration sur gel. On peut utiliser, comme échangeur d'ions, une résine échangeuse d'ions, de la cellulose échangeuse d'ions, ou un produit échangeur d'ions du type Sephadex (produit par la société Pharmacia AB) et, comme agent de filtration sur gel, des produits tels que le Toyopearl HW-50F ou HW-50SF (produit par la société Toyo Soda Kabushiki Kaisha) ou le Sephadex (produit par la société Pharmacia AB). En outre, on peut utiliser un gel de phosphate de calcium en tant que

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tel, bien qu'il soit pratique de l'utiliser sous forme d'hydroxylapatite. On peut faire passer une solution aqueuse de la substance obtenue de la manière mentionnée ci-dessus à travers une colonne dans laquelle on introduit, à une cadence appropriée, ces échangeurs d'ions ou ces agents de filtration sur gel. En variante, on peut introduire la solution aqueuse dans un récipient contenant ces échangeurs d'ions ou ces agents de filtration sur gel en une seule fois, de façon à mettre en contact la substance active avec les agents de traitement. On peut effectuer l'élution au moyen d'une solution tampon ayant une concentration saline et une valeur de pH appropriée. Si désiré, on peut combiner deux ou plusieurs échangeurs d'ions, agents de filtration sur gel ou gel de phosphate de calcium. Par exemple, on peut éluer une solution de la substance dite «SPF-100» par mise en contact avec le Sephadex DEAE, et continuer l'élution du produit par mise en contact avec du Toyopearl HW-50F ou 50SF, de manière à obtenir une purification accrue.

La substance dite «SPF-100», selon la présente invention, obtenue dans l'exemple 8 ci-dessous, est une substance peptidique qui prend la forme d'une poudre jaune pâle à l'état lyophilisé.

Les propriétés physico-chimiques de la composition tumoricide dite «SPF-100» sont les suivantes:

a) Analyse élémentaire:

C: 43,69 à 46,42%

H: 4,85 à 5,94%, et N: 9,50 à 11,42%

b) Poids moléculaire:

Approximativement 500 à 25 000 comme déterminé par filtration sur gel.

c) Point de décomposition:

Brunissement à 160° C, noircissement à 200° C et décomposition.

d) Pouvoir rotatoire:

[afo = +45,0° (c = 1,00)

e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet:

La figure 1 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1%, caractérisé par des absorptions à 257, 265, 280, 287 et 325 nm.

f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge:

Tel que représenté à la figure 2.

g) Caractéristiques de solubilité dans différents solvants:

Soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol et très peu soluble ou insoluble dans des solvants comprenant le n-butanol, l'isobutanol, le n-propanol, le n-hexane, le chloroforme, l'acétone, la méthyl isobutyl cétone et l'éther éthylique.

h) Acidité:

La valeur du pH d'une solution aqueuse à 1,0% de la substance est de 6,5.

i) Forme physique:

Poudre jaune pâle.

j) Réactions colorées:

ninhydrine: +,

biuret: +,

Molisch: —,

Dische: —,

anthrone: —, et sulfate de cystéine: —.

k) Stabilité:

Peut être stabilisée par adjonction de L-cystéine, dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline, a- et ß-cyclodextrine, (NH4)2S04, chlorure de sodium et composés similaires.

On va maintenant donner, à titre non limitatif, des exemples de mise en œuvre de l'invention.

Dans les exemples ci-dessous, l'unité d'activité de la substance dite «SPF-100» a été déterminée par la méthode de Udaka [cf. «Journal of Antibiotics», vol. 35, N" 10,1319 à 1325 (octobre 1982)]. L'activité a été déterminée par essai biologique, en utilisant un mutant filtrant à travers les macromolécules de colibacille MP-2 (FERM-P5432) [cf. «Agric. Biol. Chem.», vol. 43, p. 371 (1979)], en prenant pour guide l'activité antibactérienne contre le MP-2.

Plus précisément, on a stérilisé, par chauffage à 120° C pendant 15 minutes, un milieu (c'est-à-dire un milieu M3) consistant en 1,75% de «Bact Antibiotic medium 3» (produit par la société Difco) et 1,3% d'agar-agar. Après quoi, on coule des portions de 20 ml du 5 milieu dans des disques de Pétri et on laissé refroidir, de façon à préparer des milieux de culture sous forme de plaques.

D'autre part, on stérilise un milieu constitué de 0,5% de peptone, 0,5% d'extrait de viande, 0,3% de NaCl et 0,8% d'agar-agar, par chauffage à 120° C pendant 15 minutes. On le place ensuite dans un io thermostat à 42° C. Lorsque la température du milieu atteint 42° C, on ajoute au milieu, à une concentration de 104 cellules/ml, le MP-2 cultivé à 37° C pendant 17 heures.

On prélève 2 ml du milieu au moyen d'une pipette et on les ajoute à la surface du milieu M3 précédemment préparé. Après quoi, 15 on disperse immédiatement de manière homogène le milieu ajouté et on le solidifie. Une solution d'essai contenant la substance dite «SPF-100» est diluée de manière appropriée. On humecte un disque de papier (diamètre 8 mm, produit par la société Toyo Roshi Co., Ltd) avec la solution ainsi obtenue. Ensuite, on place ce disque de 20 papier sur la plaque préparée comme indiqué ci-dessus et il est cultivé pendant 17 heures à 37° C, de manière à déterminer le diamètre de la zone d'inhibition résultant de la substance dite «SPF-100». On définit comme une unité (1 u) la concentration de la substance dite «SPF-100» pour laquelle le diamètre d'inhibition est de 10 mm.

25

Exemple 1

On utilise 9 1 de milieu de culture A ayant la composition suivante:

1%,

1%, 0,25%, 0,25%, et 0,1%

40

extrait de viande 30 polypeptone extrait de levure casamino acides NaCl (pH = 6,9).

35 On inocule 100 ml de milieu BHI par le Streptococcus pyogenes ATCC 21060, et on le soumet à une culture statique pendant 8 heures à 37° C, de façon à obtenir un fluide de culture d'ensemencement. On inocule ensuite 11 de milieu A par 100 ml du liquide de culture d'ensemencement ainsi obtenu, et on le soumet à une préculture dans les mêmes conditions que celles appliquées au liquide de culture d'ensemencement. Ensuite, on inocule 8 1 du milieu A avec le liquide de culture ainsi obtenu, et on procède à une culture anaéro-bie sous agitation dans un bac de fermentation (101) avec une vitesse d'agitation de 300 tours par minute, pendant 11,5 heures à 37° C. On ajoute alors 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures supplémentaires. On centrifuge le bouillon de culture obtenu afin de séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 256 u/ml de la substance dite «SPF-100».

I

Exemple 2

On utilise 9 1 de milieu de culture B ayant la composition suivante:

extrait de viande 1,0%,

polypeptone 1,0%,

extrait de levure 0,25%, et

NaCl 0,1%

(pH = 7,0).

60 On inocule 8 1 du milieu B par 11 de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21060 de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation, dans un bac de fermentation (101) avec une vitesse de rotation de 300 tours par 65 minute, pendant 11 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 800 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, de manière à séparer la bactérie.

55

5

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Le bouillon de culture filtré contient 351 u/ml de substance dite «SPF-100».

Exemple 3

On utilise 91 de milieu de culture C ayant la composition suivante:

extrait de viande 1 %,

polypeptone 1%,

extrait de levure 0,25%, et casamino acides 0,25%

(pH = 6,2).

On inocule 81 du milieu C par 11 de liquide de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21060 de manière similaire à celle décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation, dans un bac de fermentation (101), avec une vitesse de rotation de 300 tours par minure, pendant 14 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, de manière à séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 298 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 4

On utilise 9 1 de milieu de culture D ayant la composition suivante:

extrait de viande 0,5%,

polypeptone 1,0%,

extrait de levure 0,25 %,

casamino acides 0,25%, et

NaCl 0,5%

(pH = 6,5).

On inocule 8 1 du milieu D par 11 de liquide de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21060, de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation, dans un bac de fermentation (101), avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute, pendant 15,5 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1200 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin de séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 285 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 5

On utilise 9 1 de milieu de culture E ayant la composition suivante:

extrait de levure 3,0%

(pH = 6,5).

On inocule 81 du milieu E avec 11 de liquide de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21060, de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaréobie sous agitation dans un bac de fermentation (101) avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute pendant 15 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, de façon à séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 182 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 6

On utilise 91 de milieu de culture F ayant la composition suivante:

maltose 0,3%,

extrait de viande 2,0%,

polypeptone 1,0%, et extrait de levure 0,25%

(pH = 7,0).

On inocule 8 1 du milieu F avec 11 de liquide de culture d'ensemencement dans« lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21060, en procédant de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation, dans un bac de fermentation (101) avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute, pendant 10,5 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin de séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 250 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 7

On utilise 9 1 du milieu de culture G ayant la composition suivante:

extrait de viade 1,0 %,

polypeptone 1,0 %, et

NaCl 0,5%

(pH = 7,0).

On inocule 8 1 du milieu G avec 1 1 de liquide de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21060, en procédant de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie, sous agitation, dans un bac de fermentation (10 1), avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute, pendant 15 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin de séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 200 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 8

On utilise 9 1 de milieu de culture H ayant la composition suivante:

extrait de viande 1,0%

polypeptone 1,0%,

extrait de levure 0,25%,

casamino acides 0,25%, et

NaCl 0,1%

(pH = 7,0).

On inocule 8 1 du milieu H avec 1 1 de liquide de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus sp. ATCC 21597, en procédant de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation, dans un bac de fermentation (101), avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute, pendant 11 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, de manière à séparer la bactérie.

Exemple 9

On utilise 9 1 de milieu de culture I ayant la composition suivante:

extrait de viande 0,5%,

polypeptone 1%,

extrait de levure 0,25%,

casamino acides 0,25%, et

NaCl 0,1%

(pH = 6,5).

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6

On inocule 8 1 de milieu I avec 11 de liquide de culture d'ence-mencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21546, en procédant de manière similaire à celle décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation,

dans un bac de fermentation (101), avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute, pendant 11 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin de séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 340 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 10

On utilise 91 de milieu de culture J ayant la composition suivante:

extrait de viande 2,0%,

polypeptone 1,0%,

extrait de levure 0,25%,

casamino acides 0,25%, et

NaCl 0,5%

(pH = 6,5).

On inocule 81 du milieu J avec 11 de liquide de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21547, en procédant de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation, dans un bac de fermentation (101), avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute, pendant 8 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1500 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin de séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 320 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 11

On utilise 91 de milieu de culture K ayant la composition suivante:

maltose 0,3%,

polypeptone 1,0%, et extrait de levure 0,25%

(pH = 6,8).

On inocule 8 1 du milieu K avec 11 de liquide de culture d'ensemencement dans lequel on a effectué une préculture de Streptococcus pyogenes ATCC 21548, en procédant de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 1, et une culture anaérobie sous agitation, dans un bac de fermentation (101), avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute, pendant 5 heures, à 37° C. On ajoute ensuite 1000 u/ml de pénicilline G, et on continue la culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin de séparer la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 270 u/ml de la substance dite «SPF-100».

Exemple 12

51 du bouillon de culture filtré, obtenu en procédant à la culture comme décrit dans l'exemple 4, contiennent 143 x IO4 u de la substance dite «SPF-100».

On ajoute du sulfate d'ammonium au bouillon de culture filtré, et on récupère une fraction correspondant au degré de saturation de 50 à 90%, de façon à obtenir un précipité. Ce précipité contient 118 x 104u de la substance dite «SPF-100».

On dissout l'ensemble du précipité dans 300 ml de solution tampon au phosphate, et on introduit la solution ainsi obtenue dans une colonne de cellulose-DEAE (5 x 70 cm), de manière à absorber la substance dite «SPF-100». On procède ensuite à une élution par étapes au moyen d'une solution 0,3M de NaCl, de façon à séparer la fraction active. On obtient ainsi un produit ayant une activité de 102,2. x 104u.

On introduit ensuite la fraction active dans une colonne de Se-phadex-DEAE A-25 (2,6 x 70 cm) de façon à absorber la fraction active. On élue ensuite, tout en augmentant linéairement la concentration de chlorure de sodium dans la solution tampon au phos-5 phate, de façon à récupérer la fraction active. On obtient une activité de 79,3 x 104 u.

Ensuite, on concentre le produit d'élution, et on l'introduit dans une colonne (2,6 x 100 cm) d'agent de filtration sur gel Toyopearl HW-50F afin de provoquer son absorption. Ensuite, on l'élue au io moyen d'une solution tampon au phosphate 1/100 M (KH2P04— Na2HP04) de façon à séparer une fraction active désignée par la dénomination «SPF-100». L'activité du produit ainsi obtenu est de 71,1 x 104u.

On lyophilise le produit d'élution ainsi obtenu, ce qui permet 15 d'obtenir 1780 mg de substance dite «SPF-100» sous la forme d'une poudre jaune pâle.

On soumet la substance dite «SPF-100» obtenue de la manière décrite dans l'exemple 12 à des essais in vitro, in vitro/in vivo et in vivo, afin d'étudier son action tumoricide.

20 Exemple d'essai 1 (essai in vitro)

On détermine l'activité tumoricide in vitro du produit soumis à l'essai, par détermination du degré de croissance cellulaire.

On utilise, comme cellules cancéreuses, des Lymphomes P-388 et 25 L-1210 obtenus par sous-culture de tumeurs implantées de manière isologue sur souris DBA/deux lignes. On met respectivement en suspension ces Lymphomes dans un milieu RPMI 1640 contenant 5 x 10~5 M de 2-mercaptoéthanol et 50 mg/1 de kanamycine auxquels on a ajouté 10% de FCS. On injecte ensuite 1 ml de ce milieu dans une 30 plaque du type «Falcon 3047» à une concentration de cellules cancéreuses de 5 x 104 cellules/puits. On injecte ensuite dans le milieu mentionné ci-dessus une quantité donnée de l'agent soumis à l'essai, dissous ou mis en suspension dans 1 ml du milieu, et on procède à une culture en présence de 5% de C02 à 37° C. 48 heures après in-35 jection de l'agent soumis à l'essai, on effectue un test de coloration sur produit vivant, et on détermine le degré de croissance cellulaire par l'équation suivante:

40

Degré de croissance cellulaire (%)

Nombre de cellules dans chaque groupe d'essai Nombre de cellules dans le groupe de référence

100

Les résultats obtenus sont indiqués au tableau 1.

; Tableau 1

Degré de croissance cellullaire (%)

Dose de substance dite «SPF-100»

Lymphome

(x 102 u)

P-388

L-1210

4,7

92,0

98,6

9,3

83,9

94,6

18,6

78,2

68,0

37,2

57,2

49,2

Exemple d'essai 2 (essai in vitro J in vivo)

On détermine l'activité tumoricide in vitro j in vivo de l'agent 60 soumis à l'essai en utilisant des souris femelles de type «ddy» ayant deux ou quatre semaines.

On met en suspension, dans une solution tampon KRP, des cellules cancéreuses ascites Ehrlich, utilisées comme cellules cancéreuses, puis on les mélange avec une quantité donnée de l'agent soumis 65 à l'essai, et on laisse incuber pendant 60 ou 80 minutes, à 37° C. On inocule les souris par voie intrapéritonéale, par des portions de 0,2 ml (0,2 ml/souris) du milieu contenant 4 x 10e ou 8 x 106 de cellules cancéreuses, afin d'observer le nombre de souris vivantes.

7

663 033

Les résultats sont indiqués aux tableaux 2 et 3.

Tableau 2

Activité tumoricide de la substance dite «SPF-100»

(nombre de souris vivantes)

(souris femelles de type «ddy» âgées de 5 semaines)

Dose (u)

Jour

0

10

15

20

25

Référence (0)

8/8

7/8

1/8

0/8

0,625 x 102

8/8

6/8

3/8

10 x 102

8/8

6/8

2/8

Dans les tableaux 2 à 5, les chiffres indiquent le rapport du nombre de souris vivantes au nombre de souris utilisées.

Tableau 3

Activité tumoricide de la substance dite «SPF-100»

(nombre de souris vivantes)

(souris femelles de type «ddy» âgées de 4 semaines)

Dose (u)

Jour

0

10

15

20

25

Référence (0) 20 x 102

8/8 8/8

2/8 8/8

0/8 8/8

0/8 6/8

Exemple d'essai 3 (essai in vivo)

On détermine l'activité tumoricide in vivo de l'agent soumis à l'essai en utilisant des souris mâles du type CRJ-CD-1 (ICR), âgées de 7 semaines.

On met en suspension, dans une solution de Hank, des cellules cancéreuses de type Sarcome-180 ascites, que l'on utilise comme cellules cancéreuses. On inocule ensuite, par voie intrapéritonéale, les souris, par des portions de 0,1 ml de suspension contenant 2 x 106 cellules cancéreuses.

On administre, par voie intrapéritonéale, une quantité donnée de l'agent soumis à l'essai aux souris une fois par jour, pendant 5 jours consécutifs, avant inoculation des cellules cancéreuses, ou bien une fois par jour, pendant 3 jours consécutifs, respectivement avant et après inoculation des cellules cancéreuses, afin d'observer le nombre de souris vivantes. Les résultats sont indiqués aux tableaux 4 et 5.

Tableau 4

Activité tumoricide de la substance dite «SPF-100»

(nombre de souris vivantes)

(administrée avant l'inoculation)

Dose (u)

Jour

0

10

15

20

25

Référence (u) 1 x 102 100 x 102

8/8 8/8 8/8

2/8 5/8 4/8

0/8 4/8 2/8

Tableau 5

(administrée avant et après l'inoculation)

Dose (u)

Jour

0

10

15

20

25

Référence (0) 1 x 102 20 x 102

8/8 8/8 8/8

8/8 8/8 7/8

3/8 7/8 5/8

1/8 4/8 2/8

Exemple 13

On dissout, dans 30 ml de solution tampon au phosphate, 1000 mg de SPF-100, obtenus de manière similaire à celle qui est décrite à l'exemple 8, sous la forme d'une poudre jaune pâle, et on fait s'écouler la solution dans une colonne garnie de Sephadex A-25 (2,6 x 70 cm), de manière à absorber le SPF-100. On procède ensuite à une élution, tout en augmentant linéairement la concentration de chlorure de sodium dans la solution tampon au phosphate, de façon à obtenir une fraction active. Ensuite, on concentre l'intégralité de la fraction active ainsi obtenue jusqu'à un volume de 5 ml, et on l'introduit dans une colonne d'agent de filtration sur gel Toyo-pearl HW-50 F (2 x 100 cm), et on élue au moyen d'une solution tampon au phosphate, de façon à obtenir une fraction active contenant une substance ayant un poids moléculaire de l'ordre de 500 à 7000. On lyophilise la fraction active, ce qui permet d'obtenir 350 mg de poudre blanche d'un produit que l'on désigne par la dénomination «SPF-1 ».

Les propriétés physico-chimiques de la substance dite «SPF-1 » sont les suivantes:

a) Analyse élémentaire:

C: 36,64 à 41,26%

H: 4,10 à 4,91%, et N: 5,40 à 6,52%.

b) Poids moléculaire :

Approximativement 500 à 7000, selon détermination par filtration sur gel.

c) Point de décomposition :

Brunissement à 170e C, noircissement à 200e C et décomposition.

d) Pouvoir rotatoire:

[ag = +63,3 à 64,3° (c = 1,04).

e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet:

La figure 3 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 3,3%, caractérisé par des absorptions à 257, 265, 280 et 287 nm.

f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge:

Tel que représenté à la figure 4.

g) Caractéristiques de solubilité dans différents solvants :

Soluble dans l'eau mais insoluble dans des solvants comprenant le méthanol, l'éthanol, le n-butanol, l'isobutanol, le n-propanol, le n-hexane, le chloroforme, l'acétone, la méthyl isobutyl cétone et l'éther éthylique.

h) Acidité:

La valeur du pH d'une solution aqueuse à 0,85% de la substance est de 6,5.

i) Forme physique:

Poudre blanche.

j) Réactions colorées:

ninhydrine: +,

biuret: +,

Molisch: —,

Dische: —,

anthrone: —, et sulfate de cystéine: —.

k) Stabilité:

Peut être stabilisée par adjonction de L-cystéine, dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline, (NH4)2S04, chlorure de sodium et composés similaires.

Exemple 14

En procédant de manière similaire à celle qui est décrite dans l'exemple 13, on obtient une fraction active contenant une substance ayant un poids moléculaire de l'ordre de 7000 à 25 000. On lyophilise cette fraction active, ce qui permet d'obtenir 380 mg de poudre jaune pâle d'une substance que l'on désigne par le terme de «SPF-2».

Les propriétés physico-chimiques de la substance dite «SPF-2» sont les suivantes:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

663033

a) Analyse élémentaire:

C: 48,57 à 53,64%

H: 5,02 à 5,98%, et N: 10,50 à 11,63%.

b) Poids moléculaire:

Approximativement 7000 à 25 000, comme déterminé par filtration sur gel.

c) Point de décomposition:

Brunissement à 160° C, noircissement à 200° C et décomposition.

d) Pouvoir rotatoire:

[<x]d = +30,7° (c = 1,00).

e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet:

La figure 5 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,2%, caractérisé par des absorptions à 257, 265, 273, 280, 287 et 325 nm.

f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge:

Comme représenté à la figure 6.

g) Solubilité dans différents solvants:

h) Acidité:

La valeur du pH d'une solution aqueuse à 1,0% de la substance est de 6,5.

i) Forme:

Poudre jaune pâle.

j) Réactions colorées:

ninhydrine: +,

biuret: +,

Molisch: —,

Dische: —,

anthrone: —, et sulfate de cystéine: —.

k) Stabilité:

Peut être stabilisée par adjonction de L-cystéine, dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline a- et ß-cyclodextrine, (NH4)2S04, chlorure de sodium ou composés similaires.

Exemple 15

On purifie, en procédant de manière similaire à celle décrite dans l'exemple 12, 51 du bouillon de culture filtré obtenu selon l'exemple 8, ce qui permet d'obtenir 1460 mg de SPF-100 jaune pâle, à l'état pulvérulent.

On traite 1000 mg de cette poudre, ce qui permet d'obtenir 330 mg de SPF-1, de la même façon que dans l'exemple 13, et 370 mg de SPF-2, de la même façon que dans l'exemple 14.

Exemple 16

On purifie, en procédant de manière similaire à celle décrite dans l'exemple 12, 5 1 du bouillon de culture filtré obtenu selon l'exemple 1, ce qui permet d'obtenir 1650 mg de SPF-100 jaune pâle, sous forme pulvérulente.

On traite 1000 mg de cette poudre, ce qui permet d'obtenir 315 mg de SPF-1, de la même façon que dans l'exemple 13, et 390 mg de SPF-2, de la même façon que dans l'exemple 14.

Exemple 17

On utilise 3 1 de milieu de culture L ayant la composition suivante:

BHI 3,7%

(pH = 7,4).

On inocule 100 ml de milieu BHI par le Streptococcus pyogenes ATCC 21060, et on le soumet à une culture statique pendant 8 heures, à 37° C, ce qui permet d'obtenir un liquide de culture d'ensemencement. On inocule 300 ml du liquide d'ensemencement dans 3 1 du milieu L, et on effectue une culture anaérobie, sous agitation, dans un ballon de 3 1, à 37° C, pendant 11,5 heures. On ajoute ensuite 500 g/ml de céphalosporine C, et on continue la culture filtré contient 120 u/ml de SPF-100.

On purifie 31 de milieu de culture pendant 5 heures de plus. On centrifuge le bouillon de culture ainsi obtenu, afin d'enlever la bactérie.

Le bouillon de culture filtré contient 120 u/ml de SPF-100.

On purifie 31 de milieu de culture filtré, en procédant de manière similaire à celle décrite dans l'exemple 12, ce qui permet d'obtenir 530 mg de SPF-100 jaune pâle, à l'état pulvérulent.

On traite 500 mg de cette poudre, ce qui permet d'obtenir 110 mg de SPF-1, de la même façon que dans l'exemple 13, et 160 mg de SPF-2, de la même façon que dans l'exemple 14.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

r

3 feuilles dessins

Claims

663033

2

REVENDICATIONS

1. Substance-mélange dite «SPF-100» ayant les propriétés physico-chimiques suivantes:

a) Analyse élémentaire:

C: 43,69% à 46,42%

H: 4,85% à 5,94%, et N: 9,50% à 11,42%.

b) Poids moléculaire:

Approximativement 500 à 25 000 comme déterminé par filtration sur gel.

c) Point de décomposition:

Brunissement à 160° C, noircissement à 200° C et décomposition.

d) Pouvoir rotatoire:

[ag = +45,0° (c = 1,00)

e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet:

La figure 1 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,1%, caractérisé par des absorptions à 257,265, 280,287 et 325 nm.

f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge:

Tel que représenté à la figure 2.

g) Caractéristiques de solubilité dans différents solvants:

Soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et l'éthanol et très peu soluble ou insoluble dans des solvants comprenant le n-butanol, l'isobutanol, le n-propanol, le n-hexane, le chloroforme, l'acétone, la méthyl isobutyl cétone et l'éther éthylique.

h) Acidité:

La valeur du pH d'une solution aqueuse à 1,0% de la substance est de 6,5.

i) Forme physique:

Poudre jaune pâle.

j) Réactions colorées:

ninhydrine: +,

biuret: +,

Molisch: —,

Dische: —,

anthrone: —, et sulfate de cystéine: —.

k) Stabilité:

Peut être stabilisée par adjonction de L-cystéine, dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline, a- et ß-cyclodextrine, (NH4)2S04 ou chlorure de sodium.
2. Substance-mélange selon la revendication 1, sous la forme dite «SPF-1 » ayant les propriétés physico-chimiques suivantes:

a) Analyse élémentaire:

C: 36,64 à 41,26%

H: 4,10 à 4,91%, et N: 5,40 à 6,52%.

b) Poids moléculaire:

Approximativement 500 à 7000, selon détermination par filtration sur gel.

c) Point de décomposition:

Brunissement à 170° C, noircissement à 200° C et décomposition.

d) Pouvoir rotatoire:

[a]™ = +63,3 à 64,3° (c = 1,04).

e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet:

La figure 3 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 3,3%, caractérisé par des absorptions à 257,265,280 et 287 nm.

f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge:

Tel que représenté à la figure 4.

g) Caractéristiques de solubilité dans différents solvants:

Soluble dans l'eau mais insoluble dans des solvants comprenant le méthanol, l'éthanol, le n-butanol, l'isobutanol, le n-propanol, le n-hexane, le chloroforme, l'acétone, la méthyl isobutyl cétone et l'éther éthylique.

h) Acidité:

La valeur du pH d'une solution aqueuse à 0,85% de la substance est de 6,5.

i) Forme physique:

5 Poudre blanche.

j) Réactions colorées:

ninhydrine: +,

biuret: +,

Molisch: —,

10 Dische: —,

anthrone: —, et sulfate de cystéine: —.

k) Stabilité:

]5 Peut être stabilisée par adjonction de L-cystéine, dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline, (NH4)2S04, ou chlorure de sodium.
3. Substance-mélange selon la revendication 1, sous la forme dite «SPF-2» ayant les propriétés physico-chimiques suivantes: 20 a) Analyse élémentaire:

C: 48,57 à 53,64%

H: 5,02 à 5,98%, et N: 10,50 à 11,63%.

b) Poids moléculaire:

25 Approximativement 7000 à 25 000, comme déterminé par filtration sur gel.

c) Point de décomposition:

Brunissement à 160° C, noircissement à 200° C et décomposition. „ d) Pouvoir rotatoire:

30

[a]n = +30,7° (c = 1,00).

e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet:

La figure 5 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution aqueuse à 0,2%, caractérisé par des absorptions à 35 257, 265, 273, 280, 287 et 325 nm.

f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge:

Comme représenté à la figure 6.

g) Solubilité dans différents solvants:

Soluble dans l'eau, partiellement soluble dans le méthanol et 40 l'éthanol et très peu soluble ou insoluble dans des solvants comprenant le n-butanol, l'isobutanol, le n-propanol, le n-hexane, le chloroforme, l'acétone, la méthyl isobutyl cétone et l'éther éthylique.

h) Acidité:

La valeur du pH d'une solution aqueuse à 1,0% de la substance 45 est de 6,5.

i) Forme:

Poudre jaune pâle.

j) Réactions colorées:

ninhydrine: +,

50 biuret: +,

Molisch: —,

Dische: —,

anthrone: — ,et sulfate de cystéine: —.

55 k) Stabilité:

Peut être stabilisée par adjonction de L-cystéine, dithiothréitol (DTT), glycérol, albumine, globuline, a- et ß-cyclodextrine, (NH4)2S04 ou chlorure de sodium.

60 4. Procédé de préparation de la substance dite «SPF-100», selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'adjonction de pénicilline ou de substances apparentées dans le milieu liquide de culture, au cours de la culture d'une bactérie du genre Streptocoque, produisant la substance tumoricide dite «SPF-100», et la récupéra-65 tion de la substance dite «SPF-100» à partir du bouillon de culture, libéré des corps bactériens.

3

663 033