FR2463619A1

FR2463619A1 - Nouvelles substances produites par des bacteries du genre fusobacterium, leur procede de preparation et leur application en therapeutique

Info

Publication number: FR2463619A1
Application number: FR8018396A
Authority: FR
Inventors: Kenzo Tamai; Isamu Saikawa; Takashi Yasuda; Shohachi Murakami; Toyoo Maeda; Hisatsugu Tsuda; Hiroshi Sakai; Masatoshi Sugita; Yoshiko Yamamoto; Hisashi Minami; Takako Hori
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1979-08-24
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1981-02-27
Also published as: IT1181595B; DE3031152C2; GB2059969A; CH648042A5; DK151639C; FI68080C; AU6164680A; DK151639B; FR2463619B1; FI68080B; ATA426480A; PT71730A; NZ194744A; NL8004759A; FI802641A; NO155697B; IT8049541A0; NO155697C; NO802499L; SE8005921L

Abstract

L'INVENTION EST DU DOMAINE DE LA MICROBIOLOGIE. IL EST DECRIT DE NOUVELLES SUBSTANCES A ACTION CARCINOSTATIQUE ET IMMUNOSTIMULANTE, QUE L'ON OBTIENT A PARTIR D'UNE CULTURE OU DE SON LIQUIDE SURNAGEANT, PREPAREE EN CULTIVANT DES BACTERIES APPARTENANT AU GENRE FUSOBACTERIUM. IL EST EGALEMENT DECRIT UN PROCEDE POUR PREPARER CES SUBSTANCES. LESDITES SUBSTANCES SONT UTILISABLES POUR LE TRAITEMENT DE DIVERSES MALADIES CANCEREUSES DES MAMMIFERES Y COMPRIS LES ETRES HUMAINS.

Description

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La présente invention concerne un procédé d'obten- tion de nouvelles substances à action carcinostatique et

immunostimulante, qui consiste à cultiver dans des condi-

tions anaérobies des bactéries productrices de substances TF, appartenant au genre Fusobacterium, età recueillir les substances résultantes de la culture ou de son liquide

surnageant (ladite substance nouvelle étant appelée ci-

après "substance TF"). L'invention concerne également les substances TF obtenues [elles comprendront ci-après TF-100, , 120, 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136), 140 et 1501, ainsi qu'un agent carcinostatique contenant

ces substances.

Ces dernières années, on en est venu à utiliser

extensivement, pour soigner les patients atteints de diffé-

rents types de cancer, un traitement reposant sur l'amélio-

ration de la fonction immunologique de l'hôte et sur l'ob-

tention d'un effet carcinostatique avec l'aide de la fonc-

tion immunologique. Parmi les agents antitumoraux utilisés dans ce traitement, il y a des constituants connus obtenus à partir d'organismes de diverses bactéries, ou par culture de diverses bactéries ou polysaccharides obtenus à partir de corps de moisissures producteurs de spores de Basidiomycetes ou de leurs corps de champignons cultivés. Cependant, ces agents antitumoraux ne sont pas encore satisfaisants par leur effet thérapeutique, leurs effets secondaires nocifs et

leur procédé d'obtention.

D'autre part, il existe des comptes-rendus sur un organisme et un liquide surnageant obtenus en cultivant des bactéries appartenant au genre Fusobacterium, par exemple Fusobacterium K031-3B, Fusobacterjim fusifomis W-12, Fusobacterium girans 1012 et Fusobacterium nucleatum 1010 [Dental Surgery, 23, 322-333 (1974), et 21, 534-539 (1972) (Japonais)]. Cependant, il n'a encore été fait aucune étude sur les constituants obtenus à partir d'une culture ou de son liquide surnageant, préparés en cultivant des bactéries appartenant au genre Fusobacterium, ni sur les activités

pharmacologiques de ces constituants.

Les auteurs de la présente invention ont étudié l'activité pharmacologique d'un liquide surnageant obtenu en cultivant des bactéries appartenant au genre Fusobacterium et en retirant les organismes de la culture, et ils ont découvert qu'un constituant spécifique obtenu à partir du liquide surnageant avait une action carcinostatique; que

ledit constituant n'avait pratiquement aucun effet d'inhi-

bition de la formation d'une colonie de cellules cancéreuses dans une méthode d'essai de formation de colonies, et n'avaient pas une action carcinostatique par destruction des

cellules cancéreuses, mais une action carcinostatique indi-

recte en augmentant l'activité antitumorale due à l'hôte ou l'immunité de l'hôte et en tirant partie de l'immunité; et que ledit constituant avait une très faible toxicité et

pouvait être obtenu également en traitant la culture.

Un objectif de la présente invention est de procurer un procédé consistant à cultiver des bactéries appartenant au genre Fusobacterium dans des conditions anaérobies, et à recueillir de la culture résultante ou de son liquide

surnageant de nouvelles substances TF à action carcino-

statique et immunostimulante.

Un autre objectif de l'invention est de procurer

lesdites substances TF.

Un autre objectif de l'invention est de procurer un

agent carcinostatique contenant lesdites substances TF.

D'autres objectifs et avantages de l'invention res-

sortiront de la description qui va suivre.

Comme bactéries utilisées dans la présente invention, on peut utiliser n'importe quelle bactérie productrice de substance TF appartenant au genre Fusobacterium et, par

exemple, on utilise de préférence Fusobacterium nucleatum.

Concrètement, on utilise Fusobacterium nucleatum TF-031

(FARM 5077; ATCC 31647).

Les propriétés bactériologiques de Fusobacterium nucleatum TF-031 sont les suivantes: (I) Forme (1) Forme des cellules: fusiforme (Figure 1) (2) Polymorphisme des cellules: absent (3) Motilité: absente (4) Spores: absents (5) Coloration de Gram: Gram négatif (6) Résistance aux acides: négative (II) Conditions de croissance dans un milieu de cultures (1) TFa, plaque de gélose et milieu de culture incliné Forme externe: ronde Taille: 1 mm environ Protubérance: forme hémisphérique Structure: en goutte de rosée Surface: lisse Bords: lisse Couleur: blanc jaunâtre laiteux Transparence: opaque (2) TF-a, milieu de cultures liquide Degré de croissance: vigoureux Turbidité: coagulum Précipité: néant croissance en surface: néant, pas de croissance jusqu'à une profondeur de 5 mm environ gaz: Néant (III) Propriétés physiologiques (1) Production d'acide sulfhydrique: +

(2) Réduction des nitrates: -

(3) Production d'acide butyrique: + (4) Production d'indole: +

(5) Uréase: -

(6) Catalase: -

(7) Hydrolyse de l'amidon: -

(8) Comportement à l'oxygène: anaérobie (9) Production d'ammoniac: + (10) Production de gaz carbonique: + (11) Domaine de croissance: pH 5 à 8,5, température

à 45 C

(12) Production de gaz à partir des saccharides: L-arabinose (-), Dxylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-). D-fructose (-), D-galactose (-), sucre de malt (-), saccharose (-), tréhalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-),

glycérol (-), amidon (-).

Les nouvelles substances TF selon l'invention sont

obtenues, par exemple, de la manière suivante.

Culture de bactéries productrices de substance TF appartenant au genre Fusobacterium I Culture ou son liquide surnageant Tampon de phosphate (Chlorure de sodium) ou eau

TF-100-- -.

Tampon de phosphate (Chlorure de sodium) (TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136) Culture ou son liquide surnageant *1 Production d'un sel de baryum TF-14o Solution *3 interne Schag TF-l 11l 0

Traitement par un I-

A[Traitement par un, '

TF-150

On va maintenant illustrer le procédé d'obtention susmentionné. (1) Culture des bactéries On procède à la culture de bactéries appartenant au genre Fusobacterium par un procédé usuel de culture des bactéries anaérobies. Autrement dit, on ajuste à un pH de 6 à 8,5, de préférence de 7,2 à 8,2, un milieu de culture

contenant une source d'azote te-% qu'extraits de cervelle-

coeur de veau, diverses peptones ou des produits similaires; une source de vitamines, telle qu'un extrait de levure ou un produit similaire; un sel minéral tel que le chlorure de sodium ou un sel similaire; une source de carbone telle que le glucose, le lactose ou un produit similaire; un agent réducteur tel que la L-cystine, le sulfite de sodium, le thioglycollate, ou un produit similaire, et on inocule

les bactéries sur le milieu de culture, après quoi on pro-

cède à une culture en régime permanent dans des conditions anaérobies entre 35 et 420C, de préférence entre 36 et 380C,

pendant 1 à 5 jours, de préférence pendant 24 à 72 heures.

En particulier, il est souhaitable d'utiliser le milieu de culture décrit dans le Tableau I ci-après (appelé ci-après

milieu de culture TF). Cependant, l'infusion de cervelle-

coeur qui est un extrait de cervelle-coeur de veau n'est pas toujours nécessaire comme source de carbone et peut être remplacée par une infusion de coeur qui est un extrait de coeur de veau, un extrait de boeuf, un extrait de poisson,

de la liqueur de macération de mais, ou un produit similaire.

Parmi les diverses peptones, la peptone de protéose et la peptone de phytone ne sont pas toujours nécessaires, et la

peptone de trypticase peut être remplacée par la polypeptone.

Quand on n'utilise pas de gélose, il est souhaitable

de procéder en culture agitée.

TABLEAU I

Constituants du milieu de culture (g/l) TF-a TF-b TF-c Peptone de trypticase 17 17 17 Peptone de phytone 3 3 1,5 Peptone de protéose 10 5 5

Infusion de cervelle-coeur 35 17,5 -

Infusion de coeur - - 25 Extrait de levure 3 3 3 Chlorure de sodium 7,5 7, 5 7,5 Glucose 6 6 6 Lactose 5 5 5 L-cystine 0,25 0,5 0,5 Sulfite de sodium 0,1 0,1 0,1 Thioglycollate 0,5 0,5 0,5 Gélose 0 ou 0,7 0ou0,7 0ou0, 7 (2) Recueil d'un liquide surnageant de la culture (prélèvement des organismes)

On prélève les organismes de la culture obtenue ci-

dessus pour avoir un liquide surnageant. Pour prélever les organismes, on peut utiliser un procédé classique, par exemple la centrifugation et un procédé de filtration faisant appel à un adjuvant de filtration,tel que "Hyflo Super Cel", et en particulier un procédé de centrifugation est préférable du point de vue de la facilité d'opération, du degré de prélèvement des organismes, et du rendementen liquide surnageant. Les organismes sont, de préférence, prélevés dans cette étape, mais ils peuvent l'être dans

l'étape suivante (3).

(3) Recueil de la substance carcinostatique TF-100 On ajoute un solvant organique hydrophile au liquide surnageant obtenu ci-dessus ou à la culture entière, et on recueille le précipité formé. A ce moment là, on ajuste de préférence à un pH de 2 à 7 le liquide surnageant ou la culture. Le solvant organique hydrophile peut être, par exemple, un alcool tel que l'éthanol ou le méthanol, ou une cétone telle que l'acétone, mais ce sont les alcools, en

particulier l'éthanol, qui donnent les meilleurs résultats.

0io Il convient d'ajouter le solvant organique hydrophile de

telle sorte que sa concentration soit de 30 à 70 %, de pré-

férence de 50 à 70 %, en volume. Après l'addition du solvant organique hydrophile, on laisse reposer le mélange résultant à basse température, de préférence à 50C environ, pendant une période de plusieurs heures à plusieurs jours,

pour compléter la formation du précipité.

On sépare le précipité ainsi formé par des procédés habituels tels que décantation, centrifugation, filtration, etc... Ensuite, on ajoute au précipité une quantité d'eau représentant de 10 à 15 fois celle du précipité obtenu [l'eau peut être remplacée par un tampon de phosphate ou par un tampon de phosphate-contenant du chlorure de sodium lorsque c'est TF-120 ou 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 ou 136) que l'on veut obtenir comme mentionné ci-après] et on élimine les matières insolubles dans l'eau qui se sont

formées, par un procédé usuel tel que centrifugation, fil-

tration, etc..., après quoi on recueille la fraction solu-

ble dans l'eau. Quand c'est la culture entière que l'on utilise, on prélève les organismes par les modes opératoires susmentionnés. On sèche la fraction soluble dans l'eau ainsi obtenue, par lyophilisation et similaires, pour obtenir

une substance carcinostatique appelée TF-100.

La substance TF-100 ainsi obtenue a les propriétés

indiquées dans le Tableau II ci-après.

(4) Recueil de la substance carcinostatique TF-110 On fait subir à la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus une dialyse ou une ultrafiltration; ou bien on dissout TF-100 dans une quantité d'eau représentant de 10 à 15 fois celle de TF-100, et on fait subir à la solution résultante une dialyse ou une ultrafiltration. On élimine par le procédé susmentionné les substances de bas poids moléculaire telles que les aminoacides et les matières minérales. On recueille la solution interne obtenue par dialyse ou ultrafiltration, puis on la sèche pour obtenir

une substance carcinostatique appelée TF-11.

La substance TF-110 ainsi obtenue a les propriétés

indiquées dans le Tableau Il ci-après.

(5) Recueil de la substance carcinostatique TF-120 On traite à l'aide d'un échangeur d'ions la fraction

soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou, si néces-

saire, la solution interne obtenue en faisant subir à la

fraction soluble dans l'eau une dialy se ou une ultrafiltra-

tion [la solution interne obtenue en-(4) ci-dessus], ou bien une solution d'une poudre de TF-110 dans une petite quantité d'eau. Comme échangeur d'ions, on utilise de préférence un échangeur d'ions faiblement basique ou un échangeur d'ions faiblement basique ayant les propriétés

d'un tamis moléculaire et, par exemple, il convient d'uti-

liser du diéthylaminoéthyl-Séphadex A-SQ parque déposée de Pharmacia Co. Itd). On équilibre une colonne garnie d'un échangeur d'ions, par exemple à l'aide d'un tampon de phosphate ayant un pH de 8 environ, après quoi on fait passer dans la colonne la solution susmentionnée à traiter, et on recueille la solution éluée, puis on la sèche par lyophilisation ou par un procédé similaire; ou bien, on place dans un récipient contenant un échangeur d'ions le même tampon que ci-dessus et la solution à traiter, et on agite le contenu du récipient, puis on filtre, après quoi on sèche le filtrat. On peut ainsi obtenir une substance carcinostatique appelée TF-120 ayant les propriétés décrites

ci-après. On peut également obtenir TF-120 en déminérali-

sant la solution éluée ou le filtrat, par exemple par dialyse à l'aide d'un tube en "Cellophane",-ou un moyen similaire, en utilisant du Séphadex G-25 (marque déposée de Pharmacia Co.

Ltd.), ou bien par ultrafiltration, puis séchage.

La substance TF-120 ainsi obtenue a les propriétés

indiquées dans le Tableau II ci-après.

(6) Recueil de la substance carcinostatique TF-130 On traite une colonne contenant les constituants adsorbés, dont on a prélevé TF-120 par le traitement indiqué en (5) ci-dessus par un tampon de phosphate, de préférence un tampon de phosphate ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,1 à 0,6 M et un pH de 8 environ (ci-après, le tampon de phosphate ayant une concentration en chlorure

de sodium de 0,1 à 0,6 M sera appelé tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,1 - 0,6 M); ou bien on fait subir à la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus, s'il y a lieu, une dialyse ou une ultrafiltration, puis un traitement par un échangeur d'ions en utilisant un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 - 0,6 M, pour obtenir une fraction que l'on n'élue pas avec un tampon de phosphate

dépourvu de chlorure de sodium mais avec un tampon de phos-

phate-chlorure de sodium 0,1 - 0,6 M. On peut mettre en oeuvre ce mode opératoire soit en continu dans une colonne, soit en discontinu. La fraction voulue ainsi obtenue,éluée avec le tampon de phosphate-chlorure de sodium est séchée par lyophilisation ou unprocédé similaire, pour obtenir une substance carcinostatique appelée TF-130. On peut diminéraliser l'éluat contenant la fraction voulue, que l'on élue avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium, par exemple par dialyse à l'aide d'un tube en "Cellophane", par tamisage moléculaire à l'aide de Séphadex G-25, ou bien par

ultrafiltration, puis on le sèche.

L'appellation "TF-130" utilisée ici désigne collec-

tivement les fractions éluées voulues obtenues en traitant la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou, s'il y a lieu, la solution interne obtenue en faisant subir

à la fraction soluble dans l'eau une dialyse ou une ultra-

filtration, à l'aide d'un échangeur d'ions, fractions qui ne sont pas éluées avec un tampon de phosphate dépourvu de

chlorure de sodium, mais éluées avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,1 - 0,6 M. TF-130 comprend concrète-

ment, par exemple, les fractions suivantes.

(i) Fraction qui n'a pas été éluée avec un tampon de phosphate dépourvu de chlorure de sodium mais a été éluée avec un tampon de phosphate- chlorure de sodium 0,6 M dans

le traitement susmentionné d'échange d'ions [cette frac-

tion est appelée TF-1316].

(ii) Fraction qui n'a pas été éluée avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M mais a été éluée avec un

tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M dans le trai-

tement susmentionné d'échange d'ions [cette fraction est appelée TF-132a et b; on obtient TF-132a en lavant un échangeur d'ions contenant le constituant adsorbé précité avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M, en

traitant l'échangeur d'ions avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,2 M, puis en recueillant la fraction éluée avec le tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M; et on obtient TF-132b en traitant la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou le composant de la solution interne

(TF-:11O) obtenue en (4) ci-dessus avec un échangeur d'ions].

(iii) Fraction qui n'a pas été éluée avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M mais a été éluée avec un

tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M dans le traite-

ment susmentionné d'échange d'ions [cette fraction est appelée TF-133a et b; les symboles a et b ont les mêmes

significations que dans le cas de TF-132a et b, respective-

ment]. (iv) Fraction qui n'a pas été éluée avec un tampon de phosphatechlorure de sodium 0,1 M mais a été éluée avec un

tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M dans le traite-

ment susmentionné d'échange d'ions [cette fraction est -

appelée TF-1323].

(v) Fraction qui n'a pas été éluée avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,5 M mais a été éluée avec un

tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,6 M dans le traite-

ment susmentionné d'échange d'ions [cette fraction est

appelée TF-1361.

Puisque ces substances TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 et 136 ont des propriétés communes sur les points suivants, ces substances ayant les propriétés communes sont appelées collectivement TF-130. Autrement dit, la substance TF-130 obtenue de la manière décrite ci-dessus possède les propriétés suivantes:

(a) Poudre blanc-grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asci-

tique d'Ehrlich chez les souris, de la tumeur consistante d'Ehrlich et du carcinome Sarcoma-180, et elle a une action immunostimulante. (c) Elle est soluble dans l'eau et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, le chloroforme,

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle commence à se décomposer à 1100C environ, et elle se

décompose remarquablement au-dessus de 200'C.

(e) Son spectre d'absorption infrarouge obtenu par la méthode de la pastille de KBr présente des bandes

d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm1.

(f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solu-

tion aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorp-

tion, et un pic d'absorption au voisinage de 256-280 nm.

(g) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la réaction phénolacide sulfurique, à la réaction anthrone-acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique, et à la réaction de Lowry-Folin, et négative à la réaction de la ninhydrine (h) Analyse élémentaire

C: 27,5 - 39,8 % H: 3,2 - 5,7 %

N: 2,8 - 6,3 %

(i) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 19,0 à environ 64,0 % en poids (exprimée en glucose), et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de LowryFolin, est au voisinage de 6,0 à 26,0 % en poids (exprimée en albumine de sérum de

veau).

Le traitement susmentionné d'échange d'ions est expli-

qué plus en détail ci-dessous. Comme échangeurd'ions utilisé dans les modes opératoires suivants, on préfère un échangeur d'ions faiblement basique ou un échangeur d'ions faiblement basique ayant les propriétés d'un tamis moléculaire et, par

exemple, il convient d'utiliser le diéthylaminoéthyl-

Séphadex A-50 utilisé en (5) ci-dessus, et le procédé suivant

peut être mis en oeuvre en discontinu.

(i) On fait passer dans une colonne d'un échangeur d'ions contenant le constituant adsorbé danslaquelle on a fait passer

la solution à traiter en (5) ci-dessus, un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,6 M ayant de préférence un pH de 8 environ, et on recueille la fraction éluée, on la concentre

éventuellement et on la déminéralise par cialyse, ultra-

filtration ou par un procédé similaire, et ensuite on la sèche par lyophilisation ou par un procédé similaire pour

obtenir une substance carcinostatique appelée TF-1316.

La substance TF-1316 ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau II ci-après. (ii)-l On fait passer dans une colonne d'un échangeur d'ions contenant le constituant adsorbé dans laquelle on a fait passer la solution à traiter en (5) ci-dessus,- pour laver la colonne, un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, après quoi

on fait passer dans la colonne un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,2 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, et on recueille la fraction éluée, on la concentre facultativement et on la déminéralise par dLalYse, par ultrafiltration ou par un procédé similaire, puis on la sèche par lyophilisation ou par un procédé similaire, pour

obtenir une substance carcinostatique appelée TF- 132a.

La substance TF-132a ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau Il ci-après.

(ii)-2 On met en oeuvre, de la manière suivante, des modes opératoires de recueil de la fraction qui n'a pas été éluée avec un tampon de phosphatechlorure de sodium 0,1 M mais a été éluée avec un tampon de phosphatechlorure de sodium 0,2 M dans le traitement d'échange d'ions, en utilisant la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou la solution interne obtenue en (4) ci-dessus, pour obtenir la substance TF- 132b. Autrement dit, on équilibre la colonne

garnie de l'échangeur d'ions avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M ayant de préférence un pH de 8 environ, après quoi on fait passer dans la colonne le tampon précité de phosphatechlorure de sodium 0,2 - 0,3 M de la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou la solution interne obtenue en faisant subir à la fraction soluble dans l'eau une î alyse ou une ultrafiltration, et -35 on recueille la solution éluée. S'il y a lieu, on lave la colonne avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M, et on réunit la solution éluée et les eaux de lavage. On-peut répéter plusieurs foisle traitement d'échange d'ions. Ensuite, on fait passer dans une colonne dans laquelle l'échangeur d'ions a été équilibré avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M ayant, de préférence un pH de 8 environ, une solution préparée en

diluant la solution éluée précitée avec un tampon de phos-

phate de telle sorte que la concentration en chlorure de sodium soit égale à 0,1 M, et on sépare la fraction qui a été éluée avec le tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M précité, après quoi on fait passer dans la colonne le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M pour obtenir un éluat. Dans l'exemple concret du traitement susmentionné d'échange d'ions, on recueille une fraction qui n'a pas été adsorbée par un échangeur d'ions équilibré avec le tampon précité de phosphatechlorure de sodium 0,2M, on la fait adsorber par un échangeur d'ions équilibré avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M, on la lave avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M, puis on l'élue avec le tampon précité de

phosphate-chlorure de sodium 0,2 M pour obtenir un éluat.

On peut également faire appel à un procédé selon lequel, inversement, on recueille la fraction qui a été adsorbée par un échangeur d'ions équilibré avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M, et ensuite on met en oeuvre un procédé de séparation de ladite fraction d'une

fraction qui a été adsorbée pr un échangeur d'ions équi-

libré avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M, et on recueille une fraction qui a été éluée avec le

tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,2M.

On concentre facultativement l'éluat-obtenu de la manière décrite cidessus et on le déminéralise par dialyse, par ultrafiltration ou par un procédé similaire, puis on le sèche par lyophilisation ou par un procédé similaire, pour

obtenir une substance carcinostatique appelée TF-132b.

La substance TF-132b ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau II ci-après.

(iii)-1) On fait passer la solution interne obtenue en-(4) ci-dessus dans une colonne d'un échangeur d'ions équilibré avec un tampon de phosphate ayant de préférence un pH de 8 environ, et on fait passer dans ladite colonne, pour laver la colonne, un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, puis on fait passer dans ladite colonne un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M ayant de préférence un pH de 8 environ, ou bien on fait passer le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M qui a été traité en (ii)-1) ci- dessus et qui contient encore le constituant adsorbé restant. On recueille la fraction éluée, on la concentre facultativement et on la déminéralise par dia1yse, par ultrafiltration ou

par un procédé similaire, puis on la sèche par lyophilisa-

tion ou par un procédé similaire, pour obtenir une substance

carcinostatique appelée TF-133a.

La substance TF-133a ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau II ci-après.

(iii)-2) On recueille de la manière suivante, qui est la même que dans le procédé susmentionré(ii)-2) la fraction qui n'a pas été éluée avec un tampon de phosphate-chlorure de

sodium 0,2 M mais a été éluée avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,3 M dans le traitement d'échange d'ions, pour obtenir TF-133b. Autrement dit, on équilibre la colonne

garnie de l'échangeur d'ions avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,3 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, après quoi on fait passer dans la colonne le tampon précité de phosphatechlorure de sodium 0,3 M de la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou la solution interne obtenue en faisant subir à la fraction soluble dans l'eau une dialyse ou une ultrafiltration, et on recueille la solution éluée. Si nécessaire, on lave la colonne avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M, et on réunit la solution éluée et les eaux de lavage. On peut

répéter plusieurs fois le traitement d'échange d'ions.

Ensuite, on fait passer dans une colonne dans laquelle l'échangeur d'ions a été équilibré avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, une solution préparée en diluant la solution éluée précitée avec un tampon de phosphate de telle sorte que la concentration en chlorure de sodium soit égale à 0,2 M, et on sépare la fraction qui a été éluée avec le tampon précité de phosphate- chlorure de sodium 0,2 M, après quoi on fait passer dans la colonne le tampon précité de

phosphate-chlorure de sodium 0,3 M pour obtenir un éluat.

Dans l'exemple concret du traitement susmentionné d'échange d'ions, on recueille une fraction qui n'a pas été adsorbée par un échangeur d'ions équilibré avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M, onla fait adsorber par un échangeur d'ions équilibré avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M, on la lave avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M, puis on l'élue avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M pour obtenir un éluat. On peut également faire appel à un procédé selon lequel, inversement, on recueille une fraction qui a été adsorbée par un échangeur d'ions équilibré avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M, et ensuite on procède à une séparation de ladite fraction d'avec une fraction qui été adsorbée par un échangeur d'ions équilibré avec le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M, et on recueille une

fraction qui a été éluée avec le tampon précité de phosphate-

chlorure de sodium 0,3 M. Ensuite, on concentre facultativement l'éluat obtenu de la manière décrite ci-dessus et on le déminéralise par dialyse, par ultrafiltration ou par un procédé similaire,

puis on le sèche par lyophilisation ou par un procédé simi-

laire, pour obtenir la substance carcinostatique voulue,

appelée TF-133b.

La substance TF-133b ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau 2 ci-après.

(iv) On met la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou la solution interne obtenue en (4) ci-dessus, sous la forme d'un tampon de phosphate-chlorure de sodium 013 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, et on fait passer le tampon obtenu dans une colonne d'échange d'ions

qui a été au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,3 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ. On ajuste la solution éluée par addition d'un tampon de phosphate de telle sorte que la concentration en chlorure de sodium soit de 0,1 M, puis on la fait passer dans une colonne d'échange d'ions qui a été au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, et ensuite on fait passer dans ladite colonne le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M, après quoi on recueille la fraction éluée, on la concentre facultativement et on la déminéralise par dialy.se, par ultrafiltration ou par un procédé similaire, puis on la sèche par lyophilisation ou par un procédé similaire, pour obtenir une substance

carcinostatique appelée TF-1323.

La substance TF-1323 ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau II ci-après.

<y) On fait passer la solution interne obtenue en (4) ci-

dessus dans une colonne contenant un échangeur d'ions équi-

libré avec un tampon de phosphate ayant, de préférence, un pH de 8 environ, et on fait passer dans ladite colonne, pour laver la colonne, un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,5 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, puis

on fait passer dans ladite colonne un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,6 M ayant, de préférence, un pH de 8 environ, ou bien on fait passer dans la colonne le tampon précité de phosphate- chlorure de sodium 0,5 M qui a été traité en (ii)-2) ci-dessus et contient encore le constituant adsorbé restant, après quoi on fait passer dans ladite colonne le tampon précité de phosphate-chlorure de sodium 0,6 M. On recueille la fraction éluée, on la concentre

facultativement et on la déminéralise par dialyse, par ultra-

filtration ou par un procédé similaire, puis on la sèche par lyophilisation ou par un procédé similaire, pour obtenir une

substance carcinostatique appelée TF-136.

La substance TF-136 ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau II ci-après.

(7) Recueil de la substance carcinostatique TF-140 On ajoute des ions baryum à la culture ou à son liquide surnageant obtenu en (1) ou en (2) ci-dessus, ou

bien à la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-

dessus, ou encore à la solution obtenue en dissolvant TF-100 dans de l'eau, de façon à former un sel de baryum, après

quoi on recueille le précipité, puis on procède à l'élimina-

tion du baryum, et on recueille la fraction soluble dans

l'eau, puis on lui fait subir une dialy se ou une ultraf il-

tration pour obtenir TF-140. Pour être plus précis, on ajoute une solution aqueuse de baryte, de préférence une solution aqueuse de baryte 0,1 - 0,5 M, à la culture ou à son liquide surnageant obtenu en (1) ou en (2) ci-dessus, ou à la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci- dessus, ou à une solution aqueuse obtenue en dissolvant TF-100 dans une quantité d'eau représentant environ 10 à fois celle de TF-100, et on ajuste de préférence le pH du mélange résultant entre 10 et 13 pour former un sel de baryum. Un précipité se dépose sous l'effet de l'addition d'une solution de baryte, et on ajuste de préférence la

quantité ajoutée d'ions baryum de telle sorte que la con-

centration des ions baryum totaux dans le volume final du mélange soit de 0,005 à 0,1 M. On filtre le mélange ainsi obtenu, et on procède à la séparation du baryum d'avec le sel de baryum obtenu. On élimine le baryum de préférence en ajoutant le sel de baryum à du sulfate de sodium, de préférence sous la forme d'une solution aqueuse à 5 - 15 %, en agitant le mélange résultant, puisen procédant à une filtration pour obtenir une solution. On lave à nouveau avec une solution aqueuse de sulfate de sodium le précipité qui a été séparé et éliminé, et on réunit les eaux de lavage à la solution susmentionnée. On fait subir à la solution

ainsi obtenue une dialyse, une ultrafiltration ou un traite-

ment similaire pour éliminer l'excès de sulfate de sodium ou de substances à poids moléculaire bas, puis on sèche la solution résultante par lyophilisation ou par un procédé similaire pour obtenir une substance cardinostatique

appelée TF-140.

La substance TF-140 ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau II ci-après.

(8) Recueil de la substance carcinostatique TF-150

On traite par un sel d'ammonium quaternaire la frac-

tion soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou la solution interne obtenue en (4) ci-dessus, et on recueille

le précipité ainsi formé, puis on lui fait subir une disso-

ciation à l'aide d'une solution contenant du chlorure de sodium, après quoi on ajoute un solvant organique hydrophile à la fraction soluble, et on recueille le précipité ainsi formé, puis on le sèche pour obtenir TF150. Le sel d'ammonium quaternaire qui peut être utilisé icien général, peut être

* sous la forme d'un complexe quelconque avec un poly-

saccharide, et des exemples particulièrement préférés de ce sel comprennent le chlorure de cétyl-pyridinium, le bromure

de cétyl-triméthyl-ammonium, etc... On procède, de préfé-

rence, au traitement par un sel d'ammonium quaternaire en présence d'un tampon tel qu'un tampon de borateou un tampon

similaire. La description concrète du traitement sus-

mentionné par un sel d'ammonium quaternaire et du mode opé-

ratoire de dissociation à l'aide d'une solution contenant du chlorure de sodium, est la suivante. Par exemple, on ajoute goutte à goutte une solution aqueuse d'un sel d'ammonium quaternaire à la fraction soluble dans l'eau obtenue en (3) ci-dessus ou à la solution interne obtenue

en (4) ci-dessus, tout en maintenant le pH faiblement basi-

que, et on agite le mélange résultant entre 0 et 500C pendant une période 10 minutes à plusieurs heures, après quoi on recueille le précipité qui s'est déposé. On lave ce précipité plusieurs fois avec un tampon, de préférence un tampon de borate à 0,1 %, contenant 0,1 M de chlorure de

sodium et une petite quantité d'un sel d'ammonium quaternai-

re, puis on le dissocie avec un tampon, de préférence un tampon de borate à 0,1 %, contenant 0,5 M de chlorure de

sodium et une petite quantité d'un sel d'ammonium quater-

naire, pour obtenir une fraction soluble, puis on ajuste de préférence à pH 2 - 6 ladite fraction soluble. Ensuite

on ajoute à la fraction soluble un solvant organique hydro-

phile, de préférence un alcool, pour que sa concentration soit finalement de 50 à 90 %, de préférence de 70 à 90 % en volume, et on laisse le mélange ainsi obtenu reposer entre 0 et 300C pendant une période de plusieurs heures à 90 heures, après quoi on recueille le précipité qui s'est déposé pour obtenir une substance carcinostatique appelée

TF-150.

La substance TF-150 ainsi obtenue possède les pro-

priétés indiquées dans le Tableau II ci-après.

TABLEAU II

Propriétés Apparence Action pharmacologique Solubilité Fraction Poudre blanc- Cette fraction inhibait la prolifération Soluble dans l'eau et insoluble grisâtre à brun de la tumeur ascitique d'Ehrlich et de dans le méthanol, l'éthanol,

TF-100 clair la tumeur consistante d'Ehrlich chez les l'acétone, le benzène, le chloro-

souris et avait une action immuno- forme, l'acétate d'éthyle et

stimulante. l'éther diéthylique.

Cette fraction inhibait la prolifération TF-110 "de la tumeur ascitique d'Ehrlich chez les

souris et avait une action immuno-

stimulante. TF-120 " t Cette fraction inhibait la prolifération de la tumeur ascitique d'Ehrlich, de la TF-1316 " tumeur consistante d'Ehrlichet du Carcincoe Sarcoma 180 chez les souris et avait une

action inmmunostimulante.

TF-132a (à suivre) 0t 0% -a TABLEAU II (Suite) TF-132b 1l Il Il TF-133a " TF-133b" "

TF-1323

TF-136

Cette fraction inhibait la prolifération de la tumeur ascitique d'Ehrlich chez les

TF-140O "

TF-14o 0souris et avait une action immuno-

simulante.

TF-150" "

... _.,. _..DTD: (à suivre) o' w% o' o- TABLEAU II (Suite) Propriétés.... . t Point de décomposition Spectre d'absorption infrarouge Méthode du KBr (cm1 Fraction Cette fraction commençait à se décomposer Le spectre présente des bandes d'absorption au à 110 C environ et se décomposait remar- voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640,

TF-100 quablement au-dessus de 200 C 1550, 1440-1380, 1240, 1140-10W et 820 cm-1.

TF-110

Le spectre présente des bandes d'absorption au TF-120 l voisinage de 36003200, 2960-2930, 1670-1640,

1550, 1380-1360, 1140-1000 et 820 cm-1.

Le spectre présente des bandes d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640,

TF-1316 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm-1.

TF-1320 "

(à suivre) o' w ou -a

TABLEAU II

TF-132b "i TF-133a " TF-133b

TF-1323 "

TF-136 "

Cette fraction commençait à se décomposer

TF-140 à 210 C environ, et se décomposait remar-

quablement à 280 C environ.

Cette fraction commençait à se décomposer

TF-150 à 110 C environ et se décomposait remar-

quablement au-dessus de 200 C.

Mi tL% N %o (à suivre) II tj uL (Suite) TABLEAU II (Suite) éés Analyse élémentaire Spectre d'absorption ultra- Séphadex G-50*

violette (solution aqueuse) Méthode Anthrone-

Fraction C (%) H (%) N (%). 260 nm H2SO4 620 nm

3016- 4 2- 4,2 Au.bord d'absorption et au Au voisinage de v.v.- Au voisinage de v.v.

TF-10 35, 7 5,-2 5)-2 voisinage de 256 - 260 nm 400, 430-530, 700-800, 390, et 410-430 ml TF-1003575,2 52 voisinage de et 840-870 mil T35-9 45 5 - l Au bord d'absorption et au TF-lO11 5J2 5t2 voisinage de 256 - 260 inm TF-120 35,1- 4,5- 2,0- Au bord d'absorption et au /2 5,5 3,r1 voisinage de 268 - 272 nm TF-1316 30,0- 3 8- 4 9- Au bord d'absorption et au T-1316 34,0 4 ç4 5j7 voisinage de 256 - 260 nm TF-320 34,8- 45 2 8- IAu bord d'absorption et au TF 3398 57 6 voisinage de 270 - 280 n 39/ 8 5,7 6 voisinage de 270 - 280 nim (à suivre) O t'., c' 1%> o o' TABLEAU II (Suite) TF-132b ,3- 39t5 4j5- ,6 2) 8- ,4 Au bord d'absorption et au voisinage de 265 - 280 nm

-3-- --

28,0- 3,$5- 4,5-. Au bord d'absorption et au TF-133a 36,6 5,i 6,3 voisinage de 258 - 262 nm Au bord d'absorption, un TF-133b 31,1- 3,9- 3, t- épaulement au voisinage de 38, 5 5,2 4!7 270 - 280 nm Au bord d'absorption, un TF-1323 2399ll 3596- 25 épaulement au voisinage de 39t5, 6 5t 265 - 280 nm TF-136 27t5- 3 2- 5,t0- Au bord d'absorption et au

TF-136

32 6,0 6 1 voisinage de 256 - 260 nm TF-140 22,0- 3 0- 50- Au bord d'absorption et au TF-14 28/0 3j5 6,5 voisinage de 255 - 260 nm -5 31 0-, 4 0- 2 8- Au bord d'absorption et au TF-150 3b,0 L,4 3)2 voisinage de 255 - 260 nm

4...._;..._

(à suivre) c1o 0D% -a tg os o0 TABLEAU II (Suite) XP ropridtds Séphadex G200** F.actio 260 nm Méthode Phénol-H SO 490 nm Méthode Anthrone-H SO 620 nm Fract on \ 2 4 2 4

TF-100

Au voisinage de v.v.- 380 Au voisinage de v.v.- 380, Au voisinage de v.v.380, TF-110l et 600-920 ml 410-520, et 630-760 ml 420-520, et 620-760 ml TF-120 Au voisinage de v.v.- 325 Au voisinage de v.v.- 360, Au voisinage de v.v.- 380, et 775-875 ml 360-480 et 510-760 ml 420-520 et 620-760 ml TF-1316 Au voisinage de v.v.- 160 ml Au voisinage de v.v.- 160 mli Au voisinage de v.v.- 340, Au voisinage de v.v.- 340, Au voisinage de v.v.340 TF-132a 600-700 et 720-880 ml 340-580 et 720-900 ml et 340-580 ml (à suivre) CO ru N O% a TABLEAU II (Suite) Au voisinage de v.v.- 150 ml Au voisinage de v.v.- 150 ml Au voisinage de v.v.- 300 et 630-940 ml TF-133b e6Au voisinage de v.v.- 170 ml Au voisinage de v.v.- 150 mi TF-1323 Au voisinage de v.v.- 160 ml Au voisinage de v.v.- 150 ml TF-136 Au voisinage de 540-930 mlLégère bande d'absorption Lgere bande d'absorption Au voisinage de v.v.- 300, Au voisinage de v.v.- 500, TF-136A4osng e50- 90m éèebnedasrto éèebnedasrto TF-140 500-900 et 900-1000 ml 650-850 et 850-1000 ml

,...... ,._

Au voisinage de v.v.- 100 Au voisinage de v.v.- 100 Au voisinage de v.v.150 ml TF-150 et 100-160 ml (à suivre) TF-132b M Cr% os os 0% U, %0 TABLEAU II (Suite) Propriét6s Chromatogramme liquide à haute performance * Fraction 220 nm 260 nm Au voisinage du front du solvant, 38-60 et Au voisinage du front du solvant, 38-60 et

TF-100 65 minutes. 65 minutes.

TF- 110

TF-120 Au voisinage du front du solvant Au voisinage du front du solvant et 38-60 minutes et 38-60 minutes Au voisinage du front du solvant Au voisinage du front du solvant T -1316 et 40-60 minutes et 40-60 minutes Au voisinage du front du solvant, 30, Au voisinage du front du solvant, 62 et TF-132a 38-60 et 65 minutes 65 minutes (à suivre) w CD M w 0% -à TABLEAU II (Suite) Au voisinage du front 48-50 minutes du solvant, 36-37 et Au voisinage du -52 minutes front du solvant, 32-39 et Au voisinage du front du solvant, 38 Au voisinage du front du solvant, 50-60 et TF-133a et 50 minutes 62 minutes Au voisinage du front du solvant Au voisinage du front du solvant, 38-39 et TF-133b et 49-50 minutes 52 minutes TF-1323 Au voisinage du front du solvant, 36, Au voisinage du front du solvant, 36, et 48-50 minutes et 50 minutes

Au voisinage du front du solvant, 28-40 Au voisinage du front du solvant.

TF-136 et 42-60 minutes et 42-60 minutes Au voisinage du front du solvant Au voisinage du front du solvant TF-14o et 40-60 minutes et 40-60 minutes Au voisinage du front du solvant, 32 Au voisinage du front du solvant, 32

TF-150 et 48-50 minutes et 48-50 minutes.

________________________________________._______ I.

(à suivre) TF-132b w M %0 TABLEAU II (Suite) Réaction colorée tion au Réaction à Réaction à Réaction de ol-H2SO4 l'anthrone-H2S04 l'indole-HCl Lowry-Folin

+ + + +

_o

_ 0XQ

v.. ^0o (& suivre) TABLEAU II (Suite) TF-132b + + + + + TF-133a - + + + + + TF-133b - + + + + +

TF-1323 - + + + + +

TF-136 - + + + + +

TF-14o - + + + + +

TF-150 - + + + + +

l_.+.._ ... _ (à suivre) m Mo _ ! TABLEAU II (Suite) ropriétés Teneur en saccharides exprimée en Teneur en protéines exprimée en glucose, mesurée par la méthode albumine de sérum de veau, mesurée Fracti phénol-H2SQ (%) par la méthode de Lowry-Folin Fraction2 (%) d ". w. ' TF-100 env. 40,0 env. 46,0 env.20>0 - env.23,0 TF-110 env. 3010 -env. 69)0 env.18,0 env. 22>0 TF-120 env. 56,0 -env. 73,0 env. 9.0 - env-3,0 TF-1316 env. 35;0 env 500 env.10>0 -env. 23>0 TF-132a env. 55j0 - env. 64;0 env.18/0 -env. 28>0 w 4s Cr% 0% -o TABLEAU II (Suite) env. 2316 - env. 4515 env. 15t5 env. 28/0 TF-133a env. 260tO - env. 35;0 env. 22,0 - env. 28/0 TF-133b env. 19,0 - env. 2415 env. 12,9 - env. 2219 TF-1323 env. 19/0 -env. 25,0 env. l, O -env. 1770 TF-136 env. 191O - env. 30/ 0 env. 6,0 - env.12!0 TF140 env. 5,0 - env.15,0 env. 23,0 - env. 32,0 TF-150 env. h0O 0 - env. 55; 0 env. 7 0 - env. 14! 0 TF-132b w Jn 1%) CM c Dans le Tableau II, on a utilisé, pour le Séphadex G-50 marqué "*", une colonne de 50 mm de diamètre et de 600 mm de haut, et de l'eau distillée comme éluant; pour de Pharmacia Co., Ltd. le Séphadex G-200 (marque déposée)/marqué "**", on a utili- sé une colonne de 44 mm de diamètre et de 500 mm de haut pour TF110, 120, 132a, 133a, 136 et 140, et une colonne de 21 mm de diamètre et de 400 mm de haut pour TF-1316, 132b, 133b, 1323 et 150, et, comme éluant, on a utilisé pour toutes les substances un tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7 et, pour obtenir le chromatogramme en phase liquide à haute performance, marqué "***", on a utilisé une colonne de 7,9 mm de diamètre x 600 mm x 2, contenant du TSK-GEL G300SW (dénomination commerciale d'un produit vendu par la Société Toyo Soda Co., Ltd.), et on a procédé à l'élution

à la température ambiante à un débit de 0,8 ml/mn en utili-

sant comme éluant un tampon de phosphate ayant un pH de 7.

Les activités pharmacologiques des présentes subs-

tances carcinostatiques TF-100, TF-110, TF-120, TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-140 et TF-150 sont les suivantes: (I) Effet des substances TF sur la viabilité des cellules (Essai de formation de colonies) Sur la base de la méthode de Kim. J.H. et al. [Cancer Res. 25, 698 (1965)], on a cultivé des cellules HeLa S-3 sur MEM Eagle complété avec du sérm de veau à 10 %, pendant 3 à 5 jours à 37 C, dans un incubateur à gaz carbonique,

après quoi on a prélevé la culture, et on a ajouté aux cel-

lules adhérant au verre une solution PBS(-) (solution aqueuse contenant 8, 0 g/l de chlorure de sodium, 0,2 g/l de

chlorure de potassium, 1,15 g/l de phosphate de sodium mono-

basique et 0,2 g/l de phosphate de potassium dibasique)

contenant 0,01 % en poids d'acide éthylènediaminetétra-

acétique et 0,1 % de trypsine. On a détaché les cellules de la surface en verre du flacon de culture et on les a dissociées en cellules simples par pipettage, puis on compté

le nombre des cellulespar microscopie. On a dilué la sus-

pension de cellules avec du MEM Eagle complété avec du sérum de veau à 20 % de telle sorte qu'ellecontienne 200 cellules par ml. Apres avoir inoculé 1 ml de la suspension de cellules dans des boîtes de Pétri et l'avoircultivée dans un incubateur à gaz carbonique à 370C pendant 24 heures, on a ajouté à la suspension de cellules le liquide surnageant obtenu à l'Exemple 1 (1), qui apparaît ci-après, de telle sorte que la concentration passe de 1/16 à 1/128. Puis, à chacune des fractions de l ml de la suspension de cellules cultivée à 370C pendant 24 heures, on a ajouté chacune des substances d'essai et dans chaque cas, on a cultivé les cellules HeLa pendant 7 jours. Après cette culture, on a séparé le milieu de culture, après quoi on a lavé les boîtes de culture avec une solution de Hank, et on a fixé les cellules avec de l'éthanol à 70 % en poids, puis on les a lavées avec de l'éthanol à 100 % en poids. Après avoir éliminé l'éthanol, on a coloré les cellules avec une solution de coloration Gimsa, après quoi on a compté les colonies et on

a calculé la viabilité des cellules.

Les résultats sont indiqué dans les Tableaux III et IV ci-après. On a calculé la viabilité des cellules dans les Tableaux à partir de l'équation suivante. La viabilité des cellules de chaque substance d'essai est représentée

sous la forme d'une moyenne de cinq essais identiques.

Nombre des colonies dans le Viabilité des cellules = cas d'un groupe traité x 100 Nombre de colonies dans le cas d'un groupe non traité

TABLEAU III

Effet du liquide surnageant sur la viabilité des cellules Viabilité des cellules (%) Dilution (ml/ml).e 48 heures 72 heures 96 heures 1/128 79y6 66,4 80,4 1/64 30o10 719 5,8

1/32 0 0 0

1/16 0 0 0

Témoin 100 100 100 w O0 N 0% w o Cm

TABLEAU IV:

Effet des substances TF sur la viabilité des cellules Substance Concentration Viabilité des cellules (pg/ml)

9914.

TF-100 50 9714

9519

9415

TF-110 50 8819

8713

9818

TF-120 50 91r 2

83;3

96;7

TF-132a 50 97, 4

95;9

96t9 TF-133a 50 95,4

88 8

95,9

TF-136 50 96r 4

95;4

98/5

98,6

TF-140 100 98,6

96/8

500 93.4

Comme le prouve cette expérience, les substances TF

selon la présente invention ont un très faible effet cyto-

toxique sur les cellules HeLa, par rapport au liquide surnageant. (II) Activité immunostimulante On a utilisé quatre souris de souche ICR pour chaque groupe. On a dissous chacune des substances d'essai dans 0,2 ml d'une solution saline physiologique, puis on les a

administrées par voie intrapéritonéale aux souris. Vingt-

quatre heures après l'administration, on a injecté par voie

intraveineuse dans la queue des souris 0,2 ml d'une suspen-

sion de carbone préparée en mélangeant 1 ml d'encre à dessin Perikan (fabriquée par GUnther-Wagner Co., Ltd.) et 2 ml d'une solution saline physiologique contenant 3 % en poids de gélatine et, respectivement, 1, 5, 10 et 15 minutes après l'injection, on a recueilli 0,02 ml du sang de l'orbite de l'oeil de la souris, à l'aide d'un capillaire à hématocrite revêtu d'héparine, et on a immédiatement dilué et hémolysé le sang avec 1, 6 ml d'une solution aqueuse à 0,1 % en poids de carbonate de sodium. On a fait subir à cette suspension

une colorimétrie à 675 nm, et on a déterminé l'indice phago-

cytotique, c'est-à-dire la valeur K, à partir de l'équation de Halpern et al. Aux souris du groupe témoin, on a administré 0,2 ml

d'une solution saline physiologique.

log C0 - logC K- t t dans laquelle C0 = teneur en poudre de carbone dans le sang au temps t0, et C = teneur en poudre de carbone dans le sang

au temps t.

Les résultats sont indiqués dans les Tableaux V à VII ci-après.

TABLEAU V

SubstanceDose Substance Dose Moyenne des valeurs K (mg/kg)

TF-100 10 0;0851 070145

0r0605 0,0302 TF-l11 5 0t0901 0,0213

0,1025 0,0025

TF-120 5 010718 0,0152

0/0559 0,0197

TF-1316 5 0,0832 0;0193

0,1001 010246

TF-132a | 5 0,1102 0,0203 0,0809 0,0oO296 T-3 3a| 5 0,0851 0,0057 TF-133a

0,0769 0,0174

TF-136| 5 0,0959 0,00oo87

T20 0 1027 0/0154

Témoin - 0;0300 0;0024

TABLEAU VI

Substance' Ds gSubstanceDose Moyenne des valeurs K TF-132b- 5 0;1190 010051

0,1073 0,0031

TF-133b 5 0t0550 0,0020 0r1099 0;0075 TF-150 5 f 0,1399 0,0011 0o0o577 o0o0098

TF-1323 5 0,1400 0,0075

0,0685 0,0126

Témoin o- I0,0286 010035

TABLEAU VII

Substance Dose(mg/kg) Moyenne des valeurs K (mg/kg)

1 0,0891 0F0156

TF-140 5 0 0946 0;0139

0,0815 0;0200

Témoin - 0;0379 ooo48 Comme le prouvent les Tableaux V à VII, les groupes, auxquels on a administré chacune des substances TF selon la

présente invention, ont montré une activation des macropha-

ges réticulo-endothéliaux, par rapport au groupe témoin, et

l'immunité cellulaire des souris normales était augmentée.

(III) Activité carcinostatique (a) Activité antitumorale contre la tumeur ascitique d'Ehrlich On a inoculé par voie intrapéritonéale des cellules tumorales d'ascites d'Ehrlich, à des souris de soucheICR

(femelles, âgées de 6 semaines) à raison de l x 10 cellu-

les par souris. Enuite, on a dissous chacune des substances d'essai dans 0,2 ml d'une solution saline physiologique, puis on les administrées par voie intrapéritonéale aux souris une fois par jour pendant 7 jours à partir du premier jour suivant l'inoculation des cellules tumorales, ou bien une fois par jour le premier jour et du troisième au septième jour pendant 6 jours au total. Dans le cas des substances d'essai du Tableau IX, on a administré chacune d'elles aux souris une fois par jour le premier jour et du troisième

jour au septième jour pendant 6 jours au total après l'ino-

culation des cellules tumorales. Au groupe témoin, on a administré 0,2 ml d'une solution saline physiologique, de la

même manière que ci-dessus.

Les résultats sont donnés dans les Tableaux VIII et

IX ci-après.

Nombre de jours de survie des souris dans un groupe auquel on a administré TC=la substance X0 T/C = Nombre de jours de survie des souris X 100 (%) du groupe témoin ( zay^ns.)

9/ o0 oocJj-

9 / ú ZLI< 8J9 9L '6z< 9 x 01

9 / L91< 9'6 + 88Z g x<5ú -

9 / ú 9I< 8' L + Z8g< 9 x I

__.............

9 / 001 OOI + I _LT

9 / I Súl 8<8 + ú E< g x oI 9l/ O 901 z 'a + ú /819 x 5 zúl-s 9 / I _ II< 87L + 89'0Z< 9 x I

p / 0 00I Z 'Z+ 8 ILl-

I*h / z ú51T< z '6 + ú'LZ' g x05 ZIg 2 / g_85<- úe'6 + 5 'LZ'5< Ol / 0 OOI ú Jl819 -91 I * 5 / ú ú61< 6 ' +5'z< 9 x 05 Oll-J / Z gI< O'OI + o'v< 9 x OI

,,..... . . ,_,, ,,.,,,,,,,,,,,,

IO / 0 O0 60T + 9S1 _T

0Z / ú1 Z91< 1i8 + ilo0< L x oL

_.. _..

seo-pe-4(% (oú) 8tArTns ap Sor sTZIYnOS! ATA' (an. e -_4STuTuIpep eaqoeou aouvisqns ap ' I I IAS QVHrIf.T Ch %0 or eu TABLEAU VIII (Suite)

TF-136

1 x 6 x 6 x 6 >23 0 >30,3 >25tO 17,2 6,5 + 5,6 8,2 2,2 >134 >176 > 145 1/6 3/6 1/6 0 / 6 *1 x 6 22,0 5,2 127 0 / 4 TF-1316 100 x 6 >32t8 11J2 >187 2 / 4 *l -_ 17t5 lf9 100 0 / 4 x 6 >35,0 9/8 >186 2 / 5 TF132b 10 x 6 >40o0 415 >213 4 / 5 *2

-_ 18,8 2,2 100 0/ 5

1 x 6 >2410 11f9 >128 1 / 5 x 6 >33,2 + 12,1 >176 3 / 5 TF-133b 10 x 6 > 34,8 10,5 >185 2 / 5 -_ 18t8 2;2 100 0 / 5 1 x 7 >29,4 + 10,8 >173 4 / 10 TF-1323 5 x 7 >38/4 + 3,5 >226 8 / 10 2 x 7 >3410 11;0 >200 6 / 10 -_ _ _ _ _ ___ 17,0 lfl 100 0 / 10 Note: *Tous les survivants étaient sans ascite et étaient complètement guéris *1 Appréciation le 35ème jour après la transplantation des cellules tumorales *2 Appréciation le 40ème jour apres la transplantation des cellules tumorales uO tuJ O'. LMd o' o

TABLEAU IX

Note: *Tous les survivants étaient sans ascite et étaient complètement guéris.

CN os os "ombre de Dose (mg/kg x Nombre moyen de jours T/C *Nombre de /s Substance le nombre d'adminis- de urv survivants sours de survie (jours)' (%Muvvns testées trations) (Le 35ème jour) 0,5 x 6 >236 + 9,3 >148 2 / 5 1 x 6 >27j0 + 75 >170 4 / 10 TF-140 5 x 6 >31t5 + 5,7 >198 9 / 15 x 6 > 28,4 + 14,8 >178 4 / 5 - _ 15t9 + 3/4 100 0 / 15

.......,...DTD: x 6 >30,6± 5,4 >159 3/ 5 TF-.150 10 x 6 >32,0 + 4)7 >168 3/ 5 x 6 >35>0 + 0 >182.5 / 5

-. _ 19,2 + 1/5 100 0 / 5

Comme le prouvent les Tableaux VIII et IX, le groupe auquel on a administré chacune des substances TF selon l'invention a bénéficié de l'effet de prolongation de la vie, par rapport au groupe témoin. (b) Activité antitumorale vis à vis de la tumeur consistante d'Ehrlich (1) On a transplanté par voie sous-cutanée des cellules tumorales d'Ehrlich dans l'aisselle à des souris de soucheICR (femelles, âgées de 6 semaines), àraison de 4 x 106 cellules par souris. Ensuite, on a administré chacune des substances d'essai aux souris une fois par jour

pendant 7 jours à partir du premier jour suivant la trans-

plantation des cellules tumorales, ou bien une fois par jour le premier jour et du troisième jour au septième jour pendant 6 jours au total. Au groupe témoin, on a administré 0,2 ml d'une solution saline physiologique, de la même manière que décrit ci-dessus. On a déterminé le poids des tumeurs le 11ème ou le 14ème jour après la transplantation des cellules tumorales. On a déterminé le poids des tumeurs en mesurant le grand diamètre (a) mm et le petit diamètre(b) mI au moyen de compas, et en appliquant l'équation suivante a x b2 Poids de la tumeur - (mg)

Les résultats sont donnés dans le Tableau X ci-après.

TABLEAU X

Dose (mg/kg' x par Poids moyen de la T/C Substance Voie d'administration le nombre tumeur (g) d'administrations) tumeur (g)(%)

,,._ ,,, ,,

Intraveineuse 50 x 6 1;19 21 TF-100 Intrapéritonéale 100 x 6 1;97 36 *1 Sous-cutanée 100 x 6 1,19 21

-___ _ _ _ _ _ _ _ 5,54 100

2 x 6 2/63 76 TF-1316 Intrapéritonéale 10 x 6 1,57 45 *1 -_ 3j,L44 100

À,,, '........ À, ' " ' ..... I .

1 x 6 5,61 62 TF-132b Intraveineuse 5 x 6 400 44 *2 x 6 4,32 48

-_ 9,06 100

1 x 6 6,46 71 TF-133b Intrapéritonéale 5 6 540 60 *2 x 6 4/00 44

-_ 9,06 100

(à suivre) cO os w aN %o Ch TABLEAU X (Suite)

TF-1323

Intrapéritonéale x7 x 7 3;48 3;17 8,33 *2 1 x 6 5j52 97 TF-136 Intraveineuse 5 x 6 4'88 85 *2 x 6 3,19 56

- 5,69 100

1 x 6 5;25 58 TF-133b 5 x 63614 TF-133b Intraveineuse 6 361 *2 x 6 3/30 36

- 9,06 100

Note: *1 Déterminé le 11ème jour après la transplantation des *2 Déterminé le 14ème jour après la transplantation des cellules tumorales cellules tumorales N 0u Ch ou dO

246361 9

(2) On a transplanté par voie sous-cutanée des cellules tumorales d'Ehrlich dans l'aisselle de-souris de soucheICR (femelles, âgées de 6 semaines) à raison de 4 x 10 cellules par souris. Ensuite, on a administré chacune des substances d'essai aux souris divisées en

groupes pour l'administration intraveineuse, l'administra-

tion intrapéritonéale, l'administration sous-cutanée et l'administration intramusculaire, à une-posologie de 10 mg/kg ou 20 mg/kg, une fois par jour le premier jour et du troisième jour au septième jour, soit 6 jours au total, après la transplantation des cellules tumorales. Au groupe

témoin, on a administré 0,2 ml d'une solution saline physio-

logique, de la même manière que ci-dessus. On a déterminé le poids des tumeurs le 13ème jour après la transplantation

des cellules tumorales.

Les résultats sont donnés dans le Tableau XI ci-

dessous. Dose Poids moyen de la Substance Voie d'administration Dose Poids moyen de la T/C (%) (mg/kg) tumeur <g)

3183 47

*TF-132a Intraveineuse 10 383

- 8111 100

Intraveineuse 10 1181 26

1,84 26

Intrapéritonéale 10 2 82 40

1)82 26

TF-133a Sous-cutanée 10 3157 51

2- 86 41

Intramusculaire 10 4/ 65 67

3122 46

-_ _- 6;99 100

O1 ros 0L% CN, %O o

2463.619

2 Comme le prouvent les Tableaux X et XI, on observe un effet d'inhibition de la croissance des tumeurs dans les groupes auxquels on a administré l'une des substances TF selon l'invention. (c) Activité antitumorale contre le carcinome Sarcoma 180 On a transplanté par voie intrapéritonéale les cellules de carcinome Sarcoma 180 à des souris de soucheICR (femelles, âgées de 6 semaines) à raison de lx 10 cellules

par souris. Ensuite, on a administré par voie intrapérito-

néale chacune des substances d'essai aux souris à une dose de 1 mg/kg, 5 mg/kg ou 10 mg/kg, une fois par jour du premier jour au septième jour, soit pendant 7 jours au total, après la transplantation des cellules tumorales ou bien une fois par jour le premier jour et du troisième jour au septième jour pendant 6 jours au total. Au groupe témoin, on a administré 0,2 ml d'une solution saline physiologique,

de la même manière que ci-dessus.

Les résultats sont donnés dans le Tableau XII ci-

dessous.

TABLEAU XII

Dose <mg/kg x par le Nombre moyen de jours T/C Nombre de Nombre de

Subsan-nombre d'administra-

Substan- nombre d'administra de survie (jour) (%) survivants souris ce tions) /testées x 6 >26]8 >140 2 / 6 x 6 >22,2 >116 1/ 6 TF-132a 1 x 6 21, 3 111 0 6

-_ 19;2 100 0/ 6

x 6 >30;3 >158 4 / 6 TF-133a 5 x 6 >27,5 >143 3 / 6 *1 1 x 6 >21;5 >112 1/ 6 -. 19t2 100 0 / 6 x 6 >30,2 >157 3 / 6 TF-136a 5 x 6 >27,3 >142 3 / 6 *1 1 x 6 >2810 >146 2/ 6

-_ 1912 100 0 / 6

x 7 >420 + 0 >300 5 / 5 TF-132b 5 x 7 >421 0 + 0 >300 5 / 5 *2

-_ 14/0 + 3,3 100 0 / 15

(à suivre) u1 w M os i do x 7 x 7 x7 1 x7 TABLEAU XII (Suite)

)0 0 >286

,0 0 >286

37,3 6,3 >266

14,0 3,3 100

/ 10 / 10

7 / 10

0 / 15

*2 x 7 >34 0,6 >255 6/ 7 TF-1323 1 x 7 >32 + 3,6 >240 5 / 7 *2

-______ __ 13,6 3,6 100 0 / 7

x 7 >28,8 11,5 >201 5 / 10 TF-1316 1 x 7 >30,9 9,5 >216 4 / 10 *1

-_ 141,3 + 2,9 100 0 / 10

x 6 >38,0 8 9 >271 4 / 5 TF-136 1 x 6 >24,8 + 12,3 >177 1 / 5 *2 14>0 + 2r5 100 0 / 5 Ui Pe Note: *1 Appréciation au 35ème jour après la transplantation des cellules tumorales *2 Appréciation au 40ème jour après la transplantation des cellules tumorales En *1 et *2, les survivants étaient dans un état de guérison complète. N ' ' i A;0 TF-133b > Comme le prouvent le Tableau XII, les groupes auxquels on a administré l'une des substances TF selon l'invention avaient bénéficié d'une activité tumorale, par comparaison avec le groupe témoin. (d) Activité antitumorale contre le mélanome B-16 (1) On a transplanté par voie sous- cutanée des cellules tumorales de mélanome B-16 dans l'aisselle de souris de soucheBDF (mâles, âgés de 7 semaines) à raison de 1 x 10 cellules par souris. Ensuite, on a administré

par voie intrapéritonéale aux souris de la substance TF-

133a à une dose de 5 mg/kg ou de 10 mg/kg une fois par jour le premier jour et du troisième jour au septième jour, pendant 6 jours au total, après la transplantation des cellules tumorales. De la même manière que ci-dessus, on a administré au groupe témoin 0,2 ml d'une solution saline physiologique et 20 mg/kg de substance appelée "5-FU" à

un autre groupe constitué à cet effet.

Les résultats sont donnés dans le Tableau XIII ci-

dessous.

TABLEAU XIII

Comme le prouve le Tableau XIII, les groupes auxquels on a administré la substance TF-133a ont bénéficié d'une apparente activité d'inhibition de la croissance des tumeurs, par comparaison avec le groupe témoin, et les groupes auxquels on a administré soit 5 mg/kg, soit 10 mg/kg Dose (mg/kg x par Poi ubstance le nombre d'admi- lads moyen de T/C (%> nistrations) lauer (g TF-133a 5 x 6 107 7 x 6 2,52 43 -FU 20 x 6 4,21 72 Témoin j 5,84 100 de TF-133a, ont bénéficié d'une activité d'inhibition de

la croissance des tumeurs égale et plus remarquable respec-

tivement, par comparaison avec le groupe auquel on a administré la substance 5-FU. (2) On a procédé à la transplantation de cellules tumorales de mélanome B-16 et à l'administration

de TF-132a, TF-133a, 5-FU et d'une solution saline physio-

logique, de la même manière qu'en (i) ci-dessus. Le 21ème jour après la transplantation des cellules tumorales, on a disséqué les souris, et on a observé la métastase des

cellules tumorales de mélanome dans les poumons.

Les résultats sont donnés dans le Tableau XIV ci-

après.

TABLEAU XIV

Comme le prouve le Tableau XIV, dans les groupes auxquels on avait administré soit la substance TF-132a,

soit la substance TF-133a, la métastase des cellules tumo-

rales de mélanome B-16 était remarquablement inhibée, par comparaison avec le groupe auquel on a administré la

substance 5-FU.

(IV) Toxicité aiguë La DL50 pour les souris est celle qui est indiquée

dans le Tableau XV ci-après.

| |Dose (mg/kg x par Nombre Pourcentage SubstancE le nombre d'admi- moyen de d'inhibition nistrations) métastases des métastaes TF-132a 5 x 6 1610 48 x 6 9f86 69 TF-133a |5 x 6 9,3 70 x 6 617 78 -FU 20 x 6 2418 20 Témoin - 3110 0

TABLEAU XV

Substance Voie d'administration DL50 (mg/kg) TF-100 Intrapéritonéale 500 Intraveineuse >250 TF-11O Intrapéritonéale >1000 Intraveineuse >250 TF120 Intrapéritonéale >1000 Intraveineuse 300 TF-132a Intrapéritonéale > 500 Intraveineuse 300 TF-133a Intrapéritonéale >500 TF-136a Intraveineuse 300 Intrapéritonéale >500 TF-132b Intraveineuse >100 TF-133b Intraveineuse >200 TF-140 Intraveineuse >100 >100 TF-14o Intraveineuse TFIntraveineuse >200 TF-1323 Intraveineuse >200 TF-1316 Intraveineuse j> 200 Comme le prouvent les expériences pharmacologiques susmentionnées, les substances TF selon l'invention sont utiles comme agents carcinostatiques, on peut s'attendre à ce qu'elles aient des activités contre diverses maladies cancéreuses, et on peut s'attendre à ce qu'elles aient des activités remarquables contre des cancers particulièrement récalcitrants. Toutes les substances TF selon l'invention ont des effets excellents, mais d'un certain nombre de points de vue, c'est la substance TF-130 que l'on préfère, et en particulier les substances 132a, 132b, 133a, 133b et 1323. On peut utiliser les substances TF selon l'invention après les avoir mises sous diverses formes pharmaceutiques telles que médicaments à prendre par voie orale, par injections,par suppositoires, etc..., mais on les utilise de préférence sous la forme pharmaceutique d'une injection. Quand on les utilise sous la forme de médicaments à prendre par voie orale, ces médicaments peuvent contenir divers excipients, et peuvent être mis sous la forme de capsules, de comprimés, de poudres ou de granules. Lorsqu'on les utilise sous forme d'injections, ces dernières peuvent être des injections sous-cutanées, intramusculaires ou-intraveineuses, et on les utilise sous la forme d'une suspension, d'une solution ou d'une poudre que l'on dissout avant de l'utiliser. Lesmédicaments

injectablespeuvent contenir un anesthésique local.

La posologie des substances TF selon l'invention est choisie de manière appropriée en fonction de l'état du

patient, mais en général, il est souhaitable de les adminis-

trer, pour un adulte, à une dose de 0,01 à 50 mg/kg une fois

par jour ou plusieurs fois par jour, et quant au mode d'ad-

ministration, on les administre de préférence par injections souscutanées, intramusculaires ou intraveineuses, ou bien

par injections dans la partie malade.

L'invention va être mieux expliquée ci-dessous par référence à des Exemples et aux dessins annexés, sur lesquels la Figure 1 représente une photographie microscopique montrant la forme de Fusobacterium nucleatum TF-031 utilisé dans cette invention; la Figure 2 représente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-100; la Figure 3 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 4 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-50; la Figure 5 représente un chromatogramme

en phase liquide à haute performance; la Figure 6 repré-

sente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-11O; la Figure 7 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 8 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait

subir à ladite substance une filtration sur gel en utili-

sant du Séphadex G-200; la Figure 9 représente un chroma-

togramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 10 représente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-120; la Figure 11 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 12 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-200; la Figure 13 représente un chromatogramme en phase liquide à

haute performance de ladite substance; la Figure 14 repré-

sente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-1316;la Figure 15 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 16 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-2 00; la Figure 17 représente un chromatogramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 18 représente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-132a; la Figure 19 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 20 représente un diagramme d'élution

obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une filtra-

tion sur gel en utilisant du Séphadex G-200; la Figure 21

représente un chromatogramme en phase liquide à haute perfor-

mance de ladite substance; la Figure 22 représente un

spectre d'absorption infrarouge de la substance carcino-

statique TF-132b; la Figure 23 représente un spectre d'ab-

sorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 24 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait

subir à ladite substance une filtration sur gel en utili-

sant du Séphadex G-200; la Figure 25 représente un chroma-

togramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 26 représente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-133a; la Figure 27 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 28 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on afait subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-200; la Figure 29 représente un chromatogramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 30

représente un spectre d'absorption infrarouge de la substan-

ce carcinostatique TF-133b; la Figure 31 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 32 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-200; la Figure 33 représente un chromatogramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 34 représente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-1323; la figure 35 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 36 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-200; la Figure 37 représente un chromatogramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 38 représente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-136; la Figure 39 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 40 représente un diagramme d'élution

obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une fil-

tration sur gel en utilisant du Séphadex G-200; la Figure 41 représente un chromatogramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 42 représente

un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcino-

statique TF-140; la figure 43 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 44 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait 6 1 subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant

du Séphadex G-200; et la Figure 45 représente un chromata-

gramme en phase liquide à haute performance de ladite substance; la Figure 46 représente un spectre d'absorption infrarouge de la substance carcinostatique TF-150; la Figure 47 représente un spectre d'absorption ultraviolet de ladite substance; la Figure 48 représente un diagramme d'élution obtenu lorsqu'on a fait subir à ladite substance une filtration sur gel en utilisant du Séphadex G-200; et la Figure 49 représente un chromatogramme en phase liquide

à haute performance de ladite substance.

Exemple 1

(1) Dans chacune de 15 bouteilles de culture de 2 litres équipé chacune d'un bouchon fileté, on a placé deux litres

d'un milieu de culture contenant 34 g de peptone de trypti-

case, 6 g de peptone de phytone, 20 g de peptone protéose, g d'une infusion de cervelle et de coeur, 6 g d'extrait de levure, 15 g de chlorure de sodium, 12 g de glucose, 10 g de lactose, 0,5 g de L-cystine, 0,2 g de sulfite de sodium, 1,0 g de thioglycollate de sodium et 1,4 g de

gélose, et on a ajusté le milieu de culture à un pH de 7.

On a stérilisé le milieu de culture sous 1,2 atm à 120'C pendant 15 minutes, on l'a réchauffé dans un bain d'eau bouillante pendant 20 minutes et immédiatement après on l'a refroidi à l'eau, après quoi on a inoculé dans le milieu de culture refroidi à l'eau ci-dessus, dans des conditions stériles, une solution de pré-culture de Fusobacterium nucleatum TF-031 préparée au préalable par culture dans un milieu ayant la même composition que ci-dessus, dans une quantité de 100 ml par bouteille de culture, et on lui a

fait subir une culture en régime permanent dans un incuba-

teur à 370C pendant 48 heures. Après l'achèvement de la

culture, on a centrifugé la culture, pour enlever les orga-

nismes, à 4000 tours/mn à 50C pendant 20 minutes. Le volume

du liquide surnageant obtenu était de 27 litres environ.

(2) Au liquide surnageant obtenu en (1) ci-dessus, on a ajouté 40 litres d'éthanol, en agitant, à 50C, et on a laissé reposer le mélange résultant dans une pièce à basse température jusqu'à ce que le précipité amorphe soit 6 2 complètement déposé. Ensuite, on a centrifugé le mélange à 6000 tours/mn à 50C pendant 15 minutes, et on a recueilli le précipité, on l'a lavé à l'éthanol, puis on l'a séché sous pression réduite pour obtenir environ 60 g de poudre brute. (3) Dans 120 ml d'eau, on a dissout 20 g de la poudre brute obtenue en (2) ci-dessus, et on a séparé les matières

insolubles dans l'eau formées à ce moment là, par centrifu-

gation à 7500 tours/Mn pendant 10 mn, après quoi on a réuni la fraction soluble dans l'eau ainsi obtenue aux eaux de lavage obtenues par lavage des matières insolubles dans l'eau deux fois avec des fractions de 60 ml d'eau, et on a séché la solution résultante sous pression réduite pour obtenir 14 g d'une poudre blanc-grisâtre à brun clair de

TF-100.

Exemple 2

On a fait subir à la solution décrite à l'Exemple 1-

(3), que l'on avait préparée en réunissant la fraction soluble dans l'eau dépourvue des matières insolubles dans l'eau, aux eaux de lavage obtenues en lavant les matières insolubles dans l'eau, une ultrafiltration en utilisant un dispositif d'ultrafiltration du type à fibres creuses

(membrane N0 HI-1: fabriquée par Asahi Kasei Kogyo -

Kabushiki Kaisha), et on a fait subir à la solution interne

une lyophilisation pour obtenir 10 g d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair de TF-110

Exemple 3

Dans une petite quantité d'eau, on a dissous 10 g de la poudre obtenue à l'Exemple 2, et on a fait passer la

solution résultante dans une colonne garnie de diéthylamino-

éthyl-Séphadex A-50, équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8, et on a recueilli la solution éluée. En outre, on a fait passer dans la colonne 2,5 litres du même tampon de phosphate que cidessus, et on a réuni la solution éluée obtenue à la solution éluée préalablement

recueillie, après quoi on a déminéralisé la solution résul-

tante à l'aide d'un dispositif d'ultrafiltration à fibres creuses (Membrane N0 HI-1), on l'a concentrée sous pression réduite, puis on lui a fait subir une lyophilisation pour 6 3 obtenir 470 mg d'une poudre blanc-grisâtre à brun clair

de TF-120.

Exemple 4

Dans 24 ml d'eau, on a dissous 2 g de la poudre obte-

nue à l'Exemple 1-(2), et on a séparé les matières insolu-

bles dans l'eau par centrifugation à 7500 tours/mn pendant minutes. On a dialysé la fraction soluble dans l'eau pendant une nuit par échange avec de l'eau distillée à 50C en utilisant un tube en "Cellophane" et on a concentré la solution interne sous pression réduite. Ensuite, on a fait passer la solution concentrée dans une colonne garnie de 150 ml de diéthylaminoéthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8, et on a lavé la colonne en y faisant passer 600 ml d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8, après quoi on a fait passer dans la colonne un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,6 M et un pH de 8, pour obtenir un éluat. On a concentré cet éluat sous pression réduite à 100 ml environ, on l'a dialysé par échange avec de l'eau distillée à 5çC, on l'a à nouveau concentré sous pression réduite, on l'a déminéralisé en utilisant une colonne de Séphadex G-25, puis on lui a fait subir une lyophilisation pour obtenir

470 mg d'une poudre blanc-grisâtre à brun clair de TF-1316.

Exemple 5

On a dialysé pendant une nuit la solution décrite à l'Exemple 1-(3) que l'on avait préparée en réunissant la fraction soluble dans l'eau dépourvue de matières insolubles dans l'eau, aux eaux de lavage obtenues en lavant les matières insolubles dans l'eau, par échange avec de l'eau distillée à 50C en utilisant un tube en "Cellophane",

et on a concentré la solution interne sous pression réduite.

On a ensuite fait passer la solution concentrée dans une colonne garnie de 50 g de diéthylaminoéthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8, et on a fait passer successivement dans la colonne 2 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8 et 2,5 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,1 M et un pH de 8, après quoi on a fait passer dans la colonne 2,5 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8, afin d'éluer la substance active adsorbée dans la colonne, et on a déminéralisé la solution éluée obtenue

en utilisant un dispositif d'ultrafiltration à fibres creu-

ses (Membrane No HI-1), puis on lui a fait subir une lyophi-

lisation pour obtenir 600 mg d'une poudre blanc-grisâtre à

brun clair de TF-132a.

Exemple 6

Dans 1,2 litre d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, on a dissous 44,2 g de la poudre obtenue à l'Exemple1-(2), et on a séparé les matières insolubles en suspension par filtration en utilisant du "Hyflo Super Cel", après quoi on a fait passer le filtrat obtenu dans une colonne de 33 cm de diamètre garnie de 500 ml de diéthylaminoéthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, et on a recueilli la solution éluée. On a lavé la colonne avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, et on a réuni les eaux de lavage à la solution éluée susmentionnée pour obtenir 1,67 litre d'une solution. On a à nouveau fait passer cette solution dans une

colonne de 8 cm de diamètre garnie de 400 ml de diéthylamino-

éthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure-de sodium de 0,3 M et un pH de 8, pour obtenir 1,68 litre d'une solution éluée. On a lavé la colonne avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, pour obtenir 1,64 litre d'eaux de lavage. On a réuni la solution éluée et les eaux de lavage, et on a ajouté à l'ensemble un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8 pour obtenir 4,98

litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentra-

tion en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8. On a fait passer la solution tampon ainsi obtenue dans une colonne de

8 cm de diamètre garnie de 500 ml de diéthylaminoéthyl-

Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8, et on a lavé la colonne avec 2 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et

un pH de 8. A 7 litres d'une solution préparée en réunis-

sant les eaux de lavage à la solution éluée, on a ajouté

un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8, pour obte-

nir 14 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant unecon-

centration en chlorure de sodium de 0,1 M et un pH de 8.

On a fait passer la solution éluée ainsi obtenue dans une

colonne de 8 cm de diamètre, garnie de 500 ml de diéthyl-

aminoéthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équi-

librée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une con-

centration en chlorure de sodium de 0,1 M et un pH de 8, et on a séparé la solution éluée. On a lavé la colonne avec

2 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concen-

tration en chlorure de sodium de 0,1 M et un pH de 8, après quoi on a fait passer dans la colonne 2 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8, et on a recueilli la solution

éluée. On a concentré la solution éluée et on l'a déminéra-

lisée en utilisant un dispositif d'ultrafiltration (filtre

utilisé: Toyo Ultrafilter UK-10), on l'a à nouveau déminé-

ralisée en utilisant une colonne garnie de Séphadex G-25, on l'a décolorée à l'aide de charbon actif, puis on lui a fait subir une lyophilisation pour obtenir 880 mg d'une

poudre blanc-grisatre à brun clair de TF-132b.

Exemple 7

solution résultante dans une colonne garnie de diéthylamino-

éthyl-Séphadex A-50, que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de8. Ensuite, on a fait passer dans la colonne 5 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8, après quoi on a fait passer dans la colonne 2,5 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, afin d'éluer la substance active adsorbée dans la colonne, et on a concentré sous pression réduite la solution éluée obtenue. On a déminéralisé la solution concentrée en utilisant un tube en "Cellophane", onl'adéminéralisée complètement à l'aide de Séphadex G-25, puis on lui a fait subir une lyophilisation pour obtenir 600 mg d'une poudre

blanc-grisâtre à brun clair de TF-133a.

Exemple 8

Dans 1,2 litre d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, on a dissous 44,2 g de la poudre obtenue à l'Exemple 1-(2), et on a séparé les matières insolubles en suspension par filtration à l'aide de "Hyflo Super Cel", après quoi on a fait passer le filtrat obtenu dans une colonne de 33 cm de diamètre garnie de 500 ml de diéthylaminoéthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant uneconcentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, et on a recueilli la solution éluée. On a lavé la colonne avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, et on a réuni les eaux de lavage à la

solution éluée précitée pour obtenir 1,67 litre d'une solu-

tion. Ona ànouveau fait passer cette solution dans une

colonne de 8 cm de diamètre garnie de 40 ml de diéthylamino-

éthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, pour obtenir 1,68 litre d'une solution éluée. On a lavé la colonne avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en

chlorure de sodium de 0,3 M et un pH-de 8, Pour'obtenir.

1,64 litre d'eaux de lavage. On a réuni la solution éluée et les eaux de lavage et on a ajouté à l'ensemble un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pHde8 pour obtenir4,98 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8. On a fait passer la solution éluée ainsi obtenue dans une colonne de 8 cm de diamètre garnie de 500 ml de diéthylaminoéthyl-Séphadex A-50, que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8, et on a lavé la colonne avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,2 M et un pH de 8, après quoi on a fait passer dans la colonne 2 litres d'un tampon de phos- phate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, et on a recueillie la solution

éluée. On a concentré la solution éluée et on l'a déminé-

ralisée à l'aide d'un dispositif d'ultrafiltration (Filtre

utilisé: Toyo Ultrafilter UK-10), on l'a à nouveau déminé-

ralisée à l'aide d'une colonne garnie de Séphadex G-25, on l'a décolorée à l'aide de charbon actif, puis on lui a fait subir une lyophilisation pour obtenir 590 mg d'une poudre

blanc-grisâtre à brun clair de TF-133b.

Exemple 9

(1) Dans 120 ml d'eau, on a dissous 20 g de la poudre brute obtenue à l'Exemple 1-(2), et on a séparé les matières

insolubles dans l'eau formées à ce moment là, par centrifu-

gation à 7500 tours/mn pendant 10 mn, après quoi on a réuni la fraction soluble dans l'eau ainsi obtenue et les eaux de lavage obtenues en lavant les matières insolubles dans l'eau deux fois avec des fractions de 60 ml d'eau, puis on lui a fait subir une ultrafiltration en utilisant un dispositif d'ultrafiltration à fibres creuses (Membrane Ne HI-1), et on a fait subir à la solution interne une lyophilisation

pour obtenir 10 g d'une poudre blanc-grisâtre à brun clair.

(2) Dans 1 litre d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, on a dissous 25 g-de la poudre obtenue par le traitement indiqué en (1) ci-dessus et on a fait passer la solution résultante dans une colonne de 33 cm de diamètre garnie de 500 ml de diéthylaminoéthyl-Séphadex A-50, que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8. On a de même lavé la colonne avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, et on a réuni la solution éluée et les eaux de lavage pour obtenir 1,6 litre d'un mélange. On a fait passer ce mélange dans une colonne de

8 cm de diamètre garnie de 400 ml de diéthylaminoéthyl-

68' Séphadex A-50, que l'on avait de même équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8, pour obtenir 1,65 litre d'une solution éluée. On a réuni la solution éluée à 1,7 litre des eaux de lavage obtenues en lavant la colonne avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,3 M et un pH de 8,

eton adilué le mélange résultant avec un tampon de phospha-

te 0,025 M ayant un pH de 8, pour obtenir 10,35 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en

chlorure de sodium de 0,1 M et un pH de 8.

On a ensuite fait passer la solution tampon ainsi obtenue dans une colonne de 8 cm de diamètre garnie de 500 ml de diéthylaminoéthyl- Séphadex A-50, que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,1 M et -un pH de 8, et on a lavé la colonne avec 2 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,1 M et un pH de 8, après quoi on a

fait passer dans la colonne 2 litres d'un tampon de phos-

phate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium

de 0,3 M et un pH de 8, et on a recueilli la solution éluée.

On a déminéralisé et concentré la solution éluée obtenue/en utilisant un dispositif d'ultrafiltration (Filtre utilisé Toyo Ultrafilter UK-10), et on l'a à nouveau déminéralisée sur Séphadex G-25, on l'a décolorée à l'aide de charbon actif, puis on lui a fait subir une lyophilisation pour obtenir 1,65 g d'une poudre blanc-grisâtre à brun clair de

TF-1323.

Exemple 10

Dans une petite quantité d'eau, on a dissous 10 g de la poudre-obtenue à l'Exemple 2, et on a fait passer la

solution résultante dans une colonne garnie de diéthylamino-

éthyl-Séphadex A-50 que l'on avait au préalable équilibrée avec un tampon de phosphate 0,025 M ayant un pH de 8. On a ensuite fait passer dans la colonne 6 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,5 M et un pH de 8, après quoi on a faitpasserdars la colonne 2,5 litres d'un tampon de phosphate 0,025 M ayant une concentration en chlorure de sodium de 0,6 M et un pH de 8, afin d'éluer la substance-active adsorbée dans la colonne, et on a déminéralisé la solution intermédiaire obtenue en utilisant un dispositif d'ultrafiltration à fibres creuses (Membrane No HI-1), on l'a concentrée sous

pression réduite, puis on-lui a fait subir une lyophilisa-

tion pour obtenir 130 mg d'une poudre blanc grisâtre à brun

clair de TF-136.

Exemple 11

Dans 200 ml d'eau, on a dissous 15 g de poudre brute obtenue à l'Exemple 1-(2), et on a séparé les matières insolubles dans l'eau par centrifugation à 7500 tours/mn

pendant 10 minutes, après quoi on a ajusté à pH 10 la frac-

tion soluble dans l'eau ainsi obtenue, en lui ajoutant goutte à goutte une solution aqueuse de baryte 0,2 M. Un précipité blanc s'est déposé sous l'effet de l'addition de la solution de baryte aqueuse. On a ajouté des ions baryum de telle sorte que la concentration des ions baryum totaux dans le volume final soit égale à 0,01 M, après quoi on a agité la solution pendant 30 minutes, et on a recueilli le précipité par filtration. On a mis le précipité de sel de baryum ainsi obtenu en suspension dans 10 ml d'une solution aqueuse à 10 % en poids de sulfate de sodium, on a agité

suffisamment, puis on a filtré et on a recueilli le filtrat.

On a à nouveau mis en suspension le précipité, on l'a agité puis on l'a filtré de la même manière que ci-dessus, u n e fois avec 10 ml d'une solution aqueuse à 10 % en

poids de sulfate de sodium, puis deux fois avec des frac-

tions de 5 ml de ladite solution, et on a recueilli chaque filtrat. En outre, on a lavé le précipité restant deux fois avec des fractions de 10 ml d'eau, puis on a filtré pour obtenir des eaux de lavage. On a réuni le filtrat recueilli susmentionné et les eaux de lavage, on a dialysé le tout par échange avec de l'eau distillée, on a concentré sous pression réduite, puis on a procédé à une lyophilisation pour obtenir 0,45 g d'une poudre blanc-grisâtre à brun clair

de TF-140.

7 0

Exemple 12

Dans 450 ml d'eau, on a dissous 32 g de la poudre obtenue à l'Exemple 1(2), et on a séparé les matières insolubles en suspension par filtration à l'aide de "Hyflo Super Cel", après quoi on a dialysé le filtrat obtenu pendant une nuit par échange avec de l'eau courante en utilisant un tube en "Cellophane". A la solution dialysée, on a ajouté goutte à goutte 80 ml d'une solution aqueuse à 20 % en poids de chlorure de cétyl pyridinium, en agitant, tout en lui ajoutant 200 ml d'un tampon de borate à 10 % en poids (pH 9,0), et on agité le mélange résultant à la température ambiante pendant 30 minutes, après quoi on a recueilli le précipité par filtration. On a mis le précipité en suspension dans 150 ml d'un tampon de borate à 0,1 % en poids (pH 9,0) contenant 0,1 M de chlorure de sodium et 0,2 % en poids de chlorure de cétyl pyridinium,

et on a agité la suspension résultante pendant 30 minutes.

On a ensuite recueilli le précipité de la suspension par filtration, et on l'a à nouveau mis en suspension dans ml d'un tampon de borate (pH 9,0) ayant la composition

susmentionnée, et on a agité pendant 30 minutes la suspen-

sion ainsi obtenue, après quoi on a recueilli le précipité

par filtration. On a mis le précipité recueilli en suspen-

sion dans 150 ml d'un tampon de borate à 0,1 % en poids (pH 9,0) contenant 0,5 M de chlorure de sodium et 0,2 % de chlorure de cétyl pyridinium, et on a agité et dissocié la

suspension résultante pendant 30 minutes. On a ensuite sépa-

ré le précipité de la suspension par filtration pour obtenir une fraction soluble. En outre, on aànouveau fait subir au précipité séparé par filtration la même dissociation que ci-dessus pour obtenir une fraction soluble. On a réuni les deux fractions solubles, et on a ajusté la fraction soluble résultante à un pH de 3 à 4 à l'aide d'acide chlorhydrique à 10 %, après quoi on lui a ajouté de l'éthanol pour que sa concentration soit finalement de 80 % en volume. On a laissé la solution résultante reposer pendant une nuit à C, et on a recueilli par filtration le précipité formé pour obtenir 5,5 g d'une poudre blanc-grisâtre à brun clair

de TF-150.

246 3619

Exemple de Préparation 1 On a garni chaque fiole de 1 mg ou de 5 mgde chacune des poudres de TF-100, 110 et 120 obtenues aux Exemples 1, 2 et 3. Ces poudres sont dissoutes dans une solution saline physiologique stérilisée, une solution contenant 0,5 %O- de lidocaine, ou une solution similaire, au moment de l'utilisation, puis elles sont utilisées sous forme d'injections. Exemple de Préparation 2 On a garni chaque fiole de 1 mg ou de 5 mg de chacune des poudres de TF-1316, 132a et 132b obtenues aux Exemples 4, 5 et 6. Ces poudres sont dissoutes dans une solution saline physiologique stérilisée, une solution contenant 0,5 % de lidocaine, ou une solution similaire, au moment de l'utilisation, puis elles sont utilisées sous forme

d' injections.

Exemple de Préparation 3 On a garni une fiole de 1 mg ou de 5 mg de la poudre de TF-133a obtenue à l'Exemple 7. On dissout cette poudre dans une solution saline physiologique stérilisée, une solution contenant 0,5 % de, lidocaine, ou une solution similaire, au moment de l'utilisation, puis on l'utilise

sous la forme d'injection.

Exemple de Préparation 4 On a garni une fiole de 1 mg ou de 5 mg de la poudre de TF-133b obtenue à l'Exemple 8. On dissout cette poudre dans une solution saline physiologique stérilisée, une solution contenant 0,5 % de lidocaine, ou une solution similaire, au moment de l'utilisation, puis on l'utilise

sous la forme d'injection.

Exemple de Préparation 5 On a garni une fiole de 1 mg ou de 5 mg de la poudre de TF-1323 obtenue à l'Exemple 9. On dissout cette poudre dans une solution saline physiologique stérilisée, une solution contenant 0,5 % de lidocaine, ou une solution similaire, au moment de l'utilisation, puis on l'utilise

sous la forme d'une injection.

Exemple de Préparation 6 On a garni chaque fiole de 1 mg ou de 5 mg de chacune des poudres TF-136, 140 et 150 obtenues aux Exemples 10, 11 et 12. Ces poudres sont dissoutes dans une solution saline physiologique stérilisée, une solution contenant 0,5 % de lidocaine, ou une solution similaire, au moment de l'utilisation, puis elles sont utilisées sous

la forme d'injections.

24636 19

Claims

REVENDICAT IONS

1. Procédé de préparation de substances à action carcinostatique et immunostimulante, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver, dans des conditions anaérobies, des bactéries productrices de substance TF, appartenant au genre Fusobacterium, et à recueillir lesdites substances de

la culture ou de son liquide surnageant.

2. Procédé selon la rexen dication 1, caractérisé en ce qu'on cultive les bactéries productrices de substance TF appartenant au genre Fusobacterium, dans des conditions anaérobies, on ajoute un solvant organique hydrophile à la culture ou à son liquide surnageant, après quoi on sépare du précipité formé les substances à action carcinostatique

et immunostimulante.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on sépare du précipité la fraction soluble dans l'eau

du précipité puis on la sèche.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on recueille le précipité formé, on fait subir à la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau une dialyse ou une ultrafiltration, et on recueille de la solution

interne les substances à action carcinostatique et immuno-

stimulante.

5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on recueille le précipité formé, on fait subir, s'il y a lieu, à la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau, une dialyse ou une ultrafiltration, puis on la traite par un échangeur d'ions, et on recueille la fraction non

adsorbée.

6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on recueille le précipité formé, on fait subir, s'il y a lieu, à la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau, une dialyse ou une ultrafiltration, puis on la traite par un échangeur d'ions, et on recueille de la fraction

adsorbée les substances à action carcinostatique et immuno-

stimulante.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en

ce qu'on traite la fraction adsorbée par un tampon de phos-

phate-chlorure de sodium 0,6 M, et on recueille la fraction éluée.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on recueille de la fraction adsorbée une fraction qui n'a pas été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de

sodium 0,1 M mais a été éluée par un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,2 M.

9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on recueille une fraction qui n'a pas été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 M, mais a été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M.

10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on recueille une fraction qui n'a pas été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 M mais a été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M.

11. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on recueille une fraction qui n'a pas été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,5 M mais a été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,6 M.

12. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on recueille le précipité formé; s'il y a lieu, on fait subir à la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau une dialyse ou une ultrafiltration; on prépare un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M de la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau, ou bien un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M de la solution interne obtenue par la dialyseoul'ultrafiltration, - puis on traite le tampon par un échangeur d'ions équilibré avec un tampon de phosphate- chlorure de sodium 0,2 - 0,-3 M; on recueille une fraction qui a traversé l'échangeur d'ions; on ajuste ensuite cette solution éluée de telle sorte que sa concentration en chlorure de sodium soit 0,1 M, et on la traite ensuite par un échangeur d'ions équilibré avec un tampon de phosphate- chlorure de sodium 0,1 M pour être adsorbeepar l'échangeur d'ions; et ensuite on recueille

une fraction qui n'a pas été éluée par un tampon de phos-

phate-chlorure de sodium 0,1 M mais a été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 ou 0,3 M.

13. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on recueille le précipité formé; s'il y a lieu, on 7 5 fait subir à la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau une dialyse ou une ultrafiltration, on prépare un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M de la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau ou un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0, 3 M de la solution interne obtenue par la dialyse ou l'ultrafiltration, puis on traite ce tampon par un échangeur d'ions équilibré avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,3 M; on recueille une fraction qui a traversé l'échangeur d'ions; on ajuste ensuite à 0,2 M la concentration en chlorure de sodium de cette solution éluée et on traite ensuite la solution par

un échangeur d'ions équilibré avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,2 M pour être adsorbé par l'échangeur d'ions; et ensuite on recueille une fraction qui n'a pas été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de

sodium 0,2 M mais a été éluée par un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,3 M.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce que l'on ajoute des ions baryum à la culture ou à son-

liquide surnageant pour former un sel de baryum, ou bien on ajoute à la culture ou à son liquide surnageant un solvant organique hydrophile, et on recueille le précipité formé, puis on ajoute des ions baryum à la fraction soluble dans l'eau du précipité ainsi recueilli, ou bien on ajoute des ions baryum à une solution d'une poudre obtenue en séchant ladite fraction du précipité qui est soluble dans l'eau, de façon à former un sel de baryum; on recueille le sel de baryum ainsi formé puis on en élimine le baryum; on recueille la fraction soluble dans l'eau et on lui fait

subir une dialyse ou une ultrafiltration.

15. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute un solvant organique hydrophile à la culture ou à son liquide surnageant; on recueille le précipité formé; on traite par un sel d'ammonium quaternaire la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau, ou la solution interne obtenue en faisant subir à la fraction soluble dans l'eau une dialyse ou une ultrafiltration; on recueille le précipité formé puis on lui fait subir une dissociation en utilisant une solution contenant du chlorure 7 6 de sodium; on ajoute un solvant organique hydrophile à la fraction soluble obtenue, pour former un précipité; et on

recueille le précipité ainsi formé.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 15, caractérisé en ce que le milieu de culture utilisé pour cultiver les bactéries contient des sources d'azote, des sources de carbone, des sources de vitamines, des agents réducteurs et des sels minéraux, éventuellement associés à

de la gélose.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 15, caractérisé en ce que le milieu de culture utilisé pour cultiver les bactéries comprend de la peptone de trypticase, de la peptone de phytone, de la peptone de protéose, une infusion de cervelle et de coeur ou une infusion de coeur, un extrait de levure, du chlorure de sodium, du glucose, du lactose, de la L-cystine, du sulfite de sodium et du thioglycollate de sodium, éventuellement

associés à de la gélose.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 15, caractérisé en ce qu'on procède à la culture entre 350 et 420C pendant 1 à 5 jours dans un milieu de culture

ajusté à un pH de 6,0 à 8,5.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 15, caractérisé en ce qu'on procède à la culture entre 360 et 380C pendant 1 à 3 jours dans un milieu de culture

ajusté à un pH de 7,2 à 8,2.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 15, caractérisé en ce que les bactéries appartenant au genre Fusobacterium sont des bactéries de Fusobacterium nucleatum.

21. Procédé selon l'une quelconque des revendications

2 à 15, caractérisé en ce que le solvant organique hydro-

phile que l'on ajoute à la culture ou à son liquide surna-

geant est un alcool.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications

2 à 15, caractérisé en ce qu'on ajoute le solvant organique hydrophile à la culture ou à son liquide surnageant-avec

une concentration de solvant de 30 à 70 % en volume.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications

6 à 13, caractérisé en ce que l'échangeur d'ions est un échangeur d'ions faiblement basique ou un échangeur d'ions faiblement basique ayant les propriétés d'un tamis molécu- laire.

24. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 - 0,6 M pour éluer la fraction adsorbée par l'échangeur

d'ions.

25. Procédé selon l'une quelconque des revendications

7 à 13 ou selon la revendication 24, caractérisé en ce que le pH du tampon de phosphate contenant du chlorure de sodium que l'on utilise pour traiter la fraction adsorbée est de

8 environ.

26. Procédé selon l'une quelconque des revendications

7 à 13 ou 24, caractérisé en ce qu'on fait subir une con-

centration, une déminéralisation et un séchage à la fraction

à laquelle on a fait subir le traitement d'échange d'ions.

27. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le sel d'ammonium quaternaire est le chlorure de

cétyl pyridinium.

28. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en

ce qu'on procède au traitement par le sel d'ammonium quater-

naire en présence d'un tampon de borate.

29. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la solution contenant du chlorure de sodium est un tampon de borate contenant du chlorure du sodium et un sel

d'ammonium quaternaire.

30. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on inocule les bactéries de Fusobacteriim nucleatum à un milieu de culture ajusté à un pH de 7,2 à 8,2 comprenant de la peptone de trypticase, de la peptone de phytone, de la peptone de protéose, une infusion de cervelle et de coeur ou une infusion de coeur, de l'extrait de levure,

du chlorure de sodium, du glucose, du lactose, de la L-

cystine, du sulfite de sodium et du thioglycollate de sodium,

ou bien à un milieu de culture comprenant les mêmes compo-

sants et de la gélose, puis on procède à la culture dans des conditions anaérobies entre 360 et 380C pendant 1 à 3 jours;

on ajoute un alcool à la culture ou à son liquide surna-

geant, à une concentration de 50 à 70 % en volume; on recueille le précipité formé; on fait subir, s'il y a lieu, à la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau, une dialyse ou une ultrafiltration, puis on la traite par un échangeur d'ions faiblement basique ou par un échangeur d'ions faiblement basique ayant les propriétés d'un tamis moléculaire, pour séparer la fraction non adsorbée; on sépare de la fraction adsorbée une fraction qui a été éluée par un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,1 ou 0,2 M; et ensuite on recueille, on concentre, on déminéralise puis on sèche une fraction qui a été éluée par un tampon phosphate-chlorure de sodium 0,3 M.

31. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on inocule des bactéries de Fusobacterium nucleatum

à un milieu de culture ajusté à un pH de 7,2 à 8,2, compre-

nant de la peptone de trypticase, de la peptone de phytone, de la peptone de protéose, une infusion de cervelle et de coeur ou une infusion de coeur, de l'extrait de levure,

du chlorure de sodium, du glucose, du lactose, de la L-

cystine, du sulfite de sodium et du thioglycollate de sodium, ou bien à un milieu de culture comprenant les mêmes constituants et de la gélose, puis on procède à la culture dans des conditions anaérobies entre 360 et 380C pendant 1 à 3 jours; on ajoute un alcool à la culture ou à son liquide surnageant, à une concentration de 50 à 70 % en volume; on recueille le précipité formé; s'il y a lieu, on fait subir à la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau une dialyse ou une ultrafiltration, puis on traite un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M de la fraction du précipité qui est soluble dans l'eau, ou un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M de la

solution interne obtenue par dialyse ou ultra-

filtration, par un échangeur d'ions faiblement basique ou

par un échangeur d'ions faiblement basique ayant les pro-

priétés d'un tamis moléculaire, que l'on -a au prélable équilibré avec un tampon de phosphate-chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M; on recueille la fraction qui a traversé l'échangeur d'ions; on ajuste cette solution éluée de façon qu'elle ait une concentration en chlorure de sodium de 0,1 à 0,2 M, puis on la traite par un échangeur d'ions faiblement basique ou par un échangeur d'ions faiblement basique ayant les propriétés d'un tamis moléculaire, que

l'on a au préalable équilibré avec un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,1 - 0,2 M,pour être adsorbépar l'échangeur d'ions; et on recueille de la fraction adsorbée

une fraction qui a été éluée par un tampon de phosphate-

chlorure de sodium 0,2 - 0,3 M, on la concentre, on la

déminéralise, puis on la sèche.

32. Procédé selon la revendication 20, 30 ou 31, caractérisé en ce que les bactéries de Fusobacterium

nucleatum proviennent d'une souche de TF-031.

33. Substance carcinostatique appelée TF-100, caracté-

risée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun-clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que et de la tumeur consistante d'Ehrlich chez les souris et

elle possède une action immunostimulante.

(c) Elle est soluble dans l'eau et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, le chloroforme,

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle

commence à se décomposer à 110 cenviron, et elle se décompo-

se nettement au-dessus de 200 C.

(e) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par la

méthode de la pastille de KBr, présente des bandes d'absorp-

tion au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, -1 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm (f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aquEuseprésente une forte absorption au bord d'absorption et

un pic d'absorption au voisinage de 256 - 260 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 50 mm de 0 x 600 mm, éluant: eau distillée) en de Pharmacia Co., Ltd. utilisant du Séphadex G-50 (marque déposéel), elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution au voisinage

du volume vide - 400, 430 - 530, 700 - 800, et 840 -

870 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm;

et aux volumes d'élution au voisinage du volume vide -

390, et 410 - 430 ml dans la mesure d'absorption à 620 nm, selon la méthode anthrone-acide sulfurique. (h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (dénomination commerciale d'un produit vendu par Toyo Soda Co., Ltd., colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2) présente des pics au voisinage du front du solvant, à 38 - 60, et à 65 mn dans

la mesure d'absorption ultraviolette à 220 nm et 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molish, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique, à la réaction de Lowry-Folin et à la réaction à la Ninhydrine. (j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 30,6 - 35,7 %, H: 4,2 - 5,2 %

N: 4,2 - 5,2 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 40,0 à environ 46,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 20,0 à environ 23,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum

de veau.

34. Substance carcinostatique appelée TF-110l, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich chez les souris, et elle possède une action

immunostimulante.

(c) Elle est soluble dans l'eau et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzene, le chloroforme,

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle commence à se décomposer à 110C environ et elle se décompose

nettement au-dessus de 200 C.

(e) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par la méthode de la pastille de KBr, présente des bandes d'absorption au voisinage de 36003200, 2960-2930, 1670- -1 1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm (f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 256 - 260 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 44 mm de 0 x 500 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) ep utilisant du Séphadex G-200

de lharmacia (o., Lta.

(marque déposée\), elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 380, et à 600 - 920 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm, aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 380, 420 - 520, et 630 - 760 ml dans la mesure

d'absorption à 490 nm, par la méthode phénol-acide sulfuri-

que; et au volumes d'élution au voisinage du volume vide - 380, 420 -520, et 620 - 760 ml dans la mesure d'absorption à 620 nm par la méthode anthrone-acide sulfurique. (h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK- GEL G300 SW (dénomination commerciale d'un produit vendu par Toyo Soda Co. . Ltd. colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2) présente des pics au voisinage du front du solvant, à 38 - 60 et 65 mn dans la mesure d'absorption

ultraviolette à 220 nm et à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molish, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique, et à la réaction de Lowry-Folin, et elle est négative à la

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 35,9 - 41,0 %; H: 4,5 - 5,2 %

N: 4,2 - 5,2 %

(k) sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 30,0 à environ 69,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 18,0 à environ 22,0 % en poids, exprimée en

albumine i sérum de veau.

35. Substance carcinostatique appelée TF-120, carac-

térisée par ses propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich chez les souris, et elle possède une action immunostimulante. (c) Elle est soluble dans l'eau et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, lechloroforme,

l'acétate d'éthyle, et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle commence à se décomposer à 110 C environ, et elle se

décompose nettement au-dessus de 200 C.

(e) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par la

méthode de la pastille de KBr, présente des bandes d'absorp-

tion au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, -1 1380-1360, 1140-1000 et 820 cm (f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 268 - 272 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 44 mm de 0 x 500 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 325, et à 775 - 875 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm; aux volumes

d'élution au voisinage du volume vide - 360, à 360 -

480, et à 510 - 760 ml dans la mesure d'absorption à 490 nm par la méthode phénol-acide sulfurique; et aux volumes

d'élution au voisinage du volume vide - 380, à 420 -

520 et à 620 - 760 ml dans la mesure d'absorption à 620 nm

par la méthode anthrone-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2), présente des pics au voisinage du front du solvant et à 38 - 60 mn dans la mesure d'absorption

ultraviolette à 220 nm et à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique et à la réaction de Lowry-Folin, et elle est négative à la

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 35,1 - 40,2 %; H: 4,5 - 5,5 %

N: 2,0 - 3,1 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 56,0 à environ 73,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 9,0 à environ 13,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

36. Substance carcinostatique appelée TF-130, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich, de la tumeur consistante d'Ehrlich,, et du carcinome Sarcoma 180 chez les souris et elle possède une

action immunostimulante.

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle

commence à se décomposer à 110 C environ, et elle se décom-

pose nettement au-dessus de 200 C.

(e) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par la

méthode de la pastille de BKr, présente des bandes d'absorp-

tion au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, -1 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm (f) Le spectre d'absorption ultraviolet desa solution

8- 2463619

-84- aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 256 - 280 nm.

(g) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la réaction phénolacide sulfurique, à la réaction anthrone- acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique, et à la réaction de Lowry-Folin, et elle est négative à la

réaction à la Ninhydrine.

(h) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants

C: 27,5 - 39,8 %; H: 3,2 - 5,7 %

N: 2,8 - 6,3 %

(i) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 19,0 à environ 64,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 6,0 à environ 28,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

37. Substance carcinostatique appelée TF-1316, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich, de la tumeur consistante d'Ehrlich et du carcinome Sarcoma180 chez les souris, et elle possède une

action immunostimulante.

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle

commence à se décomposer à 1100C environ, et elle se décom-

pose nettement au-dessus de 2000C.

(e) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par

la méthode de la pastille KBr, présente des bandes d'absorp-

tion au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550,

1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm1.

(f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 256 - 260 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 21 mmn de 0 x 400 mm, éluant: tamponde phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente une bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 160 ml dans la mesure

d'absorption ultraviolette à 260 nm; et une bande d'absorp-

tion aux volumes d'élution au voisinage du volume vide -

ml dans la mesure d'absorption à 490 nm, par la méthode

phénol-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2), présente des pics au voisinage du front du

solvant et à 40 - 60 mn dans la mesure d'absorption ultra-

violette à 220 nm, et au voisinage du front du solvant, et à 40 - 60 mn dans la mesure d'absorption ultraviolette à

260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 30,0 - 34,0 %; H: 3,8 - 4,4 %

N: 4,9 - 5,7 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 35,0 à environ 50,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 10,0 à environ 23,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

38. Substance carcinostatique appelée TF-132a, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'un poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

action immunostimulante.

(c) Elle est soluble dans l'eau et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, le chloroforme, l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique. (d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle

commence à se décomposer à 110 C environ, et elle se décom- pose nettement au-dessus de 200 C. -

(e) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par la méthode de la pastille de KBr, présente des bandes

* d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

-1 1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm (f) Le spectre d'absorption ultraviolet desa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 270 - 280 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 44 mm de 0 x 500 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 340, 600 - 700, et 720 - 880 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm; aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 340, 340 - 580, et 720 - 900 ml dans la mesure

d'absorption à 490 nm, par la méthode phénol-

acide sulfurique; et aux volumes d'élution au voisinage du volume vide 340, et 340 - 580 ml dans la mesure

d'absorption à 620 nm par la méthode anthrone-

acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute per-

formance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2), présente des pics au voisinage du front du

solvant, à 30, à 38 - 60 et à 65 mn dans la mesure d'absorp-

tion ultraviolette à 220 nm; et au voisinage du front du

solvant, à 62 et à 65 mn dans la mesure d'absorption ultra-

violette à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique, 8 7 et à la réaction de Lowry-Folin, et elle est négative à la

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 34,8 - 39,8 %; H; 4,5 - 5,7 %

N: 2,8 - 3,6 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 55,0 à environ 64,0 %O en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 18,0 à environ 28,0 % en poids, exprimée en

albumine de sérum de veau.

39. Substance carcinostatique appelée TF-132b, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich, de la tumeur consistante d'Ehrlich et du carcinome Sarcoma180 chez la souris, et elle possède une

action immunostimulante.

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle

commence à se décomposer à 110 C environ et elle se décom-

pose nettement au-dessus de 200 C.

(e) Son spectre d'absorption d'infrarouge, obtenue par la méthode de la pastille de KBr, présente des bandes

d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm1.

et un épaulement au voisinage de 265 - 280 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 21 mm de 0 x 400 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7), en utilisant du Séphadex G-200, elle présente une faible bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 150 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm; et une bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 150 ml dans la mesure d'absorption à 490 nm par

la méthode phénol-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9-mm de 0 x 600 mm x 2), présente des pics au voisinage du front du

solvant, à 36 - 37 et à 48 - 50 mn, dans la mesure d'absorp-

tion ultraviolette à 220 nm, et des pics très bas au voisi-

nage du front du solvant, à 32 - 39, et à 45 - 52 mn, dans

la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique, à la réaction de Lowry-Folin, et elle est négative à la

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 35,3 - 39,5 %; H: 4,5 - 5,6 %

N: 2,8 - 5,4 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 23,6 à environ 45,5 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 15,5 à environ 28,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

40. Substance carcinostatique appelée TF-133a, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich, de la tumeur consistante d'Ehrlich, du carcinome Sarcoma180 chez la souris, et elle possède une

action immunostimulante.

(c) Elle est soluble dans l'eau, et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, le chloroforme,

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, elle

246 3619

commence à se décomposer à 110 C environ et se décompose

nettement au-dessus de 200 C.

d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm 1 (f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 258 - 262 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 44 mm de 0 x 500 mm, éluant: tamponde phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 300, et de 630 - 940 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm; une bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 420 ml dans la mesure d'absorption à 490 nm par la méthode phénol-acide sulfurique; et une bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 420 ml dans la mesure d'absorption à

620 nm par la méthode anthrone-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute per-

formance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 im de 0 x 600 mm x 2) présente des pics au voisinage du front du

solvant, à 38 et à 50 mn dans la mesure d'absorption ultra-

violette à 220 nm; et au voisinage du front du solvant, à

50 - 60, et à 62 mn dans la mesure d'absorption ultravio-

lette à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 28,0 - 36,6 %; H: 3,5 - 5,1 %,

N; 4,5 - 6,3 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 26,0 à environ ,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 22,0 à environ 28,0 % en poids, exprimée en

albumine de sérum de veau.

41. Substance carcinostatique appelée TF-133b, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich, de la tumeur consistante d'Ehrlich et du

carcinome Sarcoma-180, et elle possède une action immuno-

stimulante.

l'acétate d'éthyle, et l'éther diéthylique.

(d) Elle ne possède pas de point de fusion bien défini, commence à se décomposer à 110 C environ, et se

décompose nettement au-dessus de 200 C.

d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm1 (f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un épaulement au voisinage de 270 - 280 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 21 mm de 0 x 400 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente une bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 170 ml dans la mesure

d'absorption ultraviolette à 260 nm; et une bande d'absorp-

tion aux volumes d'élution au voisinage du volume vide -

ml dans la mesure d'absorption à 490 nm par la méthode

phénol-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute per-

formance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2) présente des pics au voisinage du front du solvant, et à 49 - 50 mn dans la mesure d'absorption ultraviolette à 220 nm; et au voisinage du front du solvant,

à 38 - 39 et à 52 mn dans la mesure d'absorption ultra-

violette à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 31,1 - 38,5 %; H: 3,9 - 5,2 %

N: 3,4 - 4,7 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 19,0 à environ 24,5 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 12,9 à environ 22,9 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

42. Substance carcinostatique appelée TF-1323, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

action immunostimulante.

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, commence à se décomposer à 110 C environ, et se décompose

nettement au-dessus de 220 C.

d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

-1 1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm (f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un épaulement au voisinage de 265 - 280 nm.

(a) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 21 mm de 0 x 400 mm, éluant: tamponde phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente une bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 160 ml dans la mesure

d'absorption ultraviolette à 260 nm; et une bande d'absorp-

tion aux volumes d'élutions au voisinage du volume vide

- 150 ml dans la mesure d'absorption à 490 nm par la métho-

de phénol-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2) présente des pics au voisinage du front du solvant, à 36 et à 48 - 50 mn dans la mesure d'absorption ultraviolette à 220 nm; et des pics au voisinage du front du solvant, à 36 et à 50 mn dans la mesure d'absorption

ultraviolette à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

réaction à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 29,9 - 39,4 %; H: 3,9 - 5,6 %;

N: 2,8 - 5,4 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 1-9,0 à environ 25,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 11,0 à environ 17,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

43. Substance carcinostatique appelée TF-136, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich, de la tumeur consistante d'Ehrlich, et du carcinome Sarcoma-180 chez la souris, et elle possède une

action immunostimulante.

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, commence à se décomposer à 110 C environ et se décompose

nettement au-dessus de 200 C.

d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm 1.

et un pic d'absorption au voisinage de 256 - 260 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 44 mm de 0 x 500 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution au voisinage de 540 - 930 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm, et toutes les fractions ont une légère bande d'absorption dans la mesure d'absorption à 490 nm par la méthode phénolacide sulfurique et dans la mesure d'absorption à 620 nm par la méthode anthrone-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute perfor-

mance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2),présente des pics au voisinage du front du

solvant, à 28 - 40, et à 42 - 60 mn dans la mesure d'absorp-

tion ultraviolette à 220 nm; et des pics au voisinage du front du solvant et à 42 - 60 mn dans la mesure d'absorption

ultraviolette à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

acide sulfurique, à la réaction indole-acide chlorhydrique, et à la réaction de Lowry-Folin, et négative à la réaction

à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 27,5 - 32,-6 %; H: 3,2 - 4, 0 %;

N: 5,0 - 6,1 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 19,0 à environ 30,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 6,0 à environ 12,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

44. Substance carcinostatique appelée TF-140, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

que d'Ehrlich chez la souris, et elle possède une action immunostimulante. (c) Elle est soluble dans l'eau et insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, le chloroforme,

l'acétate d'éthyle, et l'éther diéthylique.

(d) Elle n'a pas de point de fusion bien défini, commence à se décomposer à 210 C environ, et se décompose

nettement au-dessus de 280 C.

(e) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par la

méthode de la pastille de KBr, présente des bandes d'absorp-

tion au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm-1 (f) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 255 - 260 nm.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 44 mm de 0 x 500 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7), en utilisant du Séphadex G-200, elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution

au voisinage du volume vide - 300, 500 - 900, et 900 -

1000loml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm;

et aux volumes d'élution au voisinage du volume vide -

500, 650 - 850, et 850 - 1000 ml dans la mesure d'absorp-

tion à 490 nm par la méthode phénol-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2) présente des pics au voisinage du

front du solvant, et à 40 - 60 mn dans la mesure d'absorp-

tion ultraviolette à 220 nm et à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 22,0 - 28,0 %; H: 3,0 - 3,5 %;

N: 5,0 - 6,5 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 5,0 à environ 15,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 23,0 % à environ 32,0 % en poids, exprimée en albumine de sérum de veau.

45. Substance carcinostatique appelée TF-150, carac-

térisée par les propriétés suivantes:

(a) Elle se présente sous la forme d'une poudre blanc-

grisâtre à brun clair.

(b) Elle inhibe la prolifération de la tumeur asciti-

l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique.

nettement au-dessus de 200 C.

(e) Le spectre d'absorption ultraviolet de sa solution

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aqueuse présente une forte absorption au bord d'absorption,

et un pic d'absorption au voisinage de 255 - 260 nm.

(f) Son spectre d'absorption infrarouge, obtenu par la méthode de la pastille de KBr, présente des bandes

d'absorption au voisinage de 3600-3200, 2960-2930, 1670-

1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 et 820 cm1.

(g) Quand on la fractionne par filtration sur gel (colonne: 21 mm de 0 x 400 mm, éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7,0) en utilisant du Séphadex G-200, elle présente des bandes d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 100, et de 100 - 160 ml dans la mesure d'absorption ultraviolette à 260 nm; et une bande d'absorption aux volumes d'élution au voisinage du volume vide - 150 ml dans la mesure d'absorption à

490 nm par la méthode phénol-acide sulfurique.

(h) Son chromatogramme en phase liquide à haute performance (éluant: tampon de phosphate 0,1 M ayant un pH de 7,0, débit: 0,8 ml/mn, à la température ambiante), obtenu en utilisant du "TSK-GEL G300 SW" (colonne: 7,9 mm de 0 x 600 mm x 2), présente des pics au voisinage du front du solvant, à 32 et à 48 - 50 mn dans la mesure d'absorption ultraviolette à 220 nm; et au voisinage du front du solvant,

à 32 et à 48 - 50 mn dans la mesure d'absorption ultra-

violette à 260 nm.

(i) Elle est positive à la réaction de Molisch, à la

réaction phénol-acide sulfurique, à la réaction anthrone-

à la Ninhydrine.

(j) Son analyse élémentaire donne les résultats suivants:

C: 31,0 - 34,0 %; H: 4,0 - 4,4 %

N: 2,8 - 3,2 %

(k) Sa teneur en saccharides, mesurée par la méthode phénol-acide sulfurique, est d'environ 40,0 à environ 55,0 % en poids, exprimée en glucose, et sa teneur en protéines, mesurée par la méthode de Lowry-Folin, est d'environ 7,0 à environ 14 % en poids, exprimée en albumine de sérum de

veau.

46. Agent carcinostatique caractérisé en ce qu'il comprend la substance carcinostatique TF-100, 110, 120, , 1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136, 140 ou 150 selon la revendication 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45, et un adjuvant pharmaceutiquement

acceptable.

47. Agent carcinostatique selon la revendication 46, caractérisé en ce que ladite substance carcinostatique est TF-132a, 132b, 133a, 133b ou 1323 selon la revendication

38, 39, 40, 41 ou 42.