SE446406B - Nya foreningar med karcinostatisk och immunostimulerande verkan framstellda genom odling av fusobacterium nucleatum tf-031(ferm 5077, atcc 31647), forfarande for framstellning av desamma och karcinostatiskt medel inneha - Google Patents

Description

. ' 446 -406 bacterium nucleatum 1010 (Dental Surgery, gå, 322-333 (1974) och gl, 534-539 (1972) (japansk)). Det har emellertid ännu inte gjorts någon studie av komponenterna erhållna från en kultur eller dess överflytande vätska framställd genom odling av bak- terier tillhörande släktet Fusobacterium och de farmakologiska å Q aktiviteterna som erhålles med dessa komponenter.

Föreliggande uppfinnare har examinerat den farmakologiska aktiviteten hos en överflytande vätska erhållen genom odling av bakterier tillhörande släktet Fusobacterium och avlägsnande av organismen från kulturen och har därvid funnit att en sär- gl skild komponent erhållen ur den överflytande vätskan har en karcinostatisk verkan; att nämnda komponent väsentligen inte har någon effekt på hämmandet av bildningen av en koloni av cancerceller vid en koloniskumningsbestämning och har inte en karcinostatisk aktivitet genom dödande av cancerceller men , en indirekt karcinostatisk aktivitet genom ökning av den indirekta värdantitumöraktiviteten eller immuniteten hos vär- den och användandet av assistans av immuniteten och att nämnda komponent har mycket låg toxicitet och kan erhållas även genom _' ¿ behandling av kulturen. arpl , Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett förfarande omfattande odling av bakterier tillhörande släktet Fusobacterium under anaeroba betingelser och utvinning av de nya TF-substanser med karcinostatiska och immunosti- mulerande aktiviteter ur de bildade kulturerna eller den över- flytande vätskan därav. é” ä Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att fram- « ställa nämnda TF-substanser.

Ett ytterligare ändamål med föreliggande uppfinning är att framställa ett karcinostatiskt medel innehållande nämnda TF- 2. ïšxlšßïsf' .~ v" substanser. “ » 4 Andra ändamål och fördelar med föreliggande uppfinning kom- mer att åskâdliggöras närmare i följande beskrivning. 4461406 u 3 Som bakterier använda i föreliggande uppfinning kan vilka som helst TF-substansproducerande bakterier tillhörande släktet Fusobacterium användas, exempelvis Fusobacterium nucleatum är att föredraga. Konkret användes Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) och liknande.

De bakteriologiska egenskaperna hos Fusobacterium nucleatum TF-031 är följande: (I) Form (l) Cellform: spindelformad (fig. l) (2) Cellpolymorfism: ingen (B) Motilitet: ingen (4) Sporer: inga (5) Gramfläck: gramnegativ (6) Syraresistens: negativ (II) Växtbetingelser i ett kulturmedium (l) TF-en agarplatta och snedkulturmedium Yttre form: en rund form Storlek: ungefär 1 mm Protuberans: hemisfärisk form Struktur: daggdroppslik Yta: jämn Kanter: jämna g Färg: mjölkaktigt gulvit Y Transparens: opak (2) TF-ett flytande kulturmedium Grad av tillväxt: livlig Grumlignota ooaqulum Utfällning: ingen Yttillväxt: ingen, ingen tillväxt till ett djup av ungefär 5 mm Gasbildning: ingen (III) Fysiologiska egenskaper (l) Bildning av vätesulfid: + (2) Reduktion av nitrater: - (3) Bildning av smörsyra: + (4) Bildning av indol: + (5) Ureas: - _ 'ru-ale _ the. ' L» -a »en .m -. V-wwnwwl.. ., 446:406 (6) Katalas: - (7) Stärkelsehydrolys: - (8) Uppträdande i förhållande till syre: anaerobisk L (9) Bildning av ammoniak: + § É J' (lO) Bildning av koldioxid: + (11) frillväxtomräae; pH s-s,s, temperatur 3o-4s°c (12) Bildning av gas från sackarider: L-arabinos (-), D-xylos (-), 3-glukos (-), D-mannos fw (-), D-fruktos (-), D-galaktos (-), maltsocker (-), *«* sukros (-), trehalos (-), sorbitøl (-), mannitol (-), inositol (-), glycerol (-), stärkelse (-).

De nya TF-substanserna enligt föreliggande uppfinning fram- , ställes på exempelvis följande sätt: Å, :hå 4415106 Kultur av TF-substans som producerar bakterier tillhörande släktet Fuso- bacterium I Kultur eller dess över- xl flytande vätska Hydrofilt k organiskt lös- |Får stål ningsmedel 'Löslig fra - 'tion Fosfatbuffert &natriumklorid] _ eller vatten I Olöslig . fraktion .Separation I |TorkningL Vattenlöslig xz $ Yi' fraktion _ _ \ *~ g Dialys eller f .ultrafiltreri ng o 'ïë Torkning Q. Inre losning ~ " ' “3 TF-llo _ _ _ “ ~ ~ __ Behandling med :ïâzzïäifafi | Fosfatbuffert _ (natriumklorid) Avsaltning Kšššat Torkning TF-l2O TF-130 (TF-1316, l32a, l32b, l33a, l33b, 1323, 136) 1 krrwn T ..\._ 446 406 6 Kultur eller dess xl överflytande vätska U _ 2 Vattenlosllg x _ fraktion -> _ ff wo 1 , f ' Produktion av et ,Éf" Ißariumjonerl --9 bariumsalt Y* I Separation o-ål Lösning! l Bariumsalt Avlëgsnande av barium Separation---ål Fasš |Lösning \ ' Dialys eller ultrafiltrering Koncentreringl Torkning x/ TF-140 446 406 _ lW_» 7 Vattenlöslig xz fraktion Ä x3 _ L Inre ,lTorkningr-9 T§;llO lösning , > 1 -å Behandling med ett ,f' * Löslig fraktion! kvaternärt ammonium- K i salt I Ett kvaternärt ammoniumkomplex Lösning innehållande a natriumklorid fi Upplösnings- förfarande "'““'“']/ , ”tvâ “W Tvättvätskor y Löslig fraktion Hydrofilt orga- niskt lösnings- medel Löslig fraktionåf Separation Fällning Ä Ü Torkning TF-150 446 406 8 Ovannämnda produktionsprocess illustreras på följande sätt: (1) Odling av bakterier odlingen av bakterier tillhörande släktet Fusobacterium genom- föres med en vanlig metod för odling av anaeroba bakterier.

Det vill säga ett kulturmedium innehållande en kvävekälla så- som extrakt av hjärna/hjärta från kalv, olika peptoner, eller liknande; en vitaminkälla såsom jästextrakt eller liknande; ett oorganiskt salt,'såsom natriumklorid eller liknande; en kolkälla, såsom glukos, laktos eller liknande; ett reducerande medel, såsom L-cystin, natriumsulfit, tioglykollat eller lik- nande, dess pH justeras till 6-8,5, företrädesvis 7,2-8,2, och bakterierna inympas i odlingsmediet, varefter en sta- tisk odIing genomföras under anaeroba betingelser vid 3s-42°c, företrädesvis 3e-3s°c, under i-s dagar, före- trädesvis 24-72 timmar. Det är särskilt önskvärt att använda deti tabell l beskrivna odlingsmediet (i det följande angivet såsom TF-odlingsmedium). Hjärn/hjärt-infusionen som är ett kalv-hjärn/hjärt-extrakt är inte alltid nödvändigt som en kolkälla och kan ersättas med en hjärt-infusion som är ett kalvhjärtextrakt, ett oxköttextrakt, ett fiskextrakt; en majs- stöpsvätska eller liknande. Bland de olika peptonerna är proteospepton och fytonpepton inte alltid nödvändiga och tryp- tikaspepton kan ersättas av polypepton.

När agar inte användes är det önskvärt att odlingen omröres.

Tabell l Kulturens beståndsdelar (g/1) TF-a TF-b TF-c Tryptikaspepton 17 l7 17 Fytonpepton 3 3 1,5 Proteospepton 10 5 5 Hjärna/hjärta-infusion 35 17,5 - Hjärtinfusion - - 25 Jästextrakt 3 3 3 Natriumklorid 7,5 7,5 7,5 Glukos 6 6 6 Laktos 5 5 5 L-cystin 0,25 0,5 0,5 446 406 9 Natriumsulfit 0,1 0,1 0,1 Tioglykolat 0,5 0,5 0,5 Agar O el. 0,7 O el. 0,7 O el. 0,7 (2) Uppsamling av en överflytande vätska från odlingen (avlägsnande av organismerna) Organismerna avlägsnas ur den enligt ovan erhållna odlingen för erhållande av en överflytande vätska. För avlägsnande av organismerna kan en vanligt metod användas, exempelvis centri- fugering och en filtreringsmetod under användning av ett fil- terhjälpmedel, såsom Hyflo Super Cel och särskilt föredrages en centrifugeringsmetod med hänsyn/till den grad till vilken organismerna avlägsnas och utbytet av den överflytande vätskan.

Organismerna avlägsnas företrädesvis i detta steg men kan även avlägsnas i följande steg (3). (3) Uppsamling av den karcinostatiska substansen TF-l00 Ett hydrofilt organiskt lösningsnedel tillsättes den enligt ovan erhållna överflytande vätskan eller kulturen och den bil- dade fällningen uppsamlas. Vid detta tillfälle justeras före- trädesvis pH hos den överflytande vätskan eller kulturen till 2-7. Det hydrofila organiska lösningsmedlet innefattar exempel- vis alkoholer, såsom etanol, metanol och liknande, och ketoner såsom aceton och liknande, även om alkoholer, särskilt etanol, ger det bästa resultatet. Det hydrofila organiska lösnings- medlet tillsättes lämpligen i koncentrationer av 30-70 volym- procent, företrädesvis 50-70 volymprocent. Efter tillsatsen av det hydrofila organiska lösningsmedlet får den errlllna bland- ningen stå vid en låg temperatur, företrädesvis vid ungefär 5°C, under flera timmar till flera dagar för att utfällningen skall bli fullständig.

Den sålunda erhållna fällningen avskiljes med vanliga metoder såsom dekantering, centrifugering, filtrering och liknande.

Därefter tillsättes vatten i en mängd av lO-15 gånger mängden av den enligt ovan erhållna fällningen (vattnet kan ersättas -«-«-«-'I%Il-.-!- fw- 1 i _ W , -446 '406 .- IC av en fosfatbuffert eller en fosfatbuffert innehållande natriumklorid när man önskar erhålla substanserna TF-120 eller l3O (1316, l32a, l32b, l33a, l33b, 1323 eller 136) såsom anges i det följande) och de bildade vattenolösliga substanserna av- lägsnas med vanliga metoder, såsom centrifugering, filtrering eller liknande, varefter den vattenlösliga fraktionen uppsam- las. När kulturen användes avlägsnas organismerna med ovan angivna metoder. Den vattenlösliga fraktionen som sålunda er- hålles torkas genom lyofilisering eller liknande för erhållande av en karcinostatisk substans TF-100.

TF-100 har egenskaperna som visas i tabell 2. (4) Uppsamling av den karcinostatiska substansen TF-110 Den vattenlösliga fraktionen som erhålles under (3) ovan utsättes för dialys eller ultrafiltrering; eller alternativt upplöses substansen TF~lO0 i vatten i en mängd som är 10-15 gånger mängden av substansen TF-100 och den erhållna lös- ningen utsättas för dialys eller ultrafiltrering. Substanser med låg molekylvikt såsom aminosyror och oorganiska substanser avlägsnas genom ovan angivna behandling. Den inre lösningen som erhålles genom dialys eller ultrafiltrering uppsamlas och torkas för erhållande av en karcinostatisk substans TF-ll0.

Den sålunda erhållna substansen TF-ll0 har egenskaperna som visas i tabell 2. (5) Uppsamling av den karcinostatiska substansen TF-120 Den vattenlösliga fraktionen som erhålles enligt den under (3) beskrivna metoden, eller, om så erfordras, den inre lös- ningen som erhålles genom att den vattenlösliga fraktionen utsättes för dialys eller ultrafiltrering (den inre lösningen som erhålles enligt den under (4) beskrivna metoden), eller en lösning av ett pulver av substansen TF-110 i en liten mängd vatten behandlas med en jonbytare. Såsom jonbytare användes en svagtbasisk jonbytare eller företrädesvis användes en svagt basisk jonbytare med en molekylsiktbarhet och lämpligen an- vändes dietylaminoetyl-Sephadex A-SO (registrerat varumärke 44a>4osa~ \ f; ll Å av Pharmacia Co., Ltd.). En kolonn packad med en jonbytare utbalanseras exempelvis med en fosfatbuffert med ett pH av ungefär 8, varefter ovan angivna lösning som skall behandlas får passera¿genom kolonnen och eluatet uppsamlas och torkas genom lyofilisering eller liknande; eller alternativt placeras den ovan angivna bufferten och lösningen som skall behandlas i ett kärl innehållande en jonbytare och innehållet omröres och filtreras sedan, varefter filtratet torkas; varvid en karcinostatisk substans TF-120 med de i det följande beskrivna egenskaperna kan erhållas. Substansen TF-l2O kan även erhållas genom avsaltning av eluatet eller filtratet, exempelvis genom dialys med användning av en cellofantub eller liknande, genom användning av Sephadex G-25 (registrerat varumärke av Pharma- cia Co¿, Ltd.) eller genom ultrafiltrering och sedan torkning av densamma. qß u; Den sålunda erhållna substansen TF-120 har de i tabell 2 visade egenskaperna. (6) Uppsamling av den karcinostatiska substansen TF-130 En kolonn innehållande de adsorberade komponenterna från vilka substansen TF-120 har avlägsnats genom behandling med den under (5) beskrivna metoden behandlas med en fosfatbuffert, före- trädesvis en fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,1-0,6 M och ett pH av ungefär 8 (i det följande anges fosfatbufferten med en natriumkloridkoncentration av 0,1-O,6M med följande beteckning: en 0,1-O,6M natriumklorid-fosfat- buffert); eller alternativt utsättes den vattenlösliga frak- tionen, erhållen enligt den under (3) beskrivna metoden, om så erfordras, för dialys eller ultrafiltrering och sedan för behandling med en jonbytare under användning av en 0,1-O,6M natriumklorid-fosfatbuffert för erhållande av en fraktion som inte elueras med en fosfatbuffert fri från natriumklorid men elueras med en 0,1-O,6M natriumklorid-fosfatbuffert.

Detta förfarande kan genomföras antingen med ett kolonnsystem eller ett satssystem. Den sålunia erhållna önskade fraktionen som elueras med natriumklorid-forfatbufferten torkas genom 446". 406 12 lyofilisering eller liknande för erhållande av en karcinosta- tisk substans TF-130. Eluatet innehållande den önskade frak- ¿” tionen som elueras med nämnda natriumklorid-fosfatbuffert kan 3% avsaltas, exempelvis genom dialys med användning av en cello- a; fantub, genom molekylsiktning med användning av Sephadex G-25, eller genom ultrafiltrering och sedan torkning.

Uttrycket “TF-130" som det användes häri hänför sig kollektivt till de önskade eluatfraktionerna erhållna genom behandling av den vattenlösliga fraktionen som erhållits med den under (3) beskrivna metoden eller om så erfordras, den inre lös- 9% 4, ningskomponenten som erhållits genom att den vattenlösliga u www fraktionen utsatts för dialys eller ultrafiltrering med en jonbytare, vilka fraktioner inte eluerats med en fosfatbuffert fri från natriumklorid men eluerats med en 0,1-0,6M natrium- klorid-fosfatbuffert. TF-130 innefattar konkret exempelvis följande fraktioner. (i) En fraktion som inte har eluerats med en fosfatbuffert fri från natriumklorid men har eluerats med en 0,6M natrium- klorid-fosfatbuffert vid den ovan angivna jonbytarbehandlingen l' s (fraktionen betecknas TF~l3l6). (ii) En fraktion som inte har eluerats med en O,lM natriumï klorid-fosfatbuffert men har eluerats med en O,2M natrium- klorid-fosfatbuffert vid den ovan angivna jonbytarbehandlingen (fraktionen betecknas TF-l32a och b; TF-l32a erhålles genom tvättning av en jonbytare innehållande den tidigare nämnda adsorberade komponenten med en O,lM natriumklorid-fosfatbuf- fert, behandling av jonbytaren med en 0,2M natriumklorid-fos- fatbuffert och uppsamling av den eluerade fraktionen med O,2M natriumklorid-fosfathuffert; och TF-l32b erhålles genom behand- -4 ling av den vattenlösliga fraktionen som erhållits med den under (3) beskrivna metoden eller den inre lösningskomponenten (TF-ll0) erhållen med den under (4) beskrivna metoden med en jonbytare). (446 406 13 (iii) En fraktion som inte har eluerats med en O,2M natrium- klorid-fosfatbuffert men har eluerats med en 0,3M natriumklo- rid-fosfatbuffert vid den ovan angivna jonbytesbehandlingen (fraktionen betecknas TF-l33a och b: a och b har samma betydel- se som beskrivits ovan vid substanserna TF-l32a och b). (iv) En fraktion som inte har eluerats med en O,lM natriumklo- rid-fosfatbuffert men har eluerats med en O,3M natriumklorid- fosfatbuffert vid ovan angivna jonbytesbehandling (fraktionen betecknas TF-1323). (v) En fraktion som inte har eluerats med en 0,5M natriumklo- rid-fosfatbuffert men har eluerats med en 0,6M natriumklorid- fosfatbuffert vid ovan angivna jonbytesbehandling (fraktionen betecknas TF-136).

Enär dessa substanser TF-1316, l32a, l32b, l33a, l33b, 1323 och 136 har vanliga egenskaper i följande avseenden.betecknas substanserna som har de vanliga egenskaperna med TF-130.

Dvs. substansen TF-130 erhâllen på ovan angivet sätt har föl- jande egenskaper: (a) Gråvitt till lätt brunt pulver (b) Den förhindrar tillväxten av Ehrlich ascites tumör, Ehr- lich fast tumör och Sarcom.-180 karcinom hos möss och har en immunostimulerande verkan. (c) Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. (d) Den har ingen klar smältpunkt, den börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas märkbart över 200°C. (e) Dess infrarödabsorptions-spektrum som erhålles med en KB:-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, ll40-1000 OCh 820 cm'l. (f) Ultraviolettabsorptions-spektrumet av dess vattenlösning visar en kraftig absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 256-280 nm.

Sxflrorna morn nalcnlrs .anger min f" “WW """""'°"'" d°k“m'""*°d fnnhonøll uiunhhenngnkoxl, lNlD-kud Bukshw mom kl-HHIH 446 406 14 (g) Den har en positiv Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyra-reaktion, indol-saltsyra-reaktion och Lowry-Folins-reaktion och en negativ ninhydrin-reaktion. (h) Elementaranalysvärden: C: 27,5-39,8 % H: 3,2-5,7 % N: 2,8-6,3 % (i) Dess sackaridinnehåll mätt med en fenol-svavelsyra- metod är ungefär 19,0 till ungefär 64,0 viktprocent (uttryckt som glykos) och dess proteininnehâll mätt med Lowry-Folins metod är i närheten av 6,0-28,0 viktprocent (uttryckt som kalvserumalbumin).

Den ovan angivna jonbytesbehandlingen beskrives speciellt i det följande. Såsom jonbytare använd i följande förfaranden föredrages en svagt basisk jonbytare eller en svagt basisk jonbytare med molekylsiktbarhet och lämpligen användes exempel- vis dietylaminoetyl-Sephadex A-50 använd vid den under (5) beskrivna metoden och följande metod kan genomföras SfltS“ vis (i) En O,6M natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH av före- trädesvis 8 får passera genom en kolonn med en jonbytare innehållande den adsorberade komponenten, vilken lösningen som skall behandlas har fått passera genom enligt den under (5) beskrivna metoden och den eluerade fraktionen uppsamlas, val- fritt koncentreras och avsaltas genom dialys, ultrafiltrering eller liknande, och torkas därefter genom lyofilisering eller liknande för erhållande av en karcinostatisk substans TF-l3l6.

Den sålunda erhållna substansen TF-1316 har egenskaperna som visas i tabell 2. (ii)-1) En O,lM natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH av före- trädesvis 8 får passera genom en kolonn med en jonbytare inne- hållande den adsorberade komponenten genom vilken lösningen som skall behandlas har fått passera enligt den under (5) beskriv- na metoden, kolonnen tvättas varefter en 0,2M natriumklorid- fosfatbuffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8 får passe- 446406 is ra genom kolonnen och den eluerade fraktionen uppsamlas, val- fritt koncentreras och avsaltas genom dialys, ultrafiltrering eller liknande och torkas sedan genom lyofilisering eller lik- nande för erhållande av en karcinostatisk substans TF-l32a.

Den sålunda erhållna substansen TF-l32a har egenskaperna som visas i tabell 2. (ii)-2) Förfaranden för uppsamlinq av fraktionen som inte har eluerats med en O,lM natriumklorid-fosfatbuffert men har eluerats med en O,2M natriumklorid-fosfatbuffert vid jonbytes- behandlingen genomföres på följande sätt med användning av den vattenlösliga fraktionen som erhållits vid den under (3) beskrivna metoden, eller den inre lösningen av den under (4) beskrivna metoden för erhållande av substansen TF-l32b. Dvs. kolonnen som packats med jonbytare har ekvilibrerats med en 0,2-O,3M natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH av företrädes- vis ungefär 8, varefter den tidigare nämnda O,2-O,3M natrium- klorid-fosfatbufferten av den vattenlösliga fraktionen erhål- len med den under (3) beskrivna metoden eller den inre lös- ningskomponenten, erhâllen genom att den vattenlösliga frak- tionen utsättes för dialys eller ultrafiltrering får passera genom kolonnen och den eluerade lösningen uppsamlas. Om så erfordras tvättas kolonnen med tidigare nämnda 0,2-O,3M nat- riumklorid-fosfatbuffert och den eluerade lösningen och tvätt- vätskorna slås samman. Jonbytesbehandlingen kan genomföras flera gånger. Därefter får en lösning framställd genom utspäd- ning av tidigare nämnda eluerade lösning med en fosfatbuffert så att natriumkloridkoncentrationen blir O,lM passera genom en kolonn i vilken jonbytaren har bringats i jämvikt med en O,lM natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH företrädesvis vid ungefär 8 och fraktionen som har eluerats med tidigare nämnda O,lM natriumklorid-fosfatbuffert avlägsnas, varefter nämnda O,2M natriumklorid-fosfatbuffert får_passera genom kolonnen för erhållande av ett eluat. I de konkreta exemplet av ovan angivna jonbytesbehandling uppsamlas en fraktion som har adsorberats på en jonbytare bringad i jämvikt med nämnda O,2M natriumklorid-fosfatbuffert, adsorberats på en jonbytare som a f' A a , 446 406 16 bringats i jämvikt med nämnda O,lM natriumklorid-fosfatbuffert, tvättats med nämnda O,lM natriumklorid-fosfatbuffert och sedan eluerats med nämnda O,2M natriumklorid-fosfatbuffert, för er- hållande av ett eluat. En metod kan även användas vid vilken omvänt fraktionen som har adsorberats på en jonbytare som bringats i jämvikt med nämnda 0,lM natriumklorid-fosfatbuffert uppsamlas och därefter genomföres ett förfarande för separe- ring av nämnda fraktion från en fraktion som har adsorberats på en jonbytare som bringats i jämvikt med nämnda O,2M natrium- klorid-fosfatbuffert och en fraktion som har eluerats med nämnda O,2M natriumklorid-fosfatbuffert uppsamlas.

Det på ovan angivet sätt erhållna eluatet koncentreras even- tuellt och avsaltas genom dialys, ultrafiltrering eller lik- nande och torkas sedan genom lyofilisering eller liknande för erhållande av en karcinostatisk substans TF-l32b.

Den sålunda erhållna substansen TF-l32b har egenskaperna som anges i tabell 2. (iii)-l) Den inre lösningskomponenten erhållen vid den under (4) beskrivna metoden får passera genom en kolonn med en jon- bytare som bringats i jämvikt med en fosfatbuffert som har ett pH företrädesvis vid ungefär 8 och en O,2M natriumklorid-fos- fatbuffert med ett pH företrädesvis vid ungefär 8 får passera genom nämnda kolonn för tvättning av kolonnen och därefter får en O,3M natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH av ungefär- 8 passera genom nämnda kolonn eller alternativt, nämnda O,3M natriumklorid-fosfatbuffert får passera genom kolonnen som har behandlats enligt den under (ii)-1) beskrivna metoden och fortfarande har en kvarvarande adsorberad komponent.

Den eluerade fraktionen uppsamlas, koncentreras eventuellt och avsaltas genom dialys, ultrafiltrering eller liknande och torkas sedan genom lyofilisering eller liknande för erhållande av en karcinostatisk substans TF-l33a.

Den sålunda erhållna substansen TF-l33a har egenskaperna som anges i tabell 2. -446 406 17 (iii)-2) Fraktionen som inte har eluerats med en O,2M natrium- klorid-folfatbuffurt men har eluerats med en O,3M natriumklo- rid-fosfatbuffert vid jonbytesbehandlingen uppsamlas på följande sätt, vilket är detsamma som beskrivits ovan under (ii)-2) för bildning av TF-l33b. Dvs. kolonnen som packats med jonby- tare och bringats i jämvikt med en O,3M natriumklorid-fosfat- buffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8, varefter nämnda O,3M natriumklorid-fosfatbuffert av den vattenlösliga frak- tionen som erhållits med den under (3) beskrivna metoden, eller den inre lösningskomponenten erhållen genom att den vattenlösliga fraktionen utsatts för dialys eller ultrafiltre- ring,-får passera genom kolonnen och den eluerade lösningen uppsamlas. Om så erfordras tvättas kolonnen med nämnda O,3M natriumklorid-fosfatbuffert och den eluerade lösningen och tvättvätskorna sammaslås. Jonbytesbehandlingen kan genomföras flera gånger. Därefter får en lösning framställd genom utspäd- ning av nämnda eluerade lösning med en fosfatbuffert så att natriumkloridkoncentrationen blir O,2M passera genom en kolonn i vilken jonbytaren har bringats i jämvikt med en O,2M natrium- klorid-fosfatbuffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8, och fraktionen som har eluerats med nämnda O,2M natriumklorid- fosfatbuffert avlägsnas, varefter nämnda O,3M natriumklorid- fosfatbuffert får passera genom kolonnen för erhållande av ett eluat. I det konkreta exemplet av ovan nämnda jonbytesbehand- ling uppsamlas en fraktion som inte har adsorberats på en jon- bytare, som bringats i jämvikt med nämnda O,3M natriumklorid- fosfatbuffert, adsorberats på en jonbytare som har bringats i jämvikt med nämnda O,2M natriumklorid-fosfatbuffert, tvättats med nämnda O,2M natriumklorid-fosfatbuffert och sedan eluerats med nämnda O,3M natriumklorid-fosfatbuffert för erhållande av ett eluat. En metod kan även användas vid vilken omvänt en fraktion som har absorberats på en jonbytare som har bringats i jämvikt med nämnda O,2M natriumklorid-fosfatbuffert uppsam- las och därefter genomföres ett förfarande för separering av nämnda fraktion från en fraktion som har adsorberats på en jonbytare som har bringats i jämvikt med nämnda O,3M nat- riumklorid-fosfatbuffert och en fraktion som har eluerats med nämnda O,3M natriumklorid-fosfatbuffert uppsamlas. 446 .406 18 Det på ovan beskrivet sätt erhållna eluatet koncentreras där- efter eventuellt och avsaltas genom dialys, ultrafiltrering eller liknande och torkas sedan genom lyofilisering eller lik- nande för erhállande av den önskade karcinostatiska substansen TF-l33b.

Den sålunda erhållna substansen TF-l33b har egenskaperna som visas i tabell 2. (iv) Den vattenlösliga fraktionen som erhålles med den under (3) beskrivna metoden eller den inre lösningskomponenten som erhålles med den under (4) beskrivna metoden, införes i en 0,3M natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8 och den erhållna bufferten får passera genom en jon- bytarkolonn som dessförinnan har bringats i jämvikt med en O,3M natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8. Den eluerade lösningen inställes genom tillsats av en fosfatbuffert så att natriumkloridkoncentrationen blir 0,lM och får sedan passera genom en jonbytarkolonn som dess- förinnan har bringats i jämvikt med en O,lM natriumklorid- , fosfatbuffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8 och där- efter får nämnda O,3M natriumklorid-fosfatbuffert passera genom nämnda kolonn,varefter den eluerade fraktionen uppsamlas, eventuellt koncentreras och avsalts genom dialys, ultrafilt- rering eller liknande och sedan torkas genom lyofilisering eller liknande för erhållande av en karcinostatisk substans TF_l323o Den sålunda erhållna substansen TF-1323 har egenskaperna som visas i tabell 2.

(V) Den inre lösningskomponenten som erhållits med den under (4) beskrivna metoden får passera genom en kolonn med en jonbytare som bringats i jämvikt med en\fosfatbuffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8, och en Oföm natriumklorid- fosfatbuffert med ett pH av företrädesvis ungefär 8 får passe- ra genom nämnda kolonn för tvättning av kolonnen och sedan får en O,6M natriumklorid-fosfatbuffert med ett pH av före- trädesvis ungefär 8 passera genom nämnda kolonn, eller alter- w-m-:pwu .v m» ;- . . .nw-w. 446. 406; ' 19 nativt får nämda 0,5M natriumklorid-fosfatbuffert passera “ ' genom kolonnen som har behandlats mflâdet under (ii)-2) beskriv- na förfarandet och fortfarande har kvarvarande absorberad komponent, varefter nämnda O,6M natriumklorid-fosfatbuffert får passera genom nämnda kolonn. Den eluerade fraktionen_uppsam1as, koncentreras eventuellt och avsaltas genom dialys, ultrafilt- rering eller liknande, och torkas sedan genom lyofilisering eller liknande för erhållande av en karcinostatisk substans TF-136.

Den sålunda erhållna substansen TF-136 har egenskaperna som visas-i tabell 2. (7) Uppsamling av den karcinostatiska substansen TF-l4O Bariumjoner tillsätteskulturen eller dess överflytande vätska erhållen vid den under (l) eller (2) ovan beskrivna metoden Eflwfimfi eller till den vattenlösliga fraktionen, erhållen vid den É under (3) ovan beskrivna metoden eller till lösningen erhållen genom upplösning av TF-100 i vatten, för bildning av ett bariumsalt, varefter fällningen uppsamlas och sedan blir före- mål för ett förfarande för avlägsnæmæ av barium och den vatten- lösliga fraktionen uppsamlas och blir sedan föremål för dialys eller ultrafiltrering för erhållande av'substansen TF-140.

Särskilt beskrives en vattenhaltig bariumhydroxidlösning, företrädesvis tillsättes en 0,1-O,5M vattenhaltig bariumhyd- roxidlösning till kulturen eller dess överflytande vätska E erhållen vid den under (l) eller (2) beskrivna metoden eller till den vattenlösliga fraktionen erhållen med den under (3) beskrivna metoden eller till en vattenhaltig lösning erhållen genom upplösning av TF-100 i vatten i en mängd av ungefär l0-l5 gånger mängden av TF-100 och pH hos den erhållna bland- ningen justeras företrädesvis till 10-l3 i och för bildning av ett bariumsalt. En fällning avsättes genom tillsats av en bariumhydroxidlösning och den tillsatta mängden av barium- jonerna justeras företrädesvis så att koncentrationen av de totala bariumjonerna i den slutliga volymen av blandningen blir 0,005-O,lM. Den sålunda erhållna blandningen filtreras och ett förfarande för separering av barium från det erhållna 44s'4os' ~ 20 bariumsaltet genomföres. Barium avlägsnas företrädesvis genom tillsats av bariumsalt till natriumsulfat, företrädes- vis en 5-l5%-ig vattenhaltig natriumsulfatlösning, den erhåll- na blandningen omröres och därefter filtreras den erhållna lösningen. Fällningen som har separerats och avlägsnats tvättas med en vattenhaltig natriumsulfatlösning igen och tvättvätskor- na kombineras med ovan nämnda lösning. Lösningen som erhålles utsättes för dialys, ultrafiltrering eller liknande, för av- lägsnande av överskott av natriumsulfat eller lågmolekylära substanser och den erhållna lösningen torkas sedan genom lyo- filisering eller liknande för erhållande av en karcinostatisk substans TF-l40.

Den sålunda erhållna substansen TF-140 har egenskaperna som visas i tabell 2. (8) Uppsamling av den karcinostatiska substansen TF-150 Den vattenlösliga fraktionen som erhållits med den under (3) ovan beskrivna metoden eller den inre lösningen som erhållits med den under (4) ovan beskrivna metoden behandlas med ett kvaternärt ammoniumsalt och den-bildade fällningen uppsamlas och underkastas ett upplösningsförfarande med användning av en lösning innehållande natriumklorid, varefter ett hydrofilt organiskt lösningsmedel tillsättes den lösliga fraktionen och den sålunda bildade fällningen uppsamlas och torkas för erhållande av substansen TF-150. Såsom kvaternärt ammonium- salt som kan användas kan nämnas vilket som helst komplex med en polysackarid och särskilt föredragna är cetyl-pyridi- niumklorid, cetyl-trimetylammoniumbromid, etc. Behandlingen med ett kvaternärt ammoniumsalt genomföras företrädesvis i närvaro av en buffert, såsom en boratbuffert eller liknande.

Den konkreta beskrivningen av ovan nämnda behandling med ett kvaternärt ammoniumsalt och dissociationsförfarandet med användning av en lösning innehållande natriumklorid är följande.

Exempelvis tillsättes en vattenhaltig lösning av ett kvater- närt ammoniumsalt droppvis till den vattenlösliga fraktionen som erhållits med den under (3) beskrivna metoden eller den inre lösningen som erhållits med den under (4) beskrivna lv ~~,¿;w,¿~gnl¥1lñv».,.n , . _ m ,,V,:\.,\»__, . _ _ __ {_ g \ 446'- 406 21 metoden, under upprätthållande av ett svagt basiskt pH och den erhållna blandningen omröres vid 0-50°C under lo minuter till flera timmar, varefter fällningen uppsamlas. Fällningen tvättas flera gånger med en buffert, företrädesvis en 0,l%-ig boratbuffert, innehållande O,lM natriumklorid och en liten mängd av ett kvaternärt ammoniumsalt och dissocieras sedan med en buffert, företrädesvis en O,l%-ig boratbuffert, innehållande O,5M natriumklorid och en liten mängd kvaternärt ammoniumsalt för bildning av en löslig fraktion och den lösliga fraktionens pH justeras därefter till 2-6. Ett hydrofilt organiskt lös- ningsmedel,företrädesvis en alkohol, sättes därefter till den lösliga fraktionen så attïdess koncentration slutligen blir SO-90 volymprocent, företrädesvis 70-90 volymprocent, och den sålunda erhållna blandningen får stå vid O-30°C under flera timmar till 90 timmar, varefter fällningen uppsamlas för bildning av en karcinostatisk substans TF-150.

Den sålunda erhållna substansen TF-150 har egenskaperna som yisas i tabell 2. g,¿J ;,; ¿,, *än ._ . _1L.,..." .ixïêfl i i 1 iir~,w¿i Ifialrtl) 446 406' 22 umuwfimuwwfl 500 umuwowfimum .ënomouoflx .flwmcwn .coumom .HOS |muw .fiocmuwš fl mfifiwæflø :oo =w»»~> fl mflflwmq uwsmfiflmoq cmxuw> wwcmn Imfløñfiumøsøëåw cm mflmn zoo mmßñ m0; Eocfiunmu Oman EOoumm :oo umšflu »mmm suwfiußm .uwñflu mmuwumm nuflnußm >m øwwxwbfififln wwmuøcflfi cofluxmnw mamma :MM |nw> wwcmuwflsšflumomøšñw cm www: Que mmwfi mon uæñøu mwßflomm sofifiunm >m GwuXw>HHfi# wfimuwflfifi :OfluxmHm mflflwâ CmMHw> m©GmH0A5EfiumOG5EEw Gm mums :oo wmmš mon umëøv ummu soflfi Iunm :OO Hmšßu mmuflomm nüfiflnflm >m :muXw>Haflu wømuøcwc flofiuxmnu mccwn cmxuw> xmwmoaoxmënmm N HHGDMH Hw>H5m uflsnn umm>m | ufl>wHm wwQmwmuD Ammfilhfi mmmfllhfi QNMHIMH mmmfllmñ wfimflnma Q ONHIMH Ofifllmñ OOH|mH W ;|||mmMw@mm4 vv ~ Hwmmxmcwmm .m f. \ | www-m 44 6» 40.6* 23 .%¥Ü : z OMHIMH fl~v~um> wucmu wflflëfiumocnfiëw Gm mums S00 mwmE mon nnEflu mwuwomm :Uflaunm >m : fi0UXW>HHH¥ ÜÜNHUGHS GÖHMXMHM MCGNQ OWHIHB E : WMHIMH..

I : MNmHl&B ^.muHOMv N Hflwßwß -gqug- w-fjyüfç za-gnggw. ~¿_ w J 24 446 406 “ = = nmmfilmß = = mmmfilmfi =_ = fl\\ n~mH|ma = = owmfilme Hnäu Omæ A00 OOOH|OwHH .Owwfi .OæmHIO«wH .ømmfl .Owwfi loßwfi _omm~|o@m~ .oowmsoowm >m cwumn |um= w wnmnmcofinmnownm man uwëfluuxmmm = wfimanma _ _ _ ~ HIEU Omæ G00 OOOH|OvHH OmmH!OwmH Ommfl Ovwfl |OhwH .OmmN|OwmN .OONm!OOwm >m Gwuwn |umn H mcmnmcøflumuomnm »mn wmsfluuxomu = O~H|mH = = Ofianms HIEU ONæ S00 . ooofløowfifi .o«~H .ommH|o««H .ommfi .o«wH uooo~ Hm>m ßHm>ww>m mwwmfimønwwcmm |OßwH ~OmmNtOmmN .OONm:OOmm >m Gwuwn S00 O OHH Hwmwmøfl ©w> mmflwfl Iumc w wcmnmcofiumuownm mms umåsuuxmmw lumflcmm wflmfinmn cofluxmnu mccmø Ocflamfi AH Eu. ^=wfl0umE|HmMv fiføfiflfiuxmwm EÜHUMUQMMCCHUQHOWQN UQÛHMHHÉH ^.m»Hou. N uxcømwmcfififiwwumøcww Hfimßmfi nmmm%MmWWW 446105" www 25 UOOON Hw>w vHw>wm>m mwwmamwnwwcmm A00 U OHH umwmmnfl Uw> I wflA®ÜHÜ@fi@m 0UG%Hß% COMDMNHW MCCUQ OWHINH ~ 1,1, rv., UOOw~ um>@ uum>mm>m wwømawwnwflcwm A00 U OHN uwuwmafl ©w> _. mmfiwwnmmvnßm mwmmnwm Gofluxmuw mccwfi Oefllmn.

I I Üflñlmfi .. _. mNmfiJmm.

Tmfiäë N Smnfi ~ -vfl-f-vmy - w: v _ W .w m. av» - _, -. ,, my; \ »-, wflwflw; Vw. . :JN 26 4 \ \ MH E % « » Lin!!! . Äí en oww 1 |mw~ >m awpwnuwc M :oo «.m w.m m.@m cwpsmxmaofiumuomnw mfl> |w.~ |m.« |~.mm n~mH|me en ow~ :OR É cwuwsum: H zoo wå Én män =w»:mxm=ofi»m~omnm mfl> «æ.~ «m.« |@.«m o~mH|ma aa ow~ |@m~ >m awumnuwc fi zoo >.m «.« o.«m =w»=mxw=oH»m~omnm uH> |m.« |w.m |o.om wHm~|ma n en ~>~ |æw~ >m nmpmcumc H :vc H.m m.m ~.o« awvcmxwmofiumuømnm øH> |o.~ |m.« |H.mm o~fi|ma W se ow~ |wm~ >m øwumsumc fl zoo ~.m ~.m o.H« , Gwucmxmcoflumnomnm wfi> |~.w |m.v |m~mm Ofifilmß í fis oßwloqw zoo oow|oo> .omm en owm W Ha om«|oH« zoo omm |om« .oow 1 .>.> |wm~ >~ awumsuwc H :uo ~.m ~.m ß.mm V |.>.> >m cmuwnumfi H >m Gmumsum: H Gmflcmxmcoflumuümnm wfi> |N.w |~_w |w.Om Ooanhß \ En Nw øoumš Hmâ m åä |«ømwm|=o»»=< en om~ .anv JWA øflnwmfi .wv z .w. = Aw. u xom|ø xwwmnmww ..w»Houv N Hfiwnwa |cwuum>v mnwxwmmwcofiv umuømnm uuwHO@>mHuaD . cwflHm>|mNHmcm Iumucwëwfim uwmmxmcm H Fr. < fu... 446 #06 27 en omm |mm~ >~ cwpmnuwc H :oo ~.n «.« o_«m cwunmxwaofißmuomnm ø@> |w.~ |o.« »o.Hm omfifma en oww N |mm~ >m awpwßwwn M suo m.@ m.m o.w~ nwunmxwcoflßmuomnm wfl> |o.m |o.m |o.- o«H|ma en owm -www >m cwuwnnmø M :oo H.@ o.« w_~m cwucnxmcowumuomnm ww> |O~m |~.m |m.hN wmfi|mH en ow~|mw~ >m nwuønuwa H fiwxoøm am «.m @.m «.mm _cw»cmxmaoH»m»omnm øfi> |w.~ |m.m |m.m~ -mH|ma en oæ~|oß~ >m awuwnnwc fl - Hwwuam nu ~.~ ~_m m.wm .awucmxmcoflpanownm v; .è-m :m .m .åÃm nmmfiå en ~w~ |wm~ >m nwuwnuwc fl zoo m.w H.m w.wm cwucmxmcoflumuomnm wfl> |m-w |m.m |O.æN mmmflnmfi ^.muHOwv N AHMDMH JL 2:- Hgv* ~ - ~ , 49,1, vä ». -n »wflcw amg* '_- 446 406 28 HE OmH|.>.> >ø cmuwnuw: H HE O>H|.>.> >m cmumšuwc H nmmHnmu.

.HE OwmlOmw 500 HE ONw|.>.> >m cmßmfluwc H HE O~w|.>.> >m cmuwsnw: H .oomn.>.> >m cwøwnnwc H mmm-HIPH.

HE OmH|.>.> >N GGQQSHWG H HE OmHlÅwCw >.m CQHMSHWG H QNMHIPH.

HE OwmlOwm S00 .HE OOmlOwH. G00 OmmlOvm .HE OæælONß S00 OOßIOOw Owml.>.> .rm CGHWSHWG H .Own I .>.> >d Gwuwflhmfl H ~Ovm I .>.> >ß Gwßwßnwfi H mmmfilmfi.

HE OwH HE OwH 1 .>.> >m nwumsnm: H |.>.> >m Gmvwsnw: H wHmHJHH.

.HE Owß HE Owß IONQ S00 ONmIONW ~Omm IOHm 500 OwwlOwm .Own HE mßwlmßß S00 mmm | .>.> >m :wuwßuwc H | .>.> >m cwumsnm: H | .>.> >m :mumnnmfi H ONHJHB .HE Owß .HE Owß IONW 500 ONmIONv _Ow.m 10mm 300 ONmIOHv .Oæm HE ONmIOOw S00 Oæm | .>.> >m cwumsuwc H | ,>.> >m :muwsnmfi H | .>.> >m cwuwsumc H OHHIPH.

OOHInfH w. N ES ONw w N EG Omv wouwFu Om mxcouuøm woumël Om mlHocwm En Owm xx. OON|U xwwmsmww uwmmxmcmmm Tmfioï N ïwnma m. _,._~-_,~~-~.\ .wflpmv-»v- w» ~ www:- Vuwflwww» fb nu ni 446: 29 Gcmnmcofiumuømnm umm>m fia OmfiI«>.> >fl CÜUÜSHWÉ H HE Ooøwlomæ &o0 Omæ|Omw .OOm|.>.> >m øwuwsnmc H wcmnmfiowumuownm umm>m HE OmH|.>.> >m cwuwnnmc H ...fiuøä N 33% HE OmH|OOH G00 OOH|.>.> >m cwvwßuwn H HE OOOH|OOm :UG OOm|OOm .OOm|.>.> >m Gwuwßumfi H HE Omm|Ovm >m Gwuwflnmfl H HE O$H||>|> >N GUHÜSHWG H Omfllhfi Ovfilwfi wmalhfi mmmfllmk \ »gwggv »~ ß v naffl-:wflilw 'Lwf-fif-'qvà ,_ 3G x 30 .GHE Nm C00 mmlæm .cmuc0HHmHw@wEmmGH:wmH >m cwumßuwfl H .GHE Omlmw S00 :wuc0HmwHwøwEmmGHcmmH >m nwuwsumc H nmmH|mH .QHE Nm :oo Owxom .QHE Om zoo mm .cmucouwwHwwwEmmøHnmmH bm cmuwsuw: H .øwvcOuwmHwwwEmmcHcmmH >m :mwmsuwc H mmmH|mH .QHE Nmnmw zoo mmlmm .QHE Omnæv 200 ßmnwm .nwucoummHmømEmm:HcmmH >m cøwmnumc H .flwuc0HmmHwwwEwmcHcmmH >m nwuwnuwn H n~mH|mH , .GHE mw :oo Nw .GHE mv zoo Omnæm .Om .:wuc0uwwHwømEmmuHcmæH >m cwvmsuwn H .:wu:0uwmHwømEwmcHcmmH >m cwuwsnmc H m~mH|mH ,_ .cfli Omlow :oo .GHE Ow|o« G00 cwu:0HmmHw©wEmmGHcmmH >m cwumnum: H cwucoHHmHmwmEmmcHcmmH >m cmuwnumn H wHmH|mB ¶ .fia Slå ä.. .Ena omTâ .Bo cwu:onuwHwøwEmmflH:mmH >m nmumznmc H cwucoHwwHwøwEwm:HcmmH >m cwuwnnwn H o~H|mH ._ = OHH|mB .QHE mm :oo ounwm .GHE mw :oo Owlæm .cmu:ouwmHw@mEmmcHcmæH >m cmumsuwn H .cwu:ouwmHmwmEmm=HcmmH >m cwuwauwø H OOH|mB En Own En ONN IIlbmM@&fl&fl . $i_umum0»mE0Hx|Amm uwmmxmcwmm Twfioï N ïwnma 4476 '406 31 .GHE Omlwv S00 Nm .cmunouwmHw©mEmmcHcmmH >m cwuøsnmfi H .GHE Omlæv S00 Nm .GwßG0HmmHwwmEmmGHGmwH >m Qmßmflnwfi H OmH|mH .QHE Ow|Ov ßuO” W .SME OwhOw 500 w QwuG0HwwHm©mEmmcHcm@H >m Gwnwflnmfl H , cwuC0nmmHwUmEmmcHGmmH >m Cwuwnnwfi H OvH|mH .Ewa 312 sno h . .Cia owå.. :oo owïwm .cwunoHumHw©mEmm:HcmwH >m dmvmcumß H.. U _:wud0HwmHwwmEmmcH:mmH >m Gwumsnmfl H wmHlhH w .GHE Om G00 mm .GHE Omlwv zoo wm fw .:0u:0HwmHm@wEmmcH=m®H >fl øwuwsumfl H _cmud0HwmHwUwEmm:HcmmH >m Gmuwnuwfi H mNmH|mB W ^.m#H@wv N HHwQflH W + + + + + | mwmTå.

W + + + + + I nmmTä. + + + + + l mmmTÉ.

+ + + + + I nwmfinma .w A + + + + + .. måmflàa , 2 . w .q 3 + + + + + a 221.2. + + + + + 1 37,2. , + + + + + | 27mm. fl + + + + + + ooflnmu. _ 0 Gofiuxmwu :Oflaxmwu v Ncofiuxmwn .v Ofluxmwu fiowuxmwu :Ofiuxmwu w å. ncfiomnäfison :Ümåoøcn .. om mxcouucm | ow måocwm unomflfio: .šflnumncflz u. :Ofiuxmwumumh nwmmxmfimmm W , 4 . Twfioä N Swnma . w 6 nu w 6 w 3 3 I r M + . + + + + | omfinma Y + . + + + + | oïfiä. + 1.” + + + + | wmfiumfi %. * ._ Tmfioë N Swnm s-«:xJ oåfl mo 13» 05 mo o.om wo .S3 0.2 mo wmTma M W o.~H mo flfiflv o.Hfi mo o.m~ nu Hfiflw o.mH nu m~m«|ma Y ,. v m_- mo Hflflu m.- mo m.«~ mo Hfifiv o.mH wo nmmfiama w . o.æ~ mv Hflfip o.- wo o_mm mo Hflfl» o.w~ mo mmmH|ma o_w~ nu Hñflv m.mH mo m.m« mo Hflfiu w.m~ wo n~mfi|ma W o.w~ mo fififip c.wH mo o.«w mo Hfifiu o_mm mo m~mH«ma x n o.m~ wo Hfifiu o.oH mo o_om mo HHH» o_mm wo wflmfilma o.mH mo Hfifiu o.m nu o_m> nu HHM» o_wm mo owfiama 1 au o.- nu Hfifiu o.w~ flu o.mw mo Hfifiv o_om mu ofifiuma 0. nn o.m~ mo Hfiflu o_o~ mv o.w« mo fififiu o.o« mo ooH|ma zu « N L W 1 ^wv øo»wE| om m _ ofluxmum 1 \ 4 SL wOuwñ ÉÃHPHTMHBOA mvmš »uwä Luucwm MQ: uumñ .moxøfim >m fr., , ~GMEDQHGEDHMW>HMM P0. EHOM fl HHWSQCCMCMNMOHN EHOM ...H .HHWÄÜGCHÜHHMMOMW QQMMWCÜWN _. ^.muuowv N Hflwnma w á .Ill 4426* 405 35 .MW O.vH m0 HHMM O~ß M0 O.~m mo Hawa O.mN nu ^.mvHOmv N AHOQMB 0.3 .B 33 o_o« mo o.m~ mo Hfiflu o.m mo Omfilhñ Ovfiimfi -_.e...___ 446 406 36 I tabell 2 användes för Sephadex G-50 mäfldzned ”x” en 55 mmø x 600 mm-kolonn och destillerat vatten såsom eluent; för sepha- dex G-200 (registrerat varumärke för Pharmacia Co., Ltd.) märkt med "xx" användes en kolonn med 44 mmø x 500 mm för TF-ll0, 120, l32a, l33a, 136 och l40 och en kolonn med 21 mmø x 400 mm för TF-1316, l32b, l33b, 1323 och 150, och såsom eluent an- vändes en 0,lM fosfatbuffert med ett pH av 7 för alla före- ningarna och för erhållande av HPL-kromatogrammet "xxx" an- vändes 2 kolonner med 7,9 mmø x 600 mmned TSK-GEL G30OSW (varmärke för Toyo Soda Co., Ltd.) och elueringen genomfördes vid rumstemperatur vid en flödeshastighet av 0,8 ml/min. med användning av 0,lM fosfatbuffert med ett pH av 7 såsom eluent.

De farmakologiska aktiviteterna hos föreliggande karcino- statiska substanser TF-100, TF-110, TF~l20, TF-l3l6, TF-l32a, TF-l32b, TF-133a, TF-l33b, TF-l323, TF-140 och TF-150 är följande: (I) TF-substansernas effekt på cellivsdugligheten (Colony- forming Assay) Baserat på metoden av Kim. J.H. et al. (Cancer Res. gå, 698 (1965)), odlades HeLa S-3-celler i Eagles MEM utökade med 10 % kalvserum under 3-5 dagar vid 37°C, C02-inkubator, varefter odlingen avlägsnades och en PBS(-)-lösning (en vattenhaltig lösning innehållande 8,0 g/l natriumklorid, 0,2 g/l kaliumklorid, l,l5 g/l natriumfosfat, monobasisk och 0,2 g/l kaliumfosfat, dibasisk) innehållande 0,01 viktpro- cent etylendiamintetraättiksyra och 0,l viktprocent trypsin sattes till de till glas häftande cellerna. Cellerna drogs av från glasytan på odlingsflaskan och upplöstes till en- skilda celler genom pipettering och därefter räknades cellerna under mikroskop. Cellsuspensionen utspäddes med Eagles MEM utökat med 20 % kalvserum så att det kan innehålla 200 cel- ler per ml. Efter det att l ml av cellsuspensionen hade in- okulerats i Petriskålar och odlats i en C02-inkubator vid 37°C under 24 timmar sattes den överflytande vätskan, erhållen enligt exempel l (l) i det följande, till cellsuspension så ß 4 IL ¿,.___. x “l 41l6*'4{l6 37 att koncentrationen blev 1/16 till l/128. Till varje l-ml- portion av cellsuspensionen odlad vid 37°C under 24 timmar sattes var och en av testsubstanserna och HeLa-cellerna , odlades under 7 dagar. Efter odlingen avlägsnades l 4 odlingsmediet, varefter odlingsskålen tvättades med Hanks lös- I Ä ning och cellerna fixerades med 70 viktprocent etanol och tvät- tades sedan med 100 viktprocent etanol. Efter det att etanolen hade avlägsnats färgades cellerna med en "Gimsa"-färgningslös- ning, varefter kolonierna räknades och cellivsdugligheten beräknades.

Resultaten vises 1 tabellerna 3 een 4. ceuivšdugfigneten i tabellerna beräknades med hjälp av följande ekvation. Cell- livsdugligneten för varje provsubstans är ett medelvärde av 5 försök.

Antal kolonier i en behandlad Cellivsduglighet = grupp X 190 Antal kolonier i en obehandlad QIUPP :L j, f w oofi oofi oofi HHo»»aox o \ o o wH\fi o o o ~m\H w.m m.ß o.om «@\~ «_ow «_wo o.mß w~H\H uwsefiu om Hmeefi» Nß flmaefiu fiwo »w:wfiHm:om>«HHwo 446 '406 ^HE\Ha. mnflsowmmuo m fiflwflwñ \ :muwnmflflmøwmšflfiflwo mm uxwwmw mcmxmuw> wøcmuäfiwuïfw :m0 Uv-Wfm.. .,,. 1,, , 39 Taßell 4 TF-substansernas effekt på cellivsdugligheten Substans Koncentration Cellivsduglighet Mig/ml) _ (%) TF-lOO 1.0 99,4 50 97,4 100 95,9 TF-110 10 94,5 50 88,9 100 ' 87,3 TF-120 10 98,8 50 ' 91,2 100 8 83,3 TF-l32a 10 96,7 5 97,4 100 ' 95,9 'rr-lasa lo \ 96,9 50 95,4 100 88,8 TF-136 10 95,9 50 96,4 100 95,4 TF-140 10 98,5 50 98,6 100 98,6 200 96,8 500 93,4 .vw 446 406 40 såsom framgår av dessa experiment har TF-substanserna enligt uppfinningen mycket låg cytoxidal effekt på HeLa-celler jämfört med den överflytande vätskan. {Üä~ (II) Immunostimulerande effekt _ ag; Fyra möss av rasen ICR användes för varje grupp. Var och en m *ü av testsubstanserna upplöstes i 0,2 ml av en fysiologisk salt- lösning och administrerades därefter intraperitonealt på mössen. 24 timmar efter administrationen injicerades 0,2 ml av en kolsuspension framställd genom blandning av l ml av Perikan Drawing Ink l7 Black (framställd av Günther-Wagner Co., Ltd.) och 2 ml av en fysiologisk saltlösning innehållande 3 viktprocent gelatin injicerades intravenöst i mussvansen och l, 5, lo och 15 minuter efter injektionen uppsamlades 0,02 ml blod från banan med användning av en hematokritkapillär belagd med heparin och utspäddes och hemolyserades omedelbart ' med 1,6 ml av en O,l viktprocentig vattenhaltig natriumkarbo- Denna suspension var föremål för kolorimetrisk natlösning. bestämning vid 675 nm och det fagocytotiska indexet, dvs.

K-värdet, bestämdes med Halperns et al ekvation.

På mössen i kontrollgruppen administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning. log Co - log C K: t-to vari Co = kolpulverinnehållet i blodet vid tiden to och C = kolpulverinnehållet i blodet vid tiden t.

Resultaten visas i tabellerna 5 till 7. »_- V .k fin, H L---- il* ->44sf4o6 41 Tabell s Dos Medeltalet av K-värdena Substans (mg/Kg) TF_l0o 10 o.o85l-1 o¿o1u5 50 ' o.o6o5 = o.o3o2 TF_ll0 5 0.o9o1 : o.o213 20 o.1o25 : o.oo25 TF_l¿o 5 o.o718 1 o.o152 20 o.0559 1 o.o197 dmflü ao o.1oo1 1 o.o2u6 ïå TF_l32a 5 o.11o2 1 o.o2o3 Éå 20 o.o8a9 : o;o296 Lflwfln TF_l33a 5_ o.o851 2 0.005? 20 0.o769 1 o.o17u 1222136 5 o.o959 i o.ooa1 20 0.102? r. 0.0l5¿l K°ntr°1l - o.o3oo 5 o.oo2u Tabell 6 %¿ “_ f Substans Dos 'Medeltalet av K-värdsna ' ams/Ks) 20 o.1o73 s o.oo31 TF_l33b 5 o.o55o = o.oo2o ni 20 o.1o99 : 0.oo75 g yi TF_l5O 5 o.1399 = o.oo11 ¿§ ao 9.057? 2 o.oo98 *% TF_l323 5 o.1uoo : c.oo75 “ 20 o.o685 : o.o126 Küntroll _ J”. v.. f w WH ”' "' 'z 4 446 406 42 Tabell 7 Substans Dos _ Medeltalet av K-värdena (ms/Ks) l 0.089l : 0.0l56 4 W gg TF-140 5 o.o9u6 x o.o139 6 Ü ia 20 o.o815 1 o.o2oo 1 Q ' à K°fltr°1l - o.o379 = o.oou8 *M i Såsom framgår av tabellerna 5 till 7 visade grupperna till * vilka var och en av TF-substanserna enligt uppfinningen hade administrerats aktivering av retikuloendotelial makrofagas IÄ 4:1 Vw* jämfört med kontrollgruppen och den cellulära immuniteten hos den normala musen ökades.

(IIl) Karcinostatisk aktivitet (a) Antitumöraktivitet gentemot Ehrlich ascites tumör Ehrlich ascites tumörceller inokulerades intraperitonealt på möss av stammen ICR (honor, 6 veckor gamla) i en mängd av l x lO5 celler per mus. Därefter upplöstes var och en av testsubstanserna i 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning och administrerades sedan intraperitonealt på mössen en gång om dagen upprepat under 7 dagar från första dagen efter inokule- = ringen av tumörcellerna, eller en gång dagligen på första É dagen och från tredje dagen till sjunde dagen under totalt 6 dagar. När det gäller testsubstanserna i tabell 9 admini- strerades var och en av dem på nßssen en gång dagligen på första dagen och från tredje dagen till sjunde dagen under totalt 6 dagar efter inckuleringen av tumörcellerna. På kontrollgruppen administrerades 0,2 ml av en fysiologisk salt- ¿ e '.\ lösning på samma sätt som angivits ovan. 14 Resultaten visas i tabellerna 8 och 9.

T/C = Antal överlevnadsdagar för möss i en grupp På vilken substansen administrerats x 100 (%) Antal överlevnadsdagar för möss i kontroll- gruppen l!:!IJ .ßv nu in .Av av 43 w \ c oofl ~.m H N.>H I m \ m NNHA æ.m w w.mN^ m x oa H* @ \ 2 @~@ H æuæNÅ © vn @ w \ m =mH^ w.w H m.æN^ m x fi . m \ o cofi N.w M m.>fl | w \ H mmH^ æ.æ « m.m~^ w x OH fiß m \ 0 wofi ~.= M m.wH W x m mmmfi ha w \ H , HWHA æ.> u æ.om^ w x a : \ o oofi w.m fi æ.>H I Hm = \ N mmfi^ w.m H m.>m^ m x om omfinma _ = \ N =mH^ m.m « m.-^ m x øfl m \ o oofi m.H H æ.wH I H* m \ m mmH^ m.~ ü m.~m^ w x om oHH|@a m \ N m=fi^ o.oH H o.=~^ m x ca Hm Qm \ o oofi m.H M w.æH 1 ooflnma W om \ m Nwf fw fi fo? N x S. mwmñ mmm» w©cm>mH fiuv finmmmwv ummmwmvmn Anmmnfinwnumflflfišwm nmwu Hmuc< |Hm>m fimucdx o\B |>wHu®>w Hmufiwømí uwflmunm N mx\mEv mon mcmumnflw uw Hfiwnma In|íl| .IJ -Aw-xq» p _ .~ ~ WW »,»»¿«;.-;~@u~ 44 446 406 mGHwHHwUHmE:u >m cm:OHumvnmHmwQmuv Hwuww nwmmw wuøw :mv mm cwmGHcEßflwm Nx mGumHHwUHmEøu >m cmCoHumv:mHmmGmu# Hwvum cwmmw wflmm :mv mm :wmGHCE@fimm Hx wwmumuøx uHws um> :oo mwuH0wm cwmcw mums wU:m>wHum>m mHH< x ".¿d4 QH \ o ooH H.H H o.~H I oH \ m oom^ o.HH H o.=m^ N x oH N* \ æ ßvM M _~.®MÅ N un .Å- oH \ z Ü? æóH H =á~^ w. x H m \ o ooH m.~ H æ.æH I N* m \ N mmH^ m.oH H æ.=m^ m x oH nmmH|m& w \ m . wSx H.~H M mi? w x w m \ H æmH^ m.HH H o.=m^ m x H m \ o ooH w.m w æ.æH | N* m \ z mHm^ m.: H o.o=^ w x oH nmmH|mB m \ m wwHA æá H o.mm^ w x m z \ c ooH m.H x m.>H | H* = x N å? ~.HH x mä? w x øoH wHmTmH.

= \ Q SH NA fl .ämm w x ww w \ o ooH m.~ H w.>H | w x H w=H^ m5 fl o.w~^ w x oH w H* w .x m E? wß fl WOT w x m wmTâ. w \ H :m7 ww q. Hñmmx w x H . Twfioä w HHwnm ,,.,.A. 446H406'* 45 QUNHWHÜX UHOS .HNP S00 WÜUHMUWN CQUCfi Ümvflfl ÜÜCM>ÜHHO>Ü NHHÉ un u .å m Hfiwflmfi m \ o oofi m.H fl N.mH I m \ m mæHA o M o.mm^ w x om m \ m å? f.. M OxNmA w x 2 Qflnä. m \ m mm? .im fl m6? w x m ma \ o oofi :.m w m.mH I m \ = æ~HA æ.=H H :.æw^ m x om mn \ m wmH^ >.m n m.Hm^ m x m ozfilmß ofi \ = o>fi^ m.w H o.wN^ m x H m \ N 3.7 m6 fl ma? m x m6 ñümmmw MwWm.mwä mmmä wflmu mw:m>wH Anv ñmmflv ummmwmflmfi fiummflfiumuumflcflñwm |mmu amucd 1um>m fimufld K o\B |>wHum>m Hmufimwwä uwfimucm N mx\mEv mon mcmumndm _\ J... 446f~4B6 '- 46 Såsom framgår av tabellerna 8 och 9 blev effekten på gruppen som hade administrerats med var och en av TF-substanserna enligt uppfinningen en förlängning av livet, jämfört med kontroll- gruppen. (b) Antitumöraktivitet mot Ehrlich fasttumör (l) Ehrlich tumörceller transplanterades subkutant i armhålan på möss av stammen ICR (honor, 6 veckor gamla) i en mängd av 4 x 106 celler per mus. Därefter administrerades var och en av testsubstanserna på mössen en gång om dagen upprepat under 7 dagar från första dagen efter transplantationen av tumör- cellerna, eller en gång om dagen från första dagen och från den tredje dagen till den sjunde dagen under totalt 6 dagar.

På kontrollgruppen administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning på samma sätt som beskrivits ovan. Tumörernas M vikt bestämdes på 11:e eller 14:e dagen efter transplanta- 'ÄÜ tionen av tumörcellerna. Tumörernas vikt bestämdes genom mät- ning av den största diametern (a) mm och den minsta diametern (b) mm med hjälp av skjutmått och beräknades med hjälp av Å 3 följande ekvation: 2 b a ä (m9) Tumörvikt = Resultaten visas l tabell 10. .-m“@“ n.T P ' w mm *+vwwWfl~- -44-6' _4106 41 kt \nÅ ur Åmmrr: RÅ- QQH @o.m 1 == oø.= w H oH N* Qw °=.m w x m »Hmwno»HHwmmH»=H nmmH|ma HH @=.w W H H .

OCH. w0.m | w: ~m.: w H CH N* == @o.= . m H m »mmaw>wu»aH nNmH|ma Nm Hw.m w x H OCH ==.m 1 H* m= ~m.H w H QH uHmw=o»HHwmmHu=H mHmH|me mh m@.~ w x N OCH =m.m | HN mH.H w H OQH Hcwfløxnsm Hm mm wm.H w X oofi uHmwG0uHnwmmHucH oofilmü .HN mHffl W N Om UMÛGmXwNHHÉH Anv Åwv Aummifluwnumflcfläwm u\e »HH>Hwøwa|HweøH HwHmu:~ » mH\mav men »»wwmm=H»mH»wHcHew< wnmuwnnm OH Hflwßmfi WH- fluïwf mcnmfiflwunwëøv >m cwcoflumucmfimmfimuu umumw cwmmfi wuwa Cwß mm uäwummm NM mcuwfifiwunwåøu >m cwcofiumucmfimmcmuv uwumw :wmmw mÄH :mv mm uëwumwm HN . .š i: âa 1 m å oflm w x 3 m* o: Hw.m m x m vmmflwawnudH nmmalmm. wm mm.m w x H _ 03 . mwd | _ ._ x 3 Sá w x 3 »mocmšmguøfi wmfi .É m... . .. l mm ææ z w x m 1 ...u ä mms w x H 4 6 oOH mm.w I q 4 Nm æm :Ûm w x on ufimmcOßflnwmmuflflH mmmfllmm. 4 N.. Efim N .. m F Ümuuowv OH Hfiwnmfi x L..l_____, 446-406 f- 49 (2) Ehrlich tumörceller transplanterades subkutant i armhålan på möss av stammen ICR (honor, 6 veckor gamla) i en mänrd av 4 x 106 celler per mus. Därefter administrerades var och en av testsubstanserna på mössen uppdelade i grupper för intra- venös'administrering, intraperitoneal administrering, sub- kutan administrering och intramuskulär administrering, i en dos av 10 mg/kg eller 20 mg/kg en gång om dagen på första dagen och från den 3:e dagen till den 7:e dagen under totalt 6 dagar efter transplantationen av tumörcellerna. På kontrollgruppen administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning på samma sätt som ovan. Tumörernas vikt bestämdes på l3:e dagen efter transplantationen av tumörcellerna.

Resultaten visas i tabell ll. Ü www -» 50 oofi | | m.. ow wm OH ßHmHDxwfl8MHßGH A: om Hm OH »=m»:xn=w mmmfilms wm om oz ofi #Hmm=OuflHmmMHuGH ww CN mw OH ummGm>muucH oofl I >= QH ßmmcw>m~»=H mwmfllmæ o\B uxH>Hm©mE|HmE§B ^wx\m%% |mmGflH®HßmHGfl%mw mcmumfløm ~H Hfiwmmm 51 Såsom framgår av tabellerna 10 och ll kan en tumörtillväxt- förhindrande effekt observeras hos grupperna På vilka var och en av TF-substanserna enligt uppfinningen administrerats. (c) Antitumöraktivitet mot Sarcom-180 karcinom Sarcom-180 karcinom transplanterades intraperitonealt På möss av stammen ICR (honor, 6 veckor gamla) i en mängd av l x lO5 celler per mus. Därefter administrerades intraperi- tonealt var och en av tcstsubstanserna på mössen i en dos av 1 mg/kg, 5 mg/kg eller lO mg/kg en gång om dagen från första dagen till sjunde dagen upprepat under totalt 7 dagar efter transplantationen av tumörcellerna, eller en gång om dagen på första dagen och från tredje dagen till sjunde dagen under totalt 6 dagar. På kontrollgruppen administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning på samma sätt som angivits ovan.

Resultaten visas i tabell 12. 446-406 52 HO , H . »mama - V = ü H OH \ O OOH m.m H O.=H | v N* O \ O OOOA O H O.~=^ O H O O~mH|ma O \ O OOHA O H O.~=^ O H OH A O \ O OOH ~.OH | O \ N OOHA _O.O~^ O x H H* O \ m OOHA m.>N^ O H O OOmH|O@ O \ m OOHA ~.Om^ O x OH .

O O \ O OOH N.OH | O \ H NHHA O.H~^ O x H H* O \ m OOHA O.-^ O x O OmmH|Oa O O \ O OOHA m.Om^ O x OH O \ O OOH ~.OH 1 Hm O \ O HHH m.H~ O H H ONmH=Oe O O \ H OHHA ~.-^ O x O O \ N OOHA O.O~^ O H OH mwmE wflmu wfiflmfimfl fixv Ammmö Hmmmfl ummcfluwnuwflnfiäflm H, ummu Hmucê numïw Hmufid x U\_H_ |m©m=>wHHw>w HmßHwuwfi uwHmucm N mvïmëv mOQ wumumnflm V NH HHOQOB w w dann' f446<4D6 53 QUMHNHDM ßUMÜCWUWHHÜN NWUCNPÜHHÜ>Û ÜÜ HN? NN .S00 .Hun H mšHmHHwuHæEflu Em cmcofiumucmfiwmcmnß .Hwuum cmmmfl wflcw mm cmhflwcfimøwm NK mcHwHHmoHmEøv >m cwaoHumvsmHmmcmuu .Hwuwm cwmmø wumm .mm cgflficñwøwm .HK 25.4 m \ O OOH m.~ H O.=H | N* m \ H NHHA m.~H H w.=~^ O H H OmH«Oa m \ H HHNA 0.0 H 0.0m^ O H m OH \ O OOH m.~ H m.=H | H* OH \ H OHNA m.O H m.Om^ H x H OHmH|ma OH \ m HONA m.HH H 0.0~^ H x m H \ O OOH O.m H O.mH | N» H \ O OONA O.m H ~m^ H x H H~mH|ma H \ O OONA w.O H =m^ > x m mH \ O OOH m.m H O.=H 1 OH \ H OONA m.O H m.>m^ O x H N* OH \ OH OONA O H O.O=^ N x m OmmH|Oæ OH \ OH OONA O H 0.0=^ > K OH *Üfif 446 406 54 Såsom framgår av tabell l2 hade grupperna på vilka var och en av TF-substanserna enligt uppfinningen hade administrerats antitumöraktivitet, jämfört med kontrollgruppen. (d) Antitumöraktivitet mot B-16 melanom (1) B-l6 melanom-tumörceller transplanterades subkutant i arm- hâlan på möss av stammen BDFI (hanar, 7 veckor gamla) i en mängd av l x lO6 celler per mus. Därefter administrerades intraperitonealt substansen TF-l33a på mössen i en dos av 5 mg/kg eller 10 mg/kg en gång om dagen på första dagen och från den tredje dagen till den sjunde dagen under totalt 6 dagar efter transplantationen av tumörcellerna. Pâ samma sätt som angivits ovan behandlades kontrollgruppen med 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning och gruppen för 5-FU-tillförsel behandlades med 20 mg/kg 5-FU.

Resultaten visas i tabell 13.

Tabell 13 Substans Dos (mg/kg x antalet Tumörmedelvikt T/C (%) administreringar) (g) TF-l33a 5 x 6 4,07 70 io x 6 2,52 i 43 5-FU 20 x 6 4,21 72 Kontroll - 5,84 100 Såsom framgår av tabell 13 hade grupperna på vilka substan- sen TF-l33a hade administrerats en uppenbar tumörtillväxt- förhindrande aktivitet jämfört med kontrollgruppen och grupper- na på vilka var och en av R mg/kg och 10 mg/kg av substansen TF-l33a hade administrerats uppvisade liknande och mer anmärk- ningsvärd tumörtillväxt-förhindrande aktivitet, jämfört med gruppen på vilken 5-FU hade administrerats. (2) Transplantationen av B-l6 melanom-tumörceller och admini- Û 446-406- 55 streringen av substanserna TF-l32a, TF-l33a, 5-FU och en fysio- logisk saltlösning genomfördes på samma sätt som angivits ovan under (l). Pâ den 2l:a dagen efter transplantationen av tumör- cellerna obducerades mössen och metastaser av melanom-tumör- cellerna observerades på lungorna.

Resultaten visas i tabell 14.

Tabell 14 Substans Dos (mg/kg x antalet Medelantal Förhindrande av administreringar) metastaser bildning av meta- staser i procent (%) TF-l32a 5 x 6 l6,0 48 l0 x 6 9,86 69 TF-l33a 5 x 6 9,3 70 10 x 6 6,7 78 5-FU 20 x 6 24,8 20 Kontroll - 31,0 O Såsom framgår av tabell 14, i grupperna på vilka var och en av substanserna TF-l32a och TF-l33a hade administrerats, hade metastaserna av B-16 melanom-tumörcellerna anmärkningsvärt förhindrats jämfört med gruppen på vilken 5-FU hade admini- Strerâtå ß (IV) Akut toxicitet LDSO för möss är såsom visas i tabell 15. 14 -v Lim ' 56 Tabell 15 substans Administreringssätt LDSO (mg/kg L m TF-100 Intraperitonealt 500 3 TF-110 Intravenöst )25O Intraperitonealt >lOOO TF-120 Intravenöst )250 Intraperitíbnealt >l0O0 TF-l32a Intravenöst 300 Intraperitonealt >500 TF-l33a Intravenöst 300 Intraperitonealt >50O TF-l36a Intravenöst 300 glntraperitonealt )5OO TF-l32b Intravenöst )lO0 TF-l33b Intravenöst )2OO TF-140 Intravenöst 7100 TF-150 Intravenöst >2OO TF-1323 Intravenöst >2OO TF-1316 Intravenöst >2OO Såsom framgår av ovannämnda farmakologiska experiment är TF-substanserna enligt föreliggande uppfinning användbara Å såsom karcinostatiska medel och kan förväntas ha inverkan på “h olika cancersjukdomar och kan även förväntas ha avsevärd ver- kan mot särskilt fast cancer. Alla TF-substanser enligt före- liggande uppfinning har utmärkt effekt även om TF-substansen 130, särskilt l32a, l32b, l33a, l33b och 1323 föredrages av olika skäl. nas. 40-6 57 TF-substanserna enligt uppfinningen kan användas efter över- föring till olika farmaceutiska former, såsom orala droger, injektioner, suppositorier eller liknande, även om de användes företrädesvis i form av injektioner. När de användes såsom orala droger kan de orala drogerna innehålla olika excipienter, och kan formas till kapslar, tabletter, pulver eller granuler.

När de användes i form av injektionslösningar kan dessa vara avsedda för subkutana injektioner, intramuskulära injektioner och intravenös injektioner och de användes i form av en suspen- sion, en lösning eller ett pulver, vilket upplöses vid använd- ningen. Injektionslösningarna kan innehålla ett lokalanestetika.

Doseringen av TF-substanserna enligt uppfinningen bestämmes med hänsyn till patienten, även om det i allmänhet är önsk- värt att administrera dem i en dos för en vuxen av 0,01 till 50 mg/kg en gång om dagen eller flera gånger om dagen och vad beträffar administreringsmetoden, administreras de företrädes- vis subkutant, intramuskulärt eller intravenöst eller i form av en injektion direkt in i den angripna delen.

Uppfinningen beskrives ytterligare nedan i exemplen och de bifogade ritningarna, i vilka figur l visar ett mikroskopfoto av Fusobacterium nucleatum TF-031, använd enligt uppfinningen, figur 2 visar ett infraröd-absorptionsspektrum av den karcino- statiska substansen TF-lOO; figur 3 visar ett ultraviolett- absorptionspektrum av nämnda substans; figur 4 visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans underkastas gel- filtrering med användning av Sephadex G-50; figur 5 visar ett HPL-kromatogram; figur 6 visar ett infraröd-absorptions- spektrum av den karcinostatlska substansen TF-llO; figur 7 visar ett ultraviolett-absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 8 visar ett elutionsmönstflr erhållet när nämnda sub- stans underkastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur 9 visar ett HPL-kromatogram av nämnda substans; figur lO visar ett infraröd-absorptionsspektrum av den karcino- statiska substansen TF-l20; figur ll visar ett ultraviolett- absorptionsspektrum av nämnda substans; figur l2 visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans-unde:kastas 446 4osf i _ 58 gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur 13 visar ett HPL-kromatogram av nämnda substans; figur 14 visar ett infraröd-absorptionsspektrum av den karcinostatiska sub- stansen TF-1316; figur 15 visar ett ultravio1ett-absorptions- spektrum av nämnda substans; figur 16 visar ett elutionsmön- ster erhållet när nämnda substans underkastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur 17 visar ett HPL- kromatogram av nämnda substans; figur 18 visar ett infraröd- absorptionsspektrum av den karcinostatiska substansen TF-132a; figur 19 visar ett ultraviolett-abserptionsspektrum av nämnda substans; figur 20 visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans underkastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur 21 visar ett HPL-kromatogram av nämnda substans; figur 22 visar ett infraröd-absorptionsspektrum av den karcinostatiska substansen TF-l32b; figur 23 visar ett ultraviolett-absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 24 visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans underkastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur 25 visar ett HPL-kromatogram av nämnda substans; figur 26 visar ett infraröd-absorptionsspwktrum av den karcinosta- tiska substansen TF-l33a; figur 27 visar ett ultraviolett- absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 28 visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans underkastas gel- filtrering med användning av Sephadex G-200; figur 29 visar ett HPL-kromatogram av nämnda substans; figur 30 visar ett infraröd-abøerptionuspektrum av den kareinoststinka nubntanlen TF-l33b; figur 31 visar ett ultraviolett-absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 32 visar ett elutionsmönster er- hållet när nämnda substans underkastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur 33 visar ett HPL-kromato- gram av nämnda substans; figur 34 visar ett infraröd-absorp- tionsspektrum av den karcinostatiska substansen TF-1323; figur 35 visar ett ultraviolett-absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 36 visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans underkastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur 37 visar ett HPL-kromatogram av nämnda substans; figur 38 visar ett infraröd-absorptionsspektrum av den karcinostatiska substansen TF-136; figur 39 visar ett ;;aÉ; .wis_à -bvfïä F” Å ~ tränings. _ 446.1, 406» 59 ultraviolett-absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 40 fl visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans under- L ¿fi kastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; figur H? 41 visar ett HPL-kromatogram av nämnda substans; figur 42 visar 5 ett infraröd-absorptionsspektrum av den karcinostatiska sub- stansen TF-140; figur 43 visar ett ultraviolett-absorptions- figur 44 visar ett elutionsmönster __; _ 4 spektrum av nämnda substans; erhållet när nämnda substans underkastas gelfiltrering med användningav Sephadex G-200; och figur 45 visar ett HPL- kromatogram av nämnda substans; figur 46 visar ett infraröd-s absorptionsspektrum av den karcinostatiska substansen TF-l50; figur 47 visar ett ultraviolett-absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 48 visar ett elutionsmönster erhållet när nämnda substans underkastas gelfiltrering med användning av Sephadex G-200; och figur 49 visar ett HPL-kromatogram av šš nämnda substans.

Exemgel 1. (l) Till vardera av femton 2-liters odlingsflaskor, var och en utrustad med skruvkork, sattes 2 liter av ett kulturmedium, innehållande 34 g tryptikaspepton, 6 g fytonpepton, 20 g pro- teospepton, 70 g hjärn/hjärt-infusion, 6 g jästextrakt, 15 g natriumklorid, l2 g glukos, 10 g laktos, 0,5 g L-cystin, 0,2 g natriumsulfit, l,0 g natriumtioglykolat och l,4 g agar och ¿¿g pH i kulturmediet justerades till 7. Kulturmediet sterilisera- byt des under 1,2 atm vid l20°C under 15 minuter, värmdes i kokande .Ä vattenbad under 20 minuter och kyldes därefter omedelbart i vatten, varefter en förkulturlösning av Fusobacterium nuclea- tum TF-031, tidigare framställt genom odling i ett odlings- medium med samma sammansättning som ovan, inokulerades i ovannämnda vattenkylda odlingsmedium under sterila betingelser i en mängd av 100 ml per odlingsflaska och underkastades en stabil odling i en inkubator vid 37°C under 48 timmar. Efter .sig fšfïâ ~ *_ _;_¿__, avslutning av odlingen centrifugerades kulturen för av- É lägsning av organismer vid 4000 varv/minut vid 5°C under 20 minuter. Mängden överflytande vätska som erhölls var ungefär 27 liter. 1 446 ms e, 60 (2) Till den överflytande vätskan som erhölls under (l) ovan sattes 40 liter etanol under omröring vid 5°C och den erhållna blandningen fick stå vid låg temperatur tills den amorfa fäll- ningen hade satt sig fullständigt. Därefter centrifugerades blandningen vid 6000 varv/minut vid 5°C under 15 minuter och fällningen uppsamlades, tvättades med etanol och torkades under reducerat tryck för erhållande av ungefär 60 g av det råa pulvret. (3) I 120 ml vatten upplöstes @0pg av det råa pulvret erhållet enligt (2) ovan och de i vatten olösliga materialen som bilda- des avlägsnades genom centrifugering vid 7500 varv/minut under l0 minuter, varefter den vattenlösliga fraktionen som erhölls kombinerades med tvättvätskorna, som erhölls genom tvättning av det vattenolösliga materialet två gånger med 60 ml-portioner av vatten och den erhållna lösningen torka- des under reducerat tryck för erhållfinäe av 14 g gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-100.

Exempel 2.

Lösningen beskriven i exempel l-(3) och framställd genom kombinering av den vattenlösliga fraktionen fri från vatten- olösliga material, med tvättvätskorna erhållna genom tvättning av de vattenolösliga substanserna underkastades ultrafiltre- ring med användning av ett ultrafiltreringssystem av hålfiber- typ (membran nr. HI-1: framställt av Asahi Kasei Kogyo Kabu- shiki Kaisha) och den inre lösningen underkastades lyofili- sering för bildning av l0 g gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-ll0. ' Exempel 3.

I en liten mängd vatten upplöstes l0 g av pulvret erhållet enligt exempel 2 och den erhållna lösningen tillfördes en kolonn packad med dietylaminoetyl-Sephadex A-50 ekvilibrerad med en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 8 och den eluerade lösningen uppsamlades. Därefter fick 2,5 liter av samma fos- tatbußfcrt iom ovan passera genom kolonnen och den eluerade lösningen som erhölls kombinerades med den tidigare uppsamlade 61 eluerade lösningen, varefter den erhållna lösningen avsaltades un- der användning av ett ultrafiltreringssystem av hålfibertyp (membran nr. HI-l), koncentrerades under reducerat tryck och underkastades sedan lyofilisering förerhâlumde av 470 mg grå- vitt till svagt brunt pulver av substansen TF-120.

Exemgel 4.

I 24 ml vatten upplöstes 2 g av pulvret erhållet enligt exemel l-(2) och de i vatten olösliga substanserna avlägsnades genom centrifugering vid 7500 varv/minut under 10 minuter. ,v¶ Den vattenlösliga fraktionen dialyserades över natten mot destiilerat vatten vid 5°C med användning av en cellofantub och den inre lösningen koncentrerades under reducerat tryck.

Den koncentrerade lösningen tillfördes därefter en kolonn, packad med 150 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 8 och kolonnen tvättades genom att 600 ml av en 0,C25M fosfat* “fort med ctt pä av 8 och därefter en 0,025M uu an. fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,6M och ett pH av 8, fick passera genom kolonnen för erhållande av ett eluat. Eluatet koncentrerades under reducerat tryck till ungefär 100 ml, dialyserades mot destillerat vatten vid 5°C, koncentrerades åter under reducerat tryck, avsaltades med användning av en kolonn av Sephadex G-25 och underkastades sedan lyofilisering för erhäüande av 470 mg av en gråvit till svagt brun substans TF-1316.

Exemgel 5.

Lösningen beskriven i exempel l-(3) och framställd genom kombinering av den vattenlösliga fraktionen fri från i vatten olösliga substanser och tvättvätskorna erhållna genom tvätt- ning av de vattenolösliga substanserna, dialyserades över natten mot destillerat vatten vid 5°C med användning av en cellofantub och den inre lösningen koncentrerades under redu- cerat tryck. Den koncentrerade lösningen tillfördes sedan en kolonn packad med 50 g dietylaminoetyl-Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 8, och 2 liter av en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 446 cos: e -e 62 8 och 2,5 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumklo- ation av 0,lM och ett pH av 8, vilka efter varandra varefter 2,5 liter av en ridkoncentr hade fått passera genom kolonnen, 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,2M och ett pH av 8 fick passera genom kolonnen för att eluera den aktiva substansen adsorberad i kolonnen och den eluerade lösningen som erhölls avsaltades med användning av ett ultra- filtreringssystem av hâlfibertyp (membran nr: HI-l) och under- kastades därefter lyofilisering för erhållande av 600 mg av ett gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-l32a.

Exempel 6.

I 1,2 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumklorid- koncentration av O,3M och ett pH av 8 löstes 44,2 g av pulvret erhållet enligt exempel l-(2) och de suspenderade olösliga substanserna avlägsnades genom filtrering med användning av Hyflo Super Cel, varefter det erhållna filtratet tillfördes en kolonn med 33 cm diameter packad med 500 ml dietylamino- ' etyl-Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvilibrerats med E en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och ett pH av 8 och den eluerade lösningen tillvaratogs.

Kolonnen tvättades med en 0,025M fosfatbuffert med en natrium- kloridkoncentration av 0,3M och ett pH av 8 och tvättvätskorna kombinerades med den ovan nämnda eluerade lösningen för erhål- lflfiæ av l,67 liter av en lösning. Lösningen tillfördes åter en kolonn med 8 cm diameter packad med 400 ml dietylamino- etyl-sephadex A-40, som tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,3M och ett pH av 8 för æfifilhnfik av 1,68 liter av en eluerad lös- ning. Kolonnen tvättades med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och ett pH av 8 för 6Ihål“ 4 lwfiß av 1,64 liter tvättvätskor. Den eluerade lösningen och tvättvätskorna kombinerades och en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av a tillsattes för erhållande av 4,98 liter av en 0,025 M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,2M och ett pH av 8. Den så erhållna buffertlösningen tillfördes en kolonn med 8 cm diameter packad med 500 ml dietylamino- etyl-Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvilibrerats med šigl J; .hk 1I\ Ju (Z) Ch 63 en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,2M och ett pH av 8 och kolonnen tvättades med 2 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av v en lösning framställd 0,2M och ett pH av 8. Till 7 liter a genom kombinering av tvättvätskorna och den eluerade lös- F ningen sattes en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 8 för fiflfilfiïfleav 14 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natrium- kloridkoncentration av 0,lM och ett pH av 8. Den eluerade lös- ningen som erhölls tillfördes en kolonn med 8 cm diameter packad med 500 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som tidigare hadeä ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumklorid- koncentration av 0,lM och ett pH av 8, och den eluerade lös- ningen avlägsnades. Kolonnen tvättades med 2 liter av en 0,025 M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,lM och ett pH av 8, varefter 2 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,2M och ett pH av 8 fick passera genom kolonnen och den eluerade lösningen uppsamlades.

Den eluerade lösningen koncentrerades och avsaltades med an- vändning av ett ultrafiltreringssystem (använt filter: Toyo Ultrafilter UK-10), avsaltades ytterligare med använlning av en Sephadex G-25-kolonn, avfärgades med aktivt kol och under- kastades därefter lyofilisering för erhålhæmæ av 880 mg av ett gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-l32b.

Exemgel 7.

I en liten mängd vatten löstes l0 g av pulvret enligt exempel 2 och den erhållna lösningen sattes till en kolonn packad med dietylaminoetyl-Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvi- librcrats med en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 8.

Därefter fick 5 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natrium- kloridkoncentration av 0,2M och ett pH av 8 passera genom kolonnen varefter 2,5 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och ett pH av 8 fick passera genom kolonnen för eluering av den aktiva substansen ä _@ som adsorberats i kolonnen och den erhållna eluerade lösningen “ li koncentrerades under reducerat tryck. Den koncentrerade lös- ningen avsaltades med användning av en cellofantub, avsalta- des fullständigt med användning av Sephadex G-25 och under- 446- -Åüö 64 kastades därefter lyofilisering för'erhålkune av 600 mg av ett gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-l33a.

Exempel 8.

I 1,2 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumklorid- koncentration av O,3M och ett pH av 8 upplöstes 44,2 g av pulv- ret erhållet enligt exempel l-(2) och de suspenderade olösliga substanserna avlägsnades genom filtrering med användning av Hyflo Super Cel, varefter det erhållna filtratet tillfördes en kolonn med 33 cm diameter packad med 500 ml dietylaminoetyl- Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och Ä g ett pH av 8 och den eluerade lösningen uppsamlades. Kolonnen * tvättades med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumklorid- koncentration av O,3M och ett pH av 8 och tvättvätskorna kombinerades med den tidigare nämnda eluerade lösningen för erhâlkflfle av 1,67 liter av en lösning. Lösningen tillfördes åter en kolonn med diametern 8 cm packad med 40 ml dietyl- aminoetyl-Sephadex A-SO, vilken tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och ett pI-I av 8 för erhållanåe av l,68 liter av en eluerad lösning. Kolonnen tvättades med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och ett pH av 8 för erhållande av 1,64 liter tvättvätskor. Den eluerade lös- ningen och tvättvätskorna kombinerades och en 0,025M fosfat- buffert med ett pH av 8 tillsattes för erhåfikmdeay 4,98 liter up, av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration *I av 0,2M och ett pH av 8. Den eluerade lösningen som erhölls t vïë tillfördes en kolonn med diametern 8 cm packad med 500 ml oietylaminoetyl-Sephadex A-50, som tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,2M och ett pH av 8 och kolonnen tvättades med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,2M och ett pH av 8, varefter 2 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och ett pH av 8 fick passera genom kolonnen och den eluerade lösningen upp- samlades. Den eluerade lösningen koncentrerades och avsalta- des med användning av ett ultrafiltreringssystem (använt fil- -..,_ ÉÖÖFGÜÖ - 65 ter: Toyo Ultrafilter UK-l0), avsaltades ytterligare med an- vändning av en Sephadex G-25-kolonn, avfärgades med aktivt kol och underkastades därefter lyofilisering för bildning av 590 mg av ett grâvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-l33b.

Exempel 9. (1) I 120 ml vatten löstes 20 g av det råa pulvret erhållet enligt exempel l-(2) och de bildadevattenolösliga substanserna avlägsnades genom centrifugering vid 7500 varv/minut under 10 minuter, varefer den vattenlösliga fraktionen som erhölls och tvättvätskorna erhållna vid tvättningen av de vattenolös- liga substanserna tvâ gånger med 60 ml-portioner av vatten, kombinerades och underkastades därefter ultrafiltrering med användning av ett ultrafiltreringssystem av hålfibertyp (membran nr. HI-l) och den inre lösningen underkastades lyo- filisering för erhållande av lO g av ett grâvitt till svagt brunt pulver. (2) I en liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumklo- ridkoncentration av 0,3M och ett pH av 8 löstes 25 g av pulv- ret erhållet enligt (l) ovan och den erhållna lösningen till- fördes en kolonn med 33 cm diameter packad med 500 ml dietyl- aminoetyl-Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,3M och ett pH av 8. Kolonnen tvättades på liknande sätt med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,3M och ett pH av 8 och den eluerade lösningen och tvätt- vätskorna kombinerades förerhäflamde av 1,6 liter av en bland- ning. Blandningen tillfördes en kolonn med 8 cm diameter packad med 400 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som tidigare ekvili- brerats med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncen- tration av 0,3M och ett pH av 8 för bildning av 1,65 liter av en eluerad lösning. Den eluerade lösningen kombinerades med 1,7 liter av tvättvätskorna erhållna genom tvättning av kolon- nen med en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentra- tion av 0,3M och ett pH av 8 och den erhållna blandningen ut- späddes med en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 8 för fram- 446 406- _ '_- 66 ställning av l0,35 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,lM och ett pH av 8.

Därefter tillfördes den sålunda erhållna buffrade lösningen en kolonn med diametern 8 cm packad med 500 ml dietylamino- etyl-Sephadex A-50, som tidigare hade ekvilibrerats med en 0,025M fcsfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,lM och ett pH av 8 och kolonnen tvättades med 2 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,1 och ett pH av 8, varefter 2 liter av en 0,025M fosfat- buffert med en natriumkloridkoncentration av O,3M och ett pH av 8 fick passera genom kolonnen och de eluerade lösningarna uppsamlades. Den eluerade lösningen som erhölls avsaltades och koncentrerades med användning av ett ultrafiltrerings- system (använt filter: Toyo Ultrafiltei UK-lO) och avsaltades ytterligare på Sephadex G-25, avfärgades med aktivt kol och underkastades därefter lyofilisering för erhåüandeav l,65 g gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-1323.

Exemgel lO.

I en liten mängd vatten löstes 10 g av pulvret erhållet enligt exempel 2 och den erhållna lösningen tillfördes en kolonn packad med dietylaminoetyl-Sephadex A-50, vilken tidigare hade ekvilibretats med en 0,025M fosfatbuffert med ett pH av 8. Därefter fick 6 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av O,5M och ett pH av 8 passera genom kolonnen varefter 2,5 liter av en 0,025M fosfatbuffert med en natriumkloridkoncentration av 0,6M och ett pH av 8 fick passera genom kolonnen för eluering av den aktiva sub- stansen adsorberad i kolonnen och den erhållna genomgående lösningen avsaltades med användning av ett ultrafiltrerinqs- system av hâlfibertyp (membran nr. HI-1), koncentrerades un- der reducerat tryck och underkastades därefter lyofilisering för afifillæfiß av 130 mg gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-136.

Exemgel ll.

I 200 ml vatten löstes l5 g av det råa pulvret erhållet enligt exempel l-(2) och de vattenolösliga substanserna avlägsnades 67 genom centrifugering vid 7500 varv/minut under 10 minuter, varefter pH i den så erhållna vattenlösliga fraktionen justera- des till l0 genom droppvis tillsats av 0,2M vattenhaltig bariumhydroxidlösning. Vit fällning utfälldes vid tillsatsen av den vattenhaltiga bariumhydroxidlösningen. Bariumjoner tillsattes så att koncentrationen av totala bariumjoner i den slutliga volymen var 0,0lM, varefter lösningen omrördes 30 minuter och fällningen uppsamlades genom filtrering. Fäll- ningen av ett bariumsalt som erhölls suspenderades i 10 ml av en 10 viktprocentig vattenhaltig natriumsulfatlösning, k omrördes tillräckligt och filtrerades sedan varefter filtra- tet uppsamlades. Fällningen suspenderades åter, omrördes och filtrerades pâ samma sätt som ovan en gång med 10 ml av en lo viktprocentig vattenhaltig natriumsulfatlösning och två gånger med 5 ml-portioner av nämnda lösning och varje filtrat uppsamlades. Därefter tvättades den återstående fällningen två gånger med l0 ml-portioner vatten och filtrerades sedan för erhäflandfl av tvättvätskor. Det nämnda uppsamlade filtratet och tvättvätskorna kombinerades, dialyserades mot destillerat vatten och koncentrerades under reducerat tryck och under- kastades därefter lycfilisering för erhållande av 0,45 g av ett gråvitt till svagt brunt pulver av substansen TF-140.

Exemgel l2.

I 450 ml vatten löstes 32 g av pulvret erhållet enligt exempel l-(2) och de suspenderade olösliga substanserna avlägsnades genom filtrering med användning av Hyflo Super Cel, varefter det erhållna íiltratet dialyserades över natten mot rinnande vatten med användning av en cellofantub. Till den dialyserade lösningen sattes droppvis 80 ml av en 20 viktprocentig vatten- haltig cetylpyridiniunkloridlösning under omröring och sam- tidigt tillsattes 200 ml av en l0 viktprocentig boratbuffert (pH 9,0) och den erhållna blandningen omrördes vid rumstempera- tur 30 minuter, varefter fällningen uppsamlades genom filtre- ring. Fällningen suspenderades i 150 ml av en 0,1 viktprocentig boratbuffert (pH 9,0) innehållande 0,lM natriumklorid och 0,2 viktprocent cetylpyridiniumklorid och den erhållna sus- pensionen omrördes 30 minuter. Därefter uppsamlades fällningen _, ., L; 68 genom filtrering. Den uppsamlade fällningen suspenderades i 150 ml av en 0,1 viktprocent boratbuffert (pH 9,0) innehål- lande 0,5M natriumklorid och 0,2 % cetylpyridiniumklorid och den erhållna suspensionen omrördes och dissocierades under 30 minuter. Därefter separerades fällningen från suspen- sionen genom filtrering för erhållande av en löslig fraktion, varefter den genom filtrering separerade fällningen åter utsattes för samma dissociationsprocedur som ovan för erhål- lande av en löslig fraktion. De två lösliga fraktionerna sammanslogs och i den erhållna lösliga fraktionen justerades pH till 3-4 med 10 % saltsyra, varefter etanol tillsattes så att dess koncentration slutligen blev 80 volymprocent.

Den erhållna lösningen fick stå över natten vid 5°C och den bildade fällningen uppsamlades genom filtrering för erhål- lande av 5,6 g av ett gråvitt till lätt brunt pulver av substansen TF-150. greparationsexempel l.

Varje flaska förpackades med l mg eller 5 mg av vart och ett av pulvren från substanserna TF-lOO, llO och 120 erhållna enligt exemplen l, 2 och 3. Pulvren upplöses i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en lösning innehållande 0,5 % lidokain eller liknande när de skall användas och användes sedan för injektioner.

Preparationsexempel 2.

Varje flaska förpackades med l mg eller 5 mg av vart och ett av pulvren från substanserna TF-l3l6, l32a och l32b erhållna enligt exemplen 4, 5 och 6. Pulvren upplöses i en sterili- serad fysiologisk saltlösning, en lösning innehållande 0,5 % lidokain eller liknande när de skall användas och användes sedan för injektioner.

Preparationsexempel 3.

En flaska förpackades med l mg eller 5 mg av pulvret från substansen TF-l33a erhållet enligt exempel 7. Pulvret upp- löses i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en lösning innehållande 0,5 % lidokain eller liknande när det skall an- f; sf; li J.. 446 -406 69 vändas och användes sedan för en injektion.

Preparationsexempel 4.

En flaska förpackades med l mg eller 5 mg av pulvret från substansen TF-l33b erhållet enligt exempel 5. Pulvret upp- löses i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en lösning innehållande 0,5 % lidokain eller liknande när det skall användas och användes sedan för en injektion.

Preparationsexempel 5.

En flaska förpackades med 1 mg eller 5 mg av pulvret från substansen TF-1323 erhållet enligt exempel 9. Pulvret upp- löses i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en lösning iWW¶ innehållande 0,5 % lidokain eller liknande när det skall användas och användes sedan för en injektion. »wwwfi Preparationsexempel 6.

Varje flaska förpackades med l mg eller 5 mg av vart och ett av pulvren från substanserna TF-136, 140 och 150 erhållna _ enligt exemplen 10, ll och 12. Pulvren upplöses i en steri- ' ' Gâfi 'M liserad fysiologisk saltlösning, en lösning innehållande _ Vfßfi 0,5 % lidokain eller liknande när de skall användas och användes-sedan för injektioner.

Claims (31)

1. 70 4446, MTG ~ PATENTKRAV l.

2. Förfarande för framställning av en TF-substans med kar- cinostatisk och immunostimulerande aktivitet, betecknad TF-100, TF-ll0, TF-120, TF-l30(TF-1316, TF-l32a, TF-l32b, TF-l33a, TF-l33b, TF-1323, TF-136), TF-140 eller TF-150, k ä n n e t e c k n a t därav, att man odlar TF-substans- producerande bakterier tillhörande Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) i ett kulturmedium som inne- håller kvävekällor, kolkällor, vitaminkällor, reduktionsmedel och oorganiska salter med eller utan agar under anaeroba betingelser, att man tillsätter ett hydrofilt organiskt lös- ningsmedel till kulturen eller dess överflytande vätska, att man uppsamlar den sålunda bildade fällningen och sedan den vattenlösliga fraktionen av fällningen, eller om så önskas ågenenför hågen av följande benenaiingef (ii, (zí, (3) eller (4): (l) man underkastar den vattenlösliga fraktionen dialys eller ultrafiltrering, uppsamlar sedan en önskad fraktion från den inre lösningen därav eller underkastar om så önskas ifrågavarande fraktion behandling med jonbytare och upp- samlar en adsorberad fraktion eller en icke-adsorberad fraktion, eller sätter ett kvarternärt ammoniumsalt till ifrågavarande fraktion som uppsamlats från den inre lös- ningen, uppsamlar den erhållna fällningen och underkastar denna sedan dissociationsbehandling och uppsamlar ifråga- varande fraktion från den behandlade vätskan; (2) man underkastar den vattenlösliga fraktionen behandling med jonbytare och uppsamlar den adsorberade fraktionen eller den icke-adsorberade fraktionen; 3) man sätter bariumjoner till den vattenlösliga fraktionen (kulturen eller dess överflytande vätska kan användas i stället för den vattenlösliga fraktionen), uppsamlar det erhållna bariumsaltet, avlägsnar barium från saltet, »V w lflnnufi , 71 ”446-'406 underkastar sedan den vattenlösliga fraktionen dialys eller ultrafiltrering och uppsamlar en önskad fraktion A,¿ ßâ. från dess inre lösning; (4) man sätter ett kvaternärt ammoniumsalt till den vatten- lösliga fraktionen, uppsamlar den erhållna fällningen, underkastar denna dissociationsbehandling och uppsamlar Å sedan en önskad fraktion från den behandlade vätskan. if 5 2r Éörfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a L därav, att den vattenlösliga fraktionen av fällningen avskil- jes från fällningen och sedan torkas. 'E g

3. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenlösliga fraktionen av fällningen under- kastas dialys eller ultrafiltrering och att substanserna med karcinostatisk och immunostimulerande aktivitet utvinnes från den inre lösningen.

4. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenlösliga fraktionen av fällningen om så önskas underkastas dialys eller ultrafiltrering och sedan Ü behandlas med en jonbytare och att den icke-adsorberade frak- “ä tionen uppsamlas. r w,

5. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenlösliga fraktionen av fällningen om så önskas underkastas dialys eller ultrafiltrering och sedan behandlas med en jonbytare och att substanserna med karcino- statisk och immunostimulerande aktivitet uppsamlas från den adsorberade fraktionen.

6. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e L e c k n a t därav, att den adsorberade fraktionen behandlas med en 0,6M natriumklorid-fosfatbuffert och att den eluerade fraktionen uppsamlas. \§, 72 446 406 '_

7. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att en fraktion som har adsorberats med en 0,lM natriumklorid-fosfatbuffert, men har eluerats med en 0,2M natriumklorid-fosfatbuffert, uppsamlas från den adsorberade fraktionen.

8. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att en fraktion som har adsorberats med en 0,2M natriumklorid-fosfatbuffert, men har eluerats med en 0,3M natriumklorid-fosfatbuffert, uppsamlas.

9. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att en fraktion som har adsorberats med en 0,lM natriumklorid~fosfatbuffert, men har eluerats med en 0,3M natriumklorid-fosfatbuffert, uppsamlas.

10. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att en fraktion som har adsorberats med en 0,5M natriumklorid-fosfatbuffert, men har eluerats med en 0,6M natriumklorid-fosfatbuffert, uppsamlas.

11. ll. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenlösliga fraktionen av fällningen under- kastas dialys eller ultrafiltrering, att en 0,2-0,3M natrium- klorid-fosfatbuffert av den vattenlösliga fraktionen av fällningen eller en 0,2-0,3M natriumklorid-fosfatbuffert av den inre lösningskomponent, som erhållits vid dialysen eller ultrafiltreringen, framställes och sedan behandlas med en jonbytare, ekvilibrerad med en 0,2-03M natriumklorid-fosfat- buffert, att en fraktion som har passerat genom jonbytaren uppsamlas, att denna eluerade lösning sedan justeras så att dess natriumkloridkoncentration blir 0,lM och att den därefter behandlas med en jonbytare, ekvilibrerad med en 0,lM natrium- klorid-fosfatbuffert, för att adsorberas därpå, och att där- efter en fraktion uppsamlas som har adsorberats med en 0,lM natriumklorid-fosfatbuffert men har eluerats med en 0,2 eller 0,3M natriumklorid-fosfatbuffert. e W. gl 73

12. Förfarande enligt patentkravet l, k a n n e t e c k n a t därav, att den vattenlösliga fraktionen av fällningen under- kastas dialys eller ultrafiltrering, att en 0,3M natrium- klorid-fosfatbuffert av den vattenlösliga fraktionen av fällningen eller en 0,3M natriumklorid-fosfatbuffert av den inre lösningskomponent, som erhållits genom dialysen eller ultrafiltreringen, framställes och sedan behandlas med en jonbytare, ekvil brerad med en 0,3M natriumklorid-fosfat- buffert, att en fraktion som har passerat genom jonbytaren uppsamlas, att natriumkloridkoncentrationen i denna eluerade lösning sedan justeras till 0,2M och att lösningen därefter behandlas med en jonbytare, ekvilibrerad med en O,2M natrium- klorid-fosfatbuffert för att adsorberas därav, och att därefter en fraktion uppsamlas, som har adsorberats med en 0,2M natriumklorid-fosfatbuffert men har eluerats med en 0,3M natriumklorid-fosfatbuffert.

13. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att bariumjoner sättes till den vattenlösliga frak- tionen av fällningen, att det bildade bariumsaltet uppsamlas och barium avlägsnas från saltet och att den vattenlösliga fraktionen uppsamlas och underkastas dialys eller ultrafilt- rering. \

14. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenlösliga fraktionen av fällningen behand- las med ett kvaternärt ammoniumsalt, att den bildade fäll- ningen uppsamlas och sedan underkastas en dissociations~ procedur med användning av en lösning innehållande natrium- klorid, att ett hydrofilt organiskt lösningsmedel sättes till den erhållna lösliga fraktionen för att bilda en fällning och att den sålunda bildade fä1'ningen uppsamlas.

15. Förfarande enligt något av patentkraven l-l4, k ä n n e - t e c k n a t därav, att det kulturmemdium som användes för odling av bakterierna innehålla: tryptikanpapton, zytanpøptøn, proteospepton, en hjärn-hjärt-infusion (eller hjärtinfusion), 7% "446 - 4136 jästextrakt, natriumklorid, glukos, laktos, L-cystin, natrium- sulfit och tioglykolat eller dessa tillsammans med agar.

16. Förfarande enligt något av patentkraven l-14, k ä n n e - & ¿¿ t e c k n a t därav, att odlingen utföres vid 35” till 42°C “Q under l till 5 dagar i ett kulturmedium vars pH justerats till 6,0 till 8,5.

17. Förfarande enligt något av patentkraven l-14, k ä n n e - t e c k n a t därav, att odlingen utföres vid 36° till ¿§°C j under l till 3 dagar i ett kulturmedium vars pH usterats till 7,2 till 8,2.

18. Förfarande enligt något av patentkraven l-14, k ä n n e - t e c k n a t därav, att det hydrofila organiska lösnings- medel som satts till kulturen eller dess överflytande vätska är en alkohol.

19. Förfarande enligt något av patentkraven l-14, k ä n n e - t e c k n a t därav, att det hydrofila organiska lösnings- medlet sättes till kulturen eller den överflytande vätskan i en lösningsmedelskoncentration av 30 till 70 volymprocent.

20. Förfarande enligt något av patentkraven 5-12, k ä n n e - t e c k n a t därav, att jonbytaren är en svagt basisk jon- bytare eller en svagt basisk jonbytare med molekylsiktbarhet. I

21. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att en 0,1-0,6M natriumklorid-fosfatbuffert användes för eluering av den fraktion som adsorberats på jonbytaren.

22. Förfarande enligt något av patentkraven 5-12 eller 21, k ä n n e t e c k n a t därav, att pH-värdet hos den natrium- kloridhaltiga fosfatbuffert som användes för behandling av den adsorberade fraktionen är ungefär B. 75 ti. 'N61 405

23. Förfarande enligt något av patentkraven 6-l2 eller 21, k ä n n e t e c k n a t därav, att den fraktion som har underkastats jonbytarbehandling koncentreras, avsaltas och torkas.

24. Förfarande enligt patentkravet 14, k ä n n e t e c k n a t därav, att det kvaternära ammoniumsaltet är cetylpyridinium- klorid.

25. Förfarande enligt patentkravet 14, k ä n n e t e c k n a t därav, att behandlingen med det kvaternära ammoniumsaltet genomföras i närvaro av en boratbuffert.

26. Förfarande enligt patentkravet 14, k ä n n e t e c k n a t därav, att lösningen som innehåller natriumklorid är en boratbuffert innehållande natriumklorid och ett kvaternärt ammoniumsalt.

27. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) inokuleras i ett kulturmedium, vars pH justerats till 7,2 till 8,2, innehållande tryptikaspepton, fytonpepton, proteospepton, en hjärn-hjärt-infusion (eller en hjärtinfu- sion), jästextrakt, natriumklorid, glukos, laktos, L-cystin, natriumsulfit och tioglykolat, eller inokuleras i ett kultur- medium innehållande dessa och agar, och sedan odlas under anaeroba betingelser vid 36° till 38°C under l till 3 dagar; en alkohol sättes till kulturen eller dess överflytande vätska i en koncentration av 50 till 70 volymprocent; den bildade fällningen uppsamlas; den vattenlösliga fraktionen av fäll- ningen underkastas, om så önskas, dialys eller ultrafiltrering och behandlas sedan med en svagt basisk jonbytare eller en svagt basisk jonbytare med en molekylsiktbarhet för avlägs- nande av den icke adsorberade fraktionen; en fraktion som har eluerats med en 0,1 eller 0,2M natriumklorid-fosfatbuffert avlägsnas från den adsorberade fraktionen; och därefter upp- samlas en fraktion som har eluerats med en 0,3M natriumklorid- 76 f44~6 406 fosfatbuffert, koncentreras, avsaltas och torkas.

28. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) inokuleras i ett kulturmedium inställt på pH 7,2 till 8,2, innehållande tryptikaspepton, fytonpepton, proteospepton, en hjärn-hjärt~infusion (eller en hjärtinfusion), jästextrakt, natriumklorid, glukos, laktos, L~cystin, natriumsulfit och tioglykolat, eller ett kulturmedium innehållande dessa och agar, och odlas sedan under anaeroba betingelser vid 36 till 38°C under l till 3 dagar; en alkohol sättes till kulturen eller dess överflytande vätska i en koncentration av 50 till 70 volymprocent; den bildade fällningen uppsamlas; den vattenlösliga fraktionen av fällningen underkastas eventuellt dialys eller ultrafiltrering och en 0,2-O,3M natriumklorid- fosfatbuffert av den vattenlösliga fraktionen av fällningen eller en O,2~O,3M natriumklorid-fosfatbuffert av den inre lösningskomponenten, erhållen genom dialys eller ultrafilt- , rering, behandlas sedan med en svagt basisk jonbytare eller svagt basisk jonbytare med en molekylsiktbarhet som har ekvilibrerats med en 0,2-0,3M natriumklorid~fosfatbuffert; fraktionen som har fått passera genom jonbytaren uppsamlas; denna eluerade lösning justeras till en natriumkloridkoncen- tration av 0,1 till 0,2M och behandlas sedan med en svagt basisk jonbytare eller en svagt basisk jonbytare med en molekylsiktbarhet som har ekvilibrerats med en 0,l-0,2M natriumkloridfosfatbuffert för att adsorberas därpå; och en fraktion som har eluerats med en 0,2-0,3M natriumklorid- fosfatbuffert uppsamlas från den adsorberade fraktionen, I . 4, J' f . Å - - _' lgh J koncentreras, avsaltas och torkas.

29. Karcinostatisk TF-substans, vald bland TF-100, TF-ll0, TF-120, TF-130 (TF-1316, TF-l32a, TF-l32b, TF-l33a, TF-l33b, TF~l323, TF-l36), TF-140 eller TF-150, vilka framställes genom odling av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) under anaeroba betingelser och uppsamling av de karoi- i lä nostatiska substanserna från odlingen eller dess överflytande ' 77 4.451' ;4*06 vätska, (A) varvid nämnda TF-100 har följande egenskaper: (a) Gråvitt till ljusbrunt pulver. (b) Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör och Ehrlich fasttumör hos möss och har en immunostimule- rande aktivitet. ' (c) Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. (d) Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. U (e) Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en gm KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av V 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, l 1240, ll40-1000 och 820 cm_ . (f) Ultraviolett-absorptionsspektret av dess vattenlösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 256-260 nm. (g) När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 50 mm diameter x 600 mm, elueringsmedel: destillerat vatten) med användning av Sephadex G-50 (registrerat varumärke tillhörande Pharmacia Co., Ltd.), har den absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 400, 430-530- 700-800 och 840-870 ml vid ultraviolett-absorbansmätningen vid 260 nm; och vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 390 och 410-430 ml vid absorbansmätningenen vid 620 nm med en antron-svavelsyrametod. (h) Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur), erhållet med användning av \ m; fi? av "TSK-GEL G300 SW" (varunamn från Toyo Soda Co., Ltd., kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 2) har . toppar i närheten av lösningsmedelsfronten, 38-60, äf och 65 min. vid ultraviolett-absorbansmätningen vid I 220 nm och 260 nm. L-V __... w! 76 44t- 406 i _. (i) Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion, Lowry-Folins reaktion och ninhydrinreaktion. (j) Elementaranalysvärden: C: 10,6-35,7 %, H: 4,2-5,2 %, N: 4,2-5,2 %. (k) Dess sackaridinnehåll. mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 40,0 till ungefär 46,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt I med Lowry-Folins metod, är ungefär 20,0 till ungefär ,,,,, 23,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; (B) varvid nämnda TF-ll0 har följande genskaper: (a) Gråvitt till ljusbrunt pulver. (b) Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos *WW möss och har en immunostimulerande effekt. vw (c) Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. (d) Den har ingen tydlig smältpunkt utan börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. J (c) Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, ._ (1240, 1140-iooe een sin em'1. ' (f) Ultraviolett-absorptionsspektret av dess vattenlösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 256-260 nm. (g) När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 44 mm diameter x 500 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200 (registrerat varumärke tillhörande Pharmacia Co., * Ltd.), har den absorptionsband vid elueringsvolymerna é i närheten av den tomma volymen - 380 och 600-920 ml vid ultraviolett-absorbansmätningen vid 260 nm, vid Ô“ elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - san, 420-520 och 6:0-760 ml vid absorbnnnmlnninunn vad i* ..._ '- *ï (h) 79 ?44GfÅ06 490 nm med en fenol-svavelsyrametod; och vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 380, 420-520 och 620-760 ml vid absorbansmätningen vid 620 nm med en antron-svavelsyrametod. Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min. vid rumstemperatur), erhållet med användning av "TSK-GEL G3000 SW" (varunamn från Toyo Soda Co., Ltd., kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 23) har toppar i N närheten av lösningsmedelsfronten, 38-60, och 65 min. (i) (j) (k) vid ultraviolett-absorbansmätningen vid 220 nm och 260 nm. Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lo/ry-Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. Elementaranalysvärden: C: 35,9-41,0 %, H: 4,5-5,2 %; N: 4,2-5,2 %. Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 30,0 till ungefär 69,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär l8,0 till ungefär 22,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; (C) varvid nämnda TF-l20 har följande egenskaper: (a) (b) (c) (d) (e) Gråvitt till ljusbrunt pulver. Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos möss och har en immunostimulerande effekt. Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Den har ingen tydlig smältpunkt utan börjar sönder- delas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1380-1360, 1140-looo aan szo cm'l. fm iÉkÉ _ ...min _x,, _ Juan-Li - 80 446 406- i i. (f) (9) (i) (j) (k) Det ultravioletta absorptionsspektret av dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 268-272 nm. När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 44 mm diameter x 500 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den absorptionsband vid elueringsvolymerïd närheten av den tomma volymen - 325 och 775-875 ml vid ultra- violett-absorbansmätningen vid 260 nm, vid eluerings- volymer i närheten av den tomma volymen - 360, 360-480 och 510-760 ml vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol-svavelsyrametod, och vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 380, 420-520 och 620-760 ml vid absorbansmätningen vid 620 nm med en antron-svavelsyrametod. Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur), erhållet med användning av "TSK-GEL G3000 SW" (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 2) har toppar i närheten av lösningsmedels- fronten, 38-60 min. vid ultraviolett-absorbansmät- ningen vid 220 nm och 260 nm. Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och nega- tivt vid ninhydrinreaktion. Elementaranalysvärden C: 35,1-40,2 %, H: 4,5-5,5 %, N: 2,0-3,1 %. Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 56,0 till ungefär 73,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 9,0 till ungefär l3,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; (D) varvid nämnda TF-130 har följande egenskaper: (a) (b) Grâvitt till ljusbrunt pulver. Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, (C) (d) (e) (f) (9) (h) (i) s: 44ó.406le Ehrlich fasttumör och sarkom-180 karcinom hos möss och har en immunostimulerande effekt. Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-iooo och 820 cm'1. Ultraviolett-absorptionsspektret av dess vattenlösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 256-280 nm. Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry~Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. Elementaranalysvärden C: 27,5-39,8 %, H: 3,2-5,7 %, N: 2,8-6,3 %. Dess sackaridinnehåll mätt med en fenol-svavelsyra- metod är ungefär 19,0 till ungefär 64,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 6,0 till ungefär 28,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; (E) varvid nämnda TF-1316 har följande egenskaper: (a) (b) Gråvitt till ljusbrunt pulver. Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich fasttumör och sarkom-180 karcinom hos möss och har en immunostimulerande effekt. Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, .__-_ _., sz 446 4066 1240, 1140-iooo och azo cm'1. (f) Ultraviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 256-260 nm. (g) När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 21 mm diameter x 400 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200 har den ett absorptionsband vid elueringsvolymer i när- heten av den tomma volymen - 160 ml vid ultraviolett- absorbansmätningen vid 260 nm, och ett absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 160 ml vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol- svavelsyrametod. (h) Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur) erhållet med användning av "TSK-GEL G3000 SW" (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 2) har toppar i närheten av lösningsmedels- fronten och 40-60 min. vid ultraviolett-absorbans- mätningen vid 260 nm. (i) Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. (j) Elementaranalysvärden C: 30,0-34,0 %, H: 3,8-4,4 %, N: 4,9-5,7 %. (k) Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 35,0 till ungefär 50,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Foiins metod, är ungefär 10,0 till ungefär 23,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; (F) varvid nämnda TF-l32a har följande egenskaper: (a) Gråvitt till ljusbrunt pulver. _ (b) Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich fasttumör och sarkom-180 karcinom hos möss och har en lmmunoltimulerande effekt. 1 få as 446ï40ón. (c) Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, N aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Å 0,, (d) Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas 'Å à vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. (e) Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av hf, 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, h f - 1240, 1140-1000 och 820 mfl. (f) Ultraviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en~absorptionstopp i närheten av 270-280 nm. (g) När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 44 mm diameter x 500 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- 1 buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har V den absorptionsband'vid elueringsvolymer i närheten av Ü ¿ *Liga den tomma volymen - 340, 600-700 och 720-880 ml vid “ k J ultraviolett-absorbansmätningen vid 260 nm; vid få elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 340, 340-580 och 720-900 ml vid absorbansmätningen vid 490 nu med ~n fenol-svavelsyrametod,“och vid elue- ringsvolymt i närheten av den tomma volymen - 340 och-f 340-580 ml vid ahsorbansmätningen vid 620 nm med en antron-svavelsyrametod. I (h) Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbufferth pH 7, flödeshastighet: 0,8 _ ml/min., vid rumstemperatur) erhållet med användning av "TSK-GEL G3000 SW" (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 2) har toppar i närheten av lösningsmedels- Å 1 fronten, 30, 38-60 och 65 min. vid ultraviolett- ü absorbansmätningen vid 220 nm, och i närheten av :,\f lösningsmedelsfronten, 62 och 65 min. vid ultra- - féšäâä violett-absorbansmätningen vid 260 nm. (i) Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och t-_ 1 Ä H negativt vid ninhydrinreaktion. ' 1 (b) :J (f) (9) (h) 446"406 (j) Elementaranalysvärden C: 34,8-39,8 %, H: 4,5-5,7 %, N: 2,8-3,6 %. (k) Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 55,0 till ungefär 64,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 18,0 till ungefär 28,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; varvid nämnda TE-l32b har följande egenskaper: (a) Gråvitt till ljusbrunt pulver. Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich fasttumör och sarkom-180 karcinom hos möss och har en immunostimulerande effekt. Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-iooo och azo cm'1. Ultraviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och har en inflektionspunkt i närheten av 265-280 nm. När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 21 mm diameter x 400 mm, elueringsmedel; 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den ett svagt absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 150 ml vid ultra- violett-absorbansmätningen vid 260 nm, och ett absorp- tionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 150 ml vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol-svavelsyrametod. Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur) erhållet med användning av TSK-GEL G3000 SW" (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm 'š ) ïaízfsr i? (i) (j) (K) 446 406 x 2) har toppar i närheten av lösningsmedelsfronten, 36-37 och 48-50 min. vid ultraviolett-absorbansmät- ningen vid 220 nm, och har mycket låga toppar i när- heten av lösningsmedelsfronten, 32-39 och 45-52 min. vid ultraviolett-absorbansmätningen vid 260 nm. Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. Elementaranalysvärden C: 35,3-39,5 %, H: 4,5-5,6 %, N: 2,8-5,4 %. Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 23,4 till ungefär 45,5 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 15,5 till ungefär 28,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; (H) varvid nämnda TF-l33a har följande egenskaper: (a) (b) (c) (d) (e) (f) (9) Gråvitt till ljusbrunt pulver. Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich fasttumör, sarkom-180 karcinom hos möss och har en immunostimulerande effekt. Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 124o, 1140-iooo och szo cm'1. Ultraviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 258-262 nm. När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 44 mm diameter x 500 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av *t (h) (i) (j) (K) (I) varvid nämnda TF-l33b har följande egenskaper: (a) (b) (0) (d) 446 406 den tomma volymen - 300 och 630-940 ml vid ultra- violett-absorbansmätningen vid 260 nm, ett absorp- tionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 420 ml vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol-svavelsyrametod, och ett absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 420 ml vid absorbansmätningen vid 620 nm med en antron-svavelsyrametod. Dess höguoplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur) erhållet med användning av "TSK-GEL G3000 SW" 7,9 mm diameter x 600 mm x 2) har toppar i närheten av lösningsmedels- 38 och 50 min. vid ultravio1ett-absorbans- (kolonn: fronten, mätningen vid 220 nm, och i närheten av lösnings- medelsfronten, 50-60 och 62 min. vid ultraviolett- absorbansmätningen vid 260 nm. Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. Elementaranalysvärden C: 28,0-36,6 %, H: 3,5-5,1 %, H: 4,5-6,3 %. Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 26,0 till ungefär 35,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehâll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 22,0 till ungefär 28,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; Gråvitt till ljusbrunt pulver. Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, mhrllch tanttumör och uarkøm-lßè karcinom hol mäns och har en immunostimulerande effekt. Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas a (e) (f) tg) (h) (i) (j) (k) 87 446 406 vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-iooo och azo am'1. U1traviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och har en inflektionspunkt i närheten av 270-280 nm. När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 21 mm diameter x 400 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den ett absorptionsband vid elueringsvolymer i när- heten av den tomma volymen - 170 ml vid ultraviolett- absorbansmätningen vid 260 nm, och ett absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 150 ml vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol- svavelsyrametod. Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur) erhållet med användning av "TSK-GEL G3000 SW" (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 2), har toppar i närheten av lösningsmedels- fronten, 49-50 min. vid ultraviolett absorbansmät- ningen vid 220 nm, och i närheten av lösningsmedels- fronten, 38-39 och 52 min. vid ultraviolett-absorbans- mätningen vid 260 nm. Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. Elementaranalysvärden C: 31,1-38,5 %, H: 3,9-5,2 %, N: 3,4-4,7 %. Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svave1syra- metod, är ungefär 19,0 till ungefär 24,5 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 12,9 till ungefär 22,9 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; G; 1,- w ' 111%), .\-_ A__ i; »w y v 2* :så (K) varvid nämnda TF-1323 har följande egenskaper: (a) Grâvitt till ljusbrunt pulver. (b) Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich fasttumör och sarkom-180 karcinom hos möss och har en immunostimulerande effekt. (c) Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. (d) Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. (e) Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 och 820 cnfl. V M (f) Ultraviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- *_ "'lösnin .visar starhkahsorption vid absorptionskanten och har en inflektionspunkt i närheten av 265-280 nm. (g) Nä! den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 21 mm x 400 mm, elueringsmedel: O,lM fosfatbuffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den ett absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen -,l6O ml vid ultraviolett-absorbans- mätningen vid 260 nm, och ett absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 150 ml vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol-svavelsyrametod. (h) Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min. vid rumstemperatur) erhållet med användning av "TSK-GEL G3000 SW" (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 2) har toppar i närheten av lösningsmedelsfronten, 36 och 48-50 min. vid ultraviolett-absorbansmätningen vid 220 nm, och toppar i närheten av lösningsmedels- fronten, 36 och 50 min. vid ultraviolett-absorbans- mätningen vid 260 nm. (i) Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och v. .vi f= (L) 446 406. negativt vid ninhydrinreaktion. (j) Elementaranalysvärden C: 29,9-39,4 %, H: 3,9-5,6 %, N: 2,8-5,4 %. (k) Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 19,0 till ungefär 25,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 11,0 till ungefär 17,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; varvid nämnda TF-136 har följande egenskaper: (a) Gråvitt till ljusbrunt pulver. (b) Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich fasttumör och sarkom-180 karcinom hos möss och har en immunostimulerande effekt. (c) Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. (d) Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär llO°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. (e) Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 och 820 cm_l. (f) Ultraviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 256-260 nm. (g) När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 44 mm diameter x 500 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den ett absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av 540-930 ml vid ultraviolett-absorbans- mätningen vid 260 nm, och alla fraktioner har ett svagt absorptionsband vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol-svavelsyrametod och vid absorbans- mätningen vid 620 nm med en antron-svavelnyramatod. (h) Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur* erhållet med användning ma., -Wßgfifiw i arg-sr» .w fiffflvïk- raw-riff »Ü 4,. 1, rr _.:.«~ w» .«~.-- WÖ* K . 90 446 406 (i) (j) (k) av "TSK-GEL G3000 SW" (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x 2) har toppar i närheten av lösningsmedels- fronten, 28-40, och 42-60 min. vid ultraviolett- absorbansmätningen vid 220 nm, och toppar i närheten av lösningsmedelsfronten och 42-60 min. vid ultra- violett-absorbansmätningen vid 260 nm. Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. Elementaranalysvärden C: 27,5-32,6 %, H: 3,2-4,0 %, N: 5,0-6,1 %. Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 19,0 till ungefär 30,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 6,0 till ungefär 12,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; (M) varvid nämnda TF-140 har föhjande egenskaper: (a). (b) (C) (d) (e) (f) (ä) _Gråvitt till ljusbrunt pulver. Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos möss och har en immunostimulerande effekt. Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär 2l0°C och sönderdelas avsevärt över 280°C. Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, l670-1640, l550, 1440-1380, 1240, 1140-iooo Och szo cm'1. Ultraviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- lösning visar stark absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 255-260 nm. När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonn: 44 mm diameter x 500 mm, elueringsmedel: 0,lM fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av ,,rs ešalvškjf f ,rpsiMsrW-i», 9: 446 406 É' den tomma volymen - 300, 500-900 och 900-1000 ml vid Ä ultraviolett-absorbansmätningen vid 260 nm, och vid ÄV elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - fiffgi soo, aso-eso och sso-iooo m1 vid absorbansmätningen %\M vid 490 nm med en fenol-svavelsyrametod. (h) Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: 0,lM fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighet: 0,8 ml/min., vid rumstemperatur) erhållet med användning av TSK-GEL G3000 SWÜ (kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm x'2) har toppar i närheten av lösningsmedelsfronten, J och 40-60 min. vid ultraviolett-absorbansmätningen vid 220 nm och 260 nm. , (i) Den reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- Å ß' '_ svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, iäfififi Fn indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och à ¿ V negativt vid ninhydrinreaktion. (j) Elementaranalysvärden C: 22,0-28,0 %, H: 3,0-3,5 %, N: 5,0-6,5 %. (k) Dess sackaridinnehåll, mätt med en fenol-svavelsyra- metod, är ungefär 5,0 till ungefär 15,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 23,0 till ungefär 32,0 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin; och (N) varvid nämnda TF-150 har följande egenskaper: (a) Gråvitt till ljusbrunt pulver. ¿?f (b) Den förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos 1 Å möss och har en immunostimulerande effekt. ßšå (c) Den är löslig i vatten och olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter. (d) Den har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ungefär ll0°C och sönderdelas avsevärt över 200°C. å (e) Ultzaviolett-absorptionsspektret hos dess vatten- ' lösning visar stark absorption vid absorptionskanten ^ och visar en absorptionstopp i närheten av 255-260 nm. M (f) Dess infraröd-absorptionsspektrum, erhållet med en íffiniw s f? i? ._ h; q Å' 3 32 446 406 1 KBr-tablettmetod, har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380/ 1240, 1140-1ooo och szo cm'1. (g) När den fraktioneras genom gelfiltrering (kolonnz 21 mm diameter x 400 mm, elueringsmedel; 0,1M fosfat- buffert, pH 7) med användning av Sephadex G-200, har den absorptionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 100 och 100-160 ml vid ultra- violett-absorbansmätningen vid 260 nm och ett absorp- tionsband vid elueringsvolymer i närheten av den tomma volymen - 150 ml vid absorbansmätningen vid 490 nm med en fenol-svavelsyrametod. (h) Dess högupplösande vätskekromatogram (elueringsmedel: O,1M fosfatbuffert, pH 7, flödeshastighetz 0,8 ml/min., vid rumstemperatur) erhållet med användning av'"TsK-GEL G3000 SW¶n(Kolonn: 7,9 mm diameter x 600 mm'n 21 har toppar ï närheten av lösningsmedels- fronten, 32, och 48-50 min. vid ultraviolett-absor- bansmätningen vid 220 nm, och i närheten av lösnings- medelsfronten, 32, och 48-50 min. vid ultraviolett- absorbansmätningen vid 260 nm. (i) Den°reagerar positivt vid Molisch-reaktion, fenol- svavelsyrareaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol- saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion och negativt vid ninhydrinreaktion. (j) Elementaranalysvärden C: 31,0-34,0 %, H: 4,0-4,4 %, N: 2,8-3,2 %. (k) Dess sackaridinnehåll, mätt med en feno1-svave1syra- metod, är ungefär 40,0 till ungefär 55,0 viktprocent, uttryckt som glukos, och dess proteininnehåll, mätt med Lowry-Folins metod, är ungefär 7,0 till ungefär 14 viktprocent, uttryckt som kalvserumalbumin.

30. Karcinostatiskt medel, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar en karcinostatisk substans TF-100, 110, 120, 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136), 140 eller 150 enligt patentkravet 29 samt ett farmaceutiskt hjälpmedel. .m ~»»,-vm~.¿a-, :“- \ I>-w\-w11cg;\ , v q - . -vmmxfrfäbraßar/*ßr "»*«~'*f'.^'"f'“* ' .1 446 4os_

31. Karcinostatískt medel enligt patentkravet 30, k ä n n e - t e c k-n a t därav, att den karcinostatiska substansen är TF-l32a, l32b, l33a, l33b eller 1323 enligt patentkravet 29.