FI68080B - Foerfarande foer framstaellning av karcinostatiska och immunostimulerande substansen - Google Patents

Description

Ι·Λ^"·1 ΓΒΊ /11 KUULUTUSjULKAISU η ο π

l-BJ UTL ÄG G N I N G S SKRI FT DOUOU

C (45) ' 1 ''J 1 ~ ^ '--j (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 12 P 1/04 SUOMI —FINLAND (21) Patenttihakemus —Patentansöknlng 80264] (22) Hakemispäivä— Ansöknlngsdag 21.08.80 (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 21.08.80 (41) Tullut julkiseksi —Blivit offentlig 25.02.81

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkal.un pvm. 29.03.85

Patent- och registerstyrelsen v ' Ansökan utlagd och utl.skrifteri publicerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd priori te t 24.08.79 24.08.79, 24.08.79, 24.08.79, 06.08.80, 06.08.80, 06.08.80, 06.08.80, 06.08.80 Japan i-Japan(JP) 107814/79, 107817/79, 107818/79, 107819/79, 108120/80, 108121/80, 108122/80, 108123/80, 108l24/80 (71) Toyama Chemical Co., Ltd., 2-5, 3-chome, Nishishinjuku , Shinjuku-ku, Tokyo, Japani-Japan(JP) (72) Kenzo Tamai, Kanazawa-shi, Isamu Saikawa, Toyama-shi,

Takashi Yasuda, Toyama-shi, Shohachi Murakami, Toyama-shi,

Toyoo Maeda, Kanazawa-shi, Hisatsugu Tsuda, Toyama-shi,

Hiroshi Sakai, Takaoka-shi, Masatoshi Sugita, Toyama-shi,

Yoshiko Yamamoto, Namerikawa-shi, Hisashi Minami, Toyama-shi,

Takako Hori, Toyama-shi, Japani-Japan(JP) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä karsinostaattisten ja immunostimuloivien aineiden valmistamiseksi - Förfarande för f ramstä11 ning av karcinostatiska och immuno-stimulerande substansen

Keksintö koskee menetelmää uusien aineiden valmistamiseksi, joilla on karsinostaattinen ja immunostimuloiva vaikutus. Näitä aineita, joita kutsutaan TF-aineiksi, saadaan viljelemällä TF-ainetta tuottavaa Fusobacterium-sukuun kuuluvaa bakteeria anaerobisissa olosuhteissa ja ottamalla talteen muodostuneet aineet viljelmästä tai sen supernatantista. Menetelmällä valmistetaan seuraavat TF-aineet: TF-100, TF-110, TF-120, TF-130, (TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-136), TF-140 ja TF-150.

Erityyppistä syöpää sairastaville potilaille on viime vuosina yhä enemmän otettu käyttöön hoitomuoto, joka käsittää potilaan immunologisen toiminnan lisäämisen ja karsinostaatti-sen vaikutuksen saamisen immunologisen toiminnan avulla. Tällaisessa hoidossa on käytetty kasvaintenvastaisia aineita, jotka on saatu erilaisista bakteeriorganismeista tai bakteerien vil- 2 68080 jelmistä tai polysakkarideista, jotka on saatu organismista Basidiomycetes. Nämä kasvaintenvastaiset aineet eivät kuitenkaan ole riittävän tehokkaita, niillä on haitallisia sivuvaikutuksia ja niiden valmistaminen on hankalaa.

Tunnetaan myös organismi ja sen supernatantti, joka on saatu viljelemällä bakteereita, jotka kuuluvat Fusobacterium-su-kuun, esimerkiksi Fusobacterium K031-3B, Fusobacterium fusifomis W-12, Fusobacterium girans 1012 ja Fusobacterium nucleatum 1010 ,/Dental Surgery, 23, 322-333 (1974) ja 21, 534-539 (1972) (japanilainen)^· Kuitenkaan ei ole aikaisemmin tutkittu viljelmästä tai supernatantista saatavia komponentteja eikä niiden farmakologisia ominaisuuksia.

Nyt on havaittu, että supernatantti, joka on saatu viljelemällä Fusobacterium-sukuun kuuluvia bakteereja ja poistamalla organismit viljelmästä, sisältää komponentteja, joilla on kar-sinostaattinen vaikutus. Näillä komponenteilla ei ole käytännöllisesti katsoen mitään syöpäsolujen kasvupesäkkeen muodostumista estävää vaikutusta kasvupesäkkeen vaahdotusanalyysimenetelmässä eikä niillä ole karsinostaattista vaikutusta, joka perustuu syöpäsolujen tuhoamiseen vaan epäsuora karsinostaattinen vaikutus, joka perustuu potilaan välittämän kasvaintenvastaisen aktiviteetin tai potilaan immuuniuden lisäämiseen. Komponentin myrkyllisyys on hyvin alhainen.

Keksintö koskee menetelmää karsinostaattisen ja immuno-stimuloivan TF-aineen valmistamiseksi, joka aine on TF-100, TF-110, TF-120, TF-130, (TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-136), TF-140 tai TF-150. Menetelmälle on tunnusomaista, että Fusobacterium-sukuun kuuluvaa TF-ainetta tuottavaa bakteeria viljellään anaerobisissa olosuhteissa pH-arvossa 5-8,5 ja lämpötilassa 30-45°C 1-5 päivää viljelyväliaineessa, joka sisältää typpi-, hiili- ja vitamiinilähteitä sekä pelkistimiä ja epäorgaanisia suoloja yhdessä agarin kanssa tai ilman sitä; saostusainetta, joka muodostuu hydrofiilisestä orgaanisesta liuottimesta, lisätään tuotettuun viljelmään tai sen superna-tanttiin, sen jälkeen kun viljelmän tai supernatantin pH on säädetty arvoon 2-7, niin että saostusaineen konsentraatio on 30-70 3 68080 tilav.-%, tai viljelmään tai supernatanttiin lisätään saostus-ainetta, joka muodostuu bariumionilähteestä saatavista barium-ioneista, niin että bariumionikonsentraatio on 0,005-0,IM pH-arvossa 10-13; muodostunut saostuma otetaan talteen; saostus-aine poistetaan saostumasta; TF-ainetta sisältävä jae erotetaan vesiliukoisena jakeena saostumasta; ja TF-aine otetaan talteen vesiliukoisesta jakeesta.

Menetelmällä saatavien TF-aineiden ominaisuudet on esitetty jäljempänä.

Menetelmässä voidaan käyttää mitä tahansa Fusobacterium-sukuun kuuluvaa TF-ainetta tuottavaa bakteeria ja edullisesti käytetään Fusobacterium nucleatum-lajia, erityisesti Fusobacte-rium nucleatum TF-031 (Farm 5077; ATCC 31647).

Fusobacterium nucleatum TF-031:n bakteriologiset ominaisuudet ovat seuraavat: (I) Muoto (1) Solujen muoto: sukkulan muotoisia (kuvio 1) (2) Solujen monimuotoisuus; puuttuu (3) Liikkuvuus: puuttuu (4) Itiöt: puuttuvat (5) Gram-laji: gram-negatiivinen (6) Hapon kestävyys: negatiivinen (II) Kasvuolosuhteet viljelyväliaineessa (1) TF-agari-levy ja vinopinta-viljelyväliaine Ulkoinen muoto: pyöreä muoto Koko: n. 1 mm

Paisuma: puolipallon muotoinen Rakenne: kastepisaraa muistuttava Pinta: sileä Reunat: tasaiset Väri: maitomaisen kellertävän valkoinen Läpikuultavuus: läpikuultamaton 4 68080 (2) TF-nestemainen viljelyväliaine Kasvusuhde: voimakas Sameus: koagulaatti Saostuma: puuttuu

Pinnan kasvu: puuttuu, ei kasvua n. 5 mm:n syvyyteen Kaasu: puuttuu (III) Fysiologiset ominaisuudet (1) Rikkivedyn tuotanto: + (2) Nitraattien pelkistyminen: - (3) Voihapon tuotanto: + (4) Indolin tuotanto: + (5) Ureaasi: - (6) Katalaasi: - (7) Tärkkelyksen hydrolyysi: - (8) Käyttäytyminen hapen suhteen: anaerobinen (9) Ammoniakin tuotanto: + (10) Hiilidioksidin tuotanto: +

(11) Kasvualue: pH 5 - 8,5, lämpötila 30 - 45°C

(12) Kaasun tuotanto sakkarideista: L-arabinoosi (-), D-ksyloosi (-), D-glukoosi (-), D-raannoo-si (-), D-fruktoosi (-), D-galaktoosi (-), mallassokeri (-), sakkaroosi (-), trehaloosi (-), sorbitoli (-), mannitoli (-), inosi-toli (-), glyseroli (-) ja tärkkelys (-).

Tämän keksinnön uusia TF-aineita tuotetaan esimerkiksi seuraavalla tavalla.

5 68080

Fusobacteriuin-sukuun kuuluvien TF-aineita tuottavien bakteerien viljely ___I_____

Viljelmä tai sen ______supernatantti * 1

Hydrofiili _______" ~ ' ' —^ orgaaninen i -~----- “ liuotin |Annetaan seistä

Liukoinen ^ jae _f-----------------T_SE°fc!5_ _] | Sakka |

Fosfaattipuskuri /______________ ...... (natriumkloridi) tai vesi__________

Liukenematon) " ~~~ ; jae <---------- Erotus ---- ! jkuivausV------[Vesiliukoinen" ---^------- ' jae x 2

TF-100 I

______L_____________________ ----- Dialyysi tai ultra-'"'

Ulkoliuos \ Suodatus__

Kuivaus Sisäinen liuos x 3 TF-110

Ei adsorboi- ^ Käsittely ionin- j tunut iae fcr— - vaihta jalla __ | ^___________________. Fosfaattipuskuri

Suolanpoisboj —^--(natriumkloridi) I Eluaatti —--'

Kuivaus L... ... , .

__I jVakevomti Ψ | —— TF-12 0 J Suolanpoistoj

Kuivausj TF-130 (TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136)

___ - TT

6 68080

Viljelmä tai sen supernatantti x --------χ2

Vesiliukoinen l . 1 v I · —-^Kuivaus---------> TF-100 j Jae_ ' I--------1 ^ - ^ Barium-suolan x --- X muodostaminen ^ Barium-ioneja

Ρ=ΓΓ_ —I

I Erotus_I ' Liuos

Barium-suola ! __I____

I Bariumin I |poisto I

Erotus 1_ \ Kiinteä --1--1 Λ ai ne__

Liuos |

Dialyysi tai ultra-suodatus j Väkevöinti j Γ ; jKuivaus j TF-140 7 68080 x 2

Vesiliukoinen jae --x3

Sisäinen . T, . "T

, . -^Kuivaus ---v TF-110 liuos Λ___] __Käsittely kvatemää- /

Liukoinen iae C- rise;4ä anraonium" * -J-lx suolalla r .......................

Kvaternäärinen anmonium- _______ kompleksi

Nat-riumkloridia ----------- sisältävä liuos ________

Dissosiointi-prosessi ~ 4·_____

| Pesuvedet^J

Liukoinen jae

Hydrofiili orgaaninen __v liuotin T · , · · ---Erotus

Liukoinen iae_ \__

Sakka

Kuivaus

V

TF-150 68080 8

Edellä esitettyä tuotantoprosessia valaistaan seuraavassa: (1) Bakteerien viljely

Fusobacteriura-sukuun kuuluvien bakteerien viljely tapahtuu jollakin tavallisella menetelmällä anaerobisten bakteerien viljelemiseksi. Tämä tarkoittaa, että viljelyväliaine, joka sisältää typpilähteen, kuten vasikan aivosydänuutteita, erilaisia peptone-ja jne.; vitamiinilähteen, kuten hiivauutetta jne.; epäorgaanisen suolan, kuten natriumkloridia jne; hiili-lähteen, kuten glukoosia, laktoosia jne.; pelkistimen, kuten L-kystiiniä, natrium-sulfiittia, tioglukolaattia jne., asetetaan pH-arvoon väliltä 6-8,5, edullisesti välille 7,2-8,2, ja bakteerit ympätään tähän viljelyväliaineeseen, minkä jälkeen muuttumattoman viljelmän annetaan kasvaa anaerobisissa olosuhteissa 35° - 42°C:ssa edullisesti 36-38°C:ssa 1-5 päivän ajan, edullisesti 24-72 tuntia. Erityisesti on toivottavaa käyttää taulukossa 1 kuvattua viljelyväliainetta (jota tämän jälkeen nimitetään TF-viljelyväliaineeksi). Aivo-sydän-uute, joka on vasikan aivo-sydän-uute, ei kuitenkaan aina ole tarpeen hiililähteenä ja voidaan korvata sydänuutteella, joka on vasikan sydänuute, lihauutteella, kalauutteella, maissin liuotus-liemellä jne. Eri peptoneista proteoosi-peptoni ja fytoni-pep-toni eivät aina ole tarpeen ja tryptikaasi-peptoni voidaan korvata polypeptonilla.

Kun agaria ei käytetä, on toivottavaa käyttää sekoituksen-alaista viljelyä.

9 68080

Taulukko 1

Viljelyväliaineen TF-a TF-b TF-c aineosat (g/1) tryptikaasi-peptoni 17 17 17 fytoni-peptoni 3 3 1,5 proteoosi-peptoni 10 55 aivo-sydän-uute 35 17,5 sydänuute - - 25 hiivauute 3 33 natriumkloridi 7,5 7,5 7,5 glukoosi 6 66 laktoosi 5 55 L-kystiini 0,25 0,5 0,5 natriumsulfiitti 0,1 0,1 0,1 tioglykolaatti 0,5 0,5 0,5 agari 0 tai 0,7 0 tai 0,7 0 tai 0,7 (2) Supernatantin talteenotto viljelmästä (organismien poistaminen) .

Organismit poistetaan edellä saadusta viljelmästä super-natin saamiseksi. Organismien poistamista varten voidaan käyttää tavanomaista menetelmää, esimerkiksi sentrifugointia ja suodatusmenetelmää käyttäen suodatusapuainetta, kuten Hyflo Super Cel, ja erityisesti sentrifugointimenetelmä on edullinen työvaiheiden, organismien poistamisasteen ja supernatantin saannon kannalta. Organismit poistetaan edullisesti tässä vaiheessa, mutta voidaan poistaa seuraavassa vaiheessa (3).

(3) Karsinostaattisen aineen TF-100 talteenotto

Edellä saatuun supernatanttiin tai viljelmään lisätään hydrofiiliä orgaanista liuotinta ja kootaan muodostunut saostuma. Tässä vaiheessa supernatantti tai viljelmä edullisesti asetetaan pH-arvoon 2-7. Hydrofiilinen orgaaninen liuotin on esimerkiksi alkoholi, kuten etanoli, metanoli jne., tai ketoni, kuten asetoni jne., vaikkakin alkoholeilla, erityisesti etanolilla saadaan paras tulos. Hydrofiilistä orgaanista liuotinta lisätään 10 68080 sopivasti niin, että sen pitoisuus on 30-70 %, erityisesti 50-70 tilav.-%. Hydrofiilisen orgaanisen liuottimen lisäämisen jälkeen syntyneen seoksen annetaan seistä alhaisessa lämpötilassa, edullisesti 5°C:ssa, useista tunneista moniin päiviin täydellisen saostumisen aikaansaamiseksi.

Täten muodostunut sakka erotetaan tavanomaisin menetelmin, kuten dekantoimalla, sentrifugoimalla tai suodattamalla.

Senjälkeen lisätään sakkaan vettä 10-15-kertainen määrä sakkaan nähden /vesi voidaan korvata fosfaatti-puskurilla tai natriumkloridia sisältävällä fosfaattipuskurilla, kun tarkoituksena on saada TF-120 tai 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 tai 136) kuten jäljempänä esitetään/ ja muodostuneet veteen liukenemattomat aineet poistetaan tavanomaisella menetelmällä, kuten sentrifugoimalla, suodattamalla jne., minkä jälkeen vesiliukoinen jae kootaan. Kun käytetään viljelmää, organismit poistetaan edellä mainituin menetelmin. Näin saatu vesiliukoinen jae kuivataan lyofiloimalla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-100 saamiseksi.

Näin saadulla TF-100:11a on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet .

(4) Karsinostaattisen aineen TF-110 kokoaminen

Edellä kohdassa (3) saatu vesiliukoinen jae saatetaan dialyysiin tai ultrasuodatukseen; tai vaihtoehtoisesti TF-100 liuotetaan veteen, jonka määrä on 10-15-kertainen TF-100:n määrään nähden, ja saatu liuos saatetaan dialyysiin tai ultrasuodatukseen. Pienmolekyyliset aineet, kuten aminohapot ja epäorgaaniset aineet poistuvat edellä kuvatulla käsittelyllä. Sisäinen liuos, joka saadaan dialyysillä tai ultrasuodatuksella, kootaan ja kuivataan sitten karsinostaattisen aineen TF-110 saamiseksi.

Näin saadulla TF-110:llä on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet .

(5) Karsinostaattisen aineen TF-120 kokoaminen

Edellä kohdassa (3) saatua veteen liukenevaa jaetta, tai jos on tarpeen, sisäistä liuosta saattamalla vesiliukoinen jae dialyysiin tai ultrasuodatukseen (edellä kohdassa (4) saatua sisäistä 11 68080 liuosta), tai TF-110:n jauheen liuosta pienessä määrässä vettä, käsitellään ioninvaihtajalla. Ioninvaihtajana käytetään heikosti emäksistä ioninvaihtajaa tai heikosti emäksistä ioninvaihtajaa, jolla on molekyyliseulontakyky, ja edullisesti käytetään esimerkiksi dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50 (Pharmacia Co., Ltd:n rekisteröity tavaramerkki). Ioninvahtajalla täytetty pylväs tasapainoi-tetaan esimerkiksi fosfaatti-puskurilla, jonka pH on n. 8, minkä jälkeen edellä mainittu käsiteltävä liuos viedään pylvään läpi ja eluoitu liuos kootaan ja kuivataan sitten lyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla; tai vaihtoehtoisesti sama puskuri kuin edellä ja käsiteltävä liuos pannaan astiaan, joka sisältää ioninvaihta-jaa, ja sisältöä sekoitetaan ja suodatetaan sitten, minkä jälkeen suodos kuivataan; jolloin voidaan saada karsinostaattinen aine TF-120, jolla on jäljempänä kuvatut ominaisuudet. TF-120 voidaan saada myös poistamalla suolat eluoidusta liuoksesta tai suodokses-ta, esimerkiksi dialyysillä käyttäen sellofaani-putkea tai vas-

Cr) taavaa, käyttämällä Sephadex G-25v (Pharmacia Co., Ltd:n rekisteröity tavaramerkki), tai ultrasuodatuksella ja kuivaamalla tämä sitten .

Näin saadulla TF-120:llä on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet .

(6) Karsinostattisen aineen TF-130 kokoaminen

Pylvästä, joka sisältää adsorboidut komponentit, joista TF-120 on poistettu kohdan (5) käsitetyllä edellä, käsitellään fosfaatti-puskurilla, edullisesti fosfaatti-puskurilla, jonka nat-riumkloridi-pitoisuus on väliltä 0,1-0,6 M ja pH n. 8 (tämän jälkeen fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-pitoisuus on väliltä 0,1-0,6 M, nimitetään 0,1-0,6 M natriumkloridi-fosfaattipuskuriksi); tai vaihtoehtoisesti edellä kohdassa (3) saatu vesiliukoinen jae saatetaan, jos on tarpeen, dialyysiin tai ultrasuodatukseen, ja sitten käsittelyyn ioninvaihtajalla käyttämällä 0,1-0,6 M natrium-kloridi-fosfaattipuskuria; jakeen saamiseksi, joka ei ole eluoitu-nut fosfaattipuskurilla, joka on vapaa natriumkloridista, mutta eluoituu 0,1 - 0,6 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla.

Tämä menetelmä voidaan toteuttaa joko pylväs-systeemillä tai panoksittaisella systeemillä. Näin saatu haluttu jae, joka elu- 12 68080 oituu natriumkloridifosfaattipuskuriila, kuivataan lyofilisoiralla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-130 saamiseksi. Eluaatista, joka sisältää halutun jakeen, joka eluoituu edellä mainitulla natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, voidaan poistaa suolat, esimerkiksi dialyysillä käyttäen sellofaani-putkea, molekyyliseulonnalla, käyttäen Sephadex G-25^, tai ultra-suodatuksella ja kuivata se sitten.

Tässä käytetty symboli "TF-130" tarkoittaa kollektiivisesti haluttuja eluoituja jakeita, jotka on saatu käsittelemällä edellä kohdassa (3) saatua veteen liukenevaa jaetta tai, jos on tarpeen, sisäistä liuos-komponenttia, joka on saatu saattamalla vesiliukoinen jae dialyysiin tai ultrasuodatukseen, ioninvaihtajalla, jotka jakeet eivät eluoidu fosfaatti-puskurilla, joka on vapaa natrium-kloridista, mutta eluoituvat 0,1-0,6 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla. TF-130 käsittää konkreettisesti, esimerkiksi, seuraa-vat jakeet.

(i) Jae, joka ei ole eluoitunut fosfaattipuskurilla, joka ei sisällä natriumkloridia, mutta on eluoitunut 0,6 M natriumklo-ridi-fosfaattipuskurilla edellä esitetyssä ioninvaihtokäsittelyssä /jae on nimetty TF-1316:ksi/.

(ii) Jae, joka ei ole eluoitunut 0,1 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,2 M natriumkloridi-fosfaat-tipurkurilla edellä mainitussa ioninvaihtokäsittelyssä /jae on nimetty TF-132a:ksi ja b:ksi; TF-132a saadaan pesemällä ioninvaihta ja, joka sisältää edellä mainitun adsorboidun komponentin, 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, käsittelemällä ioninvaihtajaa 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla ja kokoamalla sitten jae, joka on eluoitunut 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla; ja TF-132b saadaan käsittelemällä edellä kohdassa (3) saatua vesipitoista jaetta tai edellä kohdassa (4) saatua sisäistä liuoskompo-nenttia (TF-110) ioninvaihtajalla/.

(iii) Jae, joka ei ole eluoitunut 0,2 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,3 M natriumkloridi-fosfaat-tipuskurilla edellä mainitussa ioninvaihtokäsittelyssä /jae on nimetty TF-133a:ksi ja b:ksi; a ja b tarkoittavat samaa kuin edellä määriteltiin vastaavasti TF-132a:n ja b:n tapauksessa/.

(iv) Jae, joka ei ole eluoitunut 0,1 M natriumkloridi-fos- 13 68080 faattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,3 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla edellä mainitussa ioninvaihtaja-käsittelyssä /jae on nimetty TF-1323:ksi7.

(v) Jae, joka ei ole eluoitunut 0,5 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,6 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla edellä mainitussa ioninvaihtaja-käsittelyssä /"jae on nimetty TF-136:ksi7·

Koska aineilla TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 ja 136 on yhteisiä ominaisuuksia seuraavissa suhteissa, on yhdisteet, joilla on yhteiset ominaisuudet, nimetty TF-130:ksi. Tämä tarkoittaa, että edellä kuvatulla tavalla saadulla TF-130:llä on seuraavat ominaisuudet: (a) Harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe.

(b) Se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-syövän lisäkasvun ja sillä on im-munostimuloiva vaikutus.

(c) Se on liukoinen veteen ja liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin.

(d) Sillä ei ole selvää sulamispistettä, alkaa hajota n. 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti 200°C:n yläpuolella.

(e) Sen infrapuna-absorptio-spektrillä, joka on saatu KBr-tablettimenetelmällä, on absorptionauhat lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm (f) Sen vesipitoisen liuoksen ultravioletti-absorptio-spektri antaa voimakkaan absorption absorptiorajalla ja antaa absorptio-huipun 256-280 nm:n läheisyydessä.

(g) Se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikkihappo-reaktiossa , an troni-rikkihappo-reaktiossa, i.ndol i-kloori-vetyhappo-reaktiossa sekä Lowry-Folin'in reaktiossa, ja negatiivinen ninhydriini-reaktiossa.

(h) Alkuaineanalyysi-arvoja C: 27,5 - 39,8 %, H: 3,2 - 5,7 %, N: 2,8 - 6,3 %.

(i) Sen sakkaridi-pitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on n. 19,0 - n. 64,0 paino-% (glukoosina), ja sen 68080 proteiini-pitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on 6,0 - 28,0 paino-%:n läheisyydessä (vasikan seerumialbumiinina).

Edellä mainittu käsittely ioninvaihtajalla on yksityiskohtaisemmin selitetty seuraavassa. Ioninvaihtajana, jota käytetään seuraavissa menetelmissä, pidetään edullisena heikosti emäksistä ioninvaihtajaa tai heikosti emäksistä ioninvaihtajaa, jolla on molekyyliseulontakyky, ja esimerkiksi edellä kohdassa 5) käytetty dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50®on sopiva käytettäväksi ja seuraava menetelmä voidaan toteuttaa panoksittaisella järjestelmällä.

(i) 0,6 M natriumkloridi-fosfaattipuskuria, jonka pH on edullisesti n. 8, viedään ioninvaihtopylvään läpi, joka sisältää absorboidun komponentin ja jonka läpi käsiteltävä liuos on viety edellä kohdassa (5) ja eluoitu jae kootaan, valinnaisesti väkevöi-dään ja siitä poistetaan suolat dialyysillä, ultrasuodatuksella tai vastaavalla tavalla ja kuivataan senjälkeen lyofiloimalla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-1316 saamiseksi.

Näin saadulla TF-1316:11a on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet .

(ii) -l) 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri, jonka pH

on edullisesti n. 8, viedään ioninvaihtopylvään läpi, joka sisältää absorboidun komponentin ja jonka läpi käsiteltävä liuos on viety edellä kohdassa (5), pylvään pesemiseksi, minkä jälkeen 0,2 M natriumkloridi-f osfaattipuskuri, jonka pH on edullisesti n. 8, viedään pylvään läpi ja eluoitu jae kootaan, väkevöidään valinnaisesti ja siitä poistetaan suolat dialyysillä, ultrasuodatuksella jne. ja kuivataan sitten lyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-132a saamiseksi.

Näin saadulla TF-132a:lla on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet.

(ii)-2) Työvaiheet jakeen kokoamiseksi, joka ei ole eluoi-tunut 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla ioninvaihtokäsittelyssä, suoritetaan seuraavalla tavalla käyttäen edellä kohdassa (3) saatua vesiliukoista jaetta tai edellä kohdassa (4) saatua sisäistä liuosta TF-132b:n saamiseksi. Tämä tarkoittaa, että ioninvaihtajalla li 68080 täytetty pylväs tasapainotetaan 0,2-0,3 M natriumkloridi-fosfaat-tipuskurilla, jonka pH edullisesti on n. 8, minkä jälkeen edellä kohdassa (3) saadun vesiliukoisen jakeen tai sisäisen liuoskompo-nentin, joka on saatu saattamalla vesiliukoinen jae dialyysiin tai ultrasuodatukseen, 0,2 - 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipus-kuri viedään kolonnin läpi ja eluoitu liuos kootaan. Jos on tarpeen, kolonni pestään edellä mainitulla 0,2 - 0,3 M natriumkloridi-fosf aattipuskurilla ja eluoitu liuos ja pesuvedet yhdistetään. Ioninvaihtokäsittely voidaan suorittaa useita kertoja. Senjälkeen liuos, joka on valmistettu laimentamalla edellä mainittu eluoitu liuos fosfaattipuskurilla, niin että natriumkloridi-pitoisuus on 0,1 M, viedään kolonnin läpi, jossa ioninvaihtaja on tasapainotettu 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, jonka pH on edullisesti n. 8, ja jae, joka on eluoitunut edellä mainitulla 0,1 M natrium-kloridi fosfaattipuskurilla, poistetaan, minkä jälkeen edellä mainittu 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri viedään kolonnin läpi eluaatin saamiseksi. Edellä esitetyn ioninvaihtokäsittelyn konkreettisessa esimerkissä jae, joka ei ole adsorboitunut edellä mainitulla 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla tasapainotetulle ioninvaihtajalle, kootaan, adsorboidaan ioninvaihtajalle, joka on tasapainotettu edellä mainitulla 0,1 M natriumkloridi-fosfaatti-puskurilla, pestään tällä 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla ja eluoidaan sitten edellä mainitulla 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla eluaatin saamiseksi. Voidaan myös käyttää menettelytapaa, jolla päinvastoin jae, joka on adsorboitunut ioninvaihta-jalle, joka on tasapainotettu edellä mainitulla 0,1 M natriumkloridi-fosf aattipuskurilla, kootaan ja senjälkeen toteutetaan työvaihe tämän jakeen erottamiseksi jakeesta, joka on adsorboitunut ioninvaihtajalle, joka on tasapainotettu edellä mainitulla 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, ja jae, joka on eluoitunut tällä 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, kootaan.

Sen jälkeen edellä kuvatulla tavalla saatu eluaatti valinnaisesti väkevöidään ja siitä poistetaan suolat dialyysillä, ultra-suodatuksella jne. ja kuivataan sitten lyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-132b saamiseksi.

680 8 0 Näin saadulla TF-132b:lla on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet.

(iii)-l) Edellä kohdassa (4) saatu sisäinen liuoskompo-nentti viedään pylvään läpi, jossa on ioninvaihtajaa, joka on tasapainotettu fosfaattipuskurilla, jonka pH on edullisesti n.

8, ja 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri, jonka pH on edullisesti n. 8, viedään pylvään läpi sen pesemiseksi ja sitten viedään pylvään läpi 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri, jonka pH edullisesti on n. 8, tai vaihtoehtoisesti edellä mainittu 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri viedään pylvään läpi, jota on käsitelty edellä kohdassa (ii)-l) ja jossa vielä on jäljelle jäänyt adsorboitunut komponentti. Eluoitu jae kootaan, väkevöidään valinnaisesti ja siitä poistetaan suolat dialyysillä, ultrasuodattamalla jne. ja kuivataan sitten lyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-133a saamiseksi.

Näin saadulla TF-133a:lla on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet.

(iii)-2) Jae, joka ei eluoitunut 0,2 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,3 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla ioninvaihtokäsittelyssä, kootaan seuraavalla tavalla, joka on sama kuin edellä esitetyssä kohdassa (ii)-2), TF-133b:n saamiseksi. Toisin sanoen ioninvaihtajalla täytetty pylväs tasapainotetaan 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, jonka pH edullisesti on n. 8, minkä jälkeen edellä kohdassa (3) saadun vesiliukoisen jakeen 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri tai sisäinen liuoskomponentti, joka on saatu saattamalla vesiliukoinen jae dialyysiin tai ultrasuodatukseen, viedään pylvään läpi ja eluoitu liuos kootaan. Jos on tarpeen, pylväs pestään edellä mainitulla 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla ja eluoitu liuos ja pesuvedet yhdistetään. Ioninvaihtokäsittely voidaan suorittaa useita kertoja. Sen jälkeen liuos, joka on valmistettu laimentamalla edellä mainittua eluoitua liuosta fosfaattipuskurilla niin, että natriumkloridi-pitoisuus on 0,2 M, viedään pylvään läpi, jossa ioninvaihtaja on tasapainotettu 0,2 M natriumkloridifosfaattipuskurilla, jonka pH on edullisesti n. 8, ja jae, joka on eluoitu edellä mainitulla 0,2 M natriumkloridi -fosfaattipuskurilla, pois 68080 tetaan, minkä jälkeen em. 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskur1 viedään pylvään läpi eluaatin saamiseksi. Edellä esitetyn ionin-vaihtokäsittelyn konkreettisessa esimerkissä jae, joka ei ole adsorboitunut ioninvaihtajalie, joka on tasapainotettu 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, kootaan, adsorboidaan ionin-vaihtajalle, joka on tasapainotettu edellä mainitulla 0,2 M natriumkloridi-f osf aattipuskuri 1 la , pestään 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla ja eluoidaan sitten 0,3 M natriumkloridi-fos-faattipuskurilla eluaatin saamiseksi. Voidaan myös käyttää menetelmää, jossa päinvastoin jae, joka on adsorboitunut ioninvaihta-jalle, joka on tasapainotettu 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipusku-rilla, kootaan ja sen jälkeen toteutetaan työvaihe tämän jakeen erottamiseksi jakeesta, joka on adsorboitunut ioninvaihtajalie, joka on tasapainotettu 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri11a, ja jae, joka on eluoitunut edellä mainitulla 0,3 M natriumkloridi-fosf aattipuskuri 11a , kootaan.

Sen jälkeen edellä kuvatulla tavalla saatu eluaatti valinnaisesti väkevöidään ja siitä poistetaan suolat dialyysillä, ultra-suodattamalla jne. ja kuivataan sitten lyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla halutun karsinostaattisen aineen TF-133b saamiseksi.

Näin saadulla TF-133b:lla on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet .

(iv) Vesiliukoinen jae, joka saatiin edellä kohdassa (3) tai sisäinen liuoskomponentti, joka saatiin edellä kohdassa (4), muodostetaan 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskuriksi, jonka pH on edullisesti n. 8, ja saatu puskuri viedään ioninvaihtopylvään läpi, joka on sitä ennen tasapainotettu 0,3 M natriumkioridi-fos-faattipuskurilla, jonka pH on edullisesti n. 8. Eluoitu liuos asetetaan lisäämällä fosfaattipuskuria niin, että natriumkloridin pitoisuus on 0,1 M ja viedään sitten ioninvaihtopylvään läpi, joka on sitä ennen tasapainotettu 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, jonka pH on edullisesti n. 8, ja sen jälkeen edellä mainittu 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri viedään pylvään läpi, minkä jälkeen eluoitu jae kootaan, väkevöidään valinnaisesti ja siitä poistetaan suolat dialyysillä, ultrasuodatuksella tai vastaavalla tavalla ja kuivataan sitten lyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla 18 68080 karsinostaattisen aineen TF-1323 saamiseksi.

Näin saadulla TF-1323:11a on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet .

(v) Edellä kohdassa (4) saatu sisäinen liuoskomponentti viedään ioninvaihtopylvään läpi, joka on tasapainotettu fosfaatti-puskurilla, jonka pH on edullisesti n. 8, ja 0,5 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri, jonka pH on edullisesti n. 8, viedään pylvään läpi sen pesemiseksi, ja sitten pylvään läpi viedään 0,6 M natrium-kloridi-fosfaattipuskuri, jonka pH on edullisesti n. 8, tai vaihtoehtoisesti edellä mainittu 0.5 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri viedään pylvään läpi, jota on käsitelty edellä kohdassa (ii)—2) ja jossa vielä on jäljellejäänyt adsorboitunut komponentti, minkä jälkeen edellä mainittu 0,6 M natriumkloridi-fosfaattipuskuri viedään tämän pylvään läpi. Eluoitu jae kootaan, väkevöidään valinnaisesti ja siitä poistetaan suolat dialyysillä, ultrasuodatuksella jne. ja kuivataan sitten lyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-136 saamiseksi.

Näin saadulla TF-136:11a on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet .

(7) Karsinostaattisen aineen TF-140 kokoaminen

Barium-ioneja lisätään viljelmään tai sen päällä olevaan nesteeseen, joka on saatu edellä kohdassa (1) tai (2) tai vesiliukoiseen jakeeseen, joka on saatu edellä kohdassa (3), tai liuokseen, joka on saatu liuottamalla TF-100 veteen, bariumsuolan muodostamiseksi, minkä jälkeen sakka kootaan ja saatetaan sitten työvaiheeseen bariumin poistamiseksi ja vesiliuokoinen jae kootaan ja saatetaan sitten dialyysiin tai ultrasuodatukseen TF-140:n saamiseksi. Yksityiskohtaisesti selittäen vesipitoinen barium-hydroksidi-liuos, edullisesti 0,1-0,5 M vesipitoinen bariumhydrok-sidi-liuos lisätään edellä kohdassa (1) tai (2) saatuun viljelmään tai sen päällä olevaan nesteeseen tai vesiliukoiseen jakeeseen, joka on saatu edellä kohdassa (3) tai vesipitoiseen liuokseen, joka on saatu liuottamalla TF-100 veteen määrässä, joka on n. 10-15-kertainen TF-100:n määrään nähden, ja saadun seoksen pH asetetaan edullisesti välille 10-13 barium-suolan muodostamiseksi. Sakka

II

19 68080 saostuu lisäämällä bariumhydroksidiliuosta ja lisättyjen barium-ionien määrä asetetaan edullisesti niin, että bariumionien kokonaispitoisuus seoksen lopullisessa tilavuudessa on 0,005-0,1 M.

Näin saatu seos suodatetaan ja työvaihe bariumin erottamiseksi saadusta bariumsuolasta toteutetaan. Barium poistetaan edullisesti lisäämällä barium-suola natriumsulfaattiin, edullisesti 5-15 %:een vesipitoiseen natriumsulfaattiliuokseen, sekoittamalla syntynyttä seosta ja suodattamalla sitten liuoksen saamiseksi. Erotettu ja poistettu sakka pestään vesipitoisella natriumsulfaatti1iuoksella uudelleen ja pesuvedet yhdistetään edellä mainitun liuoksen kanssa. Näin saatu liuos saatetaan dialyysiin, ultrasuodatukseen jne. ylimääräisen natriumsulfaaatin tai pienempimolekyylisten aineiden poistamiseksi ja saatu liuos kuivataan sitten iyofilisoimalla tai vastaavalla tavalla karsinostaattisen aineen TF-140 saamiseksi.

Näin saadulla TF-140:llä on taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet.

(8) Karsinostaattisen aineen TF-150 kokoaminen

Edellä kohdassa (3) saatua vesiliukoista jaetta tai edellä kohdassa (4) saatua sisäistä liuosta käsitellään kvaternäärisellä ammonium-suolalla ja muodostunut sakka kootaan ja saatetaan sitten dissosiointiprosessiin käyttäen liuosta, joka sisältää natrium-kloridia, minkä jälkeen liukoiseen jakeeseen lisätään hydrofiiliä orgaanista liuotinta ja näin muodostunut sakka kootaan ja kuivataan sitten TF-150:n saamiseksi. Kvaternäärisenä ammonium-suolana, jota tässä voidaan käyttää, voi tavallisesti olla joku kompleksi polysakkaridin kanssa ja erityisen edullisia esimerkkejä tästä ovat setyyli-pyridiniumkloridi, setyyli-trimetyyliammoni umbromidi jne. Käsittely kvaternäärisellä ammoniumsuolalla suoritetaan edullisesti puskurin, kuten boraattipuskurin jne. läsnäollessa. Konkreettinen selitys edellä mainitusta käsittelystä kvaternäärisellä ammonium-suolalla ja dissosioimisvaiheesta käyttäen liuotinta, joka sisältää natriumkloridia, on seuraava. Esimerkiksi, kvaternäärisen ammonium-suolan vesipitoinen liuos lisätään tiputtaen vesiliukoiseen jakeeseen, joka on saatu edellä kohdassa (3) tai sisäiseen liuokseen, joka on saatu edellä kohdassa (4) pitäen samalla pH heikosti emäksisenä, ja saatua seosta sekoitetaan 0° -50°C:ssa

Il 21 68080

G

*· *P ! G -H -n •H g T3

•H *· W

rl c o m

G O -H U-l -n •r-ι C -H O

G G G G

G 4-> O O -H

!U I1MJ H ·Η β G

CU g O) A -P -M G

P M -P -P A

(Λ (1) β ιί > (I) M -P

G > O C li 1) G

G -P»-H-PP= = = = n tn e G e -h a) p H <D g -p G tn Q) O C <D -H Q) G 0) a; -h g -h q) -h -p

G o ω o ω r-ι rH

•H A A c P >1 >1 P G G G G >p >1

•H -H -P 0) -P P

J H JJ Λ 0) Θ

I G I I H

G Λ -n I G tn >—I

en i tn -h tn G o

P .G :G G P :G G P A

G U rP > G f—I > GIG:G

-H i—I -H (> rp |> XI :G <P

rl rl (U O -rl 0) G -H ϋ > rP

en M G rp tn G > tn ·ρ :0 -p tn

ai xl -p g cu-p-P QjrP^tnG

tn > w -p g > -P o > G tn -P

G I Xl -P i xl rp I χβ G G

-P Xl G P XI G GWo-n^

G U :G G CO U G g U oo -P

a; -P 0) G 0 -P g -p -p G rP :G G

P i—I -P > G <—I β» -P i—I :G I '—I

G g e en g g tn en g <u g x

fM > X -P G g X G O X -P g (1) G

w ·ρ a g wa! e = w e o g > = G a; :G -P :G G -p U -p -h O <D -h tn -h tn g -p -p G -p 0

a: G +JG-P-P -p-pg J-i AI G G P

A -p tn '1 i rp i—i tn rp -p tn en G

3 tn tuo <U (1) - Cg

rPO CC G-P CGG-P

G rP (P CU CD :G tn (D(l)rP CU αι ·γ~> > P

G O G g g rP G G g O Ggtntn

Ep Ai -n -P -p rp -P -rp -P · -rp -p G G O

G GG-PG G :G tn G CD A G

g :G > > tn A :G > rP g :G > g :G G

G g tn ω -P gtnrpp gtn-Ptng G :G G G G G :g G -P G :G G G -P g

CG Ep A A to > Ep A tn A E-< A l> rP -P

G

<D

A

:θ G I tn

A G G

:G > G G

G G 0)

O P G G

A G -P G = = = = rP G O (Hl

P EAPG

G rP G G G G G G K > > -n P dl 3 / en / vd g

P / O O O rP CN

G/O rp (N ΓΟ ro

G / rp rp i—I i—I i—I

P / 0) I I II I

6 /' G fin [G Pp (G U-t P EP EP EP EP Ep 22 6 8 0 8 0 3 n = = = == = = ,* +j m •ro i m

tO ·π I

W H

-P :rO tO

fO i—I >

> rH

H 0) fO

tn p > * CD -H Ή

^ *H O

ti I X5 Ή x: s Ό υ c e

^ -H 0 -H

rH > +J

^ M tn to

Ä <0 O

„ W Λ! C

0 = = = = = :t0 3 =

r^i *h tn E

r* 4J Ή g

3 ItlH-H

Ή (U

2 C Ή

Ό <U (U rH

E-< fO g O

•n -H

tO :t0 tn :t0 > rH p 6 tn rH +j :t0 ro -h 3

ΐτ< X Vi M

Λ td £) ro tN ro ro (N <o o o ro ro ro ro ro H· lto 1—I *—Il—Il—| rH i—I I—| i i i i i i tl tl tl [t| [m [li [il

Eh EH EH E-< EH EH Eh tl 23 6 8 0 8 0 . _ :α)

Ο rH

1 o 1—ι O V <ΰ

^ I I—H

o o o (ti (ti (ti *. o

•n cm -r-ι rH to o O

O * rH O “· i—I O ^ i—I

Xl O il O ϋ «) I

d ro » 3 m ' d rH o •H nlw o Λ m o (ti ι τ

Sh C CN 00 C (N *«0 C CD i—I

-P I I ro I I ro l r~ Ή xl Ooh 0 o '—i O co fl) Ha | H -H CO | H rl * CU ή -P σο o i -P oo o -dc ίθ I CUcn nt 6 CU cn oo CU ^ nt

Og P O Sh ro ^ O (N ; •H O O - i—I O ^ i—I O ro i—t +j^ en o o in o m cr\ d

Cu Xlo -CM Xl O - X) CN - d

Pr-. (ti CN O 00 = (ti CN O d|0 Xl

0 :cti ro in co m o oo -P

cn 6 G i m (ti e i m C (o n (ti

Xl H ΟθΗ·π O O rH · OfTirH -ro

Iti O) O O rH CN I

1 -p :(ti cd «· - icti vc> — i i(ti ». o rtid) Un O O B) H O g Id O Ν’ ·

CC uirro 1/1 NO II) O N rH

d CL) "P (CÖ CO O H ti ID -P CN rH | CU 6 Cl rH rH rH U H i—I O SH pr) £jj rtil -PrHii -P —I l cn -Cl^o

P P Xl CD O o X (1) o co Xl o O

p ta <u x: r- α> x: r- <u o m o G IP 0 :iti co Ή CU :rti co (ti <Xco m cn hH N—* C/0 rH |—I rH CO 1—I I—I *1 I ΕΛ PO I—I 00 x:

-P

(ti •ro ^ (0 cn γη en ·· e o u ·· x o u x o o d rH o

rH i—I O

d cn (ti

Eh C -H

-P (ti cn -P (ti o > TO (ti

(0 -P

x: -p O (ti = = = = -P -h g en o o •p x d cu h £ m

U) (ti <P

Ή Ή rH

6 ¢) ui 0)

(ti (ti O rH

O -ro-ro O

ro iti d

(0 :iti Xl CU

K 6 =(ti

:(ti (ti <—I

£h TO >i gl / co Ό

•P-P/o OO rH (N

(ti Cl) / O rH CN ro ro

C ^ / rH i—I i—| rH '—I

•p d / 0) i il i i d / (ti Cu CPPu lp [p iny P) EH EH EH Eh Eh y 24 68080 3 3 λ: -μ 3 •π Αί -Ρ <η Γ-1 3 3 ^ (Λ ·γ~ι 3 U) (Ν ω ·· 3 ι co U to :3

· O L0 <—I

O υ Ο ·· >1 Μ Ο οο Ο rV! o CN 0 3 3 rH r—ι ··

Ή tN · HU

3 GO

3 · · o

Eh G -H G O

-P CN

3 CO (0

-P 3 -P -H

O > O -P

•ro 3 -r-ι(Λ (0 -P 3 (0 -G -P .G > = = = = = 33

•HE -H -P

0 0 0 -p M 3 P* 3

H £ Ή E

3 3 0 •H 3 0) U3 O G 3

3 0 3 rH

1—1 T—l -n -iH rH

3 CO 1)

:3 G «OH

G E-nO

:3 3 :3 3 3

Eh Ί—I EH G Oj G 3 G ro cn m oo cm co o o oo ro oo ro ro ^ m

'—I I—I r-H I—\ ι—| r—| f-H

I I I I I I I

ke Ph Ph Ph Pn P=i Ph

Eh Eh Eh Eh Eh Eh E^ 25 68080 rr 1 τ!

° > S

w . o as^G3 > d ; •HH '2 m 5 C 03 B H .** 5 O+J c d n £' * U Sc * O C 1) (N ® 'π tn «I g o m <n I -—--------- O ^ v o o ω ° ° h ^00 * 1 ' d -C '° fi cL > ° ω e * ·" ° » 2 > 0 :(0 O l S m o _ £ -H tn ^ . 03 I oo v Λ o 7) :<0 en ro Π3 A ^ -n •n (/3___________

-- I 0 0 D CN Η H +> H

00j — . _ _ _ V* Cj /—* (ΰ £ fQ £ (Q (¾ M 0 03 -m C -Γ-l q n § § ,3 S5 ^ (0O <0cm (0 (0

-«(rio <—I H (D I—I Γ-· (HO HO

(rtiM H H(N I—I CM HO H 00

p_, ._( .Tj (0 (01 (01 (0 CN (0 CN

n n '(“»P -no Ή CO -HI ·η I

jj .17 (OS (Oin (0o <0o (0o ω[η u m<n d cn ο tn q r-

Xi Λ 'a OO O O O CN O N

S η H O H H -H i -H

ϋ -P :(0 (N +/:(0 +i :(0 +/ :r0 +J :r0

*> , D( H DiH DjH OjH Di H

»Ti ti ki Mi—Il Di—I Di—I M »—( Mr—( u+j5 003 0Φ 003 003 OQ3

±J M £ 'Λ+0Ο U3 A W jC W £ 03 A

,_H Φ J A :(0 tn ja :(0 A :(0 jD :(0 Λ :(0

M* r< <JH(n <H < H <!h i< H

___i___;_____ •CT inj i cm IH i o— i vo w CM- CM- O- CP - CO - “* -lp -lp -m -lp, -m

^ S ~ ·=Γ CM -CT (M

>1--------

H

2 C2 I CM I CM I tn | ccr 1 t— U3 P^CM- LP- LP- OO - MM- 3

2 -LP -UM -LP · JT -LP P

χτ -=r ro ccr ^ c ---------%

I f- I O I CM IO ICO H

CP- H- O- CO- -H

3 S -L -Ln -h -O *xr -cp +i

Hr oop ipj lp h* oop — m O

" O OP OP OP OP cp ,-ι I|

Λ A CD (0 O

2^/ o o o -H pj

Ξ / O rH OJ ΓΟ ro II

h Ja / '—I rH i—1 i—I (—! β V Cl) 1 1 1 1 1 U / $ A fc. fc fx, Cc, > / 2 Eh Eh H E- Eh U--2—----- > 68080 26 ------!----- •

P

P

X

-P

<0 m λ; -p (0 n _____— ---------

CM

O

OS (0 (0(0 (0 rfl (0 2 ' f| Ό Ej Ί-11 £3 '(—' -Γ-1 -I—I ^ T”I g dfOO (0(0 (0 (0 (0

d -HO Η CM -HO HO HO H CX\ HO

r_C H 00 HO h 00 H 00 Η Φ HO HO

^ 1 ίβ OI <0 CM (0(N (0 CM 10 (M (0 CM (0 CM

ό I Γ-l I -r-ι I ·η I -n | ·π I ·η I

(0o (0oo (0o (Oin (0o (0 o (Oin S-to MO hh Mo Mo Mo Mo

0 CM O CM O CM Ο CM OfN O CM O CM

Η Η Η Η Η Η -H

P :(0 -P :(0 -P :(0 -P :<0 O :(0 -P :(0 -P :(0 CXh Cl-H CUH DjH OjH G(H Cuh Μη mh mh mh mh mh mh ο φ oq) od) oa) ΟΦ oq) οω cn x) in x tn x w x: wx: cnxi cnx: Λ « -Q -Q XI :Φ X3 :(0 X) :(0 X) :(0

<CH < Η rt! H rt! H <! H < H rfj H

l~ I 00 I ^ l^T IH I in I rvj CO - LO - ~ co - o- o - CO - fc O' -O ~ — - ΙΟ Ό «vO - ΓΟ (^ -^ (O f\| LO LO (\j |VP IH ICM I Ό IO I IP l^r · in- cr\ * cr\ - c\j - o- o~ -LO ' LO -LO -LO -^r -CO . — -=r on ro m ro ro ~

1 LO I Ό I LO I^T I LO ΙΟ IO

CO - o - H- CT\ - LO- O- O- - CT\ sO · OO -CO - (\| -OO -^r uoro co m non corn r--.cn ojcj r-im co c\j m c\j c\i rvi ro .o cO jo ro OJ CO CO (\J LO o o

<ο m ro (o ro -r IO

H --1 H H r-l -—I r—i

I I I I I I I

B"· f1 £h t- CP Cr_ Dl, Η E - cH E-< E-1 F - E-1

•—I

27 68080 e (o H -m

o E

* VO O

0 r- * o Ν' 00 I O VO ro Ai g ro o oo r- -4-1 I 5 (N ro I I nj 1 VO O -ro

N O I (N

O CN · · VO > I

en vo > et) > · γη

(N · -ro · il) > E

K :re) > > -ro

IE :tU O

•H H :n3 o :rö o i—I oo

Ctl) .H CN rH(N i—h m

O -P I—! LO i—I LO CU I

M Q) CU I CU I JS o -PC jS o jS o :te) n C (U :te) (N :<rj cn J m

<C E Cl n 4 N

o o

CM CO

-—' I lo in

• :rö I I

AC e o o o

Jr H iH 00 r-4 n Ό (U N N E ro

° K 4 I

^ X 0) - O O

C o vo vo o f'1 o (U oo ro i-ι n 0 E ro ro

o tN I III I

AJ I *3* I—I I—I i—I

-¾ O O · E · E · · E

en > > > > '“J X cn · o »o · -o PQJffi >vo > vo > > o to ό | σι E-1 te) -H g :ifl l :π) I :cc) :te) l

JS 4 g r-4 O p-4 O 1-4 rHO

Pit O i—I ro <—I r—I (—t r-H CN

(UCo tu vo turn CU cu e'en <u σν x x x js

Pm N :rt) ce) :ce) te :rö :re) te) 4 -n 4 -n 4 4 to CC) 1—4

cO -n g rH

το E

m o o cn vo 00 co ro 1—t n 00 ro ro 00

S III I

C I o

• r—I · · CN

o > E > > Γ- vo · » i-4 · > cn CN > O > G > · nj e

CN > -ro G

:<e) oo :te) in :rc) > i—I 1—1 f— 1—I 1(C) O CC)

<—I I <—1 CO r—I 1—IO 1—I

0) CU I CU r-l r-~ -H

JS O JS IO JS CU I -P

:ct5 o :<e) r~ :ce) X o O

4 vo 4 r- 4 :rt) o 1—1

4 vo CU

--------4 1 -p c

H CU O

CC) 'TS VO (0 CS) O OO rH CN il H S) O 1—I cn ro ro E cn »—4 r—i 1—1 I—j 1—i · O CU I II I I > te) Pm [m Pm Pm Pm _JO_E-t_H_H_H___Eh > 3 28 68080 Ή Λ 6 3 3

0 C

cn o ^ -h a -P 3 ί a,

M -P

• o id > CO -n > 3

:3 O

1—1 M

H x

0) -H

33 QJ

:3 tC

i-3

i—I

Ή Ή rH fd g .H

e e g & g

3 - O

o o o (d o o o tn lti m C o o ld Ή I—I I—I o ΙΟ H 1—|

•H I

1 I I -P ! O I

(h m M · · P · co -^ > > > O > > (d · · · to · td tn > > > 33 > -r-ι > td :3 :3 :td :td o :td CN iH H rH O i—im r-l 1 Ή Ή Λ! i—I CO ιΗ Ο d) d) d) M d) I d) 3* 33 33 33 ·Η ΧΙΟ χ3 3*ί :3 :<d :td d) :td m :3 3 k3 J h3 K PI to p]

I—I

3_________

fQ r-H

^ · · g « g g to - o

0 O O rH O O O

m r·' to g o o o 1—I <—I I—I n I—I I—!

O I

I I I co I o I

σ\ o • · · I · O' > > > o > >

• · · T* · fd · rH

> > > η >·Π > E

:3 :3 :3 :3 :3 O :3 O

rH Ή rH rH rHO H to

1 I '—I I—I I—I I—ΙΟΊ I—li—I

d) d> Φ CD d) I CD I

33 33 33 33 33 o 33 o

:3 :3 :3 ;3 :3 O :3 O

J t-3 1-3 PI Pin μ3 Ή 33 33 co

CN CO CN l£> O O

co co co co m

Ή Ή rH rH rH rH

I I I I I I

ki Pm (h Cm ti ti

Eh__Eh__H_Eh_____Jh 29 68080

C

♦H

ε (O o •ro vo o O -n VO ^3 | CM 3 CO <d td vo λ:

ro -ro -ro -P

- 3 *. nj nj (d ·η (d <d 3 3

^ § -P -P -P

-P C 3 3 k; O 3 *3 ·3 Ή R VO ·3 3 3 3 R CM p = 3 3 3 3 *H *3 *3

•H -H -P -3 -P

E -3 O O O

GO 3 3 3 3 3 ·3 · ·3 ·Η 3 -3 I—13·—i '—f tji I—I -3 O :nj G :rd '-3 -P :td · >—i ·—1 1—I 3 • 3 >—I 3 ·—t O I—I r-H ‘3

,Υ G I—I *3 Φ VO Q) a> G

-p ο ω G j3 i χ: xi 3 3 XI :3 co :3 :3 uo το ,Y :rd x> 3 co Pi 3 vo — 0) 3 vo -3 CM 3_____________ 3

O

,Y 3 3 X >i -3

3 > 3 E

I—! >1 TO

3 -Y O

3 (Λ O vo

Eh 3 vo I

X) I O

O co "=i* o

Sh ro 3 ro CD -ro td ·. -ro - 3 3 3 3 0) 3 3 3 3

3 g -P -P -P -P

CQ 3 3 3 3 3 •3 *3 '3 *3 0 3 = 3 3 3 CM 3 3 3 3 3 CM -3 -3 -3 -3 -3 -P -P -P P ε 0 0 O 0 3 3 3 3 xi

•3 ·3 · *3 -3 VD

i—I Ή 3 Ή r-t •3 (d :id · :rd ε :id ;<d ό ή 3 ·—ι γ3 '—ι Ή -3 ή ο ι—ι .—ι ο Φ g α> νο Ο) φ vo χ: χ: ι χ: χ: ι :<d X) :rd co :rd :td 00 (3 vo Pi ro PI Pi ro P " ~~ | Φ VO (Π

-3 Td r3 CM

Cd 3 O O O ro ro

3 3 O r3 CM r3 .—I

-3 CO ι—I ι—I r3 1 I

ε ι ι ι Pn (χ O <d to &Μ Pn H Eh W Eh Eh Eh __Ω___L____________________ 30-6 8 0 8 0 --1-1-1——I-1- m -a- 3 fO rtJ to ro to

O

(Ti O id

00 10 I

I I o njo m 3 ro in ·ι—ι 3 3 r0 3 π3 Π3 3

3 3 3 (0 (0 <0 rtJ

TO TO TO TO TO H TO

C C C C C C C

TO *3 TO ·Η Ή *3 Ή

M M TO M TO TO TO

CC CC C C CC

•H *rH Ή ·Η ·Η ·γΗ ·γ-Ι ·Η -Ρ -Ρ ·Ρ 4-* -Ρ -Ρ +J g ΟΟ O O G O C Ο ο 3 3 3 3-3 3 -3 3 3ο •Η TO ·3 ·Η g -3 g -3 -3 ιη TOTO Ή Ή TO HI G TO | 0 0-3 00 TO TO TO TO in TO ip :3 g TO ^

-—' '—I G TO C '—Ι3Ή I—I I TO TO

• TO TO TO -3 TO -3 1-1(¾ i—l 04 Ho TO 3 X <v ε <u ε α> ε αΐτ-ι φ n· atm <υ·η -c x x X χ ^ χ: ι χ

3 TO cm TO cm TO IN TO ιχ> TO 3 TOO TO CN

TO GJ in iJ ID hi Φ 1-3 00 1-3 -ro G] N< TO 00 nj 1 3 0 oo 3 -3 Λ! -H g χ e

3 3 O

rH -ΓΟ O LO

3 m 3 r- 3

Eh ro 3 -ro

I TO

ID 00 VO (N

oo 00 oo ro ro oo 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

TO TO TO -U TOTO +J

C 3 33 3 3 3 3

TO -rH TO TO TO -Η Ή TO

TOG 33 TO g TO G

C 3 3 3 3 3 3

TO *3 -H -H TO O TO TO

TOTO TOTO TO id TO TO

0 0 0 03 0 I 03 03

3 3 3 3 TO 3 CN 3 TO 3 TO

TO -3 TO TO g -3 13* TO g -3 g '—\ ι—I (—I TO (—I ι—I 1—(

. O (¾ O O

:3 :3 :3 :3 in :3 to :3 io :3 in TO3TO ι—1 TO| r3 ι—I I TO| TO -3 TO TO TOoO TOo TOO TO U0 Φ g φ Φ φ << φ n> φ *)· CUN' x: x x χ χ ι x x; :3 o :3 :3 :3 3 :3 co :3 3 :3 3 J m J G1 i3 to TOcn TO to ι-l -n 3 3 X5 ro

CN 00 00 CN vD O O

00 ro ro oo ro -sr m

1 ^ 'TO iTO r3 ι—( i3 ι—I

I I I I I I I

fci ITO fr* (TO pu, [l, (TO

Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh 31 68080

G

•H

0 o , , , , , 1 -H + + + + +

>i-P

p m; !ä <0 O d) pj m r—i u

K

H -H + + + + +

<—I -M

0 Λί Ό ro C 0) H M____ *r 0

W

(N

ΐ + + + + +

H O

— q -h

• O 4J

λ; q λ; -P -P rd ro c ai r~> < q o

<N -H I

4J 'a* o ^ o

M (0 W

-X <1) (N

3 u ®

H -H ' O

3 >4 -H -H 4. + + + +

*0 au H 4J

Eh > O X

C (0 <U <U ft, p

X! O

O ·Η j. 4. 4. 4. 4.

U) -P •W A! 1—I r0 O 0) S u ~1-----

•H

c

•H

o ° + 1 1 1 '

>1 -P

q ro •H 0) z u_______ I -P ~PP’

3$ / U, CO

C3 / O O O iH C\J

rj / O 1—I OJ ro ro

g m / m l*H t—1 1—( r—( rH

& J « I I I * ’ /h, fe Dt, fc t.

E-ι E-· E-* E-i En

— "F

32 68080 + + + + + + + 0 0

X

+> __________<d π + + + + + + + + + + + + + -f-

P

•π

(N

O X M 0 f—I 0 Ά + + + + + + +

H

+ + + + + + +

I I I I I I I

£3 α) ΰ ro

CM n") OO CM VO O O

on on m m on j m rH i—( l—( (—^ I—( I—( r—(

I I I I I I I

ÖH fc ptl Ctl fc &, EH E~* E-1 E-< E-1 E-1 En 68080 33 G G atJ <Τ3 -P ιΗ

Λί +J r-H O O O O

H <ΰ :ιϋ ~ - o en +j g oo pj - po co 03 -H f-H PJ PJ PO Pvj Pj

> g CU rH

p · · · ·

M - Q) G G · G G

3 Λ G C

G G Oi tn -h g i i I i

•H G -. I

0 -H G cM O O O O

-P Ή ·Η — » - O

•H g - O OO - O CT

Dj G G PJ i—I OO r-i rH

1 Λ H

•H H H · · · · ·

CGO G G G G G

•H -H pj •H g I 0) G >1 -P P P O 0) >

— P (1) O

• cm tn Pi .*________

-P

HS I

•Γ-l -H |

'-'I tn (U

es o f ° °. °. °. °

_ -¾ VO CP PO O ^T

o , GO ^ VO >- ^ VO

λ; tr> rs .

3 K G e · G

«-) i tn i e

G ' G -H

G G Ή I I I I I

EH tn o 1 1 1 0 S # °. o ° °

tl ^ ^ o O VO LO LO

3 m LO po LO j

1 -P :ttS

•H 4-J «—4 · · · ·

Ό I3H CG G G

-rj P :<tf P -P g ιβ EH M <U

M *> -P

(t3 (tJ Q) . LQ S SL·______ 34 68080 ο ο σ\ o o * - * o - o

CO CO c\j c- * CM

CM CM CM rH CM CO xr rH 1—1 e g e e · g e e

I I I I I

Λ I I

UM O CO O O

* - - - o - o

CiO CM CM rH - in rH CM r-l r H MD rvj e—.

• · ... .

e e e e e e e i Λί

4J

ra ‘J31 lp, o en o o o * * - - . o pjCnen-^rmo - en -=r m cm cm en en en

O · . . . M

G · G G G · G

3 C G

^ 1 I I I I I

ία 1 o o o o o o * * - * r o ON CTn CJ\ - o O-J (—I ,—I Γ—\ LPi sz * ^ * · ·

* e G G G G

ö G

.a ca Λ m cm m m cm eo o o en m m 00 m xr Ln * I 1—I rH 1—I 1—I 1—i (—4

I I I I I I I

fc ϋ fc Pl, pt, fc. (X.

E-1 8-1 E-ι E-t E-r E-* E-1 35 68080

Taulukossa 2 käytettiin Sephadex G-50®:lle, joka on merkitty "x":llä, 50 mm0 x 600 mmm pylvästä ja tislattua vettä eluent-tina; Sephadex G :20((¾ lie (Pharmacia Co-, Ltd:n rekisteröity tavaramerkki) merkitty "x":llä, käytettiin 44 mm0 x 500 mm: n kolonnia TF-110:lie, 120:lle, 132a:lle, 133a:lle, 136:lle ja 140 :lle ja 21 mm0 x 400 mm:n pylvästä TF-1316:lle, 132b:lle, 133b:lle, 1323:lle ja 150:lle, ja eluenttina käytettiin niille kaikille 0,1 M fosfaattipuskuria, jonka pH oli 7, ja saataessa suuren erotuskyvyn neste-kromatogrämmi, joka on merkitty "x x x ":llä käytettiin 7,9 mm0 x 600 mm x 2 TSK-GEL G300SW^· (Toyo Soda Co., Ltd:n kauppanimi) pylvästä ja eluointi suoritettiin huoneen lämpötilassa virtausnopeudella 0,8 ml/min käyttäen eluenttina 0,1 M fosfaattipuskuria, jonka pH oli 7.

Näiden karsinostaattisten aineiden TF-100, TF-110, TF-120, TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-140 ja TF-150 farmakologiset vaikutukset ovat seuraavat: (I) RF-aineiden vaikutus solujen elinkelpoisuuteen (kasvu-pesäkkeiden muodostumisen määritys).

J.H. Chim.'in et ai. menetelmän (Cancer Res. 25, 698 (1965)/ pohjalla viljeltiin HeLa S-3-soluja Eagle'n MEM-väliaineessa, jota oli täydennetty 10 %:lla vasikan seerumia, 3-5 päivää 37°C:ssa C02~kasvatuskaapissa, minkä jälkeen viljely poistettiin ja PBS(-)-liuos (vesipitoinen liuos, joka sisälsi 8,0 g/1 natrium-kloridia, 0,2 g/1 kaliumkloridia, 1,15 g/1 natriumfosfaattia, yksi-emäksistä, ja 0,2 g/1 kaliumfosfaattia, kaksiemäksistä), joka sisälsi 0,01 paino-% etyleenidiamiinitetraetikkahappoa ja 0,1 paino-% trypsiiniä, lisättiin lasiin tarttuneisiin soluihin. Solut irroi-tettiin viljelypullon lasipinnalta ja erotettiin yksittäisiksi soluiksi pipetoimalla ja solulukumäärä laskettiin mikroskoopilla. Solujen suspensio laimennettiin Eagle'n MEM-väliaineella, jota oli täydennetty 20 %:lla vasikan seerumia, niin että se sisälsi 200 solua/ml. Sen jälkeen kun 1 ml solususpensiota oli ympätty petrimaljoihin ja viljelty C02-kasvatuskaapissa 37°C:ssa 24 tuntia, esimerkissä 1 (1), joka esitetään jäljempänä, saatu super-natantti lisättiin solususpensioon, niin että pitoisuudeksi tuli 1/16 - 1/128. Jokaiseen 1 ml:n annokseen solususpensiota, jota 36 6 80 8 0 oli viljelty 37°C:ssa 24 tuntia, lisättiin kutakin testiainetta ja HeLa-soluja viljeltiin kussakin tapauksessa 7 päivää. Viljelyn jälkeen viljelyväliaine poistettiin, minkä jälkeen viljelymaljät pestiin Hank'in liuoksella ja solut tehtiin liikkumattomiksi 70 paino-%:lla etanolia ja pestiin sitten 100 paino-%:lla etanolia. Etanolin poistamisen jälkeen solut värjättiin Gimsa-värjäysliuok-sella, minkä jälkeen kasvupesäkkeet laskettiin ja solujen elinvoimaisuus laskettiin.

Tulokset on esitetty taulukoissa 3 ja 4. Solun elinkelpoisuus taulukoissa laskettiin seuraavasta yhtälöstä. Jokaisen testi-aineen solun elinvoimaisuus on esitetty viiden toiston keskiarvona.

Kasvupesäkkeiden lukumäärä

Solun elinvoimaisuus - käsitellyn ryhmän tapauksessa ---x 100 kasvupesäkkeiden lukumäärä käsittelemättömän ryhmän tapauksessa 68080

rH

•ρ c

rj ττ QO

S -Ρ

0) O LO O O O

φ CO O

4J rH

r-J CT\ 2 m *r-f __________ o a — 1—( (#p n] a> '— -h

Ai 4-1

£ OT £ -LT CO

•H £ £

H £ -p VO C— O O O

<P [/} VO O

-H OJ t—I

£ O C~- £ a rH r—( ro o a) tn a: O £

Ai in -h m 4 £ 1—1 Ή

£ -P Q) -P

^ £ £ co o £ a: £ £ £ ·ρ £ Ρ av o o o o H <U cH on o

►> O CO I—I

£ W ^

•H

P ---------- £ £

P

£ _ £ 'r—i

P P

aj ^ λ x £ Π rn K 00 -— t\i Tr c\j co £ 1—1 CD OO 1—( r—j .—I r-Η ιΗ Ή £

W P

£ a) £ > £ Φ e

•fA

rö 1

PJ

38 68080

Taulukko 4 TF—aineiden vaikutus solun elinkelpoisuuteen

Aine Pitoisuus (yg/ml) S Un ^^elpoisuus | _i_v %)_ 10 99,4 TF-100 50 97, d 100 95,9 10 94.5 TF-110 50 88,9 100 87,3 10 98,8 TF-120 50 91,2 100 83,3 j i I 10 96,7 TF-132a 50 97,4 100 95,9 i 10 96,9 TF-133a 50 95.4 100 88,8 i I 10 95,9

TF-136 I 50 96,4 I

j 100 95,4 ! __!_____________: 10 98,5 50 98,6 TF-140 100 98,6 200 96,8 500 93,4 39 68080

Kuten tästä kokeesta käy ilmi on tämän keksinnön ΤΓ-ainei-den solumyrkyllinen vaikutus HeLa-soluihin hyvin alhainen verrattuna supernatanttiin.

(II) Immunostimuloiva vaikutus Käytettiin neljää ICR-kannan hiirtä kutakin ryhmää varten. Jokainen testiaine liuotettiin 0,2 inhaan fysiologista suolaliuosta ja annettiin sitten vatsaontelon sisäisesti hiirille. 24 tuntia antamisen jälkeen 0,2 ml hiilisuspensiota, joka oli valmistettu sekoittamalla 1 ml Pelikan Drawing Ink 17 Black (valmistaja Gunther-Wagner Co., Ltd.)-tussia ja 2 ml fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 3 paino-% gelatiinia, annettiin laskimonsisäisesti ruiskeena hiiren häntään ja 1, 5, 10 ja 15 minuutin kuluttua ruiskeen antamisesta 0,02 ml verta otettiin silmäkuopasta käyttäen verisolujen tilavuutta mittaavaa kapillaaria, joka oli päällystetty hepariinilla, ja laimennettiin välittömästi ja punasolut liuotettiin 1,6 ml:11a 0,1 paino-%:sta vesipitoista natriumkarbonaattiliuosta. Tämä suspensio saatettiin kolorimetriaan 675 nm:ssä ja syöjäsolu-indeksi, nimittäin K-arvo, määritettiin Halpern'in et ai. yhtälöstä .

Vertailuryhmän hiirille annettiin 0,2 ml fysiologista suolaliuosta.

K = i°g c0 - log c 1 - h jossa CQ = hiilijauheen pitoisuus veressä ajankohtana tQ, ja C = hiilijauhepitoisuus veressä ajankohtana t.

Tulokset on esitetty taulukoissa 5-7.

40 68080

Taulukko 5

Aine Annos (mg/kg) K-arvojen keskiarvo TF_1Q0 10 0,0851 ± 0,0145 50 0,060 5 0,0 30 2 TF-110 5 0,0901 i 0,0213 20 0,1025 ± 0,0025 TF_120 5 0,0718 ± 0,0152 20 0,0559 ± 0,0107 TF_13l6 5 0,0832 ± 0,0193 20 0,1001 ± 0,0296 TF_132a 5 0,1102 i 0,0203 20 0,0809 ± 0,0296

Tp_133a 5 0,0851 ± 0,0057 20 0,0769 ± 0,0179 tf_136 5 0.0959 ± 0,0087 20 0,1027 ί 0,0159

Vertailu - 0,0300 ± 0,0024 68080

Taulukko c

Aine Annos (mg/kg) K-arvojen keskiarvo ____________,_i TF-132b 5 0,1190 ± 0,0051 20 0,1073 ± 0,0031 TF_133b 5 0,0550 ± 0.0020 20 0,1099 ± 0.0075

Tp_150 5 0,1399 ± 0,0011 20 0,0577 ± 0,0098

Tp_1323 5 0,1^00 ± 0,0075 20 0,0685 ± 0,0126

Vertailu - 0,0286 ± 0,0035

Taulukko 7

Aine Annos (rag/kg) K-arvojen keskiarvo 1 0.0891 ± 0.0156 TF-140 5 0,09^6 ± 0.0139 20 0.0815 ± 0,0200

Vertailu ~ 0.0379 i 0,0048 J

__J__L_____j

Kuten taulukoista 5-7 käy ilmi ryhmät, joille annettiin kutakin tämän keksinnön TF-aineista, osoittivat retikuloendoteeli-makrofagien aktivoitumista verrattuna vertailuryhmään ja normaali-hiirien solu-immuunius lisääntyi.

(III) Karsinostaattinen vaikutus (a) Kasvaimen vastainen vaikutus Ehrlich-vesivatsakasvainta vastaan

Ehrlich-vesivatsakasvainsoluja ympättiin vatsaontelon sisäi- ! « 68080 sesti ICR-kannan hiiriin (6 viikon ikäisiin naaraisiin) määrässä 5 1 x 10 solua/hiiri. Sen jälkeen jokaista testiaineista liuotettiin 0/2 ml:aan fysiologista suolaliuosta ja annettiin sitten vatsaontelon sisäisesti hiirille kerran päivässä toistuvasti 7 päivän ajan kasvainsolujen ymppäystä seuraavasta päivästä laskettuna tai kerran päivässä ensimmäisenä päivänä ja kolmannesta seitsemänteen päivään yhteensä 6 päivän ajan. Taulukossa 9 esitettyjen testiyhdisteiden tapauksessa kutakin niistä annettiin hiirille kerran päivässä ensimmäisenä päivänä ja kolmannesta päivästä seitsemänteen päivään yhteensä kuuden päivän ajan kasvainsolujen ymppäyksen jälkeen. Vertailuryhmälle annettiin 0,2 ml fysiologista suolaliuosta samalla tavalla kuin edellä.

Tulokset on esitetty taulukoissa 8 ja 9.

Hiirien elossaolopäivien luku m/c _ ryhmässä, jolle annettiin alnetta--- X 100 (»)

Hiirien elossaolopäivien luku vertailuryhmässä 43 68080 —i—I-^ I I \ si

*0»H

R pH (—j ' H rH I—i i-H

±> Q * Sfc * * * «j -H :(0 gif o o ^ oj cm m in in -=r -=r -=r md md ud vo md md ό \.c \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ v ! rö .q mo c\j m o cm cm o rH ο ή o m m o

Q) rH

s:f0 :r0 :¾ •ΓΊ ;tn

If

W rH

_K_______ O oj o oj ro ο -=r ro o >—ivoino o- oj o \ ό o <r ca o in in o oj o ro o ό vo t~- o £h '—' I—( rH r—I rH rH I—I rH rH rH rH rH rH rH r—I i—l t—1 Λ ΛΛ ΛΛ Λ Λ Λ Λ Λ

______L

ι ! tn Q) ,Χ Λ Ο :(0:(¾ η σ\ - σ\ oo ro oj oj m w οο oj co vo αο π -H > - · O - - ... - ----1 00 >.H OO rH ι—I OJ .—( O0 CT\ OJ 0— ^q- OO OJ t~- OO Ό Or | •H :(0 ι 0 :<0 (it +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +i +1 -h hi .x a— ,Χ 0 m mo o in a) in m co oo ro 00 oj oi 00 r- o j 3 HC ................

Ή O-H oao -=r OJ Ό C— C— C— O CO no t~- O O O' >-

C (OP ΓΟ rH OJ ΓΟ rH CM Λ1 H OJ rH CO H OJOJOJfH

(0 W :(0 Λ ΛΛ ΛΛ Λ Λ Λ Λ Λ Ε-* tn :(0 0 e rH ·*Η Μ ,Χ 1 ϋθ Ο Μ Ρ :(0 C :(0 (0 ^ tn,X Ο- Ό M3 ΙΠ CO VOVXOVO VO Ό Ο

.X C

\Η XI XXI XXI XXXI χχχι tn EC o o o oo rHino ,—iuno

— (U C— H in H in rH -H

•ro tn o

O -P

c p c a) < .x ι c0 c0 Ο Ο o OJ nn o rH oj ro m Φ I-1 I—f l—i I 1 f—1 g I ι I ι ι "'"J fr fr fr fr. fr 'h E-< Eh E-< Eh Eh 44 68080 Ρ

CD

0)

____________,__G

3

4J

c (0

P

I—( r I OJ CM CM (¾ * * * * * Cu

rH

P

O O O O G

md vo vo n ρ p n in n in cn in in ρ ρ ρ p CD

CO

\ \ \ \ \ \ V \ \ \ X \ \ \ \ \. \ P

I”I

.-103.-io o cm o cm ρ· o p cn cm o q- co ιο ο ή (1) T3 >1 C G :rfl CD CD P CD CD M ,* P r--i I—I 3 :rd :3 > τι -n Ή

______ I—I G G

0 CD CD

tn in •=r vo in o r— C"- o md m o co n n o m vo o o G-p-p

en c~- p- o cm co o co ρ o cm c-- co o o- cm o o ^ 5 S

Ρ Ρ Ρ P rp r—I r—( I—I CM I—I Ρ Ρ Ρ P i—I CM OJ .—I 1 , ΛΛΛ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ ^ Η Η 3 Ρ Ρ "" ---- (Λ 3 3 • ρ Ρ Ρ H G tn en > -ρ -ρ Ό ·Ρ

f-1 tn e G

cm σ-xrPinooo 00 invpcMCMCM»cr\oomcM - - - oj - n - p ^ L’

- - - - - p » - «· - p cm o - o - p - PPP

Q VO lO OQ OJ LO rH (—i CO -^3" OJ I—| r-H r—\ OJ i—i CO r—H *-H ^3 0 0

^ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 41 +1 +1 +1 +i +i +l +i +i +i +1 p e G

p oooocm oooin ooco ocmooco ρ- ρ- ο ο °φ ίΰ 3 mono- oj cm c inoco p- ro p- co o-. co p c— nimfn

Eh cm m c\j p cm m p ro ρ· p cm en en p cm m m p in m

ΛΑΑ A AA AAA AAA

P

cn :3 :3

•p G G

<D :3 :3 - p > > :3 -P -P :3 :c0 :3 nan. G 0 O LO O P m p·

CD

LO LO LO LO LO LO LO U) Ό LO 0- C— O- 3 3 XXXI XXI XXI XXXI XXXI icSoIq)

:ccj Ρ P

Pino 'no no ρηο pno ·· χ m m pcmo ρ ρ ρ cn :3 O 0 --4 3 p > >

Ρ P G P

3 CD <1 (0 33 ε ρ: O >π -—104 --.—1----3

K K K X

vc xd .o m

VO rH OJ on OJ

on on on on m

f—I i—1 I—I I—! rH

I 1.1 I t tu Pn fu Ph E-1 iH E-^ E-1 &-* 45 68080 §1 *Γ“Ί I—\ 3 c 4J Φ (Ο -H :ιθ o la in ·η si ‘ j :5 la h —I ia h la la la la +1 Ä ^ '9 « 5 \ \ \ Ή \ \ \ \ \ g

Sovi ca -=r o on on la o 'H

O 1—I

3 :9 Ή QJ :§ α> 1¾.¾ % •|;|% 2 8 ,¾ UO +* Η 3ΓΟ <0 W >Η — > ---- ·Η γΗ Ο 03 O CO CO Ο σ\ΟΟΟϋΟ ® \ &% — ο- σ% o la νο co ο

£-1 **—' γ—1 ι—I ι—I ι—I γΗ ι—I rH γ~Η ι—I

ΛΑΛΑ ΑΛΑ ~ ------(0 1 «ο Λ ΰ ! £ § ' 00 05 O :<0 on la Is- · ·=τ o- la Λί -Η ~ - - - -=τ · - - - £ -V > :rö ο\ o- m H on la -=γ ο ιΗ 3 -Η > 33 Ή :ί0 -Η +ι +ι +ι +ι +ι +ι +ι +ι +ι ,-ι 3 CV(0 ^ *0 OCU VO O LA -3" CT\ LOOOAJ , Ε-ι H— ..... ..., q Ο m C— ι—I CO LA OCVILACT, Ό G (\J CM ΡΠ (\J r—I 0ΑΓΑΓΑγ-( ,h tf> -l-Ι ΛΛΛΛ ΛΛΛ (1) ω U Φ ° % oo ι—I .(0 33 - W s I___«

I 'H

g £ :9 :0 G G :(0 (0 .-(0 :9,

* -S G

3 VO VO V£> VO vo vo vq 0 ετ>Λί ^ ^ 3 X X X X I XXXI φ N rH #

LA rH LA O laoo G+J

£ “ rH rH LA 5(0 05 " O ;(0 Φ

tn n ·* G

SS *3

5 ® Ö) G

TO L| __ Λ 10 « 0) ° o

Ϊ5 LA

5 rH rH

* p!. (i s E-I '6H 2 __ s 46 68080

Kuten taulukoista 8 ja 9 käy ilmi koki ryhmä, jolle oli annettu kutakin tämän keksinnön TF-aineista elämänpidennysilmiön verrattuna vertailuryhmään.

(b) Kasvaimen vastainen vaikutus kiinteätä Ehrlich-kasvain-ta vastaan (1) Ehrlich-kasvainsoluja istutettiin ihonalaisesti ICR-kannan hiirien (naaraspuolisia 6 viikon ikäisiä) kainalokuoppaan määrässä 4 x 10 solua/hiiri. Sen jälkeen kutakin testiyhdisteistä annettiin hiirille kerran päivässä toistuvasti 7 päivän ajan ensimmäisestä kasvainsolujen istutuksen jälkeisestä päivästä lukien, tai kerran päivässä ensimmäisenä ja kolmannesta päivästä seitsemänteen päivään yhteensä kuuden päivän ajan. Vertailuryhmälle annettiin 0,2 ml fysiologista suolaliuosta samalla tavalla kuin edellä kuvattiin. Kasvainten painot määritettiin 11. tai 14. päivänä kasvainsolujen istuttamisen jälkeen. Kasvainten painot määritettiin mittaamalla pääläpimitta (a) mm ja pienin läpimitta (b) mm mikro-metrin avulla ja laskemalla seuraavasta yhtälöstä: a x b2

Kasvaimen paino = _ (mg) 2

Tulokset on esitetty taulukossa 10.

« 68080

H H (AJ 0\J

* * SK * o ^ h vo η o vo un o ru-3-000 f-1 0 -=r 0 \ <aj on caj 0 ο- nr 0 ¢^3-0 t— vo — 0

£H v—' r—I r—| H H

i H — 3

At tX> 0 JP. ^ ov ih ov nr on nr h 0 caj vo vo 0 0 vo ^ >—1 cv h in vo un nr vo 0 on 0 ^r^roo p

*-H U , fc . »»«·«· «»··.>> (U

p, ^ rHrHHLO. !M H on in 3· 3T d> VO UA nr σν 'π

OI (0 I

g α

♦H

m · > m en :nj (0 :t0 « g

M

d)

At

O

P

Ö (0 . o :r0

i—l X M

:(Ij VO ‘.O VO VO VO VO VO VO VO VO VO

O tr>:rO

X,Mg xxxi xxi XXXI XXX| -V \ 3

O O O (AJO i—I LO O H LP. O

p—| g n ro o o i—i i—i <—r

G ClpH rH rH

(0

E-ι tn G

O 0)

G ta G O

< P ____ Ή ·Η Ή P 4-> 4-1 to to tn Φ φ 0) •h to tn -h tn

4-1 -H -H 4-1 -H

tn :<0 :rö tn :r0 0) tn tn a) tn tn h -h tn -h •h tn -h tn -h tn

:r0 G P G :<0 G

tn o tn o tn o

•H rH d) rH *rH rH

to tn <p tn to tn a> H G P H -P G 4-1

P o G ro G O G

o g o h 2 e O

4-1 H fO t0 (0 -H rö c x tn c tn a: tn < tn P O P tn 4-1 rfl ro 40 rO rö r0 P> > H > P) > vo oi n o H CAJ on o on on on

i—I rH rH rH

<u I II I

C O- (ir ϋ Ch -H E-r E-ι E-* E"· <c „_J_ I_I__L_ 48 68080

<\J C\l CM

* X 4:

CM CO O LTt VO O CO O vO O

-=T on o CA D K\ Ο ϋΛ^τοηο /H rH I—1 • ·

G G

a) <d

CD CD

-* X

OO N m CM 03 C7\ CA LOf-lova I—I .—I

— c—I on un cd h u: cm vo on o :aj :ctS

- - - · --- ---- -n -n m m co in -=r cn ir\ in m co ov

M C

0) CD

CD CD

•H *H

I I

4-1 4-> 4-> 4-1 "7 3d ---_____ 4-1 4-1

5 CD CD

"Z ->-t -H

CO

Ό c c CD 01 _ -η -π S 3 s

M .—I I—I

o ° 0 X 0-1— ID CD VO VO VO VO “ f2

V C C

h xxixxxixxxi

rH <0 CO

Η ΙΛ O rHLOO rH LO O £ £ β Ή rH -H » g r_V (0 10

^ XX

:i0 :c0

G G

:c0 :(0 > > •Η ·Η h :r0 :<0 -p a a

CD

a) CD -»-( I—I H1

Ή -P r—I r—I

:c0 CD CO

CD <0 Q) >i >i •Ή CO CO -P 4-1

“ -H -H 4J -P

G :c0 :m CD CD

O CO CD -p 4-1 Ή -Η -H -H ‘3

CO CO M P

-M G C :c0 :rd G O O :c0 :c0

0 g 6 2 S

CO -H -5 CO ^ iy

•P CO (/) rH (N

<? <o ns

> PI J K X

m 40 y) OJ vo CO 3 co co co Jj r—4 c—( rH rj ii I ία

Ch fc pi, c

E-* E—· E-1 O

3

---- S

« 63080 (2) Ehrlich-kasvainsoluja istutettiin ihonalaisesti ICR-kannan hiirien (naaraspuolisia, 6 viikon ikäisiä) kainalo-kuoppaan määrässä 4 x 10^ solua/hiiri. Sen jälkeen kutakin testi-yhdistettä annettiin hiirille, jotka oli jaettu ryhmiin laskimon-sisäistä antamista, ihonalaista antamista ja lihaksensisäistä antamista varten annoksissa 10 mg/kg tai 20 mg/kg kerran päivässä ensimmäisenä päivänä ja kolmannesta päivästä seitsemänteen päivään yhteensä 6 päivän ajan kasvainsolujen istuttamisen jälkeen. Vertailuryhmälle annettiin 0,2 ml fysiologista suolaliuosta samalla tavalla kuin edellä. Kasvainten painot määritettiin 13. päivänä kasvainsolujen istuttamisen jälkeen.

Tulokset on esitetty taulukossa 11.

50 68080 ^s.

C^O MD VO O VO I—I I—I c~— o -=ro fMf\j^rc\JLT\-^rvr3^ro O rH Γ-Ι \ 51

•H 0 A! C W -H

1)(0 OOrH rH OJ C\J C— Ό UO C\l C7> X a, cor-< cococoootncouDojcr.

CC rn co r—(i—(OjHrocvi^rmvo <D a> ε c

*H *H

<0 :r0 > ^ to :nj (0 :aj X S____ tr·

, Ϊ t* Ol OOOOOOOO I

C^i f-t rHCVfHOJfHrUrHOJ

O 5 S

Ai λ;----.- 3

S <U

i° ·η -n tn ·Η E-· -P -P -H .μ tn tn :to oj

<l) <D tn <D

tn tn -h oj

••j ή tn -H -H

:ta :<t3 Ö +J :rd tn tn o tn tn i

•H -H <H tl) -H

tn tn aj oj tn c c -P -h c ^ o o c <o <u

Tj § i o η ω

Jr ·η -H (0 ta o -¾ a: to g •p tn tn -p o xi c ib m χ: Ϊ5 < P P > H P1 CO c0 c\j ro ro ro <D i—1 '—f

G 1 I

-H ^ ^ < ^ E- 51 68080

Kuten taulukoista 10 ja 11 käy ilmi, havaitaan kasvaimen kasvua estävä vaikutus ryhmissä, joille annettiin kutakin tämän keksinnön TF-aineista.

(c) Kasvaimen vastainen vaikutus Sarcoma-180-syöpää vastaan

Sarcoma-180-syöpää istutettiin ihonalaisesti ICR-kannan hiiriin (naaraspuolisiin, 6 viikon ikäisiin) määrässä 1 x 105 solua/hiiri. Sen jälkeen annettiin kutakin testiyhdisteistä vatsaontelon sisäisesti hiirille annoksissa 1 mg/kg, 5 mg/kg tai 10 mg/kg kerran päivässä ensimmäisestä päivästä seitsemänteen päivään toistuvasti, yhteensä 7 päivän ajan kasvainsolujen istuttamisen jälkeen, tai kerran päivässä ensimmäisenä päivänä ja kolmannesta päivästä seitsemänteen päivään yhteensä kuuden päivän ajan. Vertailuryhmälle annettiin 0,2 ml fysiologista suolaliuosta samalla tavalla kuin edellä.

Tulokset on esitetty taulukossa 12.

52 68080

C M

0 P rH rH r—I CM

^ * * * * s § ro -H :rö •P H Ln vo vo vo vo vo vo vo vo vo vc vo vo ur. m i-i \ \\ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ G CM H O O PO Γ-H O OO CO Cm O Li' U~\ 0 Ό

•H

1 :0 C g 8| r-H 3

W rH

O VD rH O comcvio c— cm vo 0 000

\ ΠΓ r-H rH O LO _n rH Ο ΙΙΛ ~ .ΖΓ O O 0 O

E-l ' 1—( rH I—I I—I rH I—I r-| r—I rH !—li—t rH CO on rH

ΛΛ Λ Λ Λ ΛΑΛ ΛΛ Ο CN > 1-1 :ίβ Γ7 Q > S? o o m d :ίθ G +ι +ι +ι ^ co cm on cm on m in cm cm 00 σ cm 000 5 7ί ·5 VO CV rH σν O rH ~N o l·- CO Ov o, cm —

^ n e CM CM CM rH on CM CM rH CO (M CM rH er -LT rH

^ Λ Λ ΛΑ Λ Λ Λ Λ Λ Λ en λ; ο ο rH φ

W Λί I

Ο ~ Ο :π3 C U Ο :0 :θ ν e g ό vo vo vo vo vo vo vo vo r- r-

Cn ,y I

^r-j x X x 1 xxx xxxi xxi \ f—t ζρ O LT\ 1—I O m rH O LO rH O LP» I E C rH rH rH n< I — Φ

I -r~I

en o O 4J C Vh C Φ C ry cd cd cd o

cm en LO CM

<D m m en en

d 1—I (—I —1 e—I

•H I I II

<C Ph Ch Ph Ph

tH · Eh &H H

53 68080 rö in ---—.. - — ____in

(0 I—I -H P

<%J C\J I—1 CM 3

Xe * * * y) in 0» 0) o o o m ooo £ I—I f—! (—l rH C— C'— I—( I—I —I LO ICO LiO 3

P

\ \ \ \ \ \\ \ \ \ \ \\ . · £ £ £ i0 o o r— o io in o m — ο -=γμο <d φ p rH I—I Q) (D 3

X X SX

rH rH

:3 :3 £ η ·η -H in G £ Cn 0> Q> :n3 in in -p •H *rl -P 4-> >

VO VO VO O moo rH VO O r-HC^-O Ρ Ρ -H

oooovoo m^ro Orno n-t^o £ 3 h

C\) CM CM r—I CM CM rH CM CM rH CM r—I rH Ρ Ρ O

'T Λ Λ Λ ΛΛ ΛΛ ΛΛ WW

Lj -*-1 S-----¢, Μ £ £ 0) .5, Φ Φ £ π ·ι—ι -γη :3 £ 3 :3 ιΗ rH ‘I 1 cn m m Ο Ο £ r-i rorovovovo-movcrv-m |5 2 9 .....rH · cm 5 5 9 n OOvoo">omcY-)rHcr\CMCOrHCM '2 'IJ Tl nj 1¾ O) '3 +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 £ £ _ n in *) rH o o ro o vo co σν ro o co o 5S2 rj r - - ^r-*-^r.-fcrXrXU; 3 oon-— ^rcMmcoo— co^T^r J! tn — ^TrOrHCOCOrHCMirnrHCOOrH C C « Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Jf5 *C0 ’> > •Η -Η 10} :3 :π3 Ρ

On Ρ-, +ι ----Ο» ιη Ο 3 ΓΗ ^ 10 ιη £ £ ··

f—I Ρ rH

Φ Φ Χ Ρ Ρ t·— c— t~- r-— c— c e·'- m vo min XXXI xxi xxi xxi >>iy X £ 0) o m i—i m rH m t—t m i—i ^ ^ ^

I—I

r-l CN

a k . y) p m vo 3 OH CM rH vo ρ ro ro m ro 3 ι—I i—I i—l <—I 3 ι ι ι ι e

li. Cp Cp Cp O

Eh E-« H Eh £

__CC

T: 54 6 8 0 8 0

Kuten taulukosta 12 käy ilmi oli ryhmillä, joille oli annettu kutakin tämän keksinnön TF-aineista, kasvaimenvastäisiä vaikutuksia verrattuna vertailuryhmään.

(d) Kasvaimen vastainen vaikutus B-16-melanoomakasvainta vastaan (1) B-16-melanoomakasvainsoluja istutettiin ihonalaisesti BDF^-kannan hiirien (urospuolisten, 7 viikon ikäisten) kainalo-kuoppaan määrässä 1 x 106 solua/hiiri. Sen jälkeen TF-133a annettiin vatsaontelon sisäisesti hiirille annoksissa 5 mg/kg tai 10 mg/kg kerran päivässä ensimmäisenä päivänä ja kolmannesta päivästä seitsemänteen päivään yhteensä 6 päivän ajan kasvainsolujen istuttamisen jälkeen. Samalla tavalla kuin edellä annettiin vertailuryhmälle 0,2 ml fysiologista suolaliuosta ja 20 mg/kg 5-FU ryhmälle 5-FU-antamista varten.

Tulokset on esitetty taulukossa 13.

Taulukko 13

Aine Annos (mg/kg x anto- Kasvaimen keskimää- kertojen lukumäärä räinen paino (g) ' TF-133a 5x6 4,07 70 10 x 6 2,52 43 5-FU 20 x 6 4,21 72

Vertailu - 5,84 100

Kuten taulukosta 13 käy ilmi, oli ryhmillä, joille annettiin TF-133a, selvä kasvaimen kasvua estävä vaikutus verrattuna vertailuryhmään, ja ryhmillä, joille annettiin sekä 5 mg/kg että 10 mg/kg TF-133a, oli yhtä suuri ja huomattavampi kasvaimen kasvua estävä vaikutus, vastaavasti, verrattuna ryhmään, jolle annettiin 5-FU.

55 6 8 0 8 0 (2.) B-16-melanoomakasvainsolujen istuttaminen ja TF-i32a:n, TF-133a:nf 5-FU:n ja fysiologisen suolaliuoksen antaminen suoritettiin samalla tavalla kuin edellä kohdassa (1). 21. päivänä kasvainsolujen istuttamisen jälkeen hiiret leikeltiin ja tumma-solukasvainsolujen haarapesäkkeet keuhkoihin tutkittiin.

Tulokset on esitetty taulukossa 14.

Taulukko 14

Aine Annos (mg/kg anto- Haarapesäkkeiden Haarapesäk- kertojen lukumäärä) keskim. lukumäärä keiden esto-% TF-132a 5x6 16,0 48 10 x 6 9,86 69 TF-133a 5x6 9,3 70 10 x 6 6,7 78 5-FU 20 x 6 24,8 20

Vertailu - 31,0 0

Kuten taulukosta 14 käy ilmi oli ryhmissä, joille oli annettu kumpaakin TF-132a:sta ja TF-133a:sta, B-16-melanoomakasvain-solujen haarapesäkkeet huomattavasti estyneet verrattuna ryhmään, jolle annettiin 5-FU.

(IV) Äkillinen myrkyllisyys LD^q hiirille on esitetty taulukossa 15.

56 68080

Taulukko 15

Aine Antotie LD50 TF-100 Vatsaontelonsisäisesti 500

„ ---------------------- — -—H

Laskimonsisäisesti >250 1Ί Ω

Vatsaontelonsisäisesti >1000

Laskimonsisäisesti >250 TF-120 Vatsaontelonsisäisesti >1000 mrn Laskimonsisäisesti 300 TF-132a

Vatsaontelonsisäisesti >500 TF-133a Laskimonsisäisesti 300

Vatsaontelonsisäisesti >500

Laskimonsisäisesti ^00 TF-136a 3

Vatsaontelonsisäisesti >500 TF-132b Laskimonsisäisesti >100 TF-133b Laskimonsisäisesti >200 TF-1^0 Laskimonsisäisesti >100 TF-150 Laskimonsisäisesti >200 TF-1323 Laskimonsisäisesti >200 TF-13-l6 Laskimonsisäisesti >t-00 57 6S080

Kuten edellä esitetyistä farmakologisista kokeista käy ilmi, ovat TF-aineet hyödyllisiä karsinostaattisina aineina ja niillä voidaan olettaa olevan vaikutus erilaisia syöpäsairauksia vastaan ja edelleen niillä voidaan olettaa olevan huomattava vaikutus nimenomaan kiinteitä syöpiä vastaan. Kaikilla TF-aineilla on erinomaiset ominaisuudet joskin TF-130, erityisesti 132a, 132b, 133a, 133b ja 1323 ovat edullisia.

Keksinnön mukaisesti valmistetut TF-aineet voidaan muuttaa erilaisiksi farmaseuttisiksi muodoiksi, kuten suun kautta annettaviksi lääkkeiksi, ruiskeina annettaviksi, peräpuikoiksi jne., vaikka niitä edullisesti käytetään injektoitavassa farmaseuttisessa muodossa. Kun niitä käytetään suun kautta annettavina lääkkeinä, nämä suun kautta annettavat lääkkeet voivat sisältää erilaisia apuaineita ja ne voidaan muokata kapseleiksi, tableteiksi, jauheiksi tai rakeiksi. Kun niitä käytetään ruiskeina, ruiskeet voivat olla ihonalaisia ruiskeita, lihaksensisäisiä ruiskeita ja laskimonsisäisiä ruiskeita ja niitä käytetään suspension, liuoksen tai jauheen muodossa, joka liuotetaan käytetettäessä. Ruiskeet voivat sisältää paikallisen puudutusaineen.

TF-aineiden annos valitaan sopivasti riippuen potilaan tilasta, vaikkakin yleensä on toivottavaa antaa niitä aikuiselle annoksissa väliltä 0,01-50 mg/kg kerran päivässä tai useampia kertoja päivässä ja mitä antotapaan tulee, niitä annetaan edullisesti ihonalaisena, lihaksensisäisenä tai laskimonsisäisenä ruiskeena tai ruiskeena vammautuneeseen osaan.

Tätä keksintöä kuvataan lähemmin seuraavassa esimerkein ja viitaten oheisiin kuvioihin, joista kuvio 1 esittää mikroskooppivalokuvaa, joka esittää tässä keksinnössä käytetyn Fusobacterium nucleatum TF-031:n muodon; kuvio 2 esittää karsinostaattisen aineen TF-100 infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 3 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; kuvio 4 esittää eluointimallia, joka on saatu, kun tämä aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-5 0^-^; kuvio 5 esittää suuren erotuskyvyn nestekromatogrammia; Rö 68080 58 kuvio 5 esittää karsinostaattisen aineen TF-110 infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 7 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; kuvio 8 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä (K) aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200 kuvio 9 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn neste-kromatogrammia; kuvio 10 esittää karsinostaattisen aineen TF-120 infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 11 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; kuvio 12 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä (R) aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200 kuvio 13 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn neste-kromatogrammia ? kuvio 14 esittää karsinostaattisen aineen TF-1316 infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 15 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; kuvio 16 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200®; kuvio 17 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn neste-kromatogrammia; kuvio 18 esittää karsinostaattisen aineen TF-132a infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 19 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; kuvio 20 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200 ®; kuvio 21 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn nestekro-matogrammia; kuvio 22 esittää karsinostaattisen aineen TF-132b infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 23 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; kuvio 24 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200®; 59 68080 kuvio 25 esittää tämän aineen suuren erotuskyvun nestekro-matogrammia; kuvio 26 esittää karsinostaattisen aineen TF-133a infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 27 esittää tämän aineen ultra^ioletti-absorptiospektriä; kuvio 28 esittää eluointi-mallia, ioka on saatu, kun tämä aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-ZOO''-'; kuvio 29 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn nestekro-matogrammia; kuvio 30 esittää karsinostaattisen aineen TF-133b infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 31 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptiospektriä; kuvio 32 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä (r) aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200v ; kuvio 33 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn nestekro-matogrammia; kuvio 34 esittää karsinostaattisen aineen TF-1323 infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 35 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptiospektriä; kuvio 36 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä (R) aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200w; kuvio 37 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn nestekro-matogrammia; kuvio 38 esittää karsinostaattisen aineen TF-136 infrapuna--absorptiospektriä; kuvio 39 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptiospektriä; kuvio 40 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200^; kuvio 41 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn nestekro-grammia; kuvio 42 esittää karsinostaattisen aineen TF-140 infrapuna-absorptiospektriä; kuvio 43 esittää tämän aineen ultravioletti-absorptiospektriä; kuvio 44 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä (ίδ aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200^; kuvio 45 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn nestekro-matogrammia; kuvio 46 esittää karsinostaattisen aineen TF-150 infrapuna-absorptiospektriä; 6o 6 80 80 kuvio 47 esittää tämän aineen uitravioletti-absorptiospektriä; kuvio 48 esittää eluointi-mallia, joka on saatu, kun tämä aine saatettiin geelisuodatukseen käyttäen Sephadex G-200®; ja kuvio 43 esittää tämän aineen suuren erotuskyvyn nestekro-matogrammia.

Esimerkki 1 (1) Kuhunkin 15 2 l:n viljelypullosta, joista jokainen oli va rustettu kierretulpalla, pantiin 2 1 viljelyväiiainetta, joka sisälsi 34 g tryptikaasipeptonia, 6 g fytonipeptonia, 20 g proteoosipep-tonia, 70 g aivo-sydän-uutetta, 6 g hiivauutetta, 15 g natriumklo-ridia, 12 g glukoosia, 10 g laktoosia, 0,5 g L-kystiiniä, 0,2 g natriumsulfiittia, 1,0 g natriuraglykolaattia ja 1,4 g agaria ja viljelyväliaine asetettiin pH 7:ään. Viljelyväiiainetta steriloitiin 1,2 atmrssa 120°C:ssa 15 minuuttia, kuumennettiin kiehuvalla vesihauteella 20 minuuttia ja vesijäähdytettiin välittömästi sen jälkeen, minkä jälkeen Fusobacterium nucleatum TF-031:n esivil-jelyliuos, joka oli ennalta valmistettu viljelemällä sitä viljely-väliaineessa, jolla oli sama koostumus kuin edellä, ympättiin edellä saatuun vedellä jäähdytettyyn viljelyväliaineeseen steriileissä olosuhteissa 100 ml:n määrä viljelypulloa kohti ja saatettiin olosuhteiltaan muuttumattomaksi viljelyksi viljelykaapissa 37°C:ssa 48 tunnin ajaksi. Kun viljely oli loppuunsuoritettu, viljelmää sentrifugoitiin organismien poistamiseksi kierrosnopeudella 4000 r/min 5°C:ssa 20 minuuttia. Saadun supernatantin määrä oli n. 27 1.

(2) Edellä kohdassa (1) saatuun supernatanttiin lisättiin 40 1 etanolia sekoittaen 5°C:ssa ja syntyneen seoksen annettiin seistä lämpötilaltaan alhaisessa tilassa, kunnes amorfinen sakka oli täydellisesti laskeutunut. Sen jälkeen seosta sentrifugoitiin nopeudella 6000 r/min 5°C:ssa 15 minuuttia ja sakka koottiin, pestiin etanolilla ja kuivattiin siten alennetussa paineessa antamaan 60 g raakajauhetta.

(3) 20 g edellä kohdassa (2) saatua raakajauhetta liuotettiin 120 ml:aan vettä ja tällöin muodostuneet veteen liukenemattomat aineet poistettiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 7500 r/min 10 minuuttia, minkä jälkeen näin saatu vesiliukoinen jae yhdistettiin pesuvesien kanssa, jotka oli saatu pesemällä veteen liukenemattomia aineita kahdesti 60 ml:n annoksilla vettä, ja syntynyt liuos kuivattiin alennetussa paineessa antamaan 14 g harmahtavan val-koista-vaalen ruskeata TF-100-jauhetta.

68080

Esimerkki 2

Esimerkissä 1-(3) kuvattu liuos, joka valmistettiin yhdistämällä vesiliukoinen jae, joka oli vapaa veteen liukenemattomista aineista, pesuvesien kanssa, jotka saatiin pesemällä veteen liuke-namattomat aineet, saatettiin uitrasuodatukseen käyttäen onttokui-tutyyppistä ultrasuodatusjärjestelmää (membraani no: HT.-l).,jota valmistaa Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha), ja sisäinen liuos lyofilisoitiin antamaan 10 g harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-110-jauhetta.

Esimerkki 3 10 g esimerkissä 2 saatua jauhetta liuotettiin pieneen määrään vettä ja saatu liuos pantiin pylvääseen, joka oli täytetty dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50^:llä, joka oli tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 8, ja eluoitu liuos koottiin. Edelleen vietiin pylvään läpi 2,5 1 samaa fosfaattipuskuria kuin edellä ja saatu eluoitu liuos yhdistettiin edellä kootun eluoidun liuoksen kanssa, minkä jälkeen syntyneestä liuoksesta poistettiin suolat käyttämällä onttokuitutyyppistä ultrasuoda-tussysteemiä (membraani no: HI-1), väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin sitten antamaan 470 mg harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-120-jauhetta.

Esimerkki 4 2 g esimerkissä 1—(2) saatua jauhetta liuotettiin 24 ml:aan vettä ja veteen liukenemattomat aineet poistettiin sentrifugoimal-la kierrosnopeudella 7500 r/min 10 minuuttia. Vesiliukoista jaetta dialysoitiin yli yön tislattua vettä vastaan 5°C:ssa käyttäen sellofaani-putkea ja sisäinen liuos väkevöitiin alennetussa paineessa. Sen jälkeen väkevöity liuos pantiin pylvääseen, joka oli täytetty 150 ml:11a dietyyliamino-etyyli-Sephadex Α-5(ί^, joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 8, ja pylväs pestiin viemällä sen läpi 600 ml 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka pH oli 8, minkä jälkeen 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-pitoisuus oli 0,6 M ja pH 8, vietiin kolonnin läpi eluaatin saamiseksi. Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa n. 100 ml:ksi, dialysoitiin tislattua vettä vastaan 5°C:ssa, väkevöitiin uudelleen alennetussa paineessa, poistettiin suolat käyttäen Sephadex G-25^-pylvästä ja lyofilisoitiin sitten antamaan 470 mg harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-1316.

“ 68080

Esimerkki 5

Esimerkissä 1-(3) kuvattua liuosta, joka valmistettiin yhdistämällä vesiliukoinen jae, joka oli vapaa veteen liukenemattomista aineista, ja pesuvedet, jotka saatiin pesemällä veteen liukenemattomia aineita, dialysoitiin yli yön tislattua vettä vastaan 5°C:ssa käyttäen sellofaani-putkea ja sisäinen liuos väkevöitiin alennetussa paineessa. Väkevöity liuos pantiin sitten pylvääseen, joka oli täytetty 50 g:11a dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50 -y, joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 8, ja 2 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka pH oli 8, ja 2,5 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridipitoisuus oli 0,1 M ja pH 8, vietiin peräkkäin pylvään läpi, minkä jälkeen 2,5 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridipitoisuus oli 0,2 M ja pH 8, vietiin pylvään läpi pylvääseen adsorboituneen vaikuttavan aineen eluoimiseksi ja saadusta eluoidusta liuoksesta poistettiin suolat käyttäen onttokuitutyyppistä ultrasuodatussys-teemiä (membraani no: HI-1) ja lyofilisoitiin sitten antamaan 600 mg harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-132a-jauhetta.

Esimerkki 6 1,2 l:aan 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8 liuotettiin 44,2 g esimerkissä l-(2) saatua jauhetta ja suspendoituneet liukenemattomat aineet poistettiin suodattamalla käyttäen Hyflo Super Cel'iä, minkä jälkeen saatu suodos pantiin 33 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, joka oli täytetty Γ§) 500 ml:lla dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50Vfy, jota oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja eluoitu liuos koottiin. Pylväs pestiin 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja pesuvedet yhdistettiin edellä mainitun eluoi-dun liuoksen kanssa antamaan 1,67 1 liuosta. Liuos pantiin jälleen 8 cm läpimittaiseen pylvääseenjoka oli täytetty 400 ml:11a diet-yyliaminoetyyli-Sephdadex A-50 , joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, antamaan 1,68 1 eluoitua liuosta. Pylväs pestiin 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, antamaan 1,64 1 pesuvesiä. Eluoitu liuos ja pesuvedet yhdistettiin ja niihin lisättiin 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka pH oli 8, antamaan 4,98 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natrium- 68080 63

kloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH 8. Käin saatu puskuriliuos pantiin 8 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, joka oli täytetty 500 ml:iia dietyyliaminoetvyii-Sephadex A-50®, joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka na-criumkloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH 8, ja pylväs pestiin 2 1:11a 0,C25 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH

8. 7 l:aan liuosta, joka oli νεlaistettu yhdistämällä pesuvedet eluoidun liuoksen kanssa, lisättiin 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka pH oli 8, antamaan 14 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,1 M ja pH 8. Näin saatu eluoitu liuos pantiin 8 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, joJ$a oli täytetty 500 ml:lla dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50 , joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,1 M ja pH 8, ja eluoitu liuos poistettiin. Pylväs pestiin 2 1:11a 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,1 M ja pH 8, minkä jälkeen 2 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH 8, vietiin pylvään läpi ja eluoitu liuos koottiin. Eluoitu liuos väkevöitiin ja siitä poistettiin suoloja käyttäen ultrasuodatussysteemiä (käytetty suodatin: Toyo Ultrafilter UK-10), poistettiin edelleen suoloja käyttäen Sephadex D-25®pylvästä, poistettiin väri aktiivihiilellä ja lyofilisoitiin sitten antamaan 880 mg harmahtavan valkoista -vaaleanruskeata TF-132b-jauhetta.

Esimerkki 7 10 g esimerkissä 2 saatua jauhetta liuotettiin pieneen määrään vettä ja syntynyt liuos pantiin pylvääseen, joka oli täytetty dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-SO^llä, joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 8. Sen jälkeen vietiin 5 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH 8, pylvään läpi, minkä jälkeen sen läpi vietiin 2,5 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, pylvääseen adsorboituneen vaikuttavan aineen eluoimiseksi, ja saatu eluoitu liuos väkevöitiin alennetussa paineessa. Väkevöidystä liuoksesta poistettiin suoloja käyttäen sellofaani-putkea ja poistettiin suolat täydellisesti käyttäen 64 68080 (r)

Sephadex G-25 -ysekä lyof ilisoitiin antamaan 50C mg harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata ?F-133a-jauhetta.

Esimerkki 8 1,2 l:aan 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-pitoisuus oli 0,3 M ja pH 8, liuotettiin 44,2 g esimerkissä l-(2) saatua jauhetta ja suspendoituneet liukenemattomat aineet poistettiin suodattamalla käyttäen Hyflo Super Cel'iä, minkä jälkeen saatu suodos pantiin 33 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, joka oli täytetty 500 ml:11a dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50, joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka nat-riumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja eluoitu liuos koottiin. Pylväs pestiin 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja pesuvedet yhdistettiin edellä mainitun eluoidun liuoksen kanssa antamaan 1,67 1 liuosta. Liuos pantiin uudelleen 8 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, ioka oli täytetty 40 ml :11a dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50 , joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, antamaan 1,68 1 eluoitua liuosta. Pylväs eluoitiin 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, antamaan 1,64 1 pesuvesiä. Eluoitu liuos ja pesuvedet yhdistettiin ja niihin lisättiin 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka pH oli 8, antamaan 4,98 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH 8. Näin saatu eluoitu liuos pantiin 8 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, joka oli täydetty 500 ml :11a dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50^ joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH 8, ja pylväs pestiin 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,2 M ja pH 8, minkä jälkeen pylvään läpi vietiin 2 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja eluoitu liuos koottiin.

Eluoitu liuos väkevöitiin ja siitä poistettiin suoloja käyttäen ultrasuodatussysteemiä (käytetty suodatin: Toyo Ultrafilter UK-10 lisäksi poistettiin suoloja käyttäen Sephadex G-25-pylvästä, poistettiin väri aktiivihiilellä ja lyofilisoitiinsitten antamaan 590 mg harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-133L·-jauhetta.

68080

Esimerkki 9 (1) 20 g esimerkissä 1— (2) saatua raakajauhetta liuotettiin 120 ml:aan vettä ja tällöin muodostuneet liukenemattomat aineet poistettiin sentrifugcimalla kierrosnopeudella 7500 r/min 10 minuutin ajan, minkä jälkeen näin saatu vesiliukoinen jae ja pesuvedet, jotka saatiin pesemällä veteen liukenemattomia aineita kahdesti 60 ml:n annoksilla vettä, yhdistettiin ja saatettiin sitten ultra-suodatukseen käyttäen onttokuitutyyppistä uitrasuodatussysteemiä (membraani no: HI-1), ja sisäinen liuos lyofilisoitiin antamaan 10 g harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata jauhetta.

(2) 1 l:aan 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, liuotettiin 25 g edellä kohdan (1) käsittelyssä saatua jauhetta ja syntynyt liuos pantiin 33 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, joka oli täytetty 500 ml :11a dietyyii- (D) aminoetyyli-Sephadex A-SO^joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8. Pylväs pestiin samoin 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja eluoitu liuos ja pesuvedet yhdistettiin antamaan 1,6 1 seosta. Seos pantiin 8 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, joka oli täytetty 400 ml :11a dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-50^-/, joka oli samalla tavalla tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, antamaan 1,65 1 eluoitua liuosta. Eluoitu liuos yhdistettiin 1,7 l:n kanssa pesuvesiä, jotka oli saatu pesemällä pylväs 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja syntynyt seos laimennettiin 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 8, 10,35 l:n 0,025 M fosfaatti-puskuria valmistamiseksi, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,1 M ja pH 8.

Sen jälkeen näin saatu puskuriliuos vietiin 8 cm:n läpimittaiseen pylvääseen, Joka oli täytetty 500 ml :1.1a dietyy liamino-etyyli-Sephadex A-50 , joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,1 M ja pH 8, ja pylväs pestiin 2 1:11a 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,1 M ja pH 8, minkä jälkeen pylvään läpi vietiin 2 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,3 M ja pH 8, ja eluoidut liuokset koottiin. Saadusta 66 08080 eluoic.usta liuoksesta poistettiin suoloja ja väkevöitiin käyttäen ultrasuodatussysteemiä (käytetty suodatin: Tovo Ultrafilter UK-10^) ja suoloja poistettiin edelleen Sephadex A-25^ullä poistettiin väri aktiivihiilellä ja lyofiiisoitiin sitten antamaan 1,65 g harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-1323-jauhetta.

Esimerkki 1Q

10 g esimerkissä 2 saatua jauhetta liuotettiin pieneen määrään vettä ja syntynyt liuos pantiin pylvääseen, joka oli täy- (S) tetty dietyyliaminoetyyli-Sephadex A-SO^llä, joka oli sitä ennen tasapainotettu 0,025 M fosfaattipuskurilla, jonka pH oli 3. Sen jälkeen pylvään läpi vietiin 6 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0,5 M ja pH 8, minkä jälkeen pylvään läpi vietiin 2,5 1 0,025 M fosfaattipuskuria, jonka natriumkloridi-väkevyys oli 0.6 M ja pH 8, pylvääseen adsorboituneen vaikuttavan aineen eluoimiseksi, ja saadusta läpikulkeneesta liuoksesta poistettiin suoloja käyttäen onttokuitutyyppistä ultrasuodatussysteemiä (membraani no: HI-1), väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofili-soitiin sitten antamaan 130 mg harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-136-jauhetta.

Esimerkki 11 15 g esimerkissä l-(2) saatua raakajauhetta liuotettiin 200 ml:aan vettä ja veteen liukenemattomat aineet poistettiin sentri-fugoimalla kierrosnopeudella 7500 r/min 10 minuutin ajan, minkä jälkeen näin saatu vesiliukoinen jae asetettiin pH 10:een lisäämällä siihen tiputtaen 0,2 M vesipitoista bariumhydroksidiliuosta. Vesipitoista bariumhydroksidiliuosta lisäämällä saostui valkoinen sakka. Barium-ioneja lisättiin niin, että barium-ionien kokonaispitoisuudeksi lopullisessa tilavuudessa tuli 0,01 M, minkä jälkeen liuosta sekoitettiin 30 minuuttia ja sakka koottiin suodattamalla. Näin saatu barium-suolan sakka suspendoitiin 10 ral:aan 10-paino-%:sta vesipitoista natriumsulfaattiliuosta, sekoitettiin riittävästi ja suodatettiin sitten ja koottiin suodos. Sakka suspendoitiin uudelleen, sekoitettiin ja suodatettiin sitten samalla tavalla kuin edellä kerran 10 ml:n kanssa 10-paino-%:sta vesipitoista natriumsulf aattiliuosta ja kahdesti 5 ml:n annoksien kanssa tätä liuosta 67 680 80 ja jokainen suodos koottiin- Lisäksi jäljellejäänyt sakka pestiin kahdesti 10 ml;n annoksilla vettä ja suodatettiin sitten pesuvesien saamiseksi. Edellä mainittu suodos koottiin ja yhdistettiin pesuvesien kanssa, dialysoitiin tislattua vettä vastaan, väkevöi-tiin alennetussa paineessa ja lyofiloitiin sitten antamaan 0,45 g harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-140-jauhetta.

Esimerkki 12 32 g esimerkissä l-(2) saatua jauhetta liuotettiin 450 mlraan vettä ja suspendoituneet liukenemattomat aineet poistettiin suodattamalla käyttäen Hyflo Super Cel'iä, minkä jälkeen saatua suo-dosta dialysoitiin yli yön juoksevaa vettä vastaan käyttäen sellofaani-putkea. Dialysoituun liuokseen lisättiin tiputtaen 80 ml 20-paino-%:sta vesipitoista setyylipyridiniumkloridiliuosta sekoittaen samalla lisäten siihen 200 ml 10-paino-%:sta boraattipuskuria (pH 9,0) ja saatua seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, minkä jälkeen sakka koottiin suodattamalla. Sakka suspen-doitiin 150 ml:aan 0,l-paino-%:sta boraattipuskuria (pH 9,0), joka sisälsi 0,1 M natriumkloridia ja 0,2 paino-% setyylipyridinium-kloridia, ja syntynyttä suspensiota sekoitettiin 30 minuuttia. Sen jälkeen sakka koottiin suspensiosta suodattamalla ja suspendoitiin uudelleen 150 mlraan boraattipuskuria (pH 9,0), jolla oli edellä mainittu koostumus, ja näin syntynyttä suspensiota sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen sakka koottiin suodattamalla. Koottu sakka suspendoitiin 150 ml:aan 0,1 paino-%:sta boraattipuskuria (pH 9,0), joka sisälsi 0,5 M natriumkloridia ja 0,2 % setyylipyri-diniumkloridia, ja syntynyttä suspensiota sekoitettiin ja dissosioi-tiin 30 minuuttia. Sen jälkeen sakka erotettiin suspensiosta suodattamalla antamaan liukoinen jae. Sitten suodattamalla erotettu sakka saatettiin jälleen samaan dissosioimisprosessiin kuin edellä antamaan liukoinen jae. Nämä kaksi liukoista jaetta yhdistettiin ja syntynyt liukoinen jae asetettiin pH 3-4:ään 10-%:sella kloori-vetyhapolla, minkä jälkeen lisättiin etanolia, niin, että sen pitoisuudeksi lopuksi tuli 80 tilav.-%. Syntyneen liuoksen annettiin seistä yli yön 5°C:ssa ja muodostunut sakka koottiin suodattamalla antamaan 5,6 g harmahtavan valkoista - vaaleanruskeata TF-150-jauhetta .

Claims (28)

68 63080 Patentt ivar3.tiir.uk set

1. Menetelmä karsinostaattisen ja immunostimuloivan TF-aineen valmistamiseksi, joka aine onTF-100, TF-110, TF-120, TF-130, (TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-136), TF-140 tai TF-150, tunnettu siitä, että Fuso-bakterium-sukuun kuuluvaa TF-ainetta tuottavaa bakteeria viljellään anaerobisissa olosuhteissa pH-arvossa 5-8,5 ja lämpötilassa 30-45°C 1-5 päivää viljelyväliaineessa, joka sisältää typpi-, hiili- ja vitamiinilähteitä sekä pelkistimiä ja epäorgaanisia suoloja yhdessä agarin kanssa tai ilman sitä; saostusainetta, joka muodostuu hydrofiilisestä orgaanisesta liuottimesta, lisätään tuotettuun viljelmään tai sen supernatanttiin, sen jälkeen kun viljelmän tai sen supernatantin pH on säädetty arvoon 2-7 niin että saostusaineen konsentraatio on 30-70 tilav.-%, tai viljelmään tai supernatanttiin lisätään saostusainetta, joka muodostuu bariumionilähteestä saatavista bariumioneista, niin että bariumionikonsentraatio on 0,005-0,IM pH-arvossa 10-13; muodostunut saostuma otetaan talteen; saostusaine poistetaan saostumasta; TF-ainetta sisältävä jae erotetaan vesiliukoisena jakee-na saostumasta; ja TF-aine otetaan talteen vesiliuokoisesta ja-keesta; jolloin (A) TF~100:lla on seuraavat ominaisuudet; (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen ja Ehrlich-kiintokasvaimen kasvua ja sillä on immunostimuHoiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuippu lähellä 256-260 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs; 50 mm 4 x 600 mm, eluetti: tislattu vesi) käyttäen Sephadex 6-50® 68080 69 (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhykkeet eluutioiila-vuuksilla lähellä välisijatilavuutta - 400, 430-530, 700-800 ja 340-870 ml mitattaessa US-absorbanssia 260 nir.:ssä, ja eiuutio-tilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -390 ja 410-430 ml mitattaessa UV-absorbanssia 620 nmissa antroni-rikkihappo-mene-telmällä, (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluent-ti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GE1 G 3000 SW® (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm 6 x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa, 38-60 ja 65 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nm:ssä ja 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reakticssa, fenoli-rikk.i-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloorive-tyhappo-reaktiossa, Lowry-Folin'in reaktiossa ja ninhydriini-reaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 30,6-35,7 %, H 4,2-5,2 %, N 4,2-5,2 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 40,0-46,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 20,0-23,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina, (B) TF-110:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) sen on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuippu lähellä 256-260 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodostuksella (pylväs 44 mm ό x 500 mm, eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri; pH 7) käyttäen Ί° 68080 Saphadex 0-200^ (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhyk-keet eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -380, 600-920 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nnussa, eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuuttaa -380, 420-520 ja 630-760 ml mitattaessa UV-absorbanssia 490 nm:ssä fenoli-rikkihappo-mene-telmällä, ja eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -380, 420-520 ja 620-760 ml mitattaessa UV-absorbanssia 620 nmrssä antroni-rikkihappomenetelmällä. (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluent-ti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 SW® (Toyo Soda Cc., Ltd., pylväs: 7,9 mm φ x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa, 38-60 ja 65 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nm:ssä ja 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloorive-tyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 35,9-41,0 %, H 4,5-5,2 % N 4,2-5,2 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 30,0-69,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 18-22 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina, (C) TF~120:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1380-1360, 1140-1C00 ja 820 cm *, (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuippu lähellä 268-272 nm, il 7i 68080 (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 44 mm ¢5 x 500 mm, eluentti: 0-1M fosfaattipuskuri, ph 7) käyttäen Sephadex G-200® (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhyk-keet eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -325 ja 775-875 ml, mitattaessa UV-absorbanssia 260 nmrssä, eluutiotilavuuksilla lähellä välisi jatilavuutta --360 , 360-480 ja 510-760 ml mitattaessa absorbanssia 490 nmrssä fenoli-rikkihappc-menetelmällä ja eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -380, 420-520 ja 620-760 ml mitattaessa absorbanssia 620 nmrssä antroni-rikkihappomenetelmällä, (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 SW® (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm φ x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa, 38-60 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nmrssä ja 260 nmrssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloori-vetyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 35,1-40,2 %, H 4,5-5,5 % N 2,0-3,1 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 56,0-73,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin’in menetelmällä on noin 9,0-13,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina, (D) TF-130:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsinooman kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (c) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm 1! 72 680 8 0 (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptio-huippu lähellä 256-280 nm, (g) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rik-kihapporeaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoii-kloo-rivetyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (h) sen alkuainenalyysi on: C 27,5-39,8 %, H 3,2-5,7 % N 2,8-6,3 %, (i) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 19,0-64,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin1 in menetelmällä on noin 6,0-28 paino-% ilmaistuna vasikan seerunialbumiinina; (E) TF-1316:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsinooman kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniinin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuippu lähellä 256-260 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 21 mm ¢5 x 400 mm, eluentti 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen Sephadex G-200*^ (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhy-ke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -160 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, ja absorptiovyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -160ml mitattaessa UV-absorbanssia 490 nmrssä fenoli-rikkihappo-menetelmällä, (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus; 0,8 ml/min, huo- 73 6 8 0 8 0 £) neenlänpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 SVr^ (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm <j> x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa ja 40-60 min mitattaessa UV-absorbans-sia 220 nm:ssä, ja lähellä liuotinrintamaa 40-60 min mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloori-vetyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) se alkuainenalyysi on: C 30,0-34,0 %f H 3,8-4,4 % N 4,9-5,7 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 35,0-50,0 paino-% ilmaistuna glukoosina ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 10,0-23,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumiaibumii-nina; (F) TF-132a:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsinooman kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-sepktrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuippu lähellä 270-280 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 44 mm ώ x 500 mm, eluentti 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen Sephadex G-200® (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhykkeet eluu-tiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -340, 600-700 ja 720-880 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, eluutiotila-vuuksilla lähellä välisijatilavuutta -340, 340-580 ja 720-900 ml 74 68080 mitattaessa absorbaiissia 4 90 nmtssä fenoli-rikkihappc-menetelmällä ja eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -340 ja 340-580 ml mitattaessa absorbanssia 620 nm:ssä antroni-rikkihappo-menetelmällä, (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluent-ti: C,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,3 ml/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3300 S\fö (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm φ x 6C0 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa, 30, 38-60 ja 65 min mitattaessa UV-ab-sorbanssia 220 nm:ssä, ja lähellä liuotinrintamaa, 62 ja 65 min mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Moliseh-reaktiossa, fencli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloori-vetyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 34,8-39,8 %, H 4,5-5,7 % N 2,8-3,6 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fencli-rikkihappo-menetelmällä on noin 55,0-64,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 18,0-28,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina; (G) TF-132b:llä on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsinooman kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm ^, (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on leveä huippu lähellä 265-280 nm, 75 68080 (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 21 mm i> x 400 mm, eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen Sephadex G-200® (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on heikko absorptio-vyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -150 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, ja absorptiovyö-hyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -150 ml mitattaessa UV-absorbanssia 490 nmrssa fenoli-rikkihappo-mene-telmällä, (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluent-ti: 0,IM fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 mi/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 sW® (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm <j> x 600 mm x 2) en huiput lähellä 1iuotinrintamaa, 36-37 ja 48-50 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nm:ssä, ja hyvin matalat huiput lähellä liuotin-rintamaa, 32-39 ja 45-52 min mitattessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloorive-tyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 35,3-39,5 %, H 4,5-5,6 % N 2,8-5,4 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 23,6-45,5 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 15,5-28,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina; (H) TF-133a:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsinooman kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm 76 6 8 0 8 0 (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptio-huippu lähellä 258-262 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 44 mm φ x 500 mm, eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen (R) Sephadex 0-200^ (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhyk-keet eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -300 ja 630-340 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nmrssä, absorptio-vyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -420 ml mitattaessa UV-absorbanssia 490 nm:ssä fenoli-rikkihappomenetel-mällä, ja absorptiovyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisi-jatilavuutta -420 ml mitattaessa UV-absorbanssia 620 nm:ssä ant-ronirikkihappo-menetelmällä, (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 sJ* (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm ^ x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa, 38 ja 50 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nm:ssä, ja lähellä liuotinrintamaa 50-60 ja 62 min mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloori-vetyhappo-reaktiossa ja Lowry-rFolin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 28,0-36,6 %, H 3,5-5,1 % N 4,5-6,3 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 26,0-35,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 22,0-28,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina; (l) TF-133b:llä on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlicn-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsinooman kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, 77 6 8080 (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IE-sepktrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm \ (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on leveä huippu lähellä 270-280 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 21 mm φ x 400 mm, eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen Sephadex G-20 <β (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -170 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nmrssä, ja absorptiovyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -150 ml mitattaessa UV-absorbanssia 490 nm:ssä fenoli-rikkihappo-menetelmällä, (h) sen suuren erotyskyvyn nestekromatogrammissa (eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 SW® (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm φ x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa 49-50 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nm:ssä, ja lähellä liuotinrintamaa 38-39 ja 52 min mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloori-vetyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 31,1-38,5 %, H 3,9-5,2 % N 3,4-4,7 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 19,0-24,5 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 12,9-22,9 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina; (J) TF-1323:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich-kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsinooman kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, 78 68080 (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm ^, (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on leveä huippu lähellä 265-280 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 21 mm © x 400 mm, eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen Sephadex 0-200^ (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -160 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nmrssä, ja absorptiovyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -150 ml mitattaessa UV-absorbanssi 490 nm:ssä fenoli-rikkihappo-menetelmällä, (h) sen suuren erotyskyvyn nestekromatogrammissa (eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa), joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 SW® (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm φ x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa 36ja 48-50 min mitattaessa UV-absor-banssia 220 nm:ssä, ja huiput lähellä liuotinrintamaa 36 ja 50 min mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloorive-tyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 29,9-39,4 %, II 3,9-5,6 % N 2,8-5,4 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 19,0-25,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin’in menetelmällä on noin 11,0-17,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina; (K) TF-136:lla on seuraavat ominaisuudet: (a) seon harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen, Ehrlich- 68080 kiintokasvaimen ja Sarcoma-180-karsionooman kasvua ja sillä on immunestimuloiva vaikutus, (e) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoiiin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin,, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhyk.keet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm \ (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuip-pu lähellä 256-260 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella 'pylväs: 44 mm φ x 50U mm, eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen Sephadex G-200^ (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhyk-keet eluutiotilavuuksilla lähellä 540-930 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nmrssä, ja kaikilla fraktioilla on heikko ab-sorptiovyöhyke mitattaessa UV-absorbanssia 490 nmrssä fenoli-rikkihappo-menetelmällä ja mitattaessa UV-absorbanssia 620 nm:ssä antroni-rikkihappo-meneteimällä, (h) sen suuren erotyskyvyn nestekroraatogrammissa (eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa) , joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 SVP'' (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm φ x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa, 28-40 ja 42-60 min mitattaessa UV-ab-sorbanssia 220 nmrssä ja huiput lähellä liuotinrintamaa ja 42- 60 min mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloorive-tyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 27,5-32,6 %, H 3,2-4,0 % N 5,0-6,1 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 19,0-30,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 6,0-12/0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina; 80 68080 (L) TF-140:llä on seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 210°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 280°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuippu lähellä 255-260 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 44 mm x 500 mm, eluentti: 0, IM fosfaattipuskuri, pH 7 ) käyttäen (6) Sephadex G-200'ty (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhykkeet eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -300, 500-900 ja 900-1000 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, ja eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -500, 650-850 ja 850-1000 ml mitattaessa UV-absorbanssia 490 nm:ssä fenoli-rikkihappo-menetelmällä, (h) sen suuren erotyskyvyn nestekromatogrammissa (eluentti: Q,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus: 0,8 ml/min, huo-nenlämpötilassa), joka on saatu käyttäen TSK-GEL G 3000 SW® (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm (6 x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa ja 40-60 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nm:ssä ja 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rik-kihapporeaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-kloo-rivetyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 22,0-28,0 %, H 3,0-3,5 % N 5,0-6,5 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 5,0-15,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lowry-Folin'in menetelmällä on noin 23,0-32,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina; 81 68080 (M) TF--150:llä on. seuraavat ominaisuudet: (a) se on harmahtavan valkoinen-vaaleanruskea jauhe, (b) se estää hiiren Ehrlich-vesivatsakasvaimen kasvua ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) se liukenee veteen ja on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole selvää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 110°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 200°C:ssa, (e) sen IR-spektrissä (KBr) on absorptiovyöhykkeet lähellä 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 ja 820 cm"1, (f) sen vesipitoisen liuoksen UV-spektri osoittaa voimakasta absorptiota absorptiorajalla ja siinä on absorptiohuip-pu lähellä 255-260 nm, (g) fraktioitaessa sitä geelisuodatuksella (pylväs: 21 mm 0 x 400 mm, eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7) käyttäen Sephadex G-200^ (Pharmacia Co., Ltd.) sillä on absorptiovyöhykkeet eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -100 ja 100-160 ml mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, ja absorptio-vyöhyke eluutiotilavuuksilla lähellä välisijatilavuutta -150 ml mitattaessa UV-absorbanssi 490 nm:ssä fenoli-rikkihappo-menetel-mällä, (h) sen suuren erotuskyvyn nestekromatogrammissa (eluentti: 0,1M fosfaattipuskuri, pH 7; virtausnopeus; 0,8 ml/min, huoneenlämpötilassa), joka on saatu käyttöen TSK-GEL G 3000 SW® (Toyo Soda Co., Ltd., pylväs: 7,9 mm φ x 600 mm x 2) on huiput lähellä liuotinrintamaa, 32 ja 48-50 min mitattaessa UV-absorbanssia 220 nm:ssä, ja lähellä liuotinrintamaa, 32 ja 48-50 min mitattaessa UV-absorbanssia 260 nm:ssä, (i) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-rikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa , indoli-kloori-vetyhappo-reaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa ja negatiivinen ninhydriinireaktiossa, (j) sen alkuaineanalyysi on: C 31,0-34,0 %, H 4,0-4,4 S, N 2,8-3,2 %, (k) sen sakkaridipitoisuus mitattuna fenoli-rikkihappo-menetelmällä on noin 40,0-55,0 paino-% ilmaistuna glukoosina, 8 2 6 80 8 0 ja sen proteiinipitoisuus mitattuna Lovry-Folin' in menetelmällä on noin 7,0-14,0 paino-% ilmaistuna vasikan seerumialbumiinina.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä.- että saostusainetta, joka muodostuu hydrof iilisestä orgaanisesta liuottimesta, lisätään saostuman muodostamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että saostuman vesiliukoinen jae erotetaan saostumasta ja kuivataan.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliukoinen jae saatetaan dialyysiin tai ultrasuodatukseen; ja TF-aine otetaan talteen sisäisestä liuoksesta.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliukoinen jae saatetaan tarvittaessa dialyysiin tai ultra-suodatukseen ja käsitellään sitten ioninvaihtajalla; ja adsor-boitumaton jae otetaan talteen.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliukoinen jae saatetaan tarvittaessa dialyysiin tai ultra-suodatukseen ja käsitellään sitten ioninvaihtajalla; ja TF-aine otetaan talteen adsorboituneesta jakeesta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että absorboitunutta jaetta käsitellään 0,6 M natrium-kloridifosfaattipuskurilla; ja eluoitu jae otetaan talteen.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että jae, joka ei ole eluoitunut 0,1 M natriumklori-di-fosfaattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, otetaan talteen adsorboituneesta jakeesta.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että jae, joka ei ole eluoitunut 0,2 M natriumklori-di-fosfaattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,3 M natriumklori-di-fosfaattipuskurilla, otetaan talteen.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että jae, joka ei ole eluoitunut 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, otetaan talteen.

11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että jae, joka ei ole eluoitunut 0,5 M natriumkloridi- 83 68080 fosfaattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,6 M natriumklcridi-fosfaattipuskurilla, otetaan talteen.

12. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliukoinen jae saatetaan tarvittaessa dialyysiin tai ultra-suodatukseen, valmistetaan 0,2-0,3 M natriumkloridi-fosfaatti-puskuri saostuman vesiliukoisesta jakeesta, tai 0,2-0,3 M nat-riurakloridi-fosfaattipuskuri sisäisestä liuoskomponentista, joka saatiin dialysoimalla tai ultrasuodatukseila, ja käsitellään sitten ioninvaihtajalla, joka on tasapainotettu 0,2-0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla; jae, joka on kulkenut ioninvaihta jän läpi, otetaan talteen; tämä eluoitu liuos säädetään sitten niin, että sen natriumkloridi-konsentraatio on 0,1 M ja käsitellään sen jälkeen ioninvaihtajalla, joka on tasapainotettu 0,1 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, adsorboitumaan siihen; ja sen jälkeen, jae, joka ei ole eluoitunut 0,1 H natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, mutta on eluoi-tuntu 0,2 M tai 0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, otetaan talteen.

13. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliukoinen jae saatetaan tarvittaessa dialyysiin tai ultrasuodatukseen, valmistetaan 0,3 M natriumkloridi-fos- faattipuskuri saostuman vesiliukoisesta jakeesta tai 0,3 M nat-riumkloridi-fosfaattipuskuri sisäisestä liuoskomponentista, joka saatiin dialyysillä tai ultrasuodatukseila, ja käsitellään sitten ioninvaihtajalla, joka on tasapainotettu 0,3 M natrium-kloridi-fosfaattipuskurilla; jae, joka on kulkenut ioninvaihtajan läpi, otetaan talteen; tämän eluoidun liuoksen natriumklo-ridi-väkevyys säädetään sitten 0,2 M:ksi ja liuosta käsitellään sen jälkeen ioninvaihtajalla, joka on tasapainotettu 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, adsorboitumaan siihen; ja sen jälkeen, jae, joka ei ole eluoitunut 0,2 M natriumkloridi-fosf aattipuskurilla, mutta on eluoitunut 0,3 M natriumkloridi-fosf aattipuskurilla, otetaan talteen.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelmään tai sen supernatanttiin lisätään barium-ioneja barium-suolan muodostamiseksi, tai viljelmään 8J 68080 4 tai sen supernatanttiin lisätään hydrofiilistä orgaanista liuotinta ja muodostunut saostuma otetaan talteen ja sitten lisätään barium-ioneja näin talteenotetun saostuman vesiliukoiseen jakee-seen, tai barium-ioneja lisätään sellaisen jauheen liuokseen, joka on saatu kuivaamalla saostuman vesiliukoinen jae, barium-suolan muodostamiseksi; muodostunut barium-suola otetaan talteen ja saatetaan sitten bariumin poistokäsittelyyn; ja vesi-liuokoinen jae otetaan talteen sekä saatetaan dialyysiin tai ultrasuodatukseen.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrofiilistä orgaanista liuotinta lisätään viljemään tai sen supernatanttiin; muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliukoista jaetta tai sisäistä 1iuoskomponenttia, joka on saatu saattamalla vesiliuokoinen jae dialyysiin tai ultrasuodatukseen, käsitellään kvaternääri-sellä ammoniumsuclalla; muodostunut soastuma otetaan talteen ja saatetaan sitten dissosioimisprosessiin käyttäen natrium-kloridia sisältävää liuosta; saatuun liukoiseen jakeeseen lisätään hydrofiilistä orgaanista liuotinta saostuman muodostamiseksi; ja näin muodostunut saostuma otetaan talteen.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerin viljelyssä käytettävä viljelyväliaine sisältää tryptikaasipeptonia, fytenipeptonia, proteoosipeptonia, aivo-sydän-uutetta (tai sydänuutetta), hii-vauutetta, natriumkloridia, glukoosia, laktoosia, L-kystiiniä, natriumsulfiittia ja tioglykolaattia, tai se sisältää niitä ja agaria.

17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljely tapahtuu 36°-38°C:ssa 1-3 päivän ajan viljelyväliainessa, jonka pH on säädetty arvoon 7,2-8,2.

18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium-sukuun kuuluva bakteeri on Fusobacterium nucleatum.

19. Jonkin patenttivaatimuksen 2-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelmään tai sen supernatanttiin lisätty hydrofiilinen orgaaninen liuotin on alkoholi. 85 68080

20. Jonkin patenttivaatimuksen 6-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ioninvaihtaja on heikosti emäksinen ioninvaihtaja tai heikosti emäksinen ioninvaihtaja, jolla on molekyyliseulontakyky.

21. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 0,1-0,6 M natriumkloridi-fosfaattipusku-ria käytetään ioninvaihtajalle adsorboituneen jakeen eluointiin.

22. Jonkin patenttivaatimuksen 7--13 tai patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että adsorboituneen jakeen käsittelyyn käytettävän natriumkloridia sisältävän fosfaattipuskurin pH on n. 8.

23. Jonkin patenttivaatimuksen 7-13 tai patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jae, joka on saatettu ioninvaihtokäsittelyyn, saatetaan väkevöitäväksi, suolan poistoon ja kuivaukseen.

24. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kvaternäärinen ammonium-suola on setyyli-pyridiniumkloridi.

25. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely kvaternäärisellä ammoniumsuoial-la suoritetaan boraattipuskurin läsnäollessa.

26. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että natriumkloridia sisältävä liuos on bo-raattipuskuri, joka sisältää natriumkloridia ja kvaternäärisen ammoniumsuolan.

27. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatuin ympätään vilje-lyväliaineeseen, jonka pH on säädetty arvoon 7,2-8,2 ja joka sisältää tryptikaasipeptonia, fytonipeptonia, proteoosipepto-nia, aivo-sydänuutetta (tai sydänuutetta), hiivauutetta, natriumkloridia, glukoosia, laktoosia, L-kystiiniä, natriumsul-fiittia tai tioglykolaattia, tai viljelyväliaineeseen, joka sisältää niitä ja agaria ja viljellään sitten anaerobisissa O c olosuhteissa 36 -38 C:ssa 1-3 päivää: viljelmään tai sen super-natanttiin lisätään alkoholia niin, että konsentraatio on 50-70 tilav.-%; muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliuokoinen jae saatetaan tarvittaessa dialyysiin tai ultra-suodatukseen ja käsitellään sitten heikosti emäksisellä ionin- 36 6 8 0 8 0 vaihtajalla tai heikosti emäksisellä ioninvaihtajalla, jolla on molekyyliseulontakyky, adsorboitumattoman jakeen poistamiseksi; jae, joka on eluoitunut 0,1 tai 0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, poistetaan absorboidusta jakeesta; ja sen jälkeen jae, joka on eluoitunut 0,3 M natriumkloridi-fosfaatti-puskurilla, otetaan talteen, väkevöidään, poistetaan suojat ja kuivataan sitten.

28. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatum ympätään vilje-lyväliaineeseen, jonka pH on säädetty arvoon 7,2-3,2 ja joka sisältää tryptikaasipeptonia, fytonipeptonia, proteoosipeptoniar aivo-sydänuutetta (tai sydänuutetta), hiivauutetta, natrium-kloridia, glukoosia, laktoosia, L-kystiiniä, natriumsulfiittia tai tioglykolaattia, tai viljelyväliaineeseen, joka sisältää niitä ja agaria, ja viljellään sitten anaerobisissa olosuhteissa 36°-38°C;ssa 1-3 päivää; viljelmään tai sen supernatanttiin lisätään alkoholia niin että konsentraatio on 50-70 tilav.-%; muodostunut saostuma otetaan talteen; saostuman vesiliukoinen jae saatetaan tarvittaessa dialyysiin tai ultrasuodatukseen ja sitten saostuman vesiliuokoisen jakeen 0,2-0,3 M natriumkloridi-fosfaattipuskuria tai dialyysistä tai ultrasuodatuksesta saadun sisäisen liuoskomponentin 0,2-0,3 M natriumkloridi-fosfaatti-puskuria käsitellään heikosti emäksisellä ioninvaihtajalla tai heikosti emäksisellä ioninvaihtajalla, jolla on molekyyliseulontakyky ja joka on tasapainotettu 0,2-0,3 M natriumkloridi-fosfaat-tipuskurilla; jae, joka on kulkenut ioninvaihtajän läpi, otetaan talteen; tämä eluoitu liuos säädetään niin, että sen natrium-kloridi-konsentraatio on 0,1-0,2 M, ja käsitellään sitten hei-kosit emäksisellä ioninvaihtajalla tai heikosti emäksisellä ioninvaihtjalla, jolla on molekyyliseulontakyky ja joka on tasapainotettu 0,1-0,2 M natriumkloridi-fosfaattipuskurilla, adsorboitumaan sille; ja jae, joka on eluoitunut 0,2-0,3 M natriumkloridi-f osfaattipuskurilla, otetaan talteen adsorboituneesta jakeesta, väkevöidään, poistetaan suolat ja kuivataan sitten. 87 68060