CH648042A5 - Carcinostatische substanzen, verfahren zur herstellung derselben und mittel mit einem gehalt derselben. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft TF-Substanzen TF-100,110,120,130,1316,123a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136,140 und 150 und ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen mit carcinostatischer und die Immunreaktion stimulierender Wirksamkeit und betrifft weiter carcinostatische Mittel mit einem Gehalt derselben.

Das Verfahren umfasst die Kultivierung von TF-Sub-stanz-produzierenden Bakterien, die zur Gattung Fusobacterium gehören, unter anaeroben Bedingungen und die Isolierung der resultierenden Substanzen von der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit (die genannte neue Substanz wird im folgenden als «TF-Substanz» bezeichnet).

In den letzten Jahren wurden in verstärktem Masse Heilmittel zur Behandlung von Patienten mit verschiedenen Krebstypen eingesetzt, die immunologische Fraktionen des Wirtes verstärken und einen carcinostatischen Effekt mit Hilfe der immunologischen Funktion erzielen. Unter den Antitu-mormitteln, die für derartige Heilmittel verwendet wurden,

sind bekannte Komponenten, die von Organismen verschiedener Bakterien oder aus Kulturen verschiedener Bakterien erhalten wurden. Es sind darunter auch Polysaccharide, die aus Fruchtkörpern von Basidiomycetes oder kultivierten Pilzkörpern derselben erhalten wurden. Diese Antitumormittel sind jedoch bisher nicht befriedigend, und zwar hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, schädlicher Nebeneffekte und hinsichtlich des Herstellungsverfahrens.

Andererseits gibt es Berichte über Organismen und eine überstehende Flüssigkeit, die durch Kultivierung von Bakte- • rien erhalten wurden, die zur Fusobacterium-gattung gehören, wie z.B. Fusobacterium K031-3B, Fusobacterium fusi-fomis W-12, Fusobacterium girans 1012 und Fusobacterium nucleatum 1010 [Dental Surgery, 23,322-333 (1974), und 21, 534-539 (1972) (japanisch)]. Es wurde bisher jedoch noch keine Untersuchung der Komponenten durchgeführt, die aus einer Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit erhalten wurden, welche durch Kultivierung von Bakterien herstellt wurde, die zu Fusobacterium gehören. Es wurden weiterhin auch noch keine pharmakologischen Aktivitäten der Komponenten untersucht.

Die pharmakologische Aktivität einer überstehenden Flüssigkeit wurde untersucht, die durch Kultivierung von Bakterien, die zu Fusobacterium gehören, und durch Abtrennung des Organismus von der Kultur erhalten wurde. Dabei haben sie gefunden, dass eine spezifische, aus der überstehenden Flüssigkeit erhaltene Komponente eine carcinostatische Aktivität aufweist. Sie haben weiterhin gefunden, dass diese Komponente im wesentlichen keine Hemmwirkung auf die Bildung einer Kolonie von Krebszellen bei einem Kolonie-Schaumbildungsassay-Verfahren aufweist und dass die Komponente nicht dadurch eine carcinostatische Aktivität aufweist, dass sie Krebszellen abtötet, sondern dass die Komponente eine indirekte carcinostatische Aktivität zeigt, indem sie nämlich die Antitumor-Aktivität des mit dem Medikament

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behandelten Wirts oder die Immunität des Wirts erhöht und sich auf diese Weise die Hilfe der Immunität zunutze macht.

Es wurde weiter gefunden, dass die genannte Komponente eine sehr geringe Toxizität aufweist und auch durch Behandeln der Kultur erhalten werden kann.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche TF-Substanzen zur Verfügung zu stellen und ein Verfahren zu schaffen, bei dem ein zu Fusobacterium gehörendes Bakterium unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird und neue TF-Substanzen mit carcinostatischen und immunostimulie-renden Aktivitäten aus der resultierenden Kultur oder der überstehenden Flüssigkeit derselben isoliert werden. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein carcinostatisches Mittel mit einem Gehalt der genannten TF-Substanzen zu schaffen.

Diese Aufgaben werden mit den Substanzen, dem Verfahren und dem Mittel nach den Patentansprüchen gelöst. Als er-findungsgemäss verwendetes Bakterium kann irgendein TF-Substanz produzierendes Bakterium das zu Fusobacterium gehört, verwendet werden. Beispielsweise wird Fusobacterium nucleatum vorzugsweise verwendet. Im konkreten Fall wird Fusobacterium nucleatum TF-031 verwendet, das unter der Ordnungsnummer ATCC 31647 am 23.5.1980 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 - USA und unter der Ordnungsnummer FERM 5077 am 12.7.1979 am Fermentation Research Institute Agency of Industriai Science and Technology Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, yatabe-machitsubuka-gun Ibaraki-ken 305-JP hinterlegt wurde.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Fusobacterium nucleatum TF-031 sind wie folgt.

(I) Form

(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)

(2) Polymorphie der Zellen: fehlt

(3) Beweglichkeit: fehlt

(4) Sporen: fehlen

(5) Gram-Färbung: gramnegativ

(6) Säurebeständigkeit: negativ

(II) Wachstumsbedingungen in einem Kulturmedium

(1) TF-a Agarplatte und geneigtes Kulturmedium äussere Form: rund

Grösse: etwa 1 mm 5 Protuberanz: hemisphärische Form Struktur: tautropfenartig Oberfläche: glatt Kanten: glatt

Farbe: milchig gelblich-weiss 10 Transparenz: opak

(2) TF-a flüssiges Kulturmedium Wachstumsgrad: heftig Trübung: Koagulum Präzipitat: keines

Wachstum an der Oberfläche: keines, kein Wachstum bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm Gas: keines

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(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Produktion von Hydrogensulfid: +

(2) Reduktion von Nitraten: —

(3) Produktion von Buttersäure: +

(4) Produktion von Indol: +

(5) Urease: —

(6) Catalase: -

(7) Hydrolyse von Stärke: -

(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob

(9) Produktion von Ammoniak: +

(10) Produktion von Kohlendioxid: +

(11) Wachstumsbereich: pH 5 bis 8,5, Temperatur 30 bis 45 °C

(12) Gasbildung aus Sacchariden:

L-Arabinose (—), D-Xylose (—), D-Glucose (—), D-35 Mannose (—), D-Fructose (—), D-Galactose (—), Malzzuk-ker (—), Saccharose ( - ), Trehalose (—), Sorbit (—), Mannit ( - ), Inosit - ), Glycerin ( - ), Stärke ( - ).

Die neuen TF-Substanzen gemäss der vorliegenden Erfindung werden beispielsweise folgendermassen hergestellt.

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Kultur von TF-Substanz liefernden Bakterien.die zum Fusobacterium-Stamm gehören

T

hydrophiles organisches Lösungsmittel

überstehende Lösung v i

Stehenlassen i

unlösl. Fraktion

's

Abtrennung

Trocknen

£ ;

wasserlösliche Fraktion

2

*

TF-100 -

äußere Lösung

>

£

'Dialyse oder

Ultrafiltration j

Trocknen

V"

TF-110

innere Lösung unadsorbier-te Fraktion <-

Behandlung mit Ionenaustausch.

Entsalzen

Eluat

Phosphatpuffer (Natriumchlorid)

Trocknen TF-120

Konzentration finita j.z zen

Trocknen

4-

TF-130 (TF-1316, 132a, 132b,

133a, 133b, 1323, 136)

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j Konzentration

1 ~~

| Trocknen

TF-1AO

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wasserlösliche Fraktion

Dissoziationsverfahren

Nk lösliche Fraktion

Wasch-lösungen hydrophiles organisches Lösungsmittel

->

lösliche Fraktior

Trocknen

I

TF-150

Das oben erwähnte Herstellungsverfahren wird im folgenden näher erläutert.

(1) Kultivierung des Bakteriums Die Kultivierung des zu Fusobacterium gehörenden Bakteriums wird mittels eines herkömmlichen Verfahrens zur Kultivierung anaerober Bakterien durchgeführt. Das heisst, es wird ein Kulturmedium verwendet, das eine Stickstoffquelle, wie Kalbshirn-Herz-Extrakte, verschiedene Peptone oder dergl.; eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt oder dergl.; ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid oder dergl.; eine

Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder dergl.; ein Re-60 duktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Thioglykollat oder dergl.; enthält. Das Medium wird auf einen pH von 6 bis 8,5 und vorzugsweise 7,2 bis 8,2 eingestellt und die Bakterien werden dem Kulturmedium eingeimpft. Daraufhin wird eine Kultivierung im Fliessgleichgewicht (steady-state-Kultivie-65 rung) unter anaeroben Bedingungen bei 35 bis 42 °C und vorzugsweise bei 36 bis 38 °C während 1 bis 5 Tagen und vorzugsweise während 24 bis 72 Stunden durchgeführt. Es ist insbesondere wünschenswert, das in der Tabelle 1 beschriebene

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Kulturmedium (im folgenden als «TF-Kulturmedium» bezeichnet) zu verwenden. Die Hirn-Herz-Infusion, bei der es sich um einen Kalbshirn-Herz-Extrakt handelt, ist jedoch nicht immer als Kohlenstoffquelle notwendig und kann durch eine Herzinfusion ersetzt werden, bei der es sich um einen Kalbs.herzextrakt handelt, sowie durch einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt, durch Maisquellwasser oder dergl. ersetzt werden. Unter den verschiedenen Peptonen sind Proteosepepton und Phytonpepton nicht immer notwendig. Das Trypticasepepton kann durch ein Polypepton ersetzt werden.

Falls Agar nicht verwendet wird, so ist es wünschenswert, eine Kultivierung unter Rühren durchzuführen.

Tabelle 1

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Bestandteile des

TF-a

TF-b

TF-c 15

Kultur

mediums (g/1)

Trypticasepepton

17

17

17

Phytonpepton

3

3

1,5 2»

Proteosepepton

10

5

5

Hirn-Herz-Infu-

35

17,5

sionsbrühe

Herz-Infusions

-

-

25

brühe

25

Hefeextrakt

3

3

3

Natriumchlorid

7,5

7,5

7,5

Glucose

6

6

6

Lactose

5

5

5

L-Cystin

0,25

0,5

0,5 30

Natriumsulfit

0,1

0,1

0,1

Thioglykollat

0,5

0,5

0,5

Agar

0 oder 0,7

0 oder 0,7

0 oder 0,7

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(2) Isolierung einer überstehenden Flüssigkeit von der Kultur (Entfernung der Organismen)

Die Organismen werden von der oben erhaltenen Kultur abgetrennt, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die Abtrennung der Organismen kann mittels eines herkömmlichen Verfahrens erfolgen. Beispielsweise kommt ein Zentri-fugieren und ein Filtrierverfahren unter Verwendungeines Filtrierhilfsmittels, wie Hyflo Super Cel, in Frage. Unter dem Gesichtspunkt von Verfahrensführung, dem Grad der Abtrennung der Organismen und der Ausbeute an überstehender Flüssigkeit wird insbesondere ein Zentrifugierverfahren bevorzugt. Die Organismen werden vorzugsweise bei dieser Verfahrensstufe entfernt, sie können jedoch auch in einer nachfolgenden Verfahrensstufe (3) entfernt werden.

(3) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-100

Der oben erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit oder der

Kultur wird ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zuge setzt, und das dabei gebildete Präzipitat wird aufgefangen. Zu diesem Zeitpunkt ist der pH der überstehenden Flüssigkeit oder der Kultur vorzugsweise auf pH 2 bis 7 eingestellt. Die hydrophilen, organischen Lösungsmittel umfassen z.B. Alko hole, wie Äthanol, Methanol oder dergl., und Ketone, wie

Aceton und dergl., wenn auch Alkohole, insbesondere Ätha nol, zu den besten Ergebnissen führen. Das hydrophile, orga nische Lösungsmittel wird in zweckentsprechender Weise zu gesetzt, so dass seine Konzentration 30 bis 70 Vol-% und ins besondere 50 bis 70 Vol-% ausmacht. Nach der Zugabe des hydrophilen, organischen Lösungsmittels wird das resultierende Gemisch bei niedriger Temperatur, vorzugsweise bei et- 65 wa 5 °C, mehrere Stunden bis einige Tage stehengelassen, um die Bildung des Präzipitats zu vervollständigen. Das auf diese Weise gebildete Präzipitat wird mittels herkömmlicher Ver-

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fahren, wie mittels Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren und dergl., abgetrennt.

Anschliessend wird Wasser in einer Menge von dem 10-bis 15fachen des oben erhaltenen Präzipitats demselben zugesetzt [das Wasser kann durch einen Phosphatpuffer oder durch einen Natriumchlorid enthaltenden Phosphatpuffer ersetzt werden, falls beabsichtigt wird, TF-120 oder 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 oder 136) zu erhalten, wie im folgenden noch näher beschrieben wird]. Die gebildeten, wasserunlöslichen Materialien werden mittels eines herkömmlichen Verfahrens, wie mittels Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl., abgetrennt, worauf die wasserlösliche Fraktion aufgefangen wird. Falls die Kultur verwendet wird, werden die Organismen mittels der oben erwähnten Verfahren entfernt. Die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion wird mittels Lyophilisation (Gefriertrocknung) oder dergl. getrocknet. Dabei erhält man eine carcinostatische Substanz TF-100. Das so erhaltene TF-100 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(4) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-110

Die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion wird einer Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen. Alternativ wird TF-100 in Wasser aufgelöst, und zwar in einer Wassermenge von dem 10- bis 15fachen des TF-100, und die resultierende Lösung wird der Dialyse oder Ultrafiltration unterworfen. Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Aminosäuren und anorganische Materialien, werden mittels der oben erwähnten Behandlung entfernt. Die bei der Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene, innere Lösung wird aufgefangen und danach getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-110 erhält. Das auf diese Weise erhal-tene TF-110 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(5) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-120

Die in der obigen Stufe 3 erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder gegebenenfalls die innere Lösung, die bei der Durchführung der Dialyse oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhalten wurde (die innere Lösung, die in der obigen Stufe (4) erhalten wurde), oder eine Lösung eines Pulvers aus TF-110 in einer geringen Menge Wasser wird mit einem Ionenaustauscher behandelt. Als Ionenaustauscher wird ein schwach basischer Ionenaustauscher oder ein schwach basischer Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung vorzugsweise verwendet. Beispielsweise ist Diäthylaminoäthyl-Se-phadex A-50 (Warenzeichen von Pharmacia Co., Ltd.) zur Verwendung geeignet. Eine mit einem Ionenaustauscher gepackte Säule wird äquilibriert, und zwar beispielsweise mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von etwa 8. Daraufhin wird die oben erwähnte Lösung, die behandelt werden soll, durch die Säulen laufenlassen und die erluierte Lösung wird aufgefangen und anschliessend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet. Alternativ werden der gleiche Puffer, wie er oben verwendet wurde, und die zu behandelnde Lösung in ein Gefäss gegeben, das einen Ionenaustauscher enthält. Der Inhalt wird gerührt und anschliessend wird filtriert, woraufhin das Filtrat getrocknet wird. Auf diese Weise kann eine carcinostatische Substanz TF-120 mit den weiter unten beschriebenen Eigenschaften erhalten werden. TF-120 kann auch durch Entsalzen der eluierten Lösung oder des Filtrats, z.B. mittels Dialyse unter Verwendung eines Cellophanrohrs oder dergl., unter Verwendung von Sephadex G-25 (Warenzeichen von Pharmacia Co., Ltd.) oder mittels Ultrafiltration und anschliessendem Trocknen des Filtrats erhalten werden. Das auf diese Weise erhaltene TF-120 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(6) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-130

Eine Säule, die die adsorbierten Komponenten enthält,

aus denen TF-120 mittels der Behandlung der obigen Stufe (5) entfernt wurde, wird mit einem Phosphatpuffer behandelt,

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und zwar vorzugsweise einem Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,6 M und einem pH von etwa 8 (der Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,6 M wird im folgenden als «0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer» bezeichnet). Alternativ wird die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion, gegebenenfalls nach Dialyse oder Ultrafiltration, der Behandlung mit einem Ionenaustauscher unter Verwendung eines 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffers unterworfen. Man erhält auf diese Weise eine Fraktion, die nicht mit einem Phosphatpuffer eluiert wird, der frei von Natriumchlorid ist, aber andererseits mit einem 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird.

Dieses Verfahren kann entweder in einem Säulensystem oder chargenweise durchgeführt werden. Die angestrebte Fraktion, die auf diese Weise erhalten wird und die mit dem Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird mittels Gefrietrocknung oder dergl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-130 erhält. Das die angestrebte Fraktion enthaltende Eluat, das mit dem zuvor erwähnten Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, kann entsalzt werden, und zwar beispielsweise mittels Dialyse unter Verwendung eines Cellophanrohrs, durch Molekularsiebung unter Verwendung von Sephadex G-25 oder durch Ultrafiltration, und kann anschliessend getrocknet werden.

Der hier verwendete Ausdruck «TF-130» bezeichnet umfassend alle angestrebten, eluierten Fraktionen, die durch Behandlung der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder gegebenenfalls der Komponente der inneren Lösung, die durch Dialyse oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhalten wurde, mit einem Ionenaustauscher erhalten werden, und zwar alle solche Fraktionen, die nicht mit einem Phosphatpuffer, der frei von Natriumchlorid ist, eluiert werden, aber andererseits mit einem 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert werden. TF-130 umfasst konkret beispielsweise folgende Fraktionen.

(i) Eine Fraktion, die nicht mit einem von Natriumchlorid freien Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird (die Fraktion wird als «TF-1316» bezeichnet).

(ii) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem

0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird [die Fraktion wird als «TF-132a und b» bezeichnet; die RF-132a-Fraktion wird erhalten, indem man einen Ionenaustauscher, der die zuvor erwähnte adsorbierte Komponente enthält, mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer wäscht, den Ionenaustauscher mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuf-fer behandelt und anschliessend die Fraktion auffängt, die mit dem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird; die TF-132b-Fraktion wird erhalten, indem man die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung (TF-110) mit einem Ionenaustauscher behandelt],

(iii) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem

0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird (die Fraktion wird als «TF-133a und b» bezeichnet; a und b haben jeweils die gleiche Bedeutung, wie im Falle von TF-132a und b definiert).

(iv) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung mit einem 0,3 M Natriumchlo-rid-Phosphatpuffer eluiert wird (die Fraktion wird als «TF-1323» bezeichnet).

(v) Eine Fraktion, die nicht mit einem 0,5 M Natrium-chlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch bei der obigen Ionenaustauscherbehandlung mit einem 0,6 M Natriumchlo-rid-Phosphatpuffer eluiert wird (die Fraktion wird als s «TF-136» bezeichnet).

Da diese Substanzen TF-1316,132a, 132b, 133a, 133b, 1323 und 136 in folgender Hinsicht gemeinsame Eigenschaften aufweisen, werden die Substanzen mit den gemeinsamen Eigenschaften als «TF-130» bezeichnet. Das heisst, das auf io die oben erwähnte Weise erhaltene TF-130 weist folgende Eigenschaften auf:

(a) Grauweiss-hellbraunes Pulver.

(b) Es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites-Tumor bei Mäusen, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carci-

15 nom und es besitzt eine immunostimulierende Aktivität.

(c) Es ist in Wasser löslich und unlösliche in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther.

(d) Es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei 20 etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert deutlich über 200 °C.

(e) Sein Infrarot-Absorptionsspektrum, das mittels eines Verfahrens unter Verwendung von KBr-Tabletten erhalten wurde, zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,

25 2960-2930,1670-1640,1550,1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm-1.

(f) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von

30 256-280 nm.

(g) Es zeigt eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion; seine Ninhydrin-Reaktion ist negativ.

35 (h) Elementaranalysen-Werte: C 27,5 bis 39,8%; H 3,2 bis 5,7%; N 2,8 bis 6,3%.

(i) Sein Saccharidanteil, bestimmt mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens, beträgt etwa 19,0 bis etwa 64,0 Gew.-% (ausgedrückt als Glucose), und sein Proteinge-40 halt, bestimmt mittels des Lowry-Folin-Verfahrens, liegt in der Nähe von 6,0 bis 28,0 Gew.-% (ausgedrückt als Kalbserumalbumin). Die oben erwähnte Ionenaustauscherbehandlung wird im folgenden noch näher erläutert. Als Ionenaustauscher bei den folgenden Verfahren wird vorzugsweise ein 45 schwach basischer Ionenaustauscher oder ein schwach basischer Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung verwendet. Beispielsweise eignet sich das in der obigen Stufe (5) verwendete Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50, und es kann folgendes Verfahren in einem Chargensystem durchgeführt so werden.

(i) Ein 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, wird durch eine Säule eines die adsorbierten Komponenten enthaltenden Ionenaustauschers, durch den die zu behandelnde Lösung in der

55 obigen Stufe (5) laufenlassen wurde, hindurchgeleitet und die eluierte Fraktion wird aufgegangen. Die Fraktion wird gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und anschliessend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische 6o Substanz TF-1316 erhält. Das auf diese Weise erhaltene TF-1316 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(ii)-l) Ein 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, wird durch eine Säule eines Ionenaustauschers, enthaltend die nach Durch-

65 laufen der zu behandelnden Lösung in der obigen Stufe (5) adsorbierte Komponente, durchlaufen lassen, um die Säule -zu waschen. Daraufhin wird ein 0,2 M Natriumchlorid-Phos-phatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist,

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durch die Säule laufenlassen und die eluierte Fraktion wird aufgefangen, gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und anschliessend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-132a erhält. Das auf diese Weise erhaltene TF-132a hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(ii)-2) Unter Verwendung der in Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder der in Stufe (4) erhaltenen, inneren Lösung werden auf die folgende Weise Verfahren zur Isolierung der Fraktion durchgeführt, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird. Auf diese Weise wird TF-132b erhalten. Das heisst, die mit dem Ionenaustauscher bepackte Säule wird mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert. Daraufhin wird der zuvor erwähnte 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder die durch Behandeln der wasserlöslichen Fraktion mittels Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene Komponente der inneren Lösung durch die Säule laufenlassen und die eluierte Lösung wird aufgefangen. Gegebenenfalls wird die Säule mit dem erwähnten 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen und die eluierte Lösung und die Waschlösungen werden kombiniert. Die Behandlung mit dem Ionenaustauscher kann mehrere Male durchgeführt werden. Anschliessend wird eine Lösung, die durch Verdünnen der oben erwähnten, eluierten Lösung mit einem Phosphatpuffer in der Weise hergestellt wurde, dass die Natriumchloridkonzentration 0,1 M sein kann, durch eine Säule laufenlassen, in der der Ionenaustauscher mit 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert wurde. Die Fraktion, die mit dem oben erwähnten 0,1 M Natrium-chlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird entfernt und anschliessend wird der oben erwähnte 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu erhalten. Bei dem konkreten Beispiel der oben erwähnten Behandlung mit dem Ionenaustauscher wird eine Fraktion aufgefangen, die nicht an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen wurde und anschliessend mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, um ein Eluat zu erhalten. Es kann auch ein Verfahren angewendet werden, bei dem umgekehrt die Fraktion, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, aufgefangen wird und bei dem anschliessend ein Verfahren zur Abtrennung der genannten Fraktion aus einer Fraktion durchgeführt wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, und wobei eine Fraktion, die mit dem oben erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, aufgefangen wird.

Anschliessend wird das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Eluat gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und daraufhin mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-132b zu erhalten. Das auf diese Weise erhaltene TF-132b hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

(iii)-l) Die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der inneren Lösung wird durch eine Säule aus einem Ionenaustauscher laufenlassen, der mit einem Phosphatpuffer äquilibriert ist, welcher vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist. Ein 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 wird durch die genannte Säule laufenlassen, um die Säule zu waschen, und anschliessend wird 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH 5 von vorzugsweise.etwa 8 durch die Säule geleitet. Alternativ wird der oben erwähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule geleitet, die in der obigen Stufe (ii)-l) behandelt wurde und noch die restliche, adsorbierte Komponente aufweist. Die eluierte Fraktion wird aufgefangen, gege-io benenfalls konzentriert, mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und dann mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz TF-133a erhält. Die so erhaltene Substanz TF-133a besitzt die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

15 (iii)-2) Die Fraktion, die nicht mit einem 0,2 M Natri-umchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer bei der Ionenaustauscherbehandlung eluiert wird, wird auf die folgende Weise aufgefangen, um TF-133b zu erhalten. Dabei handelt es sich 2o um das gleiche Verfahren wie bei der obigen Stufe (ii)-2). Das heisst, die mit dem Ionenaustauscher bepackte Säule wird mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer, der vorzugsweise einen pH von etwa 8 aufweist, äquilibriert. Daraufhin wird der oben erwähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuf-25 fer der in der obigen Stufe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder es wird die durch Behandeln der wasserlöslichen Fraktion mittels Dialyse oder Ultrafiltration erhaltene Komponente der inneren Lösung durch die Säule laufenlassen und die eluierte Lösung wird aufgefangen. Gegebenenfalls 3o wird die Säule mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen und die eluierte Lösung und die Waschflüssigkeiten werden kombiniert. Die Ionenaustauscherbehandlung kann mehrere Male durchgeführt werden. Danach wird eine Lösung, die in der Weise durch Ver-35 dünnen der zuvor erwähnten eluierten Lösung mit einem Phosphatpuffer hergestellt wurde, dass die Natriumchloridkonzentration 0,2 M betragen kann, durch eine Säule laufenlassen, in der der Ionenaustauscher mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit vorzugsweise einem pH von 40 etwa 8 äquilibriert wurde.

Die Fraktion, die mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, wird entfernt, wor- • aufhin der zuvor erwähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphat-puffer durch die Säule geleitet wird, um ein Eluat zu erhalten. 45 In dem konkreten Beispiel der oben erwähnten Ionenaustauscherbehandlung wird eine Fraktion aufgefangen, die nicht an einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, an einem Ionenaustauscher adsorbiert so wurde, der mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, mit dem zuvor erwähnten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer gewaschen wurde und anschliessend mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlo-rid-Phosphatpuffer eluiert wurde, um ein Eluat zu erhalten, ss Es kann auch ein Verfahren angewendet werden, bei dem umgekehrt eine Fraktion aufgefangen wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, der mit dem obengenannten 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde, und bei dem anschliessend ein Verfahren zur Abtrennung der 60 genannten Fraktion von einer Fraktion durchgeführt wird, die auf einem Ionenaustauscher adsorbiert wurde, welcher mit dem oben erwähnten 0,3 M Natriumchlorid-Phosphat-puffer äquilibriert wurde, wobei eine Fraktion aufgefangen wird, die mit dem obengenannten 0,3 M Natriumchlorid-65 Phosphatpuffer eluiert wurde.

Anschliessend wird das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Eluat gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und nachfolgend mit-

648 042 16

tels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, um die ange- Menge an Bariumionen wird vorzugsweise so eingestellt, dass strebte carcinostatische Substanz TF-133b zu erhalten. Das die Konzentration der Gesamtmenge der Bariumionen, bezo-auf diese Weise erhaltene TF-133b hat die in Tabelle 2 aufge- gen auf das Endvolumen der Mischung, 0,005 bis 0,1 M beführten Eigenschaften. trägt. Die auf diese Weise erhaltene Mischung wird filtriert,

(iv) Die in der obigen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche 5 und es wird ein Verfahren zur Abtrennung des Bariums aus Fraktion oder die in der obigen Stufe (4) erhltene Komponen- dem erhaltenen Bariumsalz durchgeführt. Das Barium wird te der inneren Lösung wird in einen 0,3 M Natriumchlorid- vorzugsweise entfernt, indem man das Bariumsalz zu Natri-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 über- umsulfat, und vorzugsweise einer 5- bis 15 %igen wässrigen führt und der auf diese Weise erhaltene Puffer wird durch eine Natriumsulfatlösung, gibt, die resultierende Mischung rührt Ionenaustauschersäule laufenlassen, die zuvor mit einem io und danach eine Filtration durchführt, um eine Lösung zu er-0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von halten. Der abgetrennte Niederschlag wird mit einer wässri-vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung gen Natriumsulfatlösung wiederholt gewaschen und die wird durch Zugabe eines Phosphatpuffers in der Weise einge- Waschflüssigkeiten werden mit der oben erwähnten Lösung stellt, dass die Natriumchloridkonzentration 0,1 M betragen kombiniert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird einer kann. Anschliessend wird die Lösung durch eine Ionenaus- is Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. unterworden, um den tauschersäule geleitet, die zuvor mit einem 0,1 M Natrium- Uberschuss an Natriumsulfat oder Substanzen mit niedrigem chlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von vorzugsweise etwa Molekulargewicht zu entfernen. Die resultierende Lösung

8 äquilibriert wurde, und anschliessend wird der oben er- wird anschliessend mittels Gefriertrocknung oder dergl. gewähnte 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die ge- trocknet, um eine carcinostatische Substanz TF-140 zu erhal-nannte Säule geleitet, woraufhin die eluierte Fraktion aufge- 20 ten. Das auf diese Weise erhaltene TF-140 hat die in Tabelle 2 fangen wird, gegebenenfalls konzentriert und mittels Dialyse, aufgeführten Eigenschaften.

Ultrafiltration oder dergl. entsalzt wird und anschliessend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet wird, um eine carcinostatische Substanz TF-1323 zu erhalten. Das auf diese (8) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-150

Weise erhaltene TF-1323 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Ei- » Die in der obiSen Stufe (3) erhaltene, wasserlösliche Frak-

genschaften. tion oder die in der obigen Stufe (4) erhaltene, innere Lösung

(v) Die in der obigen Stufe (4) erhaltene Komponente der wird ,mit einem quaternären Ammoniumsalz behandelt. Das inneren Lösung wird durch eine Säule eines Ionenaustau- dabei gebildete Präzipitat wird abgetrennt und danach unter schers laufenlassen, der mit einem Phosphatpuffer mit einem Verwendung einer Lösung, enthaltend Natriumchlorid, dis-pH von vorzugsweise etwa 8 äquilibriert wurde. Ein 0,5 M 3° soziiert, woraufhin ein hydrophiles, organisches Losungsmit-Natriumchlorid-Phosphatpuffer mit einem pH von Vorzugs- tel zu der löslichen Fraktion zugegeben wird. Das auf diese weise etwa 8 wird zum Waschen durch die genannte Säule ge- Weise gebildete Präzipitat wird abgetrennt und danach geleitet und danach wird ein 0,6 M Natriumchlorid-Phosphat- trocknet, wobei man TF-150 erhält. Als quaternäres Ammo-puffer mit einem pH von vorzugsweise etwa 8 durch die ge- niumsalz, das bei diesem Verfahren eingesetzt werden kann, nannte Säule laufenlassen. Alternativ wird der zuvor erwähn- 35 kommt gewöhnlich irgendein Komplex mit einem Polysac-te 0,5 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer durch die Säule lau- charid in Frage- Besonders bevorzugte Beispiele derselben fenlassen, die zuvor in der obigen Stufe (ii)-2) behandelt wur- umfassen Cetyl-pyridiniumchlorid, Cetyl-trimethylammoni-de und noch die verbleibende, absorbierte Komponente um- umbromid etc.. Die Behandlung mit einem quaternären Am-fasst, woraufhin der zuvor erwähnte 0,6 M Natriumchlorid- moniumsalz wird vorzugsweise in Gegenwart eines Puffers, Phosphatpuffer durch die Säule geleitet wird. Die eluierte 40 wie eines Boratpuffers oder dergl., durchgeführt. Im folgen-Fraktion wird aufgefangen, gegebenenfalls konzentriert, mit- den wird die obige Behandlung mit einem quaternären Amteis Dialyse, Ultrafiltration oder dergl. entsalzt und anschlies- moniumsalz und das Dissoziationsverfahren unter Verweisend mittels Gefriertrocknung oder dergl. getrocknet, um eine . dung einer Natriumchlorid enthaltenden Lösung näher erläu-carcinostatische Substanz TF-136 zu erhalten. Das auf diese tert- Beispielsweise wird eine wässrige Lösung eines quaternä-Weise erhaltene TF-136 hat die in Tabelle 2 angegebenen Ei- 45 ren Ammoniumsalzes tropfenweise zu der in der obigen Stufe genschaften. (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu der in der

(7) Isolierung der carcinostatischen Substanz TF-140 Zur obigen Stufe 4 erhaltenen, inneren Lösung zugegeben, wäh-Bildung eines Bariumsalzes werden Bariumionen entweder zu rend der pH schwach basisch gehalten wird. Die resultierende der in den obigen Stufen (1) oder (2) erhaltenen Kultur oder Mischung wird bei 0 bis 50 °C während 10 Minuten bis meh-deren überstehender Flüssigkeit oder zu der in der obigen Stu-50 rere Stunden gerührt, woraufhin das ausgefallene Präzipitat fe (3) erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu der durch abgetrennt wird. Das Präzipitat wird mehrere Male mit einer Auflösen von TF-100 in Wasser erhaltenen Lösung gegeben. Pufferlösung, vorzugsweise einem 0,1 %igen Boratpuffer, ent-Anschliessend wird das Präzipitat abgetrennt und danach ei- haltend 0,1 M Natriumchlorid und eine geringe Menge eines nem Verfahren zur Entfernung des Bariums unterworfen. Die quaternären Ammoniumsalzes, gewaschen und danach mit wasserlösliche Fraktion wird aufgefangen und danach einer 55 einem Puffer, vorzugsweise einem 0,1 %igen Boratpuffer, entDialyse oder Ultrafiltration unterworfen, um TF-140 zu er- haltend 0,5 M Natriumchlorid und eine geringe Menge eines halten. Im einzelnen wird folgendermassen vorgegangen: eine quaternären Ammoniumsalzes, dissoziiert, um eine lösliche wässrige Bariumhydroxydlösung, vorzugsweise eine 0,1 bis Fraktion zu erhalten. Nachfolgend wird ein hydrophiles, or-0,5 molare wässrige Bariumhydroxidlösung, wird zu der in ganisches Lösungsmittel, vorzugsweise ein Alkohol, nachdem den obigen Stufen (1) oder (2) erhaltenen Kultur oder deren 60 die lösliche Fraktion auf einen pH von vorzugsweise 2 bis 6 überstehender Flüssigkeit oder zu der in der obigen Stufe (3) eingestellt wurde, der löslichen Fraktion in der Weise zuge-erhaltenen, wasserlöslichen Fraktion oder zu einer durch setzt, dass deren Endkonzentration 50 bis 90% und vorzugs-Auflösen von TF-100 in Wasser erhaltenen, wässrigen Lö- weise 70 bis 90% (nach Volumen) betragen kann. Die auf die-sung gegeben, und zwar in einer Menge von etwa dem 10- bis se Weise erhaltene Mischung wird mehrere Stunden bis 90 15fachen der Menge des TF-100. Der pH der resultierenden 65 Stunden bei 0 bis 30 °C stehengelassen, woraufhin das ausge-Mischung wird vorzugsweise auf 10 bis 13 eingestellt, um ein schiedene Präzipitat abgetrennt wird, um eine carcinostati-Bariumsalz zu bilden. Durch die Zugabe einer Bariumhydro- sche Substanz TF-150 zu erhalten. Das auf diese Weise erhal-xidlösung scheidet sich ein Präzipitat ab, und die zugegebene tene TF-150 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.

17

648 042

Tabelle 2 Eigenschaften

Fraktion TF-1Ö0

TF-110

TF-120 TF-1316

TF-132a

TF-132b

TF-133a

TF-133b

TF-1323

TF-136

TF-140

TF-150

Aussehen Pharmakologische Wirkung grauweisses- diese Fraktion inhibiert das Wachstum von hellbraunes Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor Pulver bei Mäusen und weist eine immunostimulieren de Aktivität auf do. diese Fraktion inhibiert das Wachstum von

Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und besitzt immunost. Aktivität do. do.

do. diese Fraktion inhibiert das Wachstum von

Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und besitzt immunostimulierende Aktivität do. do.

do. do.

do. do.

do. do.

do. do.

do. do.

do. diese Fraktion inhibiert das Wachstum von

Ehrlich ascites Tumor und besitzt immunostimulierende Aktivität do. do.

Löslichkeit löslich in Wasser, unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther do.

do.

do.

do. do. do. do. do. do. do.

do.

Tabelle 2 ( Fortsetzung )

Eigenschaften

Fraktion

TF-100

TF-110 TF-120

TF-1316

TF-130a

TF-132b

TF-133a

TF-133b

TF-1323

TF-136

TF-140

TF-150

Zersetzungspunkt

Beginn d. Zersetzung dieser Fraktion bei etwa 110 °C und bemerkenswerte Zersetzung über 200 °C

do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

Beginn d. Zersetzung dieser Fraktion bei etwa 210 °C, beachtliche Zers. bei etwa 2800 Beginn d. Zersetzung dieser Fraktion bei etwa 110 °C und beachtliche Zers. über 200 '

IR-Absorptionsspektrum (KBr-Verfahren) (cm-1)

das Spektrum weist Absorptionsbanden in d. Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640, 1550,1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm-1 auf do.

das Spektrum weist Absorptionsbanden in d.

Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,

1550,1380-1360,1140-1000 und 820 cnr1 auf das Spektrum weist Absorptionsbanden in d.

Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,

1550,1440-1380,1240,1140-1000,820 cm"1 auf do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Eigensch.

Fraktion C(%)

Elementaranalysenwerte H(%)

TF-100

30,6-35,7 4,2-5,2

N(%) 4,2-5,2

UV-Absorptionsspektra (wässrige Lösung)

^max (nm)

bei der Absorptionskante und im Bereich von 256 bis 260 nm

Sephadex G-50+

260 nm im Bereich von V.V. bis 400,430-530, 700-800 und 840-870 ml

Anthron-H2S04-Verfahren 620 nm im Bereich von V.V. bis 390 u, 310-430 ml

§

TF-110

35,9-41,0

4,5-5,2

4,2-5,2

do.

TF-120

35,1-40,2

4,5-5,5

2,0-3,1

bei der Absorptionskante u.i. Bereich von

268-272 nm

TF-1316

30,0-34,0

3,8-4,4

4,9-5,7

do

256-260 nm

TF-132a

34,8-39,8

4,5-5,7

2,8-3,6

do.

270-280 nm

TF-132b

35,3-39,5

4,5-5,6

2,8-5,4

do.

265-280 nm

TF-133a

28,0-36,6

3,5-5,1

4,5-6,3

do.

258-262 nm

TF-133b

31,1-38,5

3,9-5,2

3,4-4,7

am Absorptionsende, eine

Schulter i. Ber. v.

270-280 nm

TF-1323

29,9-39,4

3,9-5,6

2,8-5,4

bei d. Absorptionskante, eine

Schulter LBer.v.

265-280 nm

TF-136

27,5-32,6

3,2-4,0

5,0-6,1

bei d. Absorptions

kante u.i.Ber.v.

256-260 nm

TF-140

22,0-28,0

3,0-3,5

5,0-6,5

do.

255-260 nm

TF-150

31,0-34,0

4,0-4,4

2,8-3,2

do.

255-260 nm

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Eigensch.

Fraktion 260 nm TF-100

TF-110 im Bereich von V.V-380 und

600-920 ml TF-120 im Bereich von V. V-325 und

775-785 ml TF1316 im Bereich von V.V-160 ml TF-132a im Bereich von V.V-340, 600-700 und 720-880 ml TF-132b im Bereich von V.V-150 ml TF-133a im Bereich von V.V-300

und 630-940 ml TF-133b im Bereich von V.V-170 ml TF-1323 im Bereich von V.V-160 ml TF-136 im Bereich von 540-930 ml

TF-140 im Bereich von V.V-300,

500-900 und 900-1000 ml TF-150 im Bereich von V.V-100 und

100 bis 160 ml Bemerkung: V.V = Porenvolumen

Sephadex G-200+ +

Phenol-H2S04-Verfahren 490 nm im Bereich von V.V-380, 410-520 und 630-760 ml im Bereich von V.V-360, 360-480 und 510-760 ml im Bereich von V.V-160 ml im Bereich von V.V-340, 340-580 und 720-900 ml im Bereich von V.V-150 ml im Bereich von V.V-420 ml im Bereich von V.V-150 ml do.

geringe Absorptionsbande im Bereich von V.V-500, 650-850 und 850-1000 ml im Bereich von V.V-150 ml

Anthron-H2S04-Verfahren 620 nm im Bereich von V.V-380, 420-520 und 620-760 ml im Bereich von V.V-380, 420-520 und 620-760 ml im Bereich von V.V-340 und 340-580 ml im Bereich von V.V-420 ml geringe Absorptionsbande

19 648 042

Tabelle 2 (Forlsetzung)

Eigensch. HochIeistungs-Flüssigkeitschromatogramm+ + +

Fraktion

220 nm

260 nm

TF-100

in der Nähe der Lösungsmittelfront,

in der Nähe der Lösungsmittelfront,

38-60 und 65 min

38-60 und 65 min

TF-110

do.

do.

TF-120

in der Nähe der Lösungsmittelfront und in der Nähe der Lösungsmittelfront und

38-60 min

36-60 min

TF-1316

do.

40-60 min do.

40-60 min

TF-132a do.

30,38-60 und 65 min do.

62 und 65 min

TF-132b do.

36-37 und 48-50 min do.

32-39 und 45-52 min

TF-133a do.

38 und 50 min do

50-60 und 62 min

TF-133b do.

49-50 min do.

38-39 und 52 min

TF-1323

do.

36 und 48-50 min do.

36 und 50 min

TF-136

do.

28-40 und 42-60 min do.

42-60 min

TF-140

do.

40-60 min do.

40-60 min

TF-150

do.

32 und 48-50 min do.

32 und 48-50 min

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Eigensch. Farbreaktion

Fraktion Ninhydrin- Molisch- Phenol-H2S03- Anthron-H2S04- Indol-HCl- Lowry-Folin-

reaktion reaktion Reaktion Reaktion Reaktion Reaktion

TF-100

+

+

+

+

+

+

TF-110

-

+

+

+

+

+

TF-120

-

+

+

+

+

+

TF-1316

-

+

+

+

+

+

TF-132a

—

+

+

+

+

+

TF-132b

-

+

+

+

+

+

TF-133a

-

+

+

+

+

+

TF-133b

-

+

+

+

+

+

TF-1323

-

+

+

+

+

+

TF-136

-

+

+

+

+

+

TF-140

-

+

+

+

+

+

TF-150

—

+

+

+

+

+

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Eigensch. Saccharidgehalt, ausgedrückt als Glucose, bestimmt mittels Phenol-Fraktion H2S04-Verfahren (%)

Proteingehalt, ausgedrückt als Kalbserumalbumin, bestimmt mittels des Lowry-Folin-Verfah-

rens

TF-100 TF-110 TF-120 TF-1316 TF-132a TF-132b TF-133a TF-133b TF-1323 TF-136 TF-140 TF-150

ca. 40,0-ca. 46,0 ca. 30,0-ca. 69,0 ca. 56,0-ca. 73,0 ca. 35,0-ca. 50,0 ca. 55,0-ca. 64,0 ca. 23,6-ca. 45,5 ca. 26,0-ca. 35,0 ca. 19,0-ca. 24,5 ca. 19,0-ca. 25,0 ca. 19,0-ca. 30,0 ca. 5,0-ca. 15,0 ca. 40,0-ca. 55,0

ca. 20,0-ca. 23,0 ca. 18,0-ca. 23,0 ca. 9,0-ca. 13,0 ca. 10,0-ca. 23,0 ca. 18,0-ca. 28,0 ca. 15,5-ca. 28,0 ca. 22,0-ca. 28,0 ca. 12,9-ca. 22,9 ca. 11,0-ca. 17,0 ca. 6,0-ca. 12,0 ca. 23,0-ca. 32,0 ca. 7,0-ca. 14,0

In Tabelle 2 wurde für das mit « + » gekennzeichnete Sephadex G-50 eine Säule von 50 mm 0 x 600 mm und destilliertes Wasser als Eluierungsmittel verwendet. Für das mit «+ + » bezeichnete Sephadex G-200 (Warenzeichen von Pharmacia Co., Ltd.) wurde für TF-110,120,132a, 133a, 136 und 140 eine Säule von 44 mm 0 x 500 mm und für TF-1316,132b, 133b, 1323 und 150 eine Säule von

21 mm 0 x 400 mm verwendet. Als Eluierungsmittel wurde ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7 bei allen Substanzen verwendet, um das mit « + + + » gekennzeichnete 65 Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm zu erhalten, wurde eine 7,9 mm 0 x 600 mm x 2 Säule, beschickt mit TSK-Gel G300 SW (Warenzeichen derToyo Soda Co., Ltd.), verwendet und die Eluierung wurde bei Zimmertemperatur unter

648 042

Verwendung eines 0,1 M Phosphatpuffers mit einem pH von 7 als Eluierungsmittel bei einer Durchflussrate von 0,8 ml/ min durchgeführt.

Die pharmakologischen Wirkungen der erfindungsgemäs-sen carcinostatischen Substanzen TF-100, TF-110, TF-120, TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-140 und TF-150 sollen im folgenden erläutert werden.

(I) Wirkung der TF-Substanzen auf die Zell-Lebensfähigkeit (Koloniebildungs-Assay)

Es wird nach dem Verfahren von J.H. Kim et al. [Cancer Res. 25,698 (1965)] gearbeitet. HeLa S-3-Zellen werden in Eagle's MEM versetzt mit 10% Kalbsserum, während 3 bis 5 Tagen bei 37 °C kultiviert, und zwar in einem C02-Inkubator. Danach wird die Kultur entnommen. Zu den am Glas anhaftenden Zellen gibt man eine PBS( - )-Lösung (eine wässrige Lösung von 8,0 g/1 Natriumchlorid 0,2 g/1 Kaliumchlorid, 1,15 g/1 einbasisches Natriumphosphat und 0,2 g/1 zweibasisches Kaliumphosphat), welche 0,01 Gew.-% Äthylendi-amintetraessigsäure und 0,1 Gew.-% Trypsin enthält. Die Zellen werden von der Glasfläche der Kulturflasche abgelöst und durch Pipettierung zu einzelnen Zellen getrennt. Sodann wird die Anzahl der Zellen mikroskopisch festgestellt. Die

20

Zellsuspension wird mit Eagle's MEM mit einem Gehalt von 20% Kalbsserum verdünnt, so dass pro 1 ml 200 Zellen vorliegen. Petrischalen werden mit 1 ml der Zellsuspension geimpft. Sodann erfolgt eine Kultivierung in einem C02-In-5 kubator bei 37 °C während 24 h. Die in dem nachstehenden Beispiel 1(1) erhaltene Flüssigkeit wird zu der Zellsuspension gegeben, so dass man eine Konzentration von 1/16 bis 1/128 erhält. Zu jeweils 1 ml-Portionen der bei 37 °C während 24 h kultivierten Zellsuspension gibt man die jeweiligen Testsub-lo stanzen, und in jedem Falle werden die HeLa-Zellen während 7 Tagen kultiviert. Sodann wird das Kulturmedium entfernt. Danach werden die Kulturgefässe mit Hank's Lösung gewaschen. Dann werden die Zellen mit 70 Gew.-% Äthanol fixiert und sodann mit 100 Gew.-% Äthanol gewaschen. Nach 15 Entfernung des Äthanols werden die Zellen mit einer Gimsa-Färbelösung angefärbt. Dann werden die Kolonien gezählt und die Lebensfähigkeit oder Vermehrungsfähigkeit der Zellen wird berechnet.

20 Die Ergebnisse sind in den Tabelle 3 und 4 zusammengestellt. Die Lebensfähigkeit oder Vermehrungsfähigkeit der Zellen wird nach folgender Gleichung berechnet.

Zellenvermehrungsfähigkeit =,

Zahl der Kolonien in der behandelten Gruppe Zahl der Kolonien in der unbehandelten Gruppe x 100

Die Vermehrungs- oder Lebensfähigkeit der Zellen wird bei jeder Testsubstanz als Durchschnittswert von fünf Versuchen angegeben.

Tabelle 3

Wirkung der überstehenden Flüssigkeit auf die Zellvermehrungsfähigkeit

TF-140

Verdünnung

Zellenvermehrungsfahigkeit (%)

(ml/ml)

48 h

72 h

96 h

1/128

79,6

66,4

80,4

1/64

30,0

7,9

5,8

1/32

0

0

0

1/16

0

0

0

Vergleich

100

100

100

Tabelle 4

Wirkung der TF-Substanzen auf die Zellenvermehrungs fähigkeit

Substanz

Konzentration

Vermehrungsfähigkeit der

Hg/ml)

Zellen (%) ■

TF-100

10

99,4

50

97,4

100

95,9

TF-110

10

94,5

50

88,9

100

87,3

TF-120

10

98,8

50

91,2

100

83,3

TF-132a

10

96,7

50

97,4

100

95,9

TF-133a

10

96,9

50

95,4

100

88,8

TF-136

10

95,9

50

96,4

100

95,4

30

10 50 100 200 500

98.5

98.6 98,6 96,8 93,4

35

Man erkennt aus diesen Versuchen, dass die erfmdungsge-mässen 1 F-Substanzen im Vergleich zu der überstehenden Flüssigkeit einen sehr geringen cytotoxischen Effekt auf He-La-Zellen haben.

40 (II) Immunostimulierende Wirkung

Vier Mäuse vom ICR-Stamm werden jeweils pro Gruppe verwendet. Jede Testsubstanz wird in 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und dann den Mäusen intraperitoneal verabreicht. 24 h nach der Verabreichung werden 0,2 ml 45 einer Kohlenstoffsuspension in den Schwanz der Maus intravenös injiziert. Die Kohlenstoffsuspension wird hergestellt durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche 17, Schwarz (Günther Wagner Co., Ltd.) und 2 ml physiologischer Salzlösung, welche 3 Gew.-% Gelatine enthält. 1,5,10 so und 15 min nach der Injektion werden 0,02 ml Blut aus der Augenhöhle entnommen. Hierzu wird eine Hämatokrit-Ka-pillare verwendet, welche mit Heparin beschichtet ist. Danach wird sofort verdünnt und mit 1,6 ml einer 0,1 gew.%igen wässrigen Natriumcarbonatlösung hämolysiert. Die Suspen-55 sion wird sodann bei 675 nm kolorimetriert und der phagocy-totische Index, nämlich der K-Wert, wird nach der Gleichung von Halpern et al. ermittelt. Den Mäusen in der Blindgruppe verabreicht man 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung.

60

K =

log C0-log C

t-tn

65

C0 bedeutet den Kohlepulvergehalt im Blut zur Zeit t0. C bedeutet den Kohlepulvergehalt im Blut zur Zeit t. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 bis 7 zusammengestellt.

21

648042

Tabelle 5

Substanz

Dosis (mg/kg)

Mittlerer K-Wert

TF-100

10

0,0851 ±0,0145

50

0,0605 ±0,0302

TF-110

5

0,0901 ±0,0213

20

0,1025 ± 0,0025

TF-120

5

0,0718±0,0152

20

0,0559 ±0,0197

TF-1316

5

0,0832 ±0,0193

20

0,1001 ±0,0246

TF-132a

5

0,1102 ± 0,0203

20

0,0809 ± 0,0296

TF-133a

5

0,0851 ±0,0057

20

0,0769±0,0174

TF-136

5

0,0959 ±0,0087

20

0,1027 ±0,0154

Vergleich

-

0,0300 ± 0,0024

Tabelle 6

Substanz

Dosis (mg/kg)

Mittlerer K-Wert

TF-132b

5

0,1190 ±0,0051

20

0,1073 ± 0,0031

TF-133b

5

0,0550 ±0,0020

20

0,1099 ±0,0075

TF-150

5

0,1399±0,0011

20

0,0577 ±0,0098

TF-1323

5

0,1400 ±0,0075

20

0,0685 ±0,0126

Vergleich

-

0,0286 ±0,0035

Tabelle 7

Substanz

Dosis (mg/kg)

Mittlerer K-Wert

TF-140

1

0,0891 ±0,0156

5

0,0946± 0,0139

20

0,0815 ± 0,0200

Vergleich

0,0379 ±0,0048

Man erkennt aus den Tabellen 5 bis 7, dass die mit den er-"> findungsgemässen TF-Substanzen behandelten Gruppen eine Aktivierung der retikuloendothelialen Makrophagen im Vergleich zu Vergleichsgruppen zeigen. Die zelluläre Immunität der normalen Mäuse wird erhöht.

(III) Carcinostatische Aktivität 15 (a) Antitumor-Aktivität gegen Ehrlich ascites Tumor Ehrlich ascites Tumorzellen werden Mäusen vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt), intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Menge von 1 x 105 Zellen/Maus. Sodann wird die jeweilige Testsubstanz in 0,2 ml einer physiologi-20 sehen Salzlösung aufgelöst und dann intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal pro Tag, wiederholt an 7 Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Impfung mit Tumorzellen, oder alternativ einmal am Tag, und zwar am ersten Tag sowie am dritten bis siebten Tag (an insgesamt sechs Tagen). 25 Im Falle der Testsubstanzen der Tabelle 9 erfolgt die Verabreichung derselben einmal pro Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen) nach der Impfung mit Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 8 und 9 zusammengestellt.

30

T/C"

Anzahl der Überlebenstage der behandelten Mäuse Anzahl der Überlebenstage der unbehandelten Mäuse x 100 (%)

Tabelle 8

Substanz

Dosis (mg/kg x Anzahl der Verabreichungen)

Durchschnittliche

Überlebenstage

(Tage)

T/C (%)

TF-100

70x7

> 30,1 ± 8,1 18,6± 1,9

>162 100

TF-110

10x6 50x6

>24,0 ±10,0 >32,5± 2,9 16,8 ± 1,3

>142 >193 100

TF-120

10x5 50x6

>27,5± 9,3 > 27,3 ± 9,2 17,8 ± 2,2

>154 >153 100

TF-132a

1x6 5x6 10x6

> 20,8 ± 7,8 18,3 ± 4,2

> 23,3 ± 8,8 17,2 ± 2,2

>121 106 >135 100

TF-133a

1x6 5x6 10x6

> 28,2 ± 7,8 >28,8± 9,6

> 29,7 ± 6,8 17,2± 2,2

>164 >167 >172 100

TF-136

1x6 5x6 10x6

>23,0± 6,5 >30,3± 5,6 >25,0± 8,2 17,2 ± 2,2

>134 >176 >145 100

+Anzahl der Anzahl der ge-überlebenden testeten Mäuse Mäuse

13/20 0/20

►1

2/5

3/5 *1 0/5

2/4

2/4 *1 0/4

1/6 0/6

1/6 1 0/6

3/6

4/6 n 3/6 1 0/6

1/6 3/6

1/6 1 0/6

648042

22

Tabelle 8

Substanz

Dosis (mg/kg x Anzahl der Verabreichungen)

Durchschnittliche

Überlebenstage

(Tage)

T/C (%)

+Anzahl der

überlebenden

Mäuse

Anzahl der getesteten Mäuse

TF-1316

25x6 100x6

22,Odb 5,2 >32,8 ±11,2 17,5± 1,9

127 >187 100

0/4 2/4 0/4

*1

TF-132b

5x6 10x6

>35,0± 9,8 >40,0± 4,5 18,8 ± 2,2

>186 >213 100

2/5 4/5 0/5

*2

TF-133b

1x6 5x6 10x6

>24,0 ±11,9 >33,2± 12,1 >34,8 ±10,5 18,8 ± 2,2

>128 >176 >185 100

1/5 3/5 2/5 0/5

*2

TF-1323

1x7 5x7 10x7

>29,4 ±10,8 >38,4± 3,5 >34,0± 11,0 17,0± 1,1

>173 >226 >200 100

4/10 8/10 6/10 0/10

*2

+ alle überlebendenMäuse sind frei von Ascites. Sie sind vollständig geheilt *1 Beurteilung am 35. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen *2 Beurteilung am 40. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen

Substanz Dosis (mg/kg x Anzahl der Verabreichungen

TF-140 0.5x6

1x6 5x6 10x6

TF-150 5x6

10x6 50x6

Durchschnittliche T/C Überlebenstage (%) (Tag)

>23,6±

9,3

>148

>27,0±

7,5

>170

>31,5±

5,7

>198

>28,4±

14,8

>178

15,9±

3,4

100

> 30,6 ±

5,4

>159

>32,0±

4,7

>168

>35,0±

0

>182

19,2±

1,5

100

+Anzahl der Anzahl der geüberlebend. testeten Mäuse Mäuse (am 35. Tag)

2/5

4/10

9/15

4/5

0/15

3/5 3/5 5/5 0/5

+alle überlebenden Mäuse sind frei von Ascites und vollständig geheilt

Man erkennt aus den Tabellen 8 und 9, dass die mit den erfindungsgemässen TF-Substanzen behandelten Mäuse im Vergleich zu den unbehandelten Mäusen eine verlängerte Lebensdauer zeigen.

(b) Antitumor-Aktivität gegen Ehrlichs festen Tumor (1) Ehrlich Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stamms (weibliche; 6 Wochen alt) transplantiert, und zwar in einer Anzahl von 4 x 106 Zellen/Maus. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz den Mäusen einmal am Tag an insgesamt sieben Tagen wiederholt verabreicht, und zwar beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantaion der Tumorzellen, oder alternativ einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen). Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Das Gewicht des jeweiligen Tumors wird am 11. oder 14. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen bestimmt. Das Gewicht der Tumoren wird ermittelt durch 55 Messung des grössten Durchmessers a (mm) und des kleinsten Durchmessers b (mm), und zwar mit Hilfe eines Tastgeräts. Das Gewicht wird nach folgender Gleichung ermittelt:

a x b2

Tumorgewicht = (mg)

60 2

Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengestellt. In dieser und in den folgenden Tabellen werden folgende Abkürzungen gewählt:

65

i.v. = intravenös; i.p. = intraperitoneal;

s.c. = subkutan; i.m. = intramuskulär.

23

648 042

Tabelle IO

Substanz

Verabreichungsweg

Dosis (mg/kg x Anzahl d. Verabreichungen)

Durchschn. Tumorgewicht (g)

T/C (%)

TF-100

i.v. i.p. s.c.

50x6 100x6 100x6

1,19 1,97 1,19 5,54

21

36+. 21 1 100

TF-1316

i.p.

2x6 10x6

2,63 1,57 3,44

76

45+1 100

TF-132b i.v.

1 x 6 5x6 10x6

5,61 4,00 4,32 9,06

62

44+9 48 1 100

TF-133b i.p.

1x6 5x6 10x6

6,46 5,40 4,00 9,06

71

S+2

44 100

TF-1323

i.p.

5x7 10x7

3,48 3,17 8,33

42

38 +2 100

TF-136

i.v.

1 x 6 5x6 10x6

5,52 4,88 3,19 5,69

97

85+2 56 z 100

TF-133b i.v.

1 x6 5x6 10x6

5,25 3,61 3,30 9,06

58

40+. 36 z 100

+1 bestimmt am 11. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen +2 bestimmt am 14. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen.

50

i.p.

10

2,82

40

20

1,82

26

s.c.

10

3,57

51

20

2,86

41

i.m.

10

4,65

67

20

3,22

46

-

6,99

100

(2) Ehrlichs Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhlen von Mäusen des ICR-Stamms (weiblich; 6 Wochen alt) in einer Menge von 4 x 1 o6 Zellen/Maus transplantiert. 45 Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz verabreicht. Die Mäuse werden in Gruppen unterteilt. Die Verabreichung erfolgt intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär, und zwar in einer Dosis von 10 mg/kg oder 20 mg/kg einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insgesamt 6 Tagen) nach der Transplantation der Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer phy- „ , , rT,1I1 , , , . ,r ,

siologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die . ,Man aus den TabeIlenJ0 und 11, dass bei Verab-

Tumorgewichte werden am 13. Tag nach der Transplantation reichung der erfindungsgemassen TF-Substanz ein Tumor-der Tumorzellen ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 55 wachstumsmhibierungseffekt beobachtet wird, zusammenstellt (c) Antitumor-Aktivität gegen Sarcoma-180 Carcinome

Sarcoma-180 Carcinom wird intraperitoneal transplantiert, und zwar an Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich; 6 Wo-Tabelle 11 chen alt) in einer Menge von 1 x 105 Zellen/Maus. Nachfol-

Substanz Verabrei- Dosis Durchschnittl. T/C 60 gend wird jede Testsubstanz intraperitoneal verabreicht, und chungs- (mg/kg) Tumor- (%) zwar in einer Menge von 1 mg/kg, 5 mg/kg oder 10 mg/kg weg gewicht (g) einmal am Tag vom ersten Tag bis zum siebten Tag wieder holt (an insgesamt 7 Tagen), beginnend mit dem Tag der TF-132a i.V. ' 10 3,83 47 Transplantation der Tumorzellen, oder alternativ einmal pro

- 8,11 100 65 Tag am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (an insge samt 6 Tagen). Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer T-133a i.v. 10 1,81 26 physiologischen Kochsalzlösung in gleicher Weise verab-

20 1,84 26 reicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt.

648 042

24

Tabelle 12

Substanz Dosis (mg/kg x An- Durchschn. T/C +Anz. d. Anz. d. ge-

zahl d. Verabreich. Überlebens- (%) über- testeten Mäuse tage (Tag) lebenden

Tiere

TF-132a

10x6

>26,8

>140

2/6

5x6

>22,2

>116

1/6

*1

1x6

21,3

111

0/6

1

—

19,2

100

0/6

TF-133a

10x6

>30,3

>158

4/6

5x6

>27,5

>143

3/6

*1

1x6

>21,5

>112

1/6

19,2

100

0/6

TF-136a

10 x (,

>30,2

>157

3/6

5x6

>27,3

>142

3/6

*1

1x6

>28,0

>146

2/6

1

—

19,2

100

0/6

TF-132b

10x7

>42,0± 0

>300

5/5

5x7

>42,0± 0

>300

5/5

*2

—

14,0 ± 3,3

100

0/15

TF-133b

10x7

> 40,0 ± 0

>286

10/10

5x7

>40,0± 0

>286

10/10

*9

"

1x7

>37,3± 6,3

>266

7/10

14,0 ± 3,3

100

0/15

TF-1323

5x7

>34 ± 0,6

>255

6/7

1x7

>32 ± 3,6

>240

5/7

*2

—

13,6 ± 3,6

100

0/7

TF-1316

5x7

>28,8 ±11,5

>201

5/10

1x7

>30,9± 9,5

>216

4/10

*1

14,3 ± 2,9

100

0/10

TF-136

5x6

> 38,0 ± 8,9

>271

4/5

1x6

>24,8 ±12,3

>177

1/5

*2

-

14,0 ± 2,5

100

0/5

*1 Beurteilung am 35. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen *2 Beurteilung am 40. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen

Sowohl im Falle *1 als auch im Falle *2 sind die überlebenden Tiere vollständig geheilt.

Man erkennt aus Tabelle 12, dass die mit den erfindungs-gemässen TF-Substanzen behandelten Tiere im Vergleich zu den Vergleichsgruppen Antitumor-Aktivitäten zeigen, (d) Antitumor-Aktivitäten gegen B-16 Melanome (1) B-16 Melanom-Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des BDF[-Stamms (männliche; 7 Wochen alt) transplantiert, und zwar in einer Menge von 1 x 106 Zellen/Maus. Nachfolgend wird die Substanz TF-133a intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Dosis von 5 mg/kg oder 10 mg/kg einmal am Tag, und zwar am ersten Tag und am dritten bis siebten Tag (in insgesamt 6 Tagen), nach der Transplantation der Tumorzellen. In gleicher Weise werden den Vergleichstieren 0,2 ml physiologischer Salzlösung verabreicht. Einer weiteren Gruppe wird 5-FU verabreicht, und zwar in einer Menge von 20 mg/kg. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengestellt.

Tabelle 13 Substanz

55

TF-133a

60 5-FU Vergleich

Dosis (mg/kg x Anz. der Verabreichungen)

5x5 10x6 20x6

Durchschn. Tumorgewicht (g)

4,07 2,52 4,21 5,84

T/C

(0/

70 43 72 100

Man erkennt aus Tabelle 13, dass die mit TF-133a behan-65 delten Tiere eine offensichtliche Tumorwachstums-Inhibie-rungsaktivität zeigen, und zwar im Vergleich zu denjenigen der Blindgruppe. Die Tiere zeigen bei Behandlung mit 5 mg/ kg und 10 mg/kg TF-133a die gleiche oder eine bessere Tu-

25

648 042

morwachstums-Inhibierungsaktivität als mit 5-FU behandelte Tiere.

(2) Nach dem in Abschnitt (1) beschriebenen Verfahren werden B-16 Melanom-Tumorzellen transplantiert und TF-132a, TF-133a und 5-FU sowie eine physiologische Salzlösung werden jeweils verabreicht. Am 21. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen werden die Mäuse seziert und die Metastasen der Melanom-Tumorzellen in den Lungen werden ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 aufgeführt.

Tabelle 14

Substanz Dosis (mg/kg x Durchschn. Prozentuale Me-

Anz. der Ver- Anzahl d. tastasen-Inhi-

abreichungen Metastasen bierung (%)

TF-132a

5x6

16,0

48

10x6

9,86

69

TF-133a

5x6

9,3

70

10x6

6,7

78

5-FU

20x6

24,8

20

Vergleich

-

31,0

0

Man erkennt aus Tabelle 14, dass bei Verabreichung von TF-132a und TF-133a die Bildung von Metastasen der B-16 Melanom-Tumorzellen in erheblichem Masse inhibiert wird, und zwar im Vergleich zu der mit 5-FU behandelten Gruppe.

(IV) Akute Toxizität

Die LD50-Werte bei Mäusen sind in Tabelle 15 zusammengestellt.

Tabelle 15

Substanz

Verabreichungsweg

LD50 (mg/kg)

TF-100

i.p.

500

TF-110

i.v.

> 250

i.p.

>1000

TF-120

i.v.

> 250

i.p.

>1000

TF-132a i.v.

300

i.p.

> 500

TF-133a i.p.

300

i.p.

> 500

TF-136

i.v.

300

i.p.

> 500

TF-132b i.v.

> 100

TF-133b i.v.

> 200

TF-140

i.v.

> 100

TF-150

i.v.

> 200

TF-1323

i.v.

> 200

TF-1316

i.v.

> 200

Die obigen pharmakologischen Versuche zeigen, dass die erfindungsgemässen TF-Substanzen brauchbare carcinostatische Mittel sind. Sie zeigen eine erhebliche Wirksamkeit gegen verschiedene Krebserkrankungen. Sie sind insbesondere wirksam bei festen bzw. soliden Tumoren. Alle TF-Substan-zen der vorliegenden Erfindung zeigen ausgezeichnete Effekte. Die Substanzen TF-130, und insbesondere 132a, 132b, 133a, 133b und 1323 sind unter verschiedensten Gesichtspunkten besonders bevorzugt.

Die erfindungsgemässen TF-Substanzen können zu verschiedensten pharmazeutischen Mitteln verarbeitet werden, insbesondere zu oral verabreichbaren Mitteln, injizierbaren Mitteln, Suppositorien oder dergl. Bevorzugt sind Injektionsmittel. Falls orale Mittel hergestellt werden, so können diese verschiedenste Hilfsstoffe enthalten. Sie können in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulatform vorliegen. Wenn Injektionsmittel hergestellt werden, so kann es sich um 5 solche für subkutane Injektionen, intramuskuläre Injektionen und intravenöse Injektionen handeln. Es kommen Suspensionen oder Lösungen oder auflösbare oder dispergierbare Pulver in Frage. Die Injektionsmittel können ein Lokalanaesthe-tikum enthalten.

io Die Dosis der erfindungsgemässen TF-Substanzen wird je nach dem Zustand des Patienten ausgewählt. Es ist im allgemeinen erwünscht, bei Erwachsenen eine Dosis von 0,01 bis 50 mg/kg einmal am Tag oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise subkutan, in-15 tramuskulär oder intravenös oder durch Injektion direkt in die beeinträchtigte Körperregion.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und anhand von Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

20

Fig. 1 eine mikroskopische Photographie der Form von Fusobacterium nucleatum TF-03I, welche erfindungsgemäss eingesetzt wird;

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostati-25 sehen Substanz TF-100;

Fig. 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von TF-100;

Fig. 4 ein Eluierungsmuster, erhalten bei Gelfiltration dieser Substanz mit Sephadex G-50;

Fig. 5 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm 30 dieser Substanz;

Fig. 6 ein Infratot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-110;

Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

35 Fig. 8 ein Elutionsmuster bei Gelfiltration dieser Substanz mit Sephadex G-200;

Fig. 9 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 10 ein Infratot-Absorptionsspektrum der carcinosta-40 tischen Substanz TF-120;

Fig. 11 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 12 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200; 45 Fig. 13einHochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 14 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-1316;

Fig. 15. ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser so Substanz;

Fig. 16 ein Elutionsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 17 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

55 Fig. 18 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-132a;

Fig. 19 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 20 ein Elutionsmuster bei Gelfiltration dieser Sub-6o stanz an Sephadex G-200;

Fig. 21 einHochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 22 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-132b;

65 Fig. 23 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 24 ein Elutionierungsmuster bei Gelfiltration dieser Substanz an Sephadex G-200;

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26

Fig. 25 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 26 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-133a;

Fig. 27 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 28 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 29 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 30 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-133b;

Fig. 31 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 32 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 33 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 34 ein Infratot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-1323;

Fig. 35 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 36 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 37 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 38 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-136;

Fig. 39 ein Ultravillett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 40 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 41 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 42 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-140; '

Fig. 43 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 44 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200;

Fig. 45 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz;

Fig. 46 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-150;

Fig. 47 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 48 ein Elutionierungsmuster dieser Substanz bei Gelfiltration an Sephadex G-200; und

Fig. 49 ein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm dieser Substanz.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

(1) In fünzehn, jeweils mit einer Schraubkappe ausgerüsteten 21 Kulturflaschen werden jeweils 21 eines Kulturmediums gegeben, das 34 g Trypticasepepton, 6 g Phytonpepton, _ 20 g Proteosepepton, 70 g einer Hirn-Herz-Infusion, 6 g Hefeextrakt, 15 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,5 g L-Cystin, 0,2 g Natriumsulfit, 1,0 g Natriumethioglyko-lat und 1,4 g Agar enthält; das Kulturmedium wird auf einen pH von 7 eingestellt. Das Kulturmedium wird unter 1,2 at Druck 15 min bei 120 °C sterilisiert, anschliessend 20 min auf einem siedenden Wasserband erwärmt und unmittelbar anschliessend mit Wasser gekühlt. Daraufhin wird eine Präkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031, die zuvor durch Kultivieren in einem Kulturmedium der Zusammensetzung wie oben hergestellt wurde, dem obigen wassergekühlten

Kulturmedium unter sterilen Bedingungen in einer Menge von 100 ml/Kulturflasche eingeimpft. In einem Inkubator wird während 48 h bei 37 DC eine Kultivierung im stabilen Strömungsgleichgewicht durchgeführt. Nach vollständiger 5 Kultivierung wird die Kultur zur Entfernung der Organismen 20 min bei 5 °C mit 4000 U/min zentrifugiert. Die Menge der erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit beträgt etwa 271.

(2) Zu der in der obigen Stufe (1) erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit gibt man 401 Äthanol unter Rühren bei 5 °C.

io Das resultierende Gemisch wird in einem Kühlraum stehengelassen, bis sich das amorphe Präzipitat vollständig abgesetzt hat. Anschliessend wird das Gemisch 15 min bei 5 °C mit 6000 U/min zentrifugiert. Das Präzipitat wird abgetrennt, mit Äthanol gewaschen und anschliessend unter vermindertem 15 Druck getrocknet. Man erhält etwa 60 g rohes Pulver.

(3) 20 g des in der obigen Stufe (2) erhaltenen, rohen Pulvers werden in 120 ml Wasser aufgelöst und die wasserunlöslichen Materialien, die sich zu diesem Zeitpunkt gebildet haben, werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während

2o 10 min abgetrennt. Anschliessend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion mit den Waschlösungen kombiniert, die beim zweimaligen Waschen der wasserunlöslichen Materialien mit 60 ml-Portionen Wasser erhalten wurden. Die resultierende Lösung wird unter vermindertem 25 Druck getrocknet, und man erhält 14 g grauweisses-hellbrau-nes Pulver von TF-100.

Beispiel 2

Die in Beispiel l-(3) beschriebene Lösung, die durch 30 Kombinieren der wasserlöslichen Fraktion, die keine wasserunlöslichen Materialien enthält, mit den durch Waschen der wasserunlöslichen Materialien erhaltenen Waschlösungen hergestellt wurde, wird einer Ultrafiltration unterworfen, indem man ein hohles Ultrafiltrationssystem vom Fasertyp 35 (Membran Nr. HI-1; hergestellt von Asahi Kasei Kogyo K.K.) einsetzt. Die innere Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 10 g eines grauweissen-hellbraunen Pulvers von TF-110.

t

40 Beispiel 3

10 g des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine Säule gegeben, die mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und mit einem 0,025 M Phosphat-45 puffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Weiterhin werden 2,51 des gleichen Phosphatpuffers wie oben, durch die Säule laufenlassen, und die erhaltene, eluierte Lösung wird mit der zuvor aufgefangenen, eluierten Lösung kombiniert. Daraufhin wird die so resultierende Lösung unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt, unter vermindertem Druck konzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei man 470 mg eines grauweissen-hellbraunen Pulvers von TF-120 erhält.

55

Beispiel 4

2 g des in Beispiel l-(2) erhaltenen Pulvers werden in 24 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 60 min entfernt. Die wasserlösliche Fraktion wird über Nacht gegen destilliertes Wasser bei 5 °C dialysiert, indem man ein Cellophanrohr verwendet, und die innere Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Anschliessend wird die konzentrierte Lösung auf eine mit 150 ml Diäthylaminoäth-65 yl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen, indem man 600 ml eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einem pH von 8 durchlaufen

27

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lässt, woraufhin man einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,6 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenlässt, um ein Eluat zu erhalten. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml konzentriert, gegen destilliertes Wasser bei 5 °C dialysiert, wiederum unter vermindertem Druck konzentriert, unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule entsalzt und anschliessend gefriergetrocknet. Man erhält 470 mg grauweisses-hellbraunes TF-1316.

Beispiel 5

Die in Beispiel l-(3) beschriebene Lösung, die durch Kombinieren der wasserlöslichen Fraktion, welche keine wasserunlöslichen Materialien enthält, und den durch Waschen der wasserunlöslichen Materialien erhaltenen Waschlösungen hergestellt wurde, wird über Nacht gegen destilliertes Wasser bei 5 °C dialysiert, und zwar unter Verwendung eines Cello-phanrohrs, und die innere Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird dann auf eine mit 50 g Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. 21 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einem pH von 8 und 2,51 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 werden nacheinander durch die Säule laufenlassen, woraufhin man 2,51 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenlässt, um den an der Säule adsorbierten Wirkstoff zu eluieren. Das erhaltene Eluat wird unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt und anschliessend gefriergetrocknet. Man erhält 600 mg eines grauweissen-hellbraunen Pulvers von TF-132a.

Beispiel 6

In 1,2 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 werden 44,2 g des in Beispiel l-(2) erhaltenen Pulvers aufgelöst. Die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super Cel entfernt, und das erhaltene Filtrat wird anschliessend auf eine Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, und die Waschlösungen werden mit der oben erwähnten, eluierten Lösung vereinigt. Man erhält 1,671 einer Lösung. Die Lösung wird erneut auf eine Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die mit 400 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Man erhält 1,68 1 einer eluierten Lösung. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, wobei man 1,641 Waschlösung erhält. Die eluierte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt, und es wird ein 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 in der Weise zugegeben, dass 4,98 1 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 erhalten werden. Die auf diese Weise erhaltene Pufferlösung wird auf eine Säule gegeben, die einen Durchmesser von 8 cm aufweist und mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde.

Die Säule wird mit 21 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 gewaschen. Zu 71 einer Lösung, die durch Vereinigen der Waschlösungen mit der eluierten Lösung erhalten wurde, 5 gibt man einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 zu, um 141 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 zu erhalten. Die auf diese Weise erhaltene, eluierte Lösung wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die io mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackt ist und zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird entfernt. Die Säule wird mit 21 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer 15 Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 gewaschen. Anschliessend lässt man 21 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 durch die Säule laufen und fängt die eluierte Lösung auf. Die eluierte Lösung wird konzentriert 20 und unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafilter UK-10) entsalzt. Die Lösung wird weiter entsalzt, indem man eine Sephadex G-25-Säule verwendet, und mittels Aktivkohle entfärbt. Anschliessend wird die Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 880 mg ei-25 nes grauweissen-hellbraunen Pulvers von TF-132b.

Beispiel 7

10 g des in Beispiel 2 erhaltenen Pulvers werden in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lö-30 sung wird auf eine mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Danach lässt man 5 ml eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 35 durch die Säule laufen, woraufhin 2,51 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule geschickt werden, um den auf der Säule adsorbierten Wirkstoff zu eluieren. Die erhaltene, eluierte Lösung wird unter vermindertem Druck 40 konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird unter Verwendung eines Cellophanrohrs entsalzt und unter Verwendung von Sephadex G-25 vollständig entsalzt. Danach wird die Lö- • sung gefriergetrocknet, und man erhält 600 mg eines grau-weissen-hellbraunen Pulvers von TF-133a..

45

Beispiel 8

In 1,21 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 löst man 44,2 g des in Beispiel l-(2) erhaltenen Pulvers. Die sus-50 pendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super Cel entfernt, und das erhaltene Filtrat wird dann auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphat-55 puffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die eluierte Lösung wird aufgefangen. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen und die Waschlösung wird mit der 6o zuvor erwähnten, eluierten Lösung vereinigt, wobei man 1,671 einer Lösung erhält. Die Lösung wird wiederum auf eine mit 40 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchlorid-65 konzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Man erhält 1,681 einer eluierten Lösung. Die Säule wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 ge

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waschen, wobei man 1,641 Waschlösung erhält. Die eluierte Lösung und die Waschlösung werden vereinigt und es wird 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 zugegeben, so dass man 4,981 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 " erhält. Die auf diese Weise erhaltene, eluierte Lösung wird auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,2 M und einem pH von 8 gewaschen, woraufhin man 21 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenlässt und die eluierte Lösung auffängt. Die eluierte Lösung wird konzentriert und unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafilter UK-10) entsalzt. Die Lösung wird weiter unter Verwendung einer Sephadex G-25-Säule entsalzt und mittels Aktivkohle entfärbt. Anschliessend wird die Lösung gefriergetrocknet, und man erhält 590 mg eines grau-weissen-hellbraunen Pulvers von TF-133b.

Beispiel 9

(1) 20 g des in Beispiel l-(2) erhaltenen, rohen Pulvers werden in 120 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien, die sich zu diesem Zeitpunkt gebildet haben, werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 10 min entfernt. Anschliessend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion und die durch zweimaliges Waschen der wasserunlöslichen Materialien mit 60 ml-Portionen Wasser erhaltenen Waschlösungen vereinigt und nachfolgend unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) einer Ultrafiltration unterworfen. Die innere Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 10 g eines grauweissen-hellbraunen Pulvers.

(2) In 11 eines 0,025 Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 werden 25 g des mittels obiger Stufe (1) erhaltenen Pulvers aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit 500 ml Di-äthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 33 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird auf ähnliche Weise mit einem 0,025 M Phosphat-puffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 gewaschen, und die eluierte Lösung und die Waschlösungen werden vereinigt, wobei man 1,6 1 einer Mischung erhält. Die Mischung wird auf eine mit 400 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die auf ähnliche Weise mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde, und man erhält 1,651 einer eluierten Lösung. Die eluierte Lösung wird mit 1,71 der durch Waschen der Säule mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einm pH von 8 erhaltenen Waschlösung kombiniert, und das resultierende Gemisch wird mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 in der Weise verdünnt, dass 10,351 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 erhalten werden.

Anschliessend wird die auf diese Weise erhaltene Pufferlösung auf eine mit 500 ml Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule mit einem Durchmesser von 8 cm gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 21 eines 0,025 M Phosphat28

puffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 M und einem pH von 8 gewaschen, worauf man 21 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,3 M und einem pH von 8 durch die Säule lau-5 fenlässt. Die eluierten Lösungen werden aufgefangen. Die erhaltene, eluierte Lösung wird unter Verwendung eines Ultrafiltrationssystems (verwendetes Filter: Toyo Ultrafilter AK-10) entsalzt und konzentriert, an Sephadex G-25 weiter entsalzt, mittels Aktivkohle entfärbt und danach gefrierge-io trocknet, und man erhält 1,65 g eines grauweissen-hellbraunen Pulvers vonTF-1323.

Beispiel 10

10 g des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers werden in einer 15 geringen Menge Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird auf eine mit Diäthylaminoäthyl-Sephadex A-50 bepackte Säule gegeben, die zuvor mit einem 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH von 8 äquilibriert wurde. Danach werden 61 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natri-20 umchloridkonzentration von 0,5 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenlassen, woraufhin man 2,51 eines 0,025 M Phosphatpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,6 M und einem pH von 8 durch die Säule laufenlässt, um den auf der Säule adsorbierten Wirkstoff zu 25 eluieren. Die erhaltene, durchgelaufene Lösung wird unter Verwendung eines hohlen Ultrafiltrationssystems vom Fasertyp (Membran Nr. HI-1) entsalzt, unter vermindertem Druck konzentriert und anschiessend gefriergetrocknet. Man erhält 130 mg eines grauweissen-hellbraunen Pulvers von TF-136.

30

Beispiel 11

15 g des in Beispiel l-(2) erhaltenen, rohen Pulvers werden in 200 ml Wasser aufgelöst. Die wasserunlöslichen Materialien werden durch Zentrifugieren mit 7500 U/min während 35 10 min entfernt. Anschliessend wird die auf diese Weise erhaltene, wasserlösliche Fraktion durch tropfenweise Zugabe einer 0,2 M wässrigen Bariumhydroxidlösung auf pH 10 eingestellt. Durch die Zugabe der wässrigen Bariumhydroxidlösung scheidet sich ein weisses Präzipitat ab. Es werden weiter-40 hin Bariumionen zugesetzt, bis die Gesamtkonzentration der Bariumionen in dem Endvolumen 0,01 M beträgt. Danach wird die Lösung 30 min gerührt, und das Präzipitat wird durch Filtration isoliert. Das auf diese Weise erhaltene Präzipitat eines Bariumsalzes wird in 10 ml einer 10 gew.%igen 45 wässrigen Natriumsulfatlösung suspendiert, ausreichend gerührt und danach abfiltriert. Das Filtrat wird aufgefangen. Das Präzipitat wird wiederum suspendiert, gerührt und danach auf die gleiche Weise wie oben filtriert, und zwar einmal mit 10 ml einer 10 gew.%igen wässrigen Natriumsulfatlösung 50 und zweimal mit 5 ml-Portionen der genannten Lösung. Jedes Filtrat wird aufgefangen. Das zurückbleibende Präzipitat wird weiterhin zweimal mit 10 ml-Portionen Wasser gewaschen und anschliessend filtriert, um die Waschlösungen zu isolieren. Das oben erwähnte, aufgefangene Filtrat und die 55 Waschlösungen werden vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert, unter vermindertem Druck konzentriert und anschliessend gefriergetrocknet. Man erhält 0,45 g eines grau-weissen-hellbraunen Pulvers von TF-140

60 Beispiel 12

32 g des in Beispiel l-(2) erhaltenen Pulvers werden in 450 ml Wasser aufgelöst, die suspendierten, unlöslichen Materialien werden durch Filtration unter Verwendung von Hyflo Super Cel entfernt, und das erhaltene Filtrat wird über 65 Nacht gegen fliessendes Wasser Verwendung eines Cello-phanrohrs dialysiert. Zu der dialysierten Lösung gibt man tropfenweise 80 ml einer 20%igen (nach Gewicht) wässrigen Cetylpyridiniumchlorid-Lösung unter Rühren, während man

gleichzeitig 200 ml eines 10 gew.%igen Boratpuffers (pH 9,0) addiert. Das resultierende Gemisch wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt und danach wird das Präzipitat durch Filtration isoliert. Das Präzipitat wird in 150 ml eines 0,1 gew.%igen Boratpuffers (pH 9,0), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid und 0,2 Gew.-% Cetylpyridiniumchlorid, suspendiert. Die resultierende Suspension wird 30 min gerührt. Anschliessend wird das Präzipitat durch Filtration von der Suspension abgetrennt und erneut in 150 ml eines Boratpuffers (pH 9,0) der obigen Zusammensetzung suspendiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird 30 min gerührt, woraufhin das Präzipitat durch Filtration isoliert wird. Das isolierte Präzipitat wird in 150 ml eines 0,1 gew. %igen Boratpuffers (pH 9,0), enthaltend 0,5 M Natriumchlorid und 0,2% Cetylpyridiniumchlorid, suspendiert. Die resultierende Suspension wird gerührt und 30 min dissoziieren lassen. Anschliessend wird das Präzipitat von der Suspension durch Filtration abgetrennt, und man erhält eine lösliche Fraktion. Das durch Filtration abgetrennte Präzipitat wird nochmals dem gleichen Dissoziierungsverfahren, wie oben, unterworfen, um eine lösliche Fraktion zu erhalten. Die beiden löslichen Fraktionen werden vereinigt, und die resultierende, lösliche Fraktion wird mit 10%iger Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 bis 4 eingestellt. Anschliessend wird Äthanol in der Weise zugegeben, dass seine Konzentration schliesslich 80% des Volumens ausmacht. Die resultierende Lösung wird über Nacht bei 5 °C stehengelassen, und das gebildete Präzipitat wird durch Filtration abgetrennt. Man erhält 5,6 g eines grauweissen-hellbraunen Pulvers Von TF-150.

Herstellungsbeispiel 1 Die in den Beispielen 1,2 und 3 erhaltenen Pulver von TF-100,110 und 120 werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer Lösung, die 0,5% Lidocain enthält, oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und anschliessend als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Herstellungsbeispiel 2 Die in den Beispielen 4,5 und 6 erhaltenen Pulver von

29 648 042

TF-1316,132a und 132b werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer s ähnlichen Lösung aufgelöst und danach als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Herstellungsbeispiel 3 Das in Beispiel 7 erhaltene Pulver von TF-133a wird in io Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.

15

Herstellungsbeispiel 4 Das in Beispiel 8 erhaltene Pulver von TF-133b wird in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologi-20 sehen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung aufgelöst und als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Herstellungsbeispiel 5 25 Das in Beispiel 9 erhaltene Pulver von TF-1323 wird in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Das Pulver wird in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer ähnlichen Lösung bei der Verwendung aufgelöst und danach als Injek-

30 tionsflüssigkeit eingesetzt.

Herstellungsbeispiel 6 35 Die in den Beispielen 10,11 und 12 erhaltenen Pulver von TF-136,140 und 150 werden jeweils in Mengen von 1 mg oder 5 mg in Ampullen abgefüllt. Die Pulver werden bei der Verwendung in einer sterilisierten physiologischen Salzlösung, einer 0,5% Lidocain enthaltenden Lösung oder einer 40 ähnlichen Lösung aufgelöst und anschliessend als Injektionsflüssigkeit eingesetzt.

26 Blatt Zeichnungen

Claims (32)

1. 648042

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Carcinostatische Substanz TF-100 mit folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor und Ehrlich festem Tumor bei Mäusen und hat eine immuno-stimulierende Wirkung;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

   (e) sein Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mittels dem KBr-Tabletten-Verfahren, weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm'1 auf;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung weist eine starke Absorption an der Absorptionskante auf und weist einen Absorptionspeak in der Nähe von 256 bis 260 nm auf;

   (g) falls es mittels Gelfiltration, Säule:

   50 mm 0 x 600 mm; Eluierungsmittel: destilliertes Wasser unter Verwendung von Sephadex G-50 fraktioniert wird, weist es bei der Messung der Ultraviolett-Absorption bei 260 mm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 400,430-530,700-800 und 840-870 ml auf und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich von Porenvolumen bis 390 und 410 bis 430 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpufiermit einem pH von 7; Fliessgeschwindigkeit: 0,8 ml/min bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2 erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolettabsorption bei 220 nm und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, bei 38-60 und

   65 min auf;

   (i) es zeigt eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwe-felsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion,Lowry-FoIin's-Reaktion und Ninhydrin-Reaktion;

   Q) Elementaranalysenwerte: C 30,6-35,7%; H 4,2-5,2%; N 4,2-5,2%.

   (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt ist 40,0 bis 46,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfahren bestimmter Proteingehalt ist 20,0 bis 23,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
2. 2. Carcinostatische Substanz TF-110 mit folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

   (c) es ist in Wasser löslich und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm"1 auf;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und zeigt einen Absorptionspeak im Bereich von 256-260 nm;

   (g) falls es mittels Gelfiltration, Säule:

   44 mm 0 x 500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphat-5 puffer mit einem pH von 7 unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert wird, weist es bei der Bestimmung der Ul-traviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 380 und 600-920 ml, bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm

   10 mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 380,420-520 und 630-760 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich vom Porenvolumens bis 380,

   15 420-520 und 620-760 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-Gel G300 SW, Säule:

   20 7,9 mm 0 x 600 mm x 2 erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolettabsorption bei 220 nm und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38-60 und 65 min auf;

   (i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefel-

   25 säure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-

   Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrinreaktion;

   0 Elementaranalysenwerte: C 35,9-41,0%; H 4,5-5,2%; N 4,2-5,2%;

   3o (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 30,0 bis 69,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfah-ren bestimmter Proteingehalt beträgt 18,0 bis 22,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

   35 3. Carcinostatische Substanz TF-120 mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

   40 _ (c) es ist in Wasser löslich und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert

   45 über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes • Infrarot-Absorptionsspektrum weist Absorptionsbatnden in ; -der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,15$0, 1380-1360,1140-1000 und 820 cm"1 auf;

   so (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und zeigt einen Absorptionspeak im Bereich von 268-272 nm;

   (g) falls es mittels Gelfiltration, Säule:

   55 44 mm 0 x 500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert wird, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 325 und so 775-875 ml; bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 360,360-480 und 510-760 ml; und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens bei

   65 den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 380, 420-520 und 620-760 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7,

   3

   648 042

   Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2 erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38-60 min auf;

   (i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefel-säure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrin-Reaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C 35,1-40,2%; H 4,5-5,5%; N 2,0-3,1%;

   (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 56,0 bis 73,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folin's-Ver-fahrens bestimmter Proteingehalt beträgt 9,0 bis 13,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
3. 4. Carcinostatische Substanz TF-130 mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom und hat eine immunostimulierende Wirkung;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über200°C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Spektrum weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550,1440-1380,

   1240,1140-1000 und 820 cnr1 auf;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und zeigt einen Absorptionspeak im Bereich von 256-280 nm;

   (g) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrinreaktion;

   (h) Elementaranalysenwerte: C 27,5-39,8%; H 3,2-5,7%; N 2,8-6,3%;

   (i) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 19,0 bis 64,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folin's-Ver-fahrens bestimmter Proteingehalt beträgt 6,0 bis

   28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
4. 5. Carcinostatische Substanz TF-1316 mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm"1;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 256 bis 260 nm auf;

   (g) wird es mittels Gelfiltration, Säule:

   21 mm 0 x 400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultravio-5 lett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 160 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 160 ml auf;

   io (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, weist bei der Be-15 Stimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront und 40-60 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront und 40-60 min auf;

   (i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefel-20 säure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrinreaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C 30,0-34,0%; H 3,8-4,4%; N 4,9-5,7%;

   25 (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 35,0 bis 50,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folin's-Ver-fahrens bestimmter Proteingehalt beträgt etwa 10,0 bis etwa 13,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin. 30 6. Carcinostatische Substanz TF-132a mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäu-

   35 sen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei 40 etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert

   über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes • Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550,

   45 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm-1;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 270 bis 280 nm auf;

   5° (g)wird es durch Gelfiltration, Säule:

   44 mm 0 x 500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultravio-lett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den ss Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 340,

   600-700 und 720-880 ml; bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfah-rens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 340,340-580 und 720-900 ml; und bei 60 der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 340 und 340-580 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluie-65 rungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7;

   Strömungsrate: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter

   Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule:

   7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, weist bei der Be-

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   Stimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 30,48-60 und 65 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 62 und 65 min auf;

   (i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefel-säure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrinreaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C 34,8—39,8%; H 4,5-5,7%; N 2,8-3,6%;

   (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 55,0 bis 64,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folin's-Ver-fahrens bestimmter Proteingehalt beträgt 18,0 bis 28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumablumin.
5. 7. Carcinostatische Substanz TF-132b mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Aktivität;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schemlzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm"1;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner, wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und hat eine Schulter im Bereich von 265 bis 280 nm;

   (g) wird es mittels Gelfiltration, Säule:

   21 mm 0 x 400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm eine schwache Absorptionsbande bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 200 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 36-37 und 48-50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm sehr niedrige Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 32-39 und 45-52 min auf;

   (i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefel-säure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrinreaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C 35,3—39,5%; H 4,5-5,6%; N 2,8-5,4%;

   (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 23,6 bis 45,5 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels des Lowry-Folin's-Ver-fahrens bestimmter Proteingehalt beträgt 15,5 bis 28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
6. 8. Carcinostatische Substanz TF-133a mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm"1;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 258-262 nm auf;

   (g) wird es mittels Gelfiltration, Säule:

   44 mm 0 x 500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bei 300 und 630-940 ml; bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 420 ml; und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 420 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigkchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, zeigt bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38 und 50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 50-60 und 62 min;

   (i) es ist positiv bei der Molischreaktion, Phenol-Schwefel-säure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und negativ bei der Ninhydrinreaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C 28,0—36,6%; H 3,5-5,1%; N 4,5-6,3%;

   (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 26,0 bis 35,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfah-ren bestimmter Proteingehalt beträgt 22,0 bis 28,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
7. 9. Carcinostatische Substanz TF-133b mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Aktivität;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahren erhaltenes Infrarot-Absorptionsspetrum weist Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm 1 auf;

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri4

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   gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und hat eine Schulter in der Nähe von 270 bis 280 nm;

   (g) wird es mittels Gelfiltration, Säule:

   21 mm 0 x 400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 170 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, zeigt bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 49-50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 38-39 und 52 min auf;

   (i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrinreaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C 31,1-38,5%; H 3,9-5,2%; N 3,4-4,7%;

   (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 19,0 bis 24,5 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfah-ren bestimmter Proteingehalt beträgt 12,9 bis 22,9 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
8. 10. Carcinostatische Substanz TF-1323 mit den folgenden Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festemTumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Aktivität;

   (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cm-';

   (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und eine Schulter in der Nähe von 265 bis 280 nm;

   (g) wird es durch Gelfiltration, Säule:

   21 mm 0 x 400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 160 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 150 ml auf;

   (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 36 und 48-50 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 36 und 50 min auf;

   (i) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwe-felsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-5 Chlorwasserstoffsäurereaktion und Lowry-Folin's-Reaktion und eine negative Ninhydrinreaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C29,9-39,4%; H 3,9-5,6%; N 2,8-5,4%;

   (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens be-lo stimmter Saccharidgehalt beträgt 19,0 bis 25,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfah-ren bestimmter Proteingehalt beträgt 11,0 bis 17,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
9. 11. Carcinostatische Substanz TF-136 mit den folgenden 15 Eigenschaften:

   (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

   (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor, Ehrlich festem Tumor und Sarcoma-180 Carcinom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

   20 (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

   (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert

   25 über 200 °C;

   (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 an"1;

   30 (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und einen Absorptionspeak im Bereich von 256 bis 260 nm;

   (g) wird es durch Gelfiltration, Säule:

   35 44 mm 0 x 500 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphat-puffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich von 540-930 ml auf, bei der Be-« Stimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens und bei der Bestimmung der Absorption bei 620 nm mittels eines Anthron-Schwefelsäure-Verfahrens weisen alle Fraktionen eine geringe Absorptionsbande auf;

   « (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, zeigt bei der Be-50 Stimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 28-40 und 42-60 min, und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront und 42-60 min;

   (i) es hat eine positive Molischreaktion, Phenol-Schwefel-55 säure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reaktion und eine negative Ninhydrin-Reaktion;

   (j) Elementaranalysenwerte: C 27,5-32,6%; H 3,2-4,0%; N 5,0-6,1%;

   60 (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrns bestimmter Saccharidgehalt beträgt 19,0 bis 30,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfah-ren bestimmter Proteingehalt beträgt 6,0 bis 12,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.

   65
10. 12. Carcinostatische Substanz TF-140 mit den folgenden Eigenschaften:

    (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

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    6

    (b) es inhibiert Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

    (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

    (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 210 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 280 °C;

    (e) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum zeigt Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1140-1000 und 820 cm"1;

    (f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak im Bereich von 255 bis 260 nm auf;

    (g) wird es durch Gelfiltration, Säule:

    44 mm 0 x 500 mm; Eluierungsmittel: 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 300,

    500-900 und 900-1000 ml und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 500,650-850 und 850-1000 ml auf;

    (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule: 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 und 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront und 40-60 min auf;

    (i) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrinreaktion;

    (j) Elementaranalysenwerte: C 22,0-28,0%; H 3,0-3,5%; N 5,0-6,5%;

    (k) sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 5,0 bis 15,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Verfahren bestimmter Proteingehalt beträgt 23,0 bis 32,0 Gew.-%, ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
11. 13. Carcinostatische Substanz TF-150 mit den folgenden Eigenschaften:

    (a) grauweisses-hellbraunes Pulver;

    (b) es inhibiert das Wachstum von Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;

    (c) es ist löslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Di-äthyläther;

    (d) es hat keinen scharfen Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 110 °C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert über 200 °C;

    (e) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum seiner wässri-gen Lösung zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und weist einen Absorptionspeak in der Nähe von 255 bis 260 nm auf;

    (f) sein mittels eines KBr-Tablettenverfahrens erhaltenes Infrarot-Absorptionsspektrum weist Absorptionsbanden im Bereich von 3600-3200,2960-2930,1670-1640,1550, 1440-1380,1240,1140-1000 und 820 cnr1 auf;

    (g) wird es mittels Gelfiltration, Säule:

    21 mm 0 x 400 mm; Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7, unter Verwendung von Sephadex G-200 fraktioniert, weist es bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Absorptionsbanden bei den

    Eluatvolumen im Bereich des Porenvolumens bis 100 und 100-160 ml; und bei der Bestimmung der Absorption bei 490 nm mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens Absorptionsbanden bei den Eluatvolumen im Bereich des Poren-

    5 volumens bis 150 ml auf;

    (h) sein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm, Eluierungsmittel: ein 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH von 7; Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min, bei Zimmertemperatur, das unter Verwendung von TSK-GEL G300 SW, Säule:

    io 7,9 mm 0 x 600 mm x 2, erhalten wurde, weist bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 220 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 32 und 48-60 min und bei der Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 nm Peaks im Bereich der Lösungsmittelfront, 32 und 48-50 min

    15 auf;

    (i) es hat eine positive Molisch-Reaktion, Phenol-Schwe-felsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin's-Reak-tion und eine negative Ninhydrin-Reaktion;

    2c (j) Elementaranalysenwerte: C 31,0-34,0%; H 4,0-4,4%; N 2,8-3,2%;

    (k) Sein mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmter Saccharidgehalt beträgt 40,0 bis 55,0 Gew.-%, ausgedrückt als Glucose, und sein mittels Lowry-Folin's-Ver-

    25 fahren bestimmter Proteingehalt beträgt 7,0 bis 14 Gew.-% ausgedrückt als Kalbserumalbumin.
12. 14. Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen TF-Substanzen 100,110,120,130,136b, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323,136,140,150, dadurch gekennzeichnet, dass man unter

    30 anaeroben Bedingungen zur Gattung Fusobacterium gehörende, TF-Substanz produzierende Bakterien kultiviert und aus der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit die Substanzen isoliert.
13. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeich-

    35 net, dass man die zur Gattung Fusobacterium gehörenden,

    TF-Substanz produzierenden Bakterien unter anaeroben Bedingungen kultiviert, der Kultur oder deren überstehender Flüssigkeit ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zusetzt und daraufhin die Substanzen mit carcinostatischer und io immunostimulierender Wirkung von dem gebildeten Präzipitat abtrennt.
14. 16. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung von TF-100, dadurch gekennzeichnet, dass man die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats aus dem Präzipitat auszieht und an-

    45 schliessend trocknet.
15. 17. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung von TF-110, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebildete Präzipitat isoliert, die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats einer Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft und die Substan-

    50 zen mit carcinostatischer und immunostimulierender Wirkung aus der inneren Lösung isoliert.
16. 18. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung von TF-120, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebildete Präzipitat isoliert; die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats ge-

    55 gebenenfalls einer Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft und danach mit einem Ionenaustauscher behandelt; und die nicht adsorbierte Fraktion auffangt.
17. 19. Verfahrennach Anspruch 15 zur Herstellung von TF-130, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebildete Prä-

    60 zipitat isoliert; die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats gegebenenfalls der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft; danach mit einem Ionenaustauscher behandelt; und die Substanzen mit carcinostatischer und immunostimulierender Wirkung aus der adsorbierten Fraktion isoliert.

    65 20. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von TF-1316, dadurch gekennzeichnet, dass man die adsorbierte Fraktion mit einem 0,6 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer behandelt und die eluierte Fraktion auffängt.

    7

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18. 21. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von TF- nannten, wasserlöslichen Fraktion des Präzipitats erhaltenen 132a oder TF-132b, dadurch gekennzeichnet, dass man aus Pulvers Bariumionen zusetzt, um ein Bariumsalz zu bilden; der adsorbierten Fraktion eine Fraktion isoliert, die nicht mit das gebildete Bariumsalz isoliert und danach einer Behand-einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wurde, lung zur Entfernung von Barium unterwirft; und die wasser-jedoch mit einem 0,2 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer 5 lösliche Fraktion auffängt und der Dialyse oder Ultrafiltra-eluiert wird. tion unterwirft.
19. 22. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von TF- 28. Verfahren nach Anspruch 14 zur Herstellung von

    133a oder TF-133b, dadurch gekennzeichnet, dass man eine TF-150, dadurch gekennzeichnet, dass man der Kultur oder

    Fraktion isoliert, die nicht mit einem 0,2 M Natriumchlorid- deren überstehender Flüssigkeit ein hydrophiles, organisches

    Phosphatpuffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natri- io Lösungsmittel zusetzt; das gebildete Präzipitat isoliert; die umchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird. wasserlösliche Fraktion des Präzipitats oder die durch Dialy-
20. 23. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von se oder Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktion erhalte-TF-1323, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Fraktion ne, innere Komponente der Lösung mit einem quaternären isoliert, die nicht mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphat- Ammoniumsalz behandelt; das gebildete Präzipitat isoliert puffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,3 M Natriumchlo- is und nachfolgend unter Verwendung einer Natriumchlorid rid-Phosphatpuffer eluiert wird. enthaltenden Lösung einem Dissoziationsverfahren unter-
21. 24. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von wirft; der erhaltenen, löslichen Fraktion zur Bildung eines TF-136, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Fraktion iso- Präzipitats ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zu-liert, die nicht mit einem 0,5 M Natriumchlorid-Phosphat- setzt; und das auf diese Weise gebildete Präzipitat isoliert, puffer eluiert wurde, jedoch mit einem 0,6 M Natriumchlo- 20 29. Verfahren nach einem der Ansrüche 14 bis 28, da-rid-Phosphatpuffer eluiert wird. durch gekennzeichnet, dass man für die Kultivierung der
22. 25. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung von TF- Bakterien ein Kulturmedium verwendet, welches Stickstoff-132b oder TF-1323, dadurch gekennzeichnet, dass man das quellen, Kohlenstoffquellen, Vitaminquellen, Reduktionsgebildete Präzipitat isoliert; gegebenenfalls die wasserlösliche mittel und anorganische Salze enthält, oder ein solches verFraktion des Präzipitats der Dialyse oder Ultrafiltration un- 25 wendet, das zusätzlich Agar enthält.

    terwirft, einen 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer 30. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, da-

    aus der wasserlöslichen Fraktion des Präzipitats oder einen durch gekennzeichnet, dass das zur Kultivierung der Bakte-

    0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer aus der durch rien verwendete Kulturmedium Trypticasepepton, Phyton-

    die Dialyse oder Ultrafiltration erhaltenen, inneren Kompo- pepton, Proteosepepton, eine Hirn-Herz-Infusion (oder Herz-

    nente der Lösung herstellt und dann mit einem Ionenaustau- 30 infusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose» Lactose, L-

    scher behandelt, der mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid- Cystin, Natriumsulfit und Thioglykollat umfasst oder diese

    Phosphatpuffer äquilibriert wurde; eine durch den Ionenaus- und zusätzlich Agar umfasst.

    tauscher hindurchgelaufene Fraktion auffängt; diese eluierte 31. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, da-

    Lösung dann in der Weise einstellt, dass ihre Natriumchlorid- durch gekennzeichnet, dass die Kultivierung bei 35 bis 42 °C

    konzentration etwa 0,1 M beträgt, und sie danach mit einem 35 während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium durchgeführt

    Ionenaustauscher, der mit einem 0,1 M Natriumchlorid- wird, das auf pH 6,0 bis 8,5 eingestellt ist.

    Phosphatpuffer äquilibriert ist, behandelt, um sie daran zu 32. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, da-

    adsorbieren; und nachfolgend eine Fraktion isoliert, die nicht durch gekennzeichnet, dass die Kultivierung bei 36 bis 38 °C

    mit einem 0,1 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wur- während 1 bis 3 Tagen in einem Kulturmedium durchgeführt de, jedoch mit einem 0,2 oder 0,3 M Natriumchlorid-Phos- 40 wird, das auf pH 7,2 bis 8,2 eingestellt ist.

    phatpuffer eluiert wird. 33. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, da-
23. 26. Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung von durch gekennzeichnet, dass es sich bei den zur Gattung Fuso- • 133b, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebildete Präzi- bacterium gehörenden Bakterien um Fusobacterium nuclea-pitat isoliert; gegebenenfalls die wasserlösliche Fraktion des tum handelt.

    Präzipitats der Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft, einen 45 34. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 28, da-

    ),3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer aus der wasserlös- durch gekennzeichnet, dass das hydrophile organische Lö-

    ichen Fraktion des Präzipitats oder einen 0,3 M Natrium- sungsmittel, das der Kultur oder deren überstehender Flüssig-

    ihlorid-Phosphatpuffer einer durch die Dialyse oder Ultrafil- keit zugesetzt wird, ein Alkohol ist.

    ration erhaltenen, inneren Komponente der Lösung herstellt 35. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 28, da-

    md dann mit einem Ionenaustauscher, der mit einem 0,3 M so durch gekennzeichnet, dass das hydrophile, organische Lö-

    ^atriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert ist, behandelt; sungsmittel der Kultur oder der überstehenden Flüssigkeit bis

    :ine Fraktion, die durch den Ionenaustauscher hindurchge- zu einer Lösungsmittelkonzentration von 80, vorzugsweise 30

    aufen ist, auffängt; die Natriumchloridkonzentration dieser bis 70 Vol-% zugesetzt wird.

    Merten Lösung dann auf 0,2 M einstellt und die Lösung 36. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 26, da-

    laraufhin mit einem Ionenaustauscher, der mit einem 0,2 M 55 durch gekennzeichnet, dass man als Ionenaustauscher einen

    ^atriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert ist, behandelt, schwach basischen Ionenaustauscher oder einen schwach ba-

    im sie daran zu adsorbieren; und nachfolgend eine Fraktion sischen Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung ver-

    soliert, die nicht mit einem 0,2 Natriumchlorid-Phosphatpuf- wendet.

    er eluiert wurde, jedoch mit 0,3 M Natriumchlorid-Phos- 37. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeich-

    >hatpuffer eluiert wird. «> net, dass man zum Eluieren der auf dem Ionenaustauscher
24. 27. Verfahren nach Anspruch 14 zur Herstellung von adsorbierten Fraktion einen 0,1 bis 0,6 M Natriumchlorid-TF-140, dadurch gekennzeichnet, dass man der Kultur oder Phosphatpuffer verwendet.

    leren überstehender Flüssigkeit Bariumionen zusetzt, um ein 38. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 26, oder iariumsalz zu bilden, oder der Kultur oder deren überstehen- 24, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des zur Be-

    ler Flüssigkeit ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel 65 handlung der adsorbierten Fraktion verwendeten Phosphat-

    usetzt und das gebildete Präzipitat isoliert und dann der was- puffers mit einem Gehalt an Natriumchlorid etwa 8 beträgt,

    erlöslichen Fraktion des so isolierten Präzipitats Bariumio- 39. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 26, oder ien zusetzt, oder einer Lösung eines durch Trocknen der ge- 24, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fraktion, die der

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    Ionenaustauscherbehandlung unterzogen wurde, konzentriert, entsalzt und trocknet.
25. 40. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem quaternären Ammoniumsalz um Ce-tylpyridiniumchlorid handelt.
26. 41. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung mit dem quaternären Ammoniumsalz in Gegenwart eines Boratpuffers durchführt.
27. 42. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Natriumchlorid enthaltende Lösung ein Boratpuffer, enthaltend Natriumchlorid und ein quaternäres Ammoniumsalz, ist.
28. 43. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von TF-133a oder TF-1323, dadurch gekennzeichnet, dass man Fusobacterium nucleatum einem auf pH 7,2 bis 8,2 eingestellten Kulturmedium einimpft, welches Trypticasepepton, Phytonpepton, Proteosepepton, eine Hirn-Herz-Infusion (oder eine Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, L-Cystin, Natriumsulfit und Thioglykollat umfasst, oder einem Kulturmedium einimpft, das ausser diesen zusätzlich Agar umfasst, und dann unter anaeroben Bedingungen bei 36 bis 38 °C während 1 bis 3 Tagen kultiviert; der Kultur oder ihrer überstehenden Flüssigkeit einen Alkohol in einer Konzentration von 50 bis 70 Vol-% zusetzt; das gebildete Präzipitat isoliert; die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats gegebenenfalls einer Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauscher oder mit einem schwach basischen Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung behandelt, um die nichtadsorbierte Fraktion zu entfernen; von der adsorbierten Fraktion eine Fraktion abtrennt, die mit einem 0,1 oder 0,2 M Natriumchlorid-Phos-phatpuffer eluiert wird; und daraufhin eine Fraktion isoliert, die mit einem 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird, diese Fraktion konzentriert, entsalzt und anschliessend trocknet.
29. 44. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von TF-132b, TF-133b oder TF-1323, dadurch gekennzeichnet, dass man Fusobacterium nucleatum einem auf pH 7,2 bis 8 ,2 eingestellten Kulturmedium einimpft, welches Trypticasepepton, Phytonpepton, Proteosepepton, eine Hirn-Herz-Infusion (oder eine Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, L-Cystin, Natriumsulfit und Thioglykollat umfasst, oder einem Kulturmedium einimpft, das diese und zusätzlich Agar umfasst, und dann unter anaeroben Bedingungen bei 36 bis 38 °C während 1 bis 3 Tagen kultiviert; der Kultur oder ihrer überstehenden Flüssigkeit einen Alkohol in einer Konzentration von 50 bis 70 Vol-% zusetzt; das gebildete Präzipitat isoliert; gegebenenfalls die wasserlösliche Fraktion des Präzipitats einer Dialyse oder Ultrafiltration unterwirft und dann einen 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer der wasserlöslichen Fraktion des Präzipitats oder einen 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer der bei der Dialyse oder Ultrafiltration erhaltenen, inneren Komponente der Lösung mit einem schwach basischen Ionenaustauscher oder mit einem schwach basischen Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung behandelt, der mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer äquilibriert wurde; die durch den Ionenaustauscher durchgelaufene Fraktion auffängt; diese eluierte Lösung unter Schaffung einer Natriumchloridkonzentration von 0,1 bis 0,2 M einstellt und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauscher oder einem schwach basischen Ionenaustauscher mit Molekularsiebwirkung, der mit einem 0,1 bis 0,2 M Natriumchlorid-Phosphat-puffer äquilibriert wurde, behandelt, um die eluierte Lösung daran zu adsorbieren; und aus der adsorbierten Fraktion eine Fraktion isoliert, die mit einem 0,2 bis 0,3 M Natriumchlorid-Phosphatpuffer eluiert wird, diese Fraktion konzentriert, entsalzt und danach trocknet.
30. 45. Verfahren nach einem der Ansprüche 33,43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusobacterium nucleatum der Stamm FERM 5077 ist.
31. 46. Carcinostatisches Mittel, enthaltend carcinostatische Substanzen TF-100,110,120,130,1316,132a, 132b, 133a, 133b, 1323,136,140 oder 150 gemäss den Ansprüchen 1 bis 13 sowie pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe.
32. 47. Carcinostatisches Mittel nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die carcinostatische Substanz TF-132a, 132b, 133a, 133b oder 1323 gemäss den Ansprüchen 6,7,8,9 oder 10 ist.