DE3032636C2

DE3032636C2 -

Info

Publication number: DE3032636C2
Application number: DE3032636A
Authority: DE
Inventors: Hideki Inazawa Aichi Jp Miyachi; Akira Nishinomiya Hyogo Jp Misaki; Mariko Osaka Jp Kakuta; Mineo Hachioji Tokio/Tokyo Jp Nakayama; Hideo Kasugai Aichi Jp Nagae
Original assignee: Meito Sangyo Kk Nagoya Aichi Jp
Current assignee: Meito Sangyo Kk Nagoya Aichi Jp
Priority date: 1979-08-29
Filing date: 1980-08-29
Publication date: 1989-04-20
Also published as: DE3032636A1; JPS5634701A; US4398023A; GB2061306B; GB2061306A

Description

Es ist bereits bekannt, daß Polysaccharide mit Antitumor- Aktivitäten in Polysacchariden gefunden worden sind, die aus Extrakten von Fruchtkörpern von Basidiomyceten oder von Mycelien oder Kulturbrühen von Basidiomyceten, Hefen und an deren Mikroorganismen erhalten worden sind, z. B. Glucane, Mucopolysaccharide und Lipopolysaccharide. Jedoch sind die Antitumor-Aktivitäten für die praktische Verwendung nicht ausreichend oder die Produkte haben ein enges Anti tumor-Spektrum, so daß diese Polysaccharide nur eine be grenzte klinische Anwendung gefunden haben.

In Seikagaku, Band 50, Nr. 9, Seite 762, 1978 (veröffent licht von der Japanese Biochemical Society am 25. September 1978) wird berichtet, daß saure Polysaccharide und wasser lösliches Glucan und in heißem Alkali unlösliches Glucan aus dem Fruchtkörper von Auricularia auricula-judae erhal ten wurden und daß das wasserlösliche Glucan eine starke Hemmwirkung auf in Mäuse transplantiertes Sarcoma 180 zeigte. In dem Artikel werden die Analysenergebnisse dieser Poly saccharide angegeben. Ein ähnlicher Bericht erschien in Seikagaku, Band 51, Nr. 8, Seite 616, 1979 (veröffentlicht von der Japanese Biochemical Society am 25. August 1979).

Vor diesen Berichten haben einige an der vorliegenden Erfin dung beteiligte Erfinder, aufbauend auf einem Bericht in Agricultural and Biological Chemistry 42(2), 417-425, 1978, die Patentanmeldung JA-OS 9 72 85/78 offengelegt am 23. Fe bruar 1980 mit der Offenlegungsschrift Nr. 25 409/80, einge reicht, welche ein Verfahren zur Herstellung eines β-1,3-D- Glucanpolyols mit einer grundmolaren Viskosität [η] von etwa 15 bis etwa 30 betrifft. Bei diesem Verfahren wird der Fruchtkörper oder das Mycel eines Stammes der Gattung Auri cularia mit einem wäßrigen Medium unter alkalischen Bedin gungen extrahiert, der unlösliche Teil gesammelt, mit Per iodsäure oder einem ihrer wasserlöslichen Salze oxidiert und das erhaltene Produkt sodann einer Reduktionsbehandlung un terworfen. Beschrieben wird weiterhin das erhaltene β-1,3- D-Glucanpolyol und ein Tumorbehandlungsmittel, das das β-1,3-D-Glucanpolyol enthält.

Aus der GB-PS 13 13 373 sind modifizierte β-1,3-D-Glucane bekannt, die ausgehend von Laminarin und β-Pachyman durch Oxidation und darauffolgende Reduktion erhalten werden und Antitumor-Aktivität aufweisen. Besonders stabile Produkte werden durch eine anschließende milde Hydrolyse erhalten und weisen lediglich lineare 1,3-Bindungen im Molekül sowie einen zuckeralkoholartigen Rest im Endbereich des Moleküls auf.

Es wurden nun weitere Untersuchungen durchgeführt, um ein Glucanpolyol mit einem breiteren Spektrum der Antitumor-Akti vität zu erhalten. Diese Untersuchungen haben zu der Fest stellung geführt, daß ein β-1,3-D-Glucanpolyol mit den unten angegebenen Parametern (I) und (II), das bislang noch nicht vorbeschrieben wurde, durch eine ähnliche Technik wie in der genannten älteren Anmeldung aus einem neuen Ausgangs-β- 1,3-D-Glucan hergestellt werden kann, welches Ausgangs-β-1,3- D-Glucan von einem β-1,3-D-Glucan erzeugenden Stamm der Gat tung Pestalotia hergestellt worden ist. Das β-1,3-D-Glucan polyol ist durch eine grundmolare Viskosität [η] von etwa 1 bis etwa 10 dl/g charakterisiert, welche erheblich geringer ist als diejenige des in der älteren Anmeldung beschriebenen Polyols.

Von den Erfindern wurde weiterhin festgestellt, daß das β-1,3-Glucanpolyol mit den unten angegebenen Parametern (I) und (II) ein neues Glucanpolyol ist, welches ein erheblich breiteres Antitumor-Spektrum zeigt als bekannte Polysaccha ride mit Antitumor-Aktivitäten, das eine niedrige Toxizität aufweist, den Alkoholrest R in der Formel (B) (welcher in dem nichtbehandelten β-1,3-D-Glucan nicht vorhanden ist) im Seitenkettenteil enthält und zwei klare Absorptionsban den in der Nachbarschaft von 2900 cm^-1 im Infrarot-Absorp tionsspektrum aufweist, die in dem Infrarot-Absorptions spektrum des unbehandelten β-1,3-D-Glucans nicht vorhanden sind.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues β-1,3-D-Glucanpoly ol mit einem erheblich breiteren Antitumor-Spektrum als be kannte Polysaccharide mit Antitumor-Aktivitäten zu schaffen, das mit guten Ausbeuten aus dem β-1,3-D-Glucan, welches von einem β-1,3-D-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pesta lotia hergestellt worden ist, auf einfache Weise erhalten und als Wirkstoff in einem Tumorbehandlungsmittel eingesetzt werden kann.

Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem im Patent anspruch 1 angegebenen β-1,3-D-Glucanpolyol, dem im Patent anspruch 2 angegebenen Herstellungsverfahren und dem im Patentanspruch 3 angegebenen Tumorbehandlungsmittel gelöst.

Das neue β-1,3-D-Glucanpolyol ist wenig toxisch und in sei ner Antitumor-Aktivität den aus der GB-PS 13 13 373 bekann ten Antitumormitteln überlegen.

Seine charakteristischen Eigenschaften sind wie folgt:

(I) Das Glucanpolyol enthält eine Hauptkette mit b-1,3-Glucopyranose-Einheiten der folgenden Formel

in der Glc für eine Glucopyranose-Restgruppierung steht, als wiederkehrende Einheiten und daran gebunden entweder Seitenketten der unten angegebenen Formel (B) oder sowohl Seitenketten der unten angegebenen Formel (A) als auch Seitenketten der unten angegebenen Formel (B)

worin n eine Zahl von 0 bis 1 bedeutet und

für die oben angegebene Hauptkette steht,

worin n und

die im Zusammenhang mit der Formel (A) angegebenen Bedeutungen haben und R für eine von β-D-Glucopyranose abgeleitete Gruppe der Formel

(manchmal als Polyalkoholrest bezeichnet) steht.

(II) Es weist eine grundmolare Viskosität [η] von etwa 1 bis etwa 10 dl/g auf.

Weiterhin beträgt die Anzahl der Seitenketten der Formel (B) etwa 25 bis etwa 70 pro 100 β-1,3-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette

und die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) beträgt auf der gleichen Basis 0 bis etwa 45.

Nachfolgend werden zusammenfassend die Eigenschaften und die Struktur des erfindungsgemäßen β-1,3-D-Glucanpolyols näher erläutert.

Homogenität

Die Substanz zeigt beim Gleichförmigkeitstest, der durch eine Ultrazentrifugenanalyse durchgeführt wird, einen ein zigen Peak.

Die Substanz zeigt einen einzigen Flecken bei der Elektro phorese, bei der ein Natriumboratpuffer (pH=9,3) als Lö sungsmittelsystem verwendet wird. Sie kann daher als eine homogene Substanz angesehen werden.

Löslichkeit

Löslich bei Raumtemperatur in Wasser, einer wäßrigen 1 n Natriumhydroxidlösung und Dimethylsulfoxid (die Substanz bildet häufig eine sol-artige Lösung mit hoher Fließfähig keit). Unlöslich oder nur spärlich löslich bei Raumtempera tur in Alkoholen, Aceton und Ethern.

Grundmolare Viskosität

Die grundmolare Viskosität des erfindungsgemäßen β-1,3-D-Glu canpolyols beträgt gewöhnlich etwa 1 bis etwa 10 dl/g, obgleich sie geringfügig je nach dem Oxidationsgrad mit Perjodsäure oder ihrem wasserlöslichen Salz beim Herstellungsprozeß und je nach der Durchführung oder Nichtdurchführung einer Visko sitätsverminderungsbehandlung und je nach dem Ausmaß dieser Behandlung etc. geringfügig schwanken kann. Die hierin ver wendete grundmolare Viskosität [η] wird durch die folgende Gleichung definiert:

worinη _sp=( η-η _o)/η _o=η/η _o-1. Darin bedeutet η die Viskosität (bei 25°C in wäßriger Lösung) der Lösung und η _o die Viskosität des Lösungsmittels. C ist die Konzentra tion, ausgedrückt als g/100 ml.

Infrarot-Absorptionsspektrum

Zwei klare Absorptionen liegen in der Nachbarschaft von 2900 cm^-1 vor. Diese Absorptionen unterscheiden sich von dem breiten Absorptionsspektrum des Ausgangs-b-1,3-D-Glucans.

Die Fig. 1 der Zeichnungen zeigt das Infrarot-Absorptions spektrum (KBr-Tablettenmethode) des in Beispiel 1 erhalte nen β-1,3-D-Glucanpolyols. Die Fig. 2 zeigt das Infrarot-Ab sorptionsspektrum des Ausgangs-β-1,3-D-Glucans.

Zuckerkomponenten

Die durch vollständige Hydrolyse des β-1,3-D-Glucanpolyols mit gewöhnlichen anorganischen oder organischen Säuren erhalte nen Produkte wurden als D-Glucose, Glycerin und Glykol aldehyd mittels Papierchromatographie bestimmt [Lösungsmittel system: Butanol/Pyridin/Wasser (6 : 4 : 3); Sprühreagens: Sil bernitratlösung].

Glucose und Glycerin wurden durch Gaschromatographie als Alditolacetat bestimmt.

Struktur

(A) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol vollstän dig mit 0,05 n Periodsäure oxidiert wird, dann werden 0 bis 0,52 mol, bezogen auf die Bestandteilszuckerreste, Periodat verbraucht. Gleichzeitig wird die Bildung von 0 bis 0,26 mol Ameisensäure festgestellt.

(B) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol mit Natriumborhydrid reduziert und sodann mit einer Säure voll ständig hydrolysiert wird, dann werden als Zersetzungspro dukte Glucose allein oder sowohl Glucose als auch geringe Menge Glycerin und Glykolaldehyd gebildet.

(C) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol mit Per iodsäure oxidiert und hierauf mit Natriumborhydrid reduziert und sodann mit einer Säure bei milden Bedingungen hydroly siert wird, dann wird ein wasserunlösliches, polymeres Glucan, das nur aus b-(1→3)-D-Glucosid-Bindungen zusam mengesetzt ist, gebildet; in seinem wasserlöslichen Teil wird kein Zersetzungsprodukt festgestellt, oder wenn dies doch der Fall ist, dann wird nur eine geringe Menge von Glycerin festgestellt. In keinem Fall wird Glycerin-D- glucosid festgestellt.

(D) Wenn das unter (C) beschriebene, wasserunlösliche Glucan methyliert und hydrolysiert wird und die Methylzucker in Alditolacetat umgewandelt werden und wenn eine gaschro matographische Analyse durchgeführt wird, dann werden nur 2,4,6-Tri-O-methyl-1,3,5-tri-O-acetyl-D-glucit und eine Spur von 2,3,4,6-Tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-D-glucit ge bildet.

(E) Wenn das erfindungsgemäße Glucanpolyol methyliert und hydrolysiert wird und wenn hierauf die Methylzucker in Alditolacetat umgewandelt werden und wenn eine gaschromato graphische Analyse durchgeführt wird, dann werden 2,4,6-Tri- O-methyl-1,3,5-tri-o-acetyl-D-glucit und 2,4-Di-O-methyl- 1,3,5,6-tetra-O-acetyl-D-glucit und das hoch-füchtige 1,3- Di-O-methyl-2-O-acetyl-glycerin voneinander getrennt und als Hauptkomponenten identifiziert. Geringe Mengen an 2,3,4,6-Tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-glucit und 2,3,4-Tri- O-methyl-1,5,6-tri-O-acetyl-D-glucit werden abgetrennt und identifiziert oder sie werden überhaupt nicht gebildet.

Aus den erhaltenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß das neue β-1,3-D-Glucanpolyol ein Polysaccharid ist, das aus Glucose und dem Polyalkoholrest R in Formel (B) zusammengesetzt ist, wobei die Seitenketten der Formel (B) oder sowohl Seitenketten der Formel (B) als auch der Formel (A) am Glucopyranose-Rest, der die Glucan-Haupt kette der β-(1→3)-Bindung bildet, vorhanden sind. Es wird ersichtlich, daß, wenn in der Formel (B) n den Wert 1 hat, die β-D-Glucopyranose mit n auch die durch R angegebene Struktur haben kann. Die Formel (B) soll diesen Fall ein schließen. In dem erfindungsgemäßen Glucanpolyol könnte auch ein Rest mit einer niedrigeren Kohlenstoffzahl, der von der Hydrolyse des Polyalkoholrestes mit 5 Kohlenstoff atomen der Formel R herrühren könnte, miteinander vorlie gen. Auch dieser Fall soll vom Rahmen dieser Erfindung um faßt werden.

Der Verhältnisanteil de Seitenketten der Formel (A), be zogen auf die b-(1→3)-Glucopyranose-Einheiten der Haupt kette im erfindungsgemäßen β-1,3-Glucanpolyol kann aus der verbrauchten Menge Periodsäure im Versuch (A) errechnet wer den, welcher oben im Zusammenhang mit der Struktur angege ben wurde. Der Verhältnisanteil der Seitenketten der Formel (B) kann aus den Molverhältnissen von Glycerin und Glucose in dem oben im Zusammenhang mit den Zuckerkomponenten ange gebenen Versuch errechnet werden.

Die Verhältnismengen der Seitenketten der Formeln (A) und (B) können auch aus den Verhältnisanteilen von 2,3,4,6- Tetra-O-methyl-1,5-di-O-acetyl-D-glucit, 2,4,6-Tri-O- methyl-1,3,5-tri-O-acetyl-D-glucit, 2,3,4-Tri-O-methyl- 1,5,6-tri-O-acetyl-D-glucit, 2,4-Di-O-methyl-1,3,5,6-tetra- O-acetyl-D-glucit und 1,3-Di-O-methyl-2-O-acetylglycerin errechnet werden.

Das zur Herstellung des erfindungsgemäßen β-1,3-D-Glucanpoly ols verwendete β-1,3-D-Glucan wird dadurch erhalten, daß man einen β-1,3-D-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia kultiviert und das Produkt aus der Kulturbrühe gewinnt.

Es weist keine Seitenketten der Formel (B) auf. Es enthält eine Hauptkette mit als wiederkehrende Einheiten β-1,3-Gluco pyranose-Einheiten der Formel

worin Glc für einen Glucopyranoserest steht, und an die Hauptkette gebunden Seitenketten der folgenden Formel (A)

worin n eine positive Zahl von 0 bis 1 bedeutet und

die obengenannte Hauptkette dar stellt.

Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) in dem β-1,3-D-Glucan etwa 55 bis etwa 75 pro 100 β-1,3- Glucopyranose-Einheiten in der Hauptkette, und die Anzahl der Seitenketten entsprechend n=1 beträgt etwa 2 bis etwa 8 pro 100 Hauptketten-Einheiten.

Ein Beispiel für einen β-1,3-D-Glucan erzeugenden Stamm ist der Stamm Pestalotia Nr. 815 (z. B. der Stamm FERM-P 5147; DSM Nr. 1887). Die mikrobiologischen Eigenschaften von Pestalotia Nr. 815 sind wie folgt.

Kultureigenschaften

Kolonien auf Kartoffel-Glucose-Agar. Rasche Bildung. Ausbrei tung. Farbe weiß, die später gräulich-braun wird. Luft- Hyphen. Spärlich. Im Zentrum dicht, im Randbereich spärlich. Bei der Reife entwickeln sich Häufchen. Verstreute oder an gewachsene Konidien in einer grünlich-schwarzen Masse, wenn sich die Häufchen entwickeln. Rückseite fast farblos.

Mikroskopische Beobachtungen

Lufthyphen: glasig, unregelmäßig verzweigt; Breite 2 bis 3 µm. Konidiophoren; längszylindrische Form; 10 bis 20 µm (manchmal 30 µm) lang; Aseptat; Breite 2 bis 3,5 µm; annel liert. Konidien; thallisch; vom aleuriokonidischen Typ, keulenförmig; fusoid; 4-septiert (5 Zellen), mit Hyalin; gepunktete Endzellen; 18 bis 25 µm×5 bis 6 µm. An der Spitze mit Anhängsel versehen; lang; 2 oder 3 an der Zahl; 15 bis 30 µm (manchmal 50 µm) lang; basales Anhängsel; ein zeln; geradlinig; 6 bis 10 µm lang. Mittlere 3 Zellen; fahl braun; an den Scheidewänden angeschnürt; Konidien, erzeugt aus den Konidiophoren, mit Annellierung.

Taxonomische Position

Aufgrund der oben angegebenen Kulturcharakteristika und mikroskopischer Beobachtungen wurde dieser Mikroorganismus als zugehörig zu der Art Deuteromycotina (Unterabteilung), Coelomycetes (Klasse), Melanconiales (Klasse), Pestalotia (Gattung), entsprechend "Ainsworth and Bisby′s Dictionary of the Fungi" 6. Auflage: Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England (1971), identifiziert.

Zur Herstellung des b-1,3-D-Glucans wird der β-1,3-D-Glucan erzeugende Stamm der Gattung Pestalotia kultiviert bzw. gezüchtet, die Mycelien werden von der Kulturbrühe entfernt; Methanol, Ethanol oder Aceton wird zugesetzt, um das rohe Glucan auszufällen; gewünschtenfalls wird das rohe Glucan gereinigt und hierauf das gereinigte Glucan gewonnen.

Die Kultivierung erfolgt unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das geeignete Kohlenstoffquellen enthält und das vorzugsweise weiterhin geeignete Stickstoffquellen und Mineralien enthält. Beispiele für geeignete Kohlenstoff quellen sind Glucose, Mannose, Fructose, Sorbose, Saccharose, Maltose und Mannit. Beispiele für geeignete Stickstoffquel len sind organische Stickstoffquellen, wie Pepton, Hefe extrakt, Maisquellflüsigkeit und entfettetes Sojabohnen mehl, und anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat. In vielen Fällen werden bessere Ergeb nisse erhalten, wenn man geringe Mengen von Mineralien, wie Magnesiumsalze und Phosphorsäuresalze, und Vitamine zusetzt.

Die Kultivierung kann in einem flüssigen oder festen Kulturmedium durchgeführt werden, wobei jedoch die Verwendung eines flüssigen Kulturmediums üblicher ist. Vorzugsweise wird eine Schüttelkolben-Kultivierung oder eine Kultivierung unter Belüften und Rühren in einem flüssi gen Kulturmedium durchgeführt. Die Kultivierung kann bei etwa 10 bis etwa 40°C, bevorzugt bei etwa 20 bis etwa 35°C, bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9, bevorzugt etwa 5 bis etwa 8, durchgeführt werden. Die Kultivierung kann z. B. über einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 7 Tagen erfolgen.

Nach der Kultivierung wird die flüssige Phase oder das Kul tivierungsgemisch in Mycelien und ein Kultivierungsfiltrat durch Filtration oder Zentrifugalabtrennung aufgetrennt. Ge wünschtenfalls werden die Mycelien mehrere Male mit Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeiten werden mit dem Kulti vierungsfiltrat kombiniert. Wenn ein geeignetes Ausfällungs mittel, z. B. ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zu dem kombi nierten Gemisch in der etwa 1- bis etwa 4-fachen Volumen menge, bezogen auf das Gemisch, zugesetzt wird, dann wird das rohe Glucan als Niederschlag erhalten.

Dieses rohe Glucan kann entweder sofort als Ausgangsmate rial oder nach dem Trocknen bei niedriger Temperatur verwen det werden. Gewünschtenfalls kann es vor dem Gebrauch wei terbehandelt werden.

So kann z. B. das rohe Ausgangs-Glucan in der etwa 100- bis 200fachen Menge wäßriger Natriumchloridlösung, z. B. wäßri ger Natriumchloridlösung mit einer Konzentration von etwa 0,5 bis 1,0%, gewünschtenfalls bei erhöhter Temperatur von etwa 90 bis etwa 95°C, während etwa 30 Minuten bis etwa 1 Stunde ge rührt werden. Das behandelte Glucan wird zentrifugiert, um die Flüssigkeitsschicht zu entfernen. Eine wäßrige alkali sche Lösung, z. B. eine wäßrige etwa 0,1 bis 1,0 n Natrium hydroxidlösung, wird zu dem Rückstand in der etwa 100- bis etwa 200fachen Menge gegeben und hierauf wird das Gemisch zentrifugiert. Die Flüssigkeitsschicht wird mit einer Säure, z. B. Salzsäure, neutralisiert und ein Ausfällungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Aceton, wird in der etwa 1- bis etwa 4fachen Menge, bezogen auf Flüssigkeitsschicht, zuge setzt. Der Niederschlag wird sodann abgetrennt und gesam melt. Diese Behandlungsweise wird geeignet oft wiederholt. Sodann werden gewünschtenfalls Proteine und andere Verun reinigungen durch Gelfiltration, Dialyse, etc. abgetrennt. Der Niederschlag wird in etwa 50- bis 100fachen Gewichts menge destilliertem Wasser suspendiert. Die Suspension wird vollständig gerührt, und das obengenannte Ausfällungs mittel wird zugesetzt, um einen Niederschlag zu bilden, der abgetrennt und gesammelt wird. Er wird sodann, z. B. bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck, getrocknet, um das Ausgangs-β-1,3-D-Glucan zu liefern.

Das β-1,3-D-Glucan wird sodann erfindungsgemäß mit Period säure oder einem ihrer wasserlöslichen Salze oxidiert. Bei der Durchführung der Oxidationsbehandlung wird 1 Teil Ausgangs- Glucan in etwa 50 oder etwa 500 Teilen einer wäßrigen Lö sung, die Periodsäure oder eines ihrer wasserlöslichen Salze, z. B. Natriummetaperiodat oder Kaliummetaperiodat, in einer Kon zentration von etwa 0,01 bis etwa 0,5 m, vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 0,2 m, und erforderlichenfalls einen Puffer. Wie Sn-acetat-Puffer oder Citratpuffer, gewöhnlich mit ei nem pH-Wert von 3 bis 8, enthält, suspendiert oder aufge löst. Die Suspension oder Lösung wird gerührt, damit die Bestandteile miteinander reagieren. Der Anteil an Period säure oder ihrem wasserlöslichen Salz, bezogen auf das Aus gangs-Glucan, ist keinen besonderen Beschränkungen unter worfen, doch können gewöhnlich günstige Ergebnisse erhal ten werden, wenn etwa 0,1 bis etwa 3 mol Ausgangs-Glucan, bezogen auf die Einheiten der wasserfreien Glucose, ver wendet werden.

Vorzugsweise wird die Reaktion an einem dunklen Ort oder bei einer so niedrig wie möglichen Temperatur, gewöhnlich bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise etwa unter 15°C, mehr bevorzugt unterhalb etwa 5°C, durchgeführt. Die Reak tionszeit beträgt etwa 2 bis etwa 10 Tage, zweckmäßiger weise etwa 2 bis etwa 5 Tage. In diesem Fall können günsti gere Ergebnisse erhalten werden, wenn man in beliebiger Weise Proben des Reaktionsgemisches entnimmt, nach der Fleury-Lange-Methode (J. Pharm. Chem. 17, 196, 1933) die ver brauchte Menge an Periodsäure bestimmt, um das Ausmaß der Oxidation und das Auftreten einer Peroxidierungsreaktion als Nebenreaktion zu bestimmen, und die Reaktion in der Weise kontrolliert, daß die gewünschte Oxidation durchge führt wird.

Die nach der Oxidationsreaktion erfolgende Reduktionsbehand lung kann in der Weise durchgeführt werden, daß man das re sultierende Oxidationsprodukt abtrennt, ein wäßriges Medium zusetzt und das Gemisch mit einem Reduktionsmittel redu ziert oder daß man direkt das resultierende Oxidationspro dukt mit einem Reduktionsmittel ohne Isolierung aus dem Re aktionssystem reduziert.

Im letzteren Fall kann das Oxidationsprodukt vorbehandelt werden, indem man z. B. die nichtumgesetzte Periodsäure mit Ethylenglykol zersetzt oder indem man eine Dialyse durch führt, um nichtumgesetzte Periodsäure und Nebenprodukte ab zutrennen. Die Reaktion kann wirksamer durchgeführt werden, indem man den pH-Wert des Oxidations-Reaktionsgemisches im schwächer alkalischen Bereich (pH etwa 8) mit Natri umbicarbonat, Natriumcarbonat etc. einstellt.

Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel wasserlöslich. Bei spielsweise kann Palladium-Kohle verwendet werden, doch wird gewöhnlich Natriumborhydrid (NaBH₄) eingesetzt. Die Menge des Reduktionsmittels beträgt etwa 1 mol oder mehr bevor zugt etwa 1,2 bis etwa 2 mol/mol Periodsäure in der Oxida tionsreaktion. Die Verwendung einer überschüssigen Menge des Reduktionsmittels beeinflußt die Reduktionsreaktion nicht in nachteiliger Weise. Es ist ausreichend, wenn die Re duktionsreaktion gewöhnlich über einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 2 Tagen durchgeführt wird. Gewünschtenfalls kann die Zeit für die Reduktionsreaktion kürzer oder länger sein.

Nach der Reduktionsreaktion wird überschüssiges NaBH₄ durch Zugabe einer Mineralsäure, wie Salzsäure, oder einer organi schen Säure, wie Essigsäure, zersetzt; erforderlichen falls kann der wasserunlösliche Rückstand in dem Reaktions gemisch durch bekannte Maßnahmen, wie Zentrifugierung oder Filtration, entfernt werden. Alternativ kann der Überschuß an NaBH₄ nach Entfernung des wasserunlöslichen Rückstands zersetzt werden. Das gewünschte Produkt kann aus der re sultierenden, wasserlöslichen Fraktion erhalten werden, indem man die Nebenprodukte durch bekannte Maßnahmen, wie Dialyse, entfernt und sodann den Rückstand lyophilisiert oder sprühtrocknet. Das gewünschte Produkt kann auch in der Weise abgetrennt und gewonnen werden, daß man ein mit Was ser mischbares Nicht-Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol oder Aceton, zusetzt. Die Menge des zu diesem Zeitpunkt zugesetzten Nicht-Lösungsmittels kann größer sein als die minimale Menge, die eine Ausfällung des gewünschten Endproduktes induzieren kann. Gewöhnlich ist sie die etwa 1- bis etwa 5fache Volumenmenge der wasserlöslichen Frak tion. Der Niederschlag wird getrocknet und erforderlichen falls pulverisiert, um das gewünschte b-1,3-D-Glucanpolyol zu erhalten, das gewünschtenfalls durch bekannte Reinigungs maßnahmen, wie Wiederausfällung oder Dialyse, gereinigt werden kann.

In einer beliebigen Stufe des Herstellungsverfahrens für das β-1,3-D-Glucanpolyol kann eine Behandlung zur Verminderung der Viskosität durchgeführt werden. Diese Behandlung kann eine weitere Verminderung der Toxizität des Produktes bewirken, und sie bringt verschiedene Vorteile bei der Arzneimittel formulierung mit sich.

Die Behandlung zur Verminderung der Viskosität kann z. B. durch Ultraschallbehandlung, Säurehydrolyse, enzymatischen Abbau oder Zugabe eines Wasserstoffbindungen-Spaltungs mittels geschehen. Die Behandlung kann einmal oder mehrfach durchgeführt werden. Diese Behandlungsmethoden können für sich oder als Kombination aus zwei oder mehreren angewendet werden.

Bei der Durchführung der Ultraschallbehandlung zur Veminderung der Viskosität wird in einer beliebigen Verfahrensstufe eine wäßrige Lösung oder wäßrige Suspension des zu behandelnden Materials in ein Gefäß gegeben und, ge gebenenfalls unter Rühren, der Bestrahlung mit Ultraschallwellen unterworfen. Die Frequenz der Ultraschallwellen ist zwar nicht besonders beschränkt; sie beträgt gewöhnlich etwa 10 bis etwa 500 kHz. Die Behandlungstemperatur ist vorzugs weise nicht höher als etwa 50°C. Gewünschtenfalls wird das Behandlungsgefäß abgekühlt, um einen Temperaturanstieg der Behandlungslösung zu verhindern. Die Behandlungszeit kann in geeigneter Weise je nach den Eigenschaften des zu behan delnden Materials und denjenigen des gewünschten Endproduk tes ausgewählt werden. Gewöhnlich ist ein Zeitraum von etwa 300 Minuten oder weniger genügend. Nach der Ultraschallbehand lung kann das Produkt den nachfolgenden Maßnah men entweder als solches oder nach Durchführung einer Trennung unterworfen werden.

Bei der Durchführung der Säurehydrolyse-Behandlung zur Verminderung der Viskosität wird eine Mineral säure, wie Salz- oder Schwefelsäure, oder eine organische Säure, wie Ameisensäure, zu der wäßrigen Lösung oder wäßri gen Dispersion des zu behandelnden Materials gegeben. Hin sichtlich der Behandlungsbedingungen besteht keine besonde re Beschränkung. Wird jedoch diese Behandlung nach Beendigung der Reduktionsbehandlung durchgeführt, so ist es hinsichtlich Ausbeute oder Antitumoreffekt des Endproduk tes zweckmäßig, milde Bedingungen anzuwenden, z. B. etwa 0,1 bis 0,2 n Salzsäure oder Schwefelsäure bei einer möglichst niedrigen Temperatur, gewöhnlich bei Raumtemperatur oder darunter, vorzugsweise nicht mehr als etwa 15°C während etwa 10 bis etwa 24 Stunden. Nach der Behandlung wird das Produkt mit einem Alkali, wie Natrium hydroxid, Kaliumhydroxid, Bariumhydroxid oder Natriumcarbo nat, neutralisiert und danach der nächste Herstellungs schritt durchgeführt. Man kann aber auch so vorgehen, daß man das behandelte Produkt zuerst abtrennt und dann der oben angegebenen Operation unterwirft.

Bei Durchführung der enzymatischen Behandlung zur Verminderung der Viskosität wird ein β-1,3-D-Glucan zer setzendes Enzym, z. B. Zymolyase 5000 (eine Art eines β-1,3- Glucan zersetzenden Enzyms vom endo-Typ) auf das zu behan delnde Material, z. B. in einem wäßrigen Medium, in einer be liebigen, gewünschten Stufe des Herstellungsverfahrens ein wirken gelassen. Nach dieser Behandlung wird das Enzym in üblicher Weise entfernt und hierauf der nächste Her stellungsschritt durchgeführt. Alternativ kann man auch so vorgehen, daß man das behandelte Produkt zuerst abtrennt und dann dem obigen Verfahrensschritt unterwirft.

Wenn man ein Wasserstoffbindungen-Spaltungsmittel zur Verminderung der Viskosität zusetzt, wird min destens eine Verbindung, die die Eigenschaft hat, Wasser stoffbindungen zu spalten, z. B. Harnstoff, Guanidin oder ein Derivat davon, zu einer wäßrigen Lösung oder einer wäßrigen Dispersion des zu behandelnden Materials in einer beliebigen, gewünschten Stufe des Herstellungsprozesses zu gesetzt und das Gemisch gerührt. So werden z. B. 1 bis 4 Teile Harnstoff zu 1 Teil wäßriger Lösung, die der Reduk tionsbehandlung unterworfen worden ist, zugesetzt, und das Gemisch wird 24 Stunden bei etwa 20 bis etwa 100°C gerührt. Der Harnstoff wird dann durch Dialyse etc. entfernt, und hierauf wird der Rückstand lyophilisiert oder sprühgetrock net, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wird. Man kann auch so vorgehen, daß man Methanol, Ethanol oder Aceton zu gibt, um einen Niederschlag zu bilden, der sodann getrock net wird, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

Die Verhältnisanteile der Seitenketten und die grundmolare Viskosität [η] des angestrebten β-1,3-D-Glucanpolyols kön nen, wie gewünscht, innerhalb der angegebenen Bereiche variiert werden, indem man den Oxidationsgrad bei der Oxi dation des Ausgangs-Glucans mit Periodsäure oder einem ihrer wasserlöslichen Salze oder den Grad der Verminderung der Viskosität bei der Behandlung zur Verminderung der Viskosität in geeigneter Weise auswählt.

Die Antitumor-Aktivität des β-1,3-D-Glucanpolyols wird in den folgenden Tierversuchen gezeigt.

(1) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei ICR-JCL-Mäusen

Ascites-Zellen von Sarcom 180 wurden peritoneal in ICR-JCL- Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g inokuliert.

Eine Woche später, als die Ascites vollständig zugenommen hatten, wurden 6 Millionen Tumorzellen von Sarcoma 180 in den sub kutanen Teil des Rückens der Mäuse durch den rechten Lei stenteil transplantiert. Beginnend nach 24 Stunden nach der Transplantation wurde das β-1,3-D-Glucanpolyol intraperitoneal einmal täglich über einen Zeitraum von 10 Ta gen verabreicht. In der 5. Woche wurde der Tumor herausge kernt und sein Gewicht wurde mit demjenigen der nichtbe handelten Gruppen verglichen. Das Tumor-Hemmverhältnis wurde errechnet und die Anzahl der Tumoren, die sich vollständig zurückgebildet hatten, wurde ermittelt.

Das Tumor-Hemmverhältnis wurde nach folgender Gleichung er rechnet:

Darin bedeuten:
das durchschnittliche Tumorgewicht in den nichtbe handelten Gruppen (10 Mäuse/Gruppe)
das durchschnittliche Gewicht des Tumors in den behandelten Gruppen (10 Mäuse/Gruppe).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

(2) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Ehrlich Carcinom bei ICR-JCL-Mäusen

3,5 Millionen Ehrlich Carcinomzellen wurden in den subku tanen Teil des rechten Leistenteils von ICR-JCL-Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

(3) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Meth-A bei Balb/c-Mäusen

25 Tausend Meth-A-Tumorzellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von Balb/c-Mäusen mit einem Körper gewicht von etwa 23 g transplantiert, und dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

(4) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei C3H/He-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von C3H/He-Mäusen mit einem Körper gewicht von etwa 23 g transplantiert. Danach wurde wie unter (1) beschrieben verfahren.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

(5) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei Balb/c-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von Balb/c-Mäusen mit einem Körper gewicht von etwa 23 g transplantiert. Danach wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Ta belle 5 aufgeführt.

Tabelle 5

(6) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei C₅₇BL/6-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von C₅₇BL/6-Mäusen mit einem Körper gewicht von etwa 20 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6

(7) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von Sarcom 180 bei ddY-Mäusen

6 Millionen Sarcom 180-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von ddY-Mäusen mit einem Körperge wicht von etwa 23 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 auf geführt.

Tabelle 7

(8) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von CCM-Adeno- Carcinom bei ICR-JCL-Mäusen

6 Millionen CCM-Adenocarcinom-Zellen wurden in den subkuta nen Teil des rechten Leistenteils von ICR-JCL-Mäusen mit ei nem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Tabelle 8

(9) Antitumor-Aktivitätstest unter Verwendung von NTF- Reticulum-Zellen-Sarcom bei ICR-JCL-Mäusen

6 Millionen NFT-Reticulum-Zellen-Sarcom-Zellen wurden in den subkutanen Teil des rechten Leistenteils von ICR-JCL- Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 23 g transplantiert. Dann wurde wie unter (1) beschrieben verfahren. Die Ergeb nisse sind in Tabelle 9 zusammengestellt.

Tabelle 9

Aus den Ergebnissen dieser Versuche wird ersichtlich, daß das erfindungsgemäße β-1,3-D-Glucanpolyol das Wachstum von Experimentaltumoren signifikant hemmt und eine ausgeprägte Antitumor-Aktivität in den unter (2) bis (9) beschriebenen Testsystemen zeigt, bei denen bislang allgemein angenommen wurde, daß herkömmliche, bekannte Anti tumor-Polysaccharide nicht signifikant wirksam sind. Dies weist auf den großen Vorteil des β-1,3-D-Glucanpolyols bei der klinischen Anwendung hin.

Bei den oben beschriebenen Tierversuchen kann davon ausge gangen werden, daß die gleichen Effekte bei anderen Warm blütern, wie dem Menschen, bei Haustieren, bei Geflügel, bei Hunden, bei Katzen, bei Kaninchen, bei Ratten etc. er zeugt werden.

Die Toxizität des β-1,3-D-Glucanpolyols ist sehr niedrig, und die LD₅₀-Werte der in den nachfolgenden Beispielen 1, 4 und 5 erhaltenen Produkte bei ICR-JCL-Mäusen sind in Tabelle 10 zusammengestellt.

Tabelle 10

(LD₅₀-Werte in g/kg)

Es wurde bestätigt, daß durch den Effekt der Ultraschallbe handlung die Produkte der Beispiele 4 und 5 eine niedrigere Toxizität hatten.

Das Tumorbehandlungsmittel, das als Wirkstoff das oben be schriebene β-1,3-D-Glucanpolyol enthält, kann zur Behandlung von Krebserkrankungen der Verdauungsorgane, wie Magenkrebs, Ösophaguskrebs, Kolon-und Rektumkrebs, von Lungenkrebs oder von Brustkrebs eingesetzt werden. Es enthält eine pharma zeutisch wirksame Menge an β-1,3-D-Glucanpolyol und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel. Der Gehalt an β-1,3-D-Glucan polyol macht allgemein etwa 1 bis etwa 90 Gew.-% aus und kann je nach der Dosierungsform des Mittels variiert wer den.

Das Tumorbehandlungsmittel kann in oral verabreich baren Formen, z. B. Pulver, Granulat, Kapseln, Tabletten, beschichteten Tabletten, Sirups und wäßrigen Zubereitungen, sowie in parenteral verabreichbaren Formen, wie Zubereitungen zur Injektion, in Kombination mit einem pharmazeutisch an nehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel formuliert sein.

Beispiele für Träger sind feste Träger oder Verdünnungsmittel, wie Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Glucose, Lactose, Saccharose, Dextrin, Saccharoseester, Stärke, Sorbit, Mannit, kristalline Cellulose, Talk, Kaolin, synthetisches Aluminiumsilicat, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Celluloseacetat-phthalat, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gummiarabikum, Tragantgummi, Gelatine, Agarmehl und Schellack; und flüssige Träger oder Verdünnungsmittel, wie Wasser, physiologische Kochsalzlösungen, Ethanol, Propylenglykol, Polyethylen glykol, Glycerin, Hartman-Lösung und Ringer-Lösung.

Das Tumorbehandlungsmittel kann durch allge meine Verfahrensweisen zur Behandlung von Tumoren verab reicht werden, z. B. durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, oral, intra rektal, durch Beschichten als äußeres Arzneimittel und durch Infusion. Das Dosierungs- und Verabreichungsschema richtet sich nach dem Typ und dem Zustand des Pa tienten und des Tumors.

So beträgt z. B. die Dosierung des β-1,3-D-Glucan polyols bei der oralen Verabreichung gewöhnlich 1 bis 5000 mg/kg Körpergewicht/Tag, vorzugsweise 2 bis 2000 mg/kg/ Tag, und bei der Injektion 0,5 bis 5000 mg/kg Körpergewicht/ Tag, bevorzugt 1 bis 2000 und mehr bevorzugt 2 bis 500 mg/ kg/Tag.

Das Tumorbehandlungsmittel kann in Kombination mit anderen Antitumor mitteln verwendet werden. Eine Kombination, die eine Er höhung des immunologischen Effekts mit sich bringt, ist besonders wirksam.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Referenzbeispiel
(Herstellung des Ausgangs-β-1,3-D-Glucans)

Glucose\|30 g
Polypepton	3 g
Hefeextrakt	3 g
K₂HPO₄	1 g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,5 g
Wasser	1 l
pH 6,50

100 ml eines flüssigen Kulturmediums mit obiger Zusammenset zung wurden jeweils in 150 Sakaguchi-Kolben mit einer Kapa zität von 500 ml eingegeben. Jeder Kolben wurde mit einem Baumwollstöpsel verschlossen. Die Kolben wurden 20 min bei 120°C sterilisiert. Ein Pestalotia Nr. 815-Stamm, der ge sondert in einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden war, wurde in die einzelnen Kulturmedien in üblicher Weise ein okuliert und 7 Tage bei 28°C unter Schütteln mit einer Rate von 120 Mal/min und mit einer Amplitude von 7 cm kulti viert, wodurch 13,5 l Kulturbrühe erhalten wurden. Zu der Kulturbrühe wurden 13,5 l destilliertes Wasser gegeben, und das Gemisch wurde gut gerührt, um es zu homogenisieren. Sodann wurde es 30 min bei 10 000 G zentrifugiert, um die Mycelien zu entfernen. Auf diese Weise wurden 21,5 l über stehende Flüssigkeit erhalten. 60 l Aceton wurden zu der überstehenden Flüssigkeit unter Rühren zugesetzt, um einen Niederschlag zu bilden. Der Niederschlag wurde herausgenom men, zweimal mit Aceton gewaschen und dann getrocknet, wo durch 52,5 g rohes Glucan erhalten wurden.

Beispiel 1

50 g faserartiges Glucan, erhalten im Referenzbeispiel, wur den zu kleinen Stücken zerschnitten und in 16 l einer 0,5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert. Das Gemisch wurde 3 h bei etwa 40°C gerührt, pulverisiert und 20 min in einem Homogenisator bei 15 000 min^-1 homogeni siert. Dann wurden 16 l destilliertes Wasser zugesetzt und das Gemisch wurde vollständig gerührt und 30 min bei 4000 min^-1 zentrifugiert, wodurch ein unlösliches Produkt erhalten wurde. 20 l destilliertes Wasser wurden zu dem re sultierenden, wasserunlöslichen Teil zugesetzt, und das Ge misch wurde vollständig gerührt und in ähnlicher Weise zen trifugiert. Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt und Natriumhydroxid wurde zu dem resultierenden, wasserunlösli chen Teil so zugesetzt, daß die Endkonzentration 0,5 n er reichte. Das Gesamtvolumen des Gemisches wurde auf 15 l ein gestellt, und es wurde 2 h bei Raumtemperatur zur Bildung einer Lösung gerührt. Die Lösung wurde 30 min bei 4000 min^-1 zentrifugiert und eine geringe Menge des Rückstand wurde ent fernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 6 n Salzsäure neutralisiert, und es wurde ein gleiches Volumen Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde mit einer Geschwindigkeit von 2000 min^-1 5 min zentrifugiert, wodurch ein Niederschlag ge bildet wurde. 10 l Wasser wurden zu dem resultierenden Nie derschlag zugesetzt und das Gemisch wurde vollständig ge rührt und sodann der gleichen Wieder-Ausfällungsoperation unterworfen. Es wurde lyophilisiert, wodurch 40 g Glucan als Ausgangsmaterial erhalten wurden.

5 g Ausgangs-Glucan wurden in 2 l einer wäßrigen Lösung sus pendiert, die 6,65 g Natriummetaperiodat (NaIO₄) enthielt, und die Suspension wurde 7 Tage unter Rühren bei 10°C in einem dunklen Raum umgesetzt. 1,5 g Ethylenglykol wurden zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um den Überschuß an Natriummetaperiodat zu zersetzen. Hierauf wurde eine kleine Menge Natriumbicarbonat zugefügt, um die Reaktion schwach alkalisch zu machen. Sodann wurden 1,2 g Natriumborhydrid zugesetzt, um eine Reduktion bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 Tagen unter Rühren durchzuführen. Nach der Reduktion wurde der Überschuß an Natriumborhydrid mit Essigsäure zersetzt (pH < 6). Das resultierende Produkt wur de 2 Tage gegen fließendes Wasser dialysiert. Die rest liche Lösung wurde unter Verwendung von Kieselgur als Filtrationshilfsmittel filtriert. Das Filtrat wurde mit dem dreifachen Volumen an Methanol versetzt, wodurch ein Niederschlag erhalten wurde. Zu dem Niederschlag wurde Wasser gegeben und das Gemisch wurde lyophilisiert, wodurch 3,1 g β-1,3-D-Glucanpolyols als weiße, faserartige Substanz erhalten wurden.

Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[η]
6,21 dl/g
Elementaranalyse	C 40,32%; H 6,00%
Anteil an Seitenketten (A)	0
Anteil an Seitenketten (B)	69,1

(Die Anteile der Seitenketten (A) und (B) sind auf 100 β- 1,3-Glucopyranose-Einheiten der Hauptkette bezogen. Die gleiche Bezugnahme gilt auch für die nachfolgenden Beispiele.)

Beispiel 2

5 g des in Beispiel 1 erhaltenen Ausgangs-Glucans wurden in 1 l einer wäßrigen Lösung suspendiert, die 4,16 g Natrium metaperiodat enthielt. Die Suspension wurde 5 Tage bei 10°C unter Rühren in einem dunklen Raum umgesetzt. Nach der Reak tion wurde die Reaktionslösung gegen fließendes Wasser dialy siert und die restliche Lösung wurde 30 min bei 4000 min^-1 zentrifugiert. Der resultierende Niederschlag wurde in 1 l Wasser suspendiert und es wurden 880 mg Natriumborhydrid zugesetzt. Die Reduktion wurde 2 Tage bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt. Nach der Reduktionsreaktion wurde der Überschuß an Natriumborhydrid mit Essig säure pH < 6,0 zersetzt. Das Produkt wurde 30 Minuten bei 4000 min^-1 zentrifugiert. 2 l Wasser wurden zu dem Niederschlag gegeben und nach dem Rüh ren wurde das Gemisch zentrifugiert. Die resultierende, überstehende Flüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüs sigkeit kombiniert, die beim vorhergegangenen Zentifugier vorgang gebildet worden war. Zu der Lösung wurde die 1,5fache Volumenmenge Methanol gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei 2000 min^-1 zur Bildung eines Niederschlags zen trifugiert. Der Niederschlag wurde in 1,5 l Wasser aufge löst und die gleiche Wieder-Ausfällungsoperation unter Ver wendung von Methanol wurde durchgeführt. Der resultierende Niederschlag wurde mit Methanol entwässert und bei vermin dertem Druck getrocknet, wodurch 2,8 g β-1,3-D-Glucanpolyols als weißes Pulver erhalten wurden.

Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[η]
7,25 dl/g
Elementaranalyse	C 40,39%; H 5,90%
Anteil an Seitenketten (A)	27,8
Anteil an Seitenketten (B)	41,7.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, mit der Aus nahme, daß man 2,8 g Natriummetaperiodat und 590 mg Natri umborhydrid verwendete. Man erhielt so β-1,3-D-Glucanpolyol in Form eines weißen Pulvers in einer Menge von 2,5 g. Die Eigenschaften dieses Produktes waren wie folgt:

[η]
7,68 dl/g
Elementaranalyse	C 40,42%; H 5,88%
Anteil an Seitenketten (A)	41,3
Anteil an Seitenketten (B)	28,7.

Beispiel 4

5 g Ausgangs-Glucan wurden wie in Beispiel 1 mit Natrium metaperiodat oxidiert und mit Natriumborhydrid reduziert. Sodann wurde der Überschuß an Natriumborhydrid mit Essig säure bis pH=6,0 zersetzt. Das Gemisch wurde gegen fließendes Wasser dialysiert.

Die restliche, nichtdialysierte Lösung wurde mit Wasser so verdünnt, daß die Zuckerkonzentration 0,25% betrug. Somit wurden etwa 1250 ml Lösung erhalten. Die Lösung wurde auf weniger als 5°C abgekühlt und 100 min einer Ultraschallbe handlung mit einer Osizillierungsfrequenz von 20 kHz und einer Abgabe von 60 W unterworfen, während sie kühl gehal ten wurde (höchstens 30°C). Die behandelte Lösung wurde un ter Verwendung von Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde bei vermindertem Druck auf 50 ml konzentriert und mit der 3fachen Volumenmenge Aceton versetzt, wodurch ein Nieder schlag ausfiel.

Der Niederschlag wurde in Wasser aufgelöst und lyophylisiert, wodurch 2,4 g β-1,3-D-Glucanpolyol als weiße, faserartige Sub stanz erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[η]
3,27 dl/g
Elementaranalyse	C 40,51%; H 6,22%
Anteil an Seitenketten (A)	0
Anteil an Seitenketten (B)	68,3.

Beispiel 5

5 g Ausgangs-Glucan wurden gemäß Beispiel 2 mit Natriummeta periodat oxidiert und dann mit Natriumborhydrid reduziert. Sodann wurde der Überschuß an Natriumborhydrid mit Essig säure pH < 6 zersetzt und das Produkt gegen fließendes Wasser dialysiert. Die restliche Lösung wurde auf eine Zuckerkon zentration von 0,25% gebracht, um 1250 ml einer Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde 200 min einer Ultra schallbehandlung bei einer Oszillierungsfrequenz von 20 kHz und einer Abgabe von 70 W unterworfen, während sie kühl ge halten wurde (höchstens 35°C). Die behandelte Lösung wurde zuerst unter Verwendung von Kieselgur filtriert und dann unter Druck unter Verwendung eines Millipore- Filters mit einer Porengröße von 0,45 µm weiter filtriert. Das Filtrat wurde bei vermindertem Druck auf etwa 500 ml konzentriert und lyophilisiert, wodurch 2,9 g β-1,3-D-Glucan polyol erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[η]
1,87 dl/g
Elementaranalyse	C 40,48%; H 5,95%
Anteil an Seitenketten (A)	27,0
Anteil an Seitenketten (B)	40,2.

Beispiel 6

5 g des in Beispiel 1 erhaltenen Ausgangs-Glucans wurden in 2 l 0,05 n Acetatpuffer (pH 5) suspendiert, der darin gelöst 5,91 g Kaliummetaperiodat enthielt. Die Suspension wurde 10 Tage bei 10°C unter Rühren in einem dunklen Raum umge setzt. Ethylenglykol (1,5 g) wurde zu der Reaktionslösung gegeben und das Gemisch gegen fließendes Wasser dialy siert. Eine kleine Menge Natriumbicarbonat wurde zu der rest lichen Lösung zugesetzt, um sie schwach alkalisch zu machen. Sodann wurden 1,2 g Natriumborhydrid zugesetzt und das Ge misch wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt, um eine Re duktion durchzuführen. Nach der Reduktion wurde der Über schuß an Natriumborhydrid mit Essig säure zersetzt und das Produkt wurde gegen fließendes Was ser dialysiert. Die restliche, nichtdialysierte Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wo durch 3,4 g β-1,3-D-Glucanpolyol als weiße, faserartige Sub stanz erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[η]
9,48 dl/g
Elementaranalyse	C 40,36%; H 5,92%
Anteil an Seitenketten (A)	14,4
Anteil an Seitenketten (B)	55,6.

Beispiel 7

5 g des im Referenzbeispiel erhaltenen, faserartigen Glucans wurden in 2,0 l Wasser suspendiert, pulverisiert und in einem Homogenisator (15 000 min^-1, 20 min) homogenisiert. Sodann wurden 500 ml einer wäßrigen Lösung von 6,65 g Natri ummetaperiodat zugefügt und es wurde 7 Tage bei 15°C unter Rühren in einem dunklen Raum umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 reduziert. Überschüssiges Natriumborhydrid wurde mit Essigsäure zersetzt und das Produkt wurde gegen fließendes Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wurde die restliche Lösung 30 min bei 4000 min^-1 zentrifugiert. 2 l Wasser wur den zu dem Niederschlag zugegeben und das Gemisch wurde nach dem Rühren zentrifugiert. Die resultierende, überste hende Flüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit, die in der vorhergegangenen Zentrifugierungsoperation ge bildet worden war, kombiniert. Zu der Lösung wurde die 2fache Volumenmenge an Aceton zur Ausfällung eines Niederschlags gegeben. 1 l Wasser wurde zu dem Niederschlag gegeben und Aceton wurde zugesetzt, um erneut in der gleichen Weise wie oben beschrieben auszufällen. Der Nie derschlag wurde mit Methanol entwässert und bei vermindertem Druck getrocknet, wobei 2,4 g β-1,3-D-Glucanpolyol als weißes Pulver erhalten wurden. Die Eigenschaften des Produktes waren wie folgt:

[η]
8,55 dl/g
Elementaranalyse	C 40,38%; H 6,05%
Anteil an Seitenketten (A)	1,3
Anteil an Seitenketten (B)	67,8.

Beispiel 8

Herstellung von Arzneimitteln.

Tabletten
Menge (mg)
Glucanpolyol von Beispiel 2
2000
Lactose	1400
Polyvinylpyrrolidon	400
Talk	500
Stärke	200

Das Glucanpolyol wurde mit Lactose vermischt, und das Ge misch wurde durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 60 µm getrieben. Hierauf wurde das Gemisch mit alkoho lischem Polyvinylpyrrolidon befeuchtet und durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,67 mm granuliert und getrocknet. Das getrocknete Granulat wurde durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 1,2 mm gegeben, mit Talk und Stärke versetzt und tablettiert.

Granulat
Menge (mg)
Glucanpolyol von Beispiel 2
2000
Methylcellulose	1500
Maisstärke	800
Polyvinylpyrrolidon	200
Aromatisierungsmittel	etwas

Das Glucanpolyol, Methylcellulose, Aromatisierungsmittel und Maisstärke wurden vermischt und durch ein Sieb mit ei ner lichten Maschenweite von 60 µm geleitet. Das Gemisch wurde mit alkoholischem Polyvinylpyrrolidon befeuchtet und durch ein Edelstahlsieb mit einem Durchmesser von 0,7 mm granuliert.

Zubereitung für die Injektion
Menge (mg)
Glucanpolyol von Beispiel 4
500
Glucose	2000
destilliertes Wasser	mäßige Menge

Das Glucanpolyol und die Glucose wurden in destilliertem Wasser zur Injektion zu einem Volumen von 50 ml aufgelöst und dann in üblicher Weise zu einer Zubereitung für die Injektion formuliert.

Versuchsbericht

Es wurden die Antitumoraktivitäten von β-1,3-D-Glucanpoly olen nach der Erfindung und nach dem Stand der Technik ent sprechend der GB-PS 13 13 373 untersucht und miteinander verglichen.

Die Tierversuche wurden, wie auf den Seiten 21/22 (= Seite 24/25 der ursprünglichen Beschreibung) der Beschrei bung unter (1) beschrieben, durchgeführt, d. h. unter Ver wendung von Sarcom 180 bei ICR-JCL-Mäusen.

Die Versuche wurden mit dem Produkt aus Beispiel 1 der An meldung (erfindungsgemäß) sowie mit den Produkten gemäß Bei spiel 3 und Beispiel 6 der GB-PS 13 13 373 durchgeführt. Außerdem wurde ein Kontrollversuch durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

Diese Ergebnisse zeigen folgendes: Das erfindungsgemäße β-1,3- D-Glucanpolyol gemäß Beispiel 1 der Anmeldung entfaltet eine außerordentlich hohe Antitumoraktivität bei beiden unter suchten Dosierungen von 1 mg und 5 mg jeweils pro kg Körper gewicht und pro Tag. Das Tumor-Hemmverhältnis betrug 98% bzw. 100%. Eine vollständige Rückbildung der Tumoren fand bei 9 von 10 bzw. bei allen 10 Versuchstieren statt.

Das aus der GB-PS 13 13 373 bekannte Pachymanpolyol entfaltet zwar in einer Dosis von 5 mg/kg/Tag ebenfalls eine beträcht liche Antitumoraktivität, die jedoch nicht die Stärke des erfindungsgemäßen Mittels erreicht: Das Tumor-Hemmverhältnis beträgt 80%, die vollständige Rückbildung der Tumoren wurde bei 5 von 10 Versuchstieren beobachtet. Bei einer Dosis von 1 mg/kg/Tag erweist sich die Antitumoraktivität von β-Pachy manpolyol als unbefriedigend: Das Tumor-Hemmverhältnis macht nur 44,8% aus und vollständige Rückbildung der Tumoren wurde nur bei einem von 10 Versuchstieren beobachtet.

Bei den ebenfalls aus der GB-PS 13 13 373 bekannten Lamina ranpolyol erweist sich die Antitumoraktivität bei beiden ge prüften Dosierungen von 5 mg- bzw. 1 mg/kg/Tag als unbefrie digend: Das Tumor-Hemmverhältnis betrug lediglich 40,0% bzw. 15,6%. Eine vollständige Rückbildung der Tumoren fand bei keinem der Versuchstiere statt.

Claims

1. β-1,3-D-Glucanpolyol, dadurch gekenn zeichnet, daß es sich von einem β-1,3-D-Glucan ab leitet, welches von einem b-1,3-D-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia erzeugt worden ist, und daß das Glu canpolyol
(I) eine Hauptkette enthält mit β-1,3-Glucopyranose- Einheiten der folgenden Formel: in der Glc für eine Glucopyranose-Restgruppierung steht, als wiederkehrende Einheiten und daran gebunden entweder Seiten ketten der unten angegebenen Formel (B) oder sowohl Seiten ketten der unten angegebenen Formel (A) als auch Seitenket ten der unten angegebenen Formel (B) worin n eine Zahl von 0 bis 1 bedeutet und für die oben angegebene Hauptkette steht, worin n und die im Zusammenhang mit der Formel (A) angegebenen Bedeutungen haben und R für eine von β-D-Glucopyranose abgeleitete Gruppe der Formel steht,
(II) eine grundmolare Viskosität [η] von etwa 1 bis etwa 10 dl/g aufweist,
und daß pro 100 β-1,3-Glucopyranose-Einheiten der Haupt kette die Anzahl der Seitenketten der Formel (B) etwa 25 bis etwa 70 und die Anzahl der Seitenketten der Formel (A) etwa 0 bis etwa 45 beträgt.

2. Verfahren zur Herstellung eines β-1,3-D-Glucanpolyols gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein durch einen β-1,3-D-Glucan erzeugenden Stamm der Gattung Pestalotia hergestelltes β-1,3-D-Glucan in jeweils an sich bekannter Weise mit Periodsäure oder einem ihrer wasserlöslichen Salze oxidiert und hierauf das Oxidationsprodukt einer Reduktionsbehandlung unterwirft.

3. Tumorbehandlungsmittel, enthaltend eine antitumor wirksame Menge eines β-1,3-D-Glucanpolyols gemäß Anspruch 1.