DE1915687A1 - Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden mit Antitumorwirkung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden mit Antitumorwirkung

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DE1915687A1
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Description

Taito Coc, LTD und Kaken Kagaku Kabushiki Kaisha,
No. 1, 6-chome, Yaesu, Chuo-ku, Tokyo, Japan und
No. 28-8, 2-chome, Honkomagome, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan
Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden mit Antitumorwirkung.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden, die gegen Tumore wirken, und im wesentlichen aus D-Glucoseresten mit ß-(i ~> 3)-Bindung bestehen.
Die Erfindungtbetrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden - die hauptsächlich aus D-Glucoseresten mit ß-(1 ~* 3)-Bindung bestehen und Antitumorwirkung aufweisen - und umfasst eine oder mehrere der folgenden Massnahmen, die in gewünschter Reihenfolge durchgeführt werden können:
die Extraktion der Fruchtkörper (fruit-bodies), Sclerotia oder ivlycelien der Fungi Ascomyceten, Basidiomyceten und Fungi imperfecti mit wasser oder alkalischer Lösung, Vermischen des erhaltenen Extraktes oder des bei der flüssigen Kultivierung dieser Fungi erhaltenen Kulturfilträte mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln und Sammeln des dabei gebildeten Niederschlags oder - falls gewünscht - Säurezusatz bis zur leicht sauren .Reaktion und Entfernung des Niederschlags und/oder
die Dialyse des Produktes gegen Wasser zur Anreicherung der nicht -dialysierbaren Substanz und/oder
das Hindurchführen des -broduktes durch Ionenaustauscherkolonnen und Auffangen der abfliessenden Flüssigkeit und/oder
die Behandlung mit Aktivkohle zur Anreicherung der nicht adsorbierbaren Substanz.
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BAD ORIGINAL
Die gemäss Erfindung benutzten Fungi stauen aus folgenden Klassen und Ordnungen: . . = /..-\ .-.-..
A) Ascomyceten ._...■ .--.-.■.. Familie Pyrenophoraceae der Ordnung Sphaeriales. Familien Bulgariaceae, üelvallaceae und Pezizaceae der Ordnung Pezizales.
B) Basidiomyceten — Subclass Homobasidiae
Familien Tricholomataceae, Agaricaceae, Boletaceae, Russulaceae der Ordnung Agaricales.
Familien Clavariaceae, Cantharellaceae, Corticiaceae^ und Polyporaceae der Ordnung Ahpyllophorales.
Ordnung Fhallales
Ordnung Lyeoperdales
Familien Tremellaceae und Auriculariaceae der Unterklasse Heterobasidiae.
C) Fungi imperfekti
Dematiaceae der Ordnung Moniliales.
Die Fungi wachsen in üblichen Kulturmedien gut und scheiden das
sex
Antitumor-wirksamePolyXicharid der Erfindung in die KuItürflüssigkeit ab. Als Kohlenstofflieferanten können Glucose und Saccharose, als Stickstofflieferanten anorganische Stickstoffverbindungen wie Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, -phosphat sowie -chlorid( oder organische Stickstoffverbindungen,wie Harnstoff und Aminosäuren benutzt werden. Der Zusatz geringer Mengen an iViagneäumsälzen und Phosphaten als (organische Salze zu den Kulturmedien lieferte ebenso gute Resultate wie der Zusatz von Hefeextrakt, Pepton oder Thiamin. Der pH-Wert des Kulturmediums wird im Bereich von 3-6 und die Kultivierungstemperatur bei etwa 25 bis 300C gehalten. Die Kultivierungsdäuer hängt von der Art des eingesetzten Fungus ab und nimmt etwa gewöhnlich 3 Tage bis 3 vVochen in Anspruch»
Zur Extraktion aus dem Kulturmedium und zur Reinigung der Wirksubstanz der Erfindung werden aus der kultivierten Mischung nach Vervollständigung der Kulturfliissigkeit die Myzelien abfiltriert oder zentrifugiert, das erhaltene KuIturfiltrat mit einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel Methanol,
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BAD ORJQINAt 5
Aethanol, Propanol, Isopropanol oder Aceton vermischt, wobei ein Niederschlag erhalten wird. Die Konzentration des zugesetzten organischen Lösungsmittels sollte vorzugsweise 20 bis 60 Vol% betragen.
Falls notwendig wird die Lösung mit der Wirksubstanz (effective principle) noch einer oder mehrerer der folgenden Behandlungen in der gewünschten Reihenfolge unterworfen, um geringe Mengen anorganischer Ionen und anderer Verunreinigungen zu entfernen.
Solche Behandlungen umfassen:
Konzentration der Lösung unter vermindertem Druck, Entfernung der Proteine,indem man den pH-Wert der Lösung auf 1-4- mit organischen Säuren wie Essig-, Ameisen-, Bernstein- oder Trichloressigsäurejoder/organischen Säuren,wie Salz-, Schwefel- oder Phosporsäure feinstellt, Entfärbung mit Aktivkohle,
Dialyse in fliessendem Wasser sowie
Hindurchführen durch Ionenaustauscherkolonnen.
Die Wirksubstanz kann nach diesen Behandlungen mit organischen Lösungsmitteln gefällt werden.
Zur Extraktion der Wirksubstanz aus den Fruchtkörpern, Sclero- tia und/oder Myeelien werden diese in Wasser oder alkalischer Lösung bei Raumtemperatur oder unter fcrhiteen gründlich gerührt. Falls notwendig können die Fungiteile vermählen oder homogenisiert werden,Tim eine wirksamere Extraktion zu erzielen. Als alkalische Lösungsmittel verwendet man zweckmässig Natron- oder Kalilauge unterhalb von 5n. Der erhaltene Extrakt wird neutralisiert, konzentriert und gereinigt - wenn notwendig - und das Polysaccharid (effective principle) mit einer Antitumorwirkung wird, in der weiter oben für das Kulturfiltrat angegebenen Weise, erhalten. In einigen Fällen wird der alkalische Extrakt neutralisiert, die Fällung mit dem organischen Lösungsmittel durchgeführt und dann kann noch die Dialyse oder das Entsalzen mit Ionenaustauscherkolonnen angeschlossen werden« Bei Wiederholung dieser "Verfahrensmassnahmen erhält man ein Polysaccharid (effective principle) mit höherem Reinheitsgrad.
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BAD ORIGINAL
Die gemäss Erfindung erhaltene Wirksubstanz stellt ein weisses bis grauweisses nicht hygroscopisch.es Pulver dar und ist eine hochmolekulare Substanz, die nicht durch eine semipermeable Membran hindurchgeht. Sie löst sich langsam in Wasser und ist in organischen Lösungsmitteln gewöhnlich unlöslich. Ihre wässerige Lösung ist neutral und Säure, Alkali sowie &itze gegenüber verhältnismässig beständig. Saure Hydrolyse der Substanz sowie die papierchromatographische Behandlung zeigte, dass die Zuckerkomponente hauptsächlich aus Glucose besteht,-es sich hauptsächlich um ein Glucan handelt, jedoch je nach der Spezies eine kleine Menge Xylose, Mannose und Galactose vorhanden ist. Die Substanz weist die allgemeinen Eigenschaften der Polysaccharide aufc, β* gibt positive Molisch-, Bial-, Dubois-, Disch-, Tryptophan-Schwefelsäure- und Antron-Reaktionen^und eine negative Hinhydrin-Reaktion. Sie lieferte auch die Fehlingsche-Jod-Stärke -Reak ti on .
Da das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung bis zu einem gewissen Grade der Hydrolyse unterliegt, wenn es der Incubation mit ß-(1 —* 3) *«Ä Glucanase unterworfen wird (Reese und Mandel, Can. J. Liicrobiol. , 5, 173 (1959))i wird angeaommen, dass es sich um ein Glucan mit D-Glucoseresten in ß-(1 —f 3)-Bindung~ als naupt·** handelt. Gleichzeitig wird offcin dem HydaLysat Gentiobiose identifiziert, sojlass auch die Anwesenheit von ß-(1- —> 6)-Seitenfitl:ten in Betracht gezogen wird. Die Methyl-, Acetjjlyl-, Carboxymethyl-, Sulfonsäure- sowie Phosphorsäurederivate dieses Polysaccharide werden mit den konventionellen Methoden erhalten und die partiell hydrolysieren Produkte durch Behandlung mit Enzymen, Säuren oder Alkalien. Die Wirksamkeit
f^ (CJ Q
und die Tiscosität der Produkte sind von der/ursprünglichen tolysaccharids verschieden,, jedoch alle zeigen bis zu einem gewissen Grade die Antitumorwirkung.
Die Antitumorwirkung des gemass Erfindung erhaltenen Wirkprinzips wurde an der festen Form von Sarkoma - 180 bei Mäusen untersucht.
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Für die tierischen Experimente wurden 2 Gruppen von Mäusen von je etwa 20 g "benutzt. Jede Gruppe "bestand aus 10 Mäusen. Eine Gruppe diente als Kontrollgruppe ohne Behandlung.· Bei den Tieren aller Gruppen wurden Transplantationen mit 5 x 10 Zellen von Sarkoma - 180 subcutan in der rechten Leiste vorgenommen.
24- Stunden nach der Transplantation intraperitoneal ,einen Tag um den anderen, insgesamt 1o itffel. Nach 25 Tagen wurde die Tumore herausgenommen, ihr durchschnittliches Gewicht, die durchschnittliche Zunahme des Körpergewichts, der Verhältniswert der Tumorhemmung, die Zahl der zurückgegangenen Tumore sowie die Mortalität der Tiere bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle enthalten, aus der hervorgeht, dass die Substanz der Erfindung, wird sie in einer Dosis von 2 bis 15 mg/kg verabreicht, einen Wert für die Hemmwirkung von etwa 90 % gegenüber der festen Form von Sarkoma - 180 aufweist und der Tumor bei der Mehrzahl der Tiere zurückgegangen ist.
Tabelle
Stamm Mortft,
acli-
tät		 Dosis
mg/kg		 Aenderung im
durchschnitt
lichen Kör
pergewicht.
R·		 Verhält-
niswert
d.Hemm-
wirkung
% 		Rück
gangs-
zahl
%
Versuch 1
Kontrolle 0/10 - 2.1 — 0
Cochliobolus
sativas, C		 0/10 2 1.6 95 60
Cochliobolus
sativas, W		 0/10 2 1.8 90 50
Cladosporium
fluvum, A		 0/10 5 2.0 85 40
Carb oxyme thyl
pachyman		 0/9 25 1.9 82 33
Sclerotinia
sclerotiorum		 0/10 10 2.4 96 50
Enzymatically
degradated glucan
prepared from Scle-0/10
rotinia sclerotio-		 2 1.9 84 40
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- 6 - Dosis
mg/kg		 • 191 5687
Stamm Mort^
sfli-
tät		 • Aenderung im
durchschnitt
lichen Kör
pergewicht		 Verhält-
niswert
d.Hemm
wirkung
% 		Hück-
gangs-
zahl
%
Versuch 2 -
Kontrolle 0/10 5 2o3 — 0
Sclerotinia
sclerotiorum, C		 0/10 10 2.0 95 50
Sclerotinia
sclerotiorum, A		 0/10 2 1.5 93 50
Gortcium
centrifugum, A		 0/10 10 2.1 90 30
j?lammulina
velutipes, W		 0/10 10 1.6 93 50
JTlammulina
velutipes, A		 0/10 5 2.1 94- .50
Fholiota nameko, W 0/10 10 2.6 80 30
Fholiota nameko, A 0/10 10 2.0 90 40
Trieöloma
aggregatum, A		 0/10 1.5 80 30
A: Alkaliextrakt, C: KuIturfiltrat, W: Wasserextrakt
Bei in-vitro-Incubation von Tumorzellen für etwa 3 Stunden in hochkonzentrierter wässriger Lösung dieses Polysaccharids findet keine Zerstörung der Tumorzellen statt; somit ist dieses Polysaccharid von den sogenannten cytotoxisehen Antikrebsmitteln, die klinisch angewendet werden und die die Tumore direkt zerstören, verschieden. Es wird daher angenommen, dass sie durch ein Organ des Gasttieres irgendeine Substanz produziert und spezifisch die Widerstandsfähigkeit des ü-asttieres gegen den Tumor erhöht. Die Polysaccharide weisen gewöhnlich eine sehr niedrige Toxicität auf und eines der wesentlichen Merkmale des Polysaccharids der Erfindung ist seine extrem niedrige Toxicität. Bei intraperitonealer Application von sogar 1,000 mg/kg bei Mäusen wurde keines der Tiere getötet. Tägliche intraperitoneale Ap^- flication von 1, 5 oder 25 mg/kg dieses Polysaccharids bei Ratten hatte keine sichtbare Körpergewichtsabnahme noch irgendeine lethale Wirkung zur Folge. Mit anderen Worten, die Substanz der
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Erfindung zeigt eine durch den Gast vermittelte Antitumorwirkung in einer Dosis,die der der vorhandenen cytoxisch und antagonestisch wirkenden Antikrebsmitteln, die klinisch benutzt werden, gleich ist. Dennoch weist eic eine -extrem niedrige Toxicität auf, was für die Krebstherapie ausserordentlich vorteilhaft ist.
Beispiel 1
Mit ßclerotinia sclerotiorum wurde ein flüssiges Medium, das 3 % Saccharose, 0,1 % Hefeextrakt, 0,3 % natriumnitrat, 0, 1 % KHpPO^, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,05 % Kaliumchlorid enthält, beimpf 1e-und die Mischung in einem Schüttelkolben der Kultivierung unterworfen, wobei man 300 ecm SaOtfckultur erhält. Dieses' Saatkultur goss man Hn 15 Liter des gleichen Mediums ati und führte die Kultivierung bei 28°C 160 Stunden unter Belüftung mit einer Zuführung von 15 lAlin. und unter ftühren bei 300 U/Min. durch. Danach zentrifugierte man das Myxel ab, versetzte das erhaltene KuIturfiltrat mit der Gleichen Vol-Menge Methanol, sammelte den gebildeten i«iedersc:ilag und löste ihn in Wasser. Diese wässrige Lösung versetzte man zur Umfällung erneut mit Lethanol. Man erhielt 16,5 g eines weissen Pulvers*
Beispiel 2
280 g des nach dem Verfahren von ieispiel 1 erhaltenen feuchten Mytels von Sclerotinia sclerotiorum wurden in 500 ecm 2 η i.atröiv. walauge gegeben, die Mischung gründlich gerührt, in einer Homogenisierungsvorrichtung zerkleinert und 2^ Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach entfernte-man das Mycel, stellte das Filtrat mit Essigsäure auf pH 2 ein und filtrierte vom ausgefällten ungelösten liiederschlag ab. Das Filtrat dialysierte man 3 Tage gegen fliessendeH '.Yasser. Die nicht-dialysierbare Lösung engieman unter vermindertem Druck ein, versetzte.sie dann mit der gleichen Vol-IJenge Methanol und sammelte-den gebildeten Niederschlag, den man danach in .'.asser iosteund mit !»!ethanol erneut erhält 2,5 g eines weissen amorphen Pulvers.
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Beispiel 3
100 g (feuchtes Gewicht) des myaels von Sclerotinia sclerotiorum das nach dem Verfahren des Beispiels 1'erhalten worden war, gab man in 400 ecm 1 η kalilauge und erhitzte, die Mischung zur heIssen Extraktion für 30 Minuten auf 600CT. Danach filtrierte man das Mycel ab, stellte das FiItrat mit Salzsäure auf pH 2 ein, filtrierte von der ausgefällten festen Substanz ab, dialysierte das Filtrat 4 Tage gegen fliessendes Wasser, engte die nichtdialysierbare Lösung auf 250 ecm. ein und versetzte sie mit 350 ecm Isopropanol. Den gebildeten Niederschlag sammelte man, löste ihn in Wasser und führte mit Isopropanol erneut die Fällung herbei. Man erhielt 1,2 g grau-weissiiehes,amorphes Pulver.
Beispiel 4
Zur Herstellung von 300 ecm Saatkultur beimpfte man ein Kulturmedium der in Beispiel 1 benutzten Zusammensetzung mit Cochliobolus sativus. Mit der erhaltenen Saatkultur beimpfte man 15 1 des gleichen Mediums und führte die Kultuvierung unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen durch. Danach zentrifugierte
CLb et-vtch chileman das liiycel ab, engte die rlussigkeit unter vermindertem Druck ein, versetzte sie mit dem gleichen Volumen Aethanol, sammelte den gebildeten Niederschlag, löste ihn in Wasser, erwärmte die Lösung mit Aktivkohle und versetzte sie nach dem Filtrieren mit Aethanol, wobei man einen Niederschlag von 9»5 g eines leicht grau-weissuchen Pulvers erhielt.
Beispiel 5
Eine Liischung von 370 g feuchten L-iyeels von Cochliobolus sativus. das in der in Beispiel 4 angegebenen '.Veise erhalten worden war, in 1 1 wasser, rührte θβ· gründlich in einer Homogenisierungsvorrichtung und hielt sie dann 2 Stunden unter fiihren auf 1000C. Das Myfcel filtrierte man ab, stellte das Filtrat mit Essigsäure auf pH 3 ein undjfiltrierte den gebildeten Niederschlag ab. Danach engte man das Filtrat unter vermindertem Druck ein, gab es in einen Cellophanbeütel und dialysierte es 24 Stunden gegen fliessendes »»asser. Die nicht-dialysierbare Lösung in dem Beutel
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versetzte man mit dem gleichen Volumen Methanol, wobei man 3,1 g eines grau-we is suchen Pulvers erhielt.
Beispiel. 6 ·
500 ecm eines Kulturmediums, das 35O % Glucose, 0,3 % Natriumnitrat, 0,1 % KH2PO^, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,5 % Kaliumchlorid, 0,1 % Hefeextrakt und Oj0O5 °/o Ferrisulfat enthielt, wurden 15 Minuten bei 1200C sterilisiert und mit dem Mytel Pholiota nameko beimpft. Die Mischung wurde kultiviert, das Mycel entfernt, das KuIturfiltrat unter vermindertem Druck auf 200 ecm eingeengt, diese Lösung mit 120 ecm.Methanol versetzt, der gebildete Niederschlag gesammelt und in Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung gab man in einen Cellophanbeutel, dialysierte sie 3 lnage gegen fliessendes Wasser, engte die nicht-dialysierbare" Lösung in dem Beutel unter vermindertem Druck ein, setzte Methanol zur Fällung hinzu, sammelte den erhaltenen Miederschlag und wusch/in äea wasserfreieni,Methanol. Der Niederschlag ergab nach dem 'Trocknen 0,3 g eines amorphen, weis sen Pulvers.
Beispiel'7 ■
Lentinu-s edodes und Plammulina velutipes von Tricholomataceae wurden in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise behandelt, ivian erhielt 0,2 g bzw. 0,9 g eines amorphen,weissen Pulvers.
Beispiel 8"
Das Myeel von Pholiota nameko,das nach der in Beispiel 6 beschriebenen Kultivierung erhalten worden war, wurde in 100 ecm 2 η natronlauge gegeben^ ULe Mischung in einer Homogenisierungsvorrichtung bei Raumtemperatur etwa 1 Stunde gerührt," danach 20 Stunden stehen gelassen, das Mygel abfiltriert und das Piltrat mit Essigsäure auf pH 3 eingestellt. Den gebildeten unlöslichen Niederschlag filtrierte man ab, gab das Filtrat in einen Cellophanbeutel, dialysierte es 2 Tage gegen fliessendes Wasser, Tiiiierte die nicht-dialysierbare Lösung durch Kolonnen mit stark sauren und stark basischen Ionenaustauscherharzen, (Amberlite IR - 120 und IRÄ-410 der Rohm und Hafte Co., USA), engte die austretende Pliiss-i gkeit unter vermindertem Druck ein, versetzte das
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erhaltene Konzentrat mit dem gleichen Volumen Methanol und sammelte den gebildeten Niederschlag. Danach löste man ihn in Wasser und führte mit Methanol die Umfäilung durch. Man erhielt 350 nig eines amorphen ,weissen Pulvers. ,....-■ .
Beispiel 9
2 1 des in Beispiel 6 beschriebenen Mediums sterilisierte man 15 Minuten bei 1200C, beimpfte es mit Cladosporium flavum. und führte die Kultivierung bei 280C 5 Tage in einem Kolben unter ■Schütteln durch. Das hierbei erhaltene Mygel gab-man in 500 ecm 2 η Natronlauge, - die- Mischung gründlich in einer Homogenisierungsvorrichtung, Hess sie dann 24- Stunden bei Raum_ temperatur stehen um sie gründlich zu extrahieren, filtrierte das Myeel ab und stellte das Filtrat mit Essigsäure auf pH 4-ein. Die dabei ausgefallene unlösliche Substanz filtrierte man ab, engte das Filtrat unter vermindertem Druck ein, versetzte es mit dem gleichen Volumen Methanol, filtrierte, den gebildeten Niederschlag ab, löste ihn sodann in Wasserund führte die Lösung durch Kolonnen/Amberlite IR - 12o und IRA. - 4-10. Die abfliessende Flüssigkeit versetzte man zur Fällung wieder mit Methanol. Man erhielt 2,5 g eines grauenfamorphen Pulvers.
Beispiel 10
Eine Mischung von 5OO g von im Handel erhältlichen Pholiota nameko in 3>5 Liter .1 η Natronlauge wurde in- einer Homogenisierungsvorrichtung gerührt und dann 24- Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach weiterer Aufarbeitung der Mischung in der in Beispiel 8 beschriebenen Weise erhielt man 4- g eines amorphen Pulvers. -
Beispiel 11 .
300 g der im Handel erhältlichen Fruchtkörper von Flammulina velutipes wurden mit 3 Liter Wasser versetzt, in einer Homogenisierungsvorrichtung gerührt und die erhaltene Mischung 3 Stunden auf 80 bis 1000C erhitzt. Danach- liess man sie abkühlen, filtrierte sie, versetzte den Rückstand mit 1,5 1 Wasser und
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wiederholte die Extraktion. Die vereinigten Filtrate engte man auf 1 1 ein, fügte 1,5 1 Methanol zu, sammelte den gebildeten Niederschlag, löste ihn in Wasser, gab zu der Lösung Aktivkohle, erwärmte und filtrierte die Lösung. Mit erneuter Methanolzugabe zu dem Filtrat führte man die Fällung herbei. Es wurden 1,5 g weissestamorphes Pulver erhalten.
Beispiel 12
Zu dem in Beispiel 10 erhaltenen Extraktionsrückstand gab man 400 ecm 3 η Kalilauge und rührte die Mischung 24- Stunden bei Raumtemperatur. Die nach Filtrieren erhaltene Extraktionslösung neutralisierte man mit Salzsäure, filtrierte den gebildeten Niederschlag ab und dialysierte das Filtrat in einem Cellophanbeutel 3 Tage gegen fliessendes Wasser. Die nicht-dialysierbare Lösung stellte man mit Essigsäure auf pH 3»5 ein, liess sie über Nacht stehen und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab. Das Filtrat engte man auf 200 ecm ein und führte mit Methanol die Fällung herbei. Man erhielt 0,7 g amorphes,weisses Pulver.
Beispiel 13
Die Mischung von 500 g im Handel erhältlichen Fruchtkörpern von Pholiota nameko in 2 Liter »«asser wurde in einer Homogenisierungsvorrichtung gründlich zerkleinert, filtriert und danach der Rückstand mit 1,5 1 Wasser versetzt( um eine Extraktion zu bewirken. Die vereinigten Filtrate engte man unter vermindertem Druck auf 900 ecm ein, versetzte sie mit 600 ecm Aceton und sammelte den dabei gebildeten i\iederschlag. Danach löste man ihn in Wasser, gab Aktivkohle zu, erwärmte die Mischung, filtrierte die Lösung und führte in dem Filtrat mit Aceton die Fällung durch· Man* erhielt 2,3 g eines schwach grau-weisslichen,amo^)hen Pulvers.
Beispiel 14
500 g Flammulina velutipes des Handels wurden in einer Homogenisierungsvorrichtung zerkleinert, danach in 4 Liter 2 η Natronlauge gegeben und die Liischung 2 fage bei Raumtemperatur gerührt
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BAD ORIGlNAU
um die Extraktion zu bewirken. Danach, filtrierte man die Mischung, extrahierte den Rückstand'erneut mit 2 1 2 η Watronlauge und. vereinigte die beiden Teile des Extraktes miteinander. Den neutralisierten Extrakt gab man in einen Cellophanbeutel und dialysierte ihn 2 Tage gegen messendes Wasser. -Bie hicht-dialysierbare Lösung stellte man mit Essigsäure auf pH 3>5 ein, filtrierte den gebildeten Niederschlag ab, engte das Filtrat unter vermindertem Druck auf 1,5 1 sin und führte in diesem Konzentrat durch Zugabe von 5GO ecm Isopropanol die Fällung durch. Den gebildeten Niederschlag sammelte man, löste ihn erneut in Wasser und führte mit Isopropanol die Umfällung durch. Man erhielt 4,1 g weisses amdphes Pulver.
Beispiel 15
Die Mischung von 20 getrockneten^Buklin (das Mytel von Poria cocos) des Handels in 400 ecm 3 η Natronlauge rührte man in einer Homogenisierungsvorrichtung 1 Stunde bei Raumtemperatur und filtrierte dann. Das Filtrat machte man mit Essigsäure leicht alkalisch, dialysierte und versetzte die nicht-dialysierbare Lösung mit dem gleichen Volumen Methanol, wobei man 11 g weisses Pulver erhielt. Dies ist ein PolysaccharlaV'Pachyman", von dem man 1.0 g in 270 ecm 1 η Natronlauge löste, 12 g Monochloressigsaure in einzelnen Anteilen bei Raumtemperatur zuführte und die mischung eine Stunde rührte. Die Iviischung erwärmte man dann auf .550C, hielt sie 3 Stunden auf dieser Temperatur, neutralisierte mit Essigsäure auf pH 6,0 und filtrierte den gebildeten Niederschlag ab. Das Filtrat dialysierte man 2 Tage und fütafte su- der nicht-dialysierbaren lösung das 3-iache Volumen Aethanol zu, wobei man 11,2 g des Natriumsalzes von Carboxymethylpachyman erhielt.
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Claims (5)

Patentansprüche
1.) Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden, die im wesentlichen aus D-Glucοseresten mit ß-01 —) 3)-Bindung·bestehen und Antitumorwirkung aufweisen, gekennzeichnet durch eine oder mehrere der in beliebiger Reihenfolge durchzuführenden Massnahmen*
die Extraktion der Fruchtkörper, Sclerotia oder Mycelien der Fungi Pyrenophoraceae, Bulgariaceafi,, Helveliaceae, Pezizaceae, Tricholomataceae, Agaricaceae, Boletaceae, Russulaceae, Clavariaceae, Cantharellaceae, Corticiaceae, Polyporaceae, Phallales, Lycoperdales, Tremellaceae, iifriculariaceae und/oder Dematiaceae mit Wasser oder alkalischer Lösung bei Raumtemperatur oder unter Erhitzen, Vermischen des erhaltenen Extraktes oder des bei der flüssigen Kultivierun|r&?y§Befu^g4^Mi:Lmi:Gaiif§sser mischbaren organischen Lösungsmitteln und Sammeln des dabei gebildeten Niederschlags oder - gegebenenfalls weiterer Säurezusatz bis zur leicht sauren Reaktion, und Entfernung des Niederschlags und/oder
die Dialyse des Produktes gegen wasser zur Anreicherung der nichtdialysierbaren Substanz und/oder
das Hindurchführen des Produktes durch Ionenaustauscherkolonnen und Auffangen der abfliessenden Flüssigkeit und/oder
die Behandlung mit Aktivkohle zur Anreicherung der nicht-absorbierbaren Substanz.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polysaccharid in an sich bekannter Weise in das Methyl-, Acetyl-, Carboxymethyl-, Sulfonsäure- sowie Phosphorsäurederivat oder durch Behandlung mit Enzymen, Säuren oder Alkalien in partiell hydrolysierte Derivate übergeführt wird.
3.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die alkalische Extraktion mit bis zu 5 η Alkalilauge bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
9098^2/1518 BAD OfclGINAt.
4.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das Methanol, Aethanol, Propanol, Isopropanol oder Aceton als ein frei mit V/asser mischbares organisches Lösungsmittel verwendet wird.
5.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Säurezugabestufe Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder Trichloressigsäure als Säure verwendet wird.
909842/1518
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