DE2336378A1

DE2336378A1 - Verfahren zur herstellung eines wasserloeslichen polysaccharids

Info

Publication number: DE2336378A1
Application number: DE19732336378
Authority: DE
Inventors: Junji Hamuro
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-07-17
Filing date: 1973-07-17
Publication date: 1974-02-07
Also published as: JPS544960B2; FR2193031A1; JPS4930547A; FR2193031B1; GB1417436A

Description

Polysaccharide

Priorität: 17. Juli 1972, Nr. 71454/1972, Japan

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Polysacchariden.

Natürliche Polysaccharide sind wertvolle Rohmaterialien für verschiedene Industriezweige, beispielsweise für die Nahrungsmittel- und Futtermittel-herstellende Industrie.

Kürzlich wurde ein bestimmtes Polysaccharid als Antitumormittel mit geringen Nebenwirkungen festgestellt. Viele dieser natürlichen Polysaccharide sind in Wasser unlöslich oder wenig löslich und sie werden daher aus natürlichen organischen Substanzen in niederer Ausbeute unter strengen Bedingungen, wie im alkalischen oder sauren Medium und bei hoher Temperatur extrahierte Darüber hinaus ist diese Unlöslichkeit der Polysaccharide ein Nacliteil bei der Verabreichung als Antitumormittel.

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Es ist gut bekannt, daß Polysaccharide durch Carboxymethylierung, Phosphorylierung oder partielle Hydrolyse wasserlöslich gemacht werden. Durch diese Reaktionen verlieren jedoch die Polysaccharide häufig ihre brauchbaren Eigenschaften, beispielsweise ihre Anti tumoraktivi tat.

Es konnte nun gefunden werden, daß sich aus natürlichen organischen Substanzen abgeleitete Polysaccharide leicht in Wasser lösen, wenn sie in eine wässrige lösung von Harnstoff oder dessen Derivaten gebracht werden, und daß die leichte löslichkeit der Polysaccharide auch nach der Behandlung bestehen bleibt.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Polysaccharids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein natürliches Polysaccharid oder eine dieses enthaltende Pflanze oder ein Mikroorganismus mit einer wässrigen Lösung behandelt wird, die ein Harnstoffderivat der Formel

Rp Ν»

^ά C=X

in der X für Sauerstoff, Schwefel oder NH steht und jeder der Reste R.., R«, R* und R. ein Wasserst off atom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, enthält, und das erhaltene wasserlösliche Polysaccbarid aus der Lösung gewonnen wird,

Diese erfindungsgemäße Behandlung ist wertvoll zur Extraktion des Polysaccharids aus der Pflanze oder dem Mikroorganismus, ohne daß die planare chemische Struktur verändert wird.

Die Polysaccharide, die zur Herstellung der wasserlöslichen Polysaccharide nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet weri . r.

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können, umfassen ein Polysaccharid, das aus- einem Funguß, einem Bakterium, einer Hefe, einem Baum und einem Graminaceae-Gras extrahiert wurde, sowie ß-1,3-Glucane, die aus einem solchen Polysaccharid durch Oxidation, Reduktion und Hydrolyse gebildet wurden. Zu Beispielen für solche Polysaccharide gehören Pachyman, das aus Poria cocos Wolf extrahiert wurde, lentinan, das aus lentinus edodes extrahiert wurde, die Polysaocharide,die aus Pomes applanatus, Coriolus versicolor, Coriolus hirsutus, Pholiota nameko, Flammulina velutipes und Trametes sanguinea extrahiert werden, geringfügig wasserlösliche Hemicellulose, Xylan, Inulin, wasserunlösliche Stärke und Paehymaran, Paehymaran wird aus Pachyman durch Oxidation, Reduktion und anschließende Hydrolyse hergestellt.

Die erfindungsgemäß zur Herstellung des wasserlöslichen Polysaccharide verwendeten Verbindungen sind Harnstoff oder dessen Analoga und Derivate, d.h. Verbindungen, welche die f ΈΆ_Ο \ Gruppe enthalten. Zu diesen Verbindungen gehören flug/ / Harnstoff, Iminoharnstoff (Guanidin), Thioharnstoff und deren Derivate, in denen Wasserstoffatome der Aminogruppe durch eine Alkylgruppe substituiert ist. Die wässrige lösung des Harnstoffes oder Harnstoffderivats wird vorzugsweise in einer Konzentration von mehr als 2 Mol/l angewendet. Das Verfahren zum löslichmachen ist bei jedem beliebigen pH-Wert wirksam.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise das natürliche Polysaccharid oder eine dieses enthaltende Pflanze oder ein dieses enthaltender Mikroorganismus in eine wässrige lösung des Harnstoffes oder des Harnstoffderivate getaucht. Dabei wird gewöhnlich ein Teil eines natürlichen Polysaccharids oder einer Pflanze oder eines Mikroorganismus, der dieses enthält, in 20 bis 100 Teile der wässrigen lösung des Harnstoffes oder des Harnstoffanalogen getaucht. Die erhaltene Suspension oder lösung wird mehr als 1 Stunde gerührt. Das Löslichmachen kann ohne Erhitzen vor sich gehen, es wird jedoch durch Erhitzen auf eine Temperatur

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unter 150 C, vorzugsweise zwischen 40 und 70 C, gefördert. Unlösliche Substanzen werden durch Zentrifugieren oder Filtration entfernt und ein wassermischbares organisches Lösungsmittel wird der überstehenden Flüssigkeit oder dem Filtrat in der 2- bis 5-fachen Volumenmenge zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit einer geringen Menge gekühlten Wassers und einer wässrigen Alkohollösung gewaschen und unter Bildung eines wasserlöslichen pulverförmigen Polysaccharide getrocknet.

Die chemische Struktur des erfindungsgemäß erhaltenen wasserlöslichen Polysaccharide zeigt gegenüber der des nativen Polysaccharide keine Veränderung und der größte Teil der Antitumoraktivitat des nativen Polysaccharide verbleibt auch in dem wasserlöslichen Polysaccharid.

Die Menge des gelösten Polysaccharids wird kolorimetrisch nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmt.

Beispiel 1

1 g pulverförmiges Pachyman, das aus einem Fungus von Poria cocus Wolf mit Hilfe einer wässrig-alkalischen lösung extrahiert worden war, wurde in 50 ml einer wässrigen Harnstofflösung der Konzentration 6,0 Mol/l gegeben und die Suspension wurde 5 Stunden gerührt, wobei die Temperatur bei 80⁰G gehalten wurde. Die verbleibenden unlöslichen Materialien wurden durch leiten durch ein Milliporenfilter entfernt und 48 ml des Filtrats wurden mit 140 ml Methanol vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen, mit einer geringen Wassermenge gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 720 mg eines amorphen Pulvers erhalten wurden. Die Gesamtmenge des erhaltenen Pulvers wurde vollständig in 50 ml Wasser gelöst.

Andererseits wurde die vorstehend beschriebene Verfahrensweise wiederholt, mit der Abänderung, daß die wässrige Harnstofflösung durch Wasser ersetzt wurde. Wenn die 10-fache Volumenmenge Metha-

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nol, bezogen auf das Filtrat, zugesetztwurde, bildete sich jedoch kein Niederschlag.

Da die löslichkeit von Pachyman in Wasser einen Wert von nur etwa 1,8 mg/dl "bei 120⁰C hat, beträgt die löslichkeit des vorstehend erhaltenen löslichen Pachymans etwa das 800-fache der löslichkeit des nativen Pachyman·

Beispiel 2

Je 1 g pulverförmiges Pachyman wurde in 50 ml einer wässrigen Harnstofflösung der Konzentration von 4 oder 8 Mol/l suspendiert und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt. Dabei wurden 640 mg bzw. 601 mg eines trockenen amorphen Pulvers erhalten. Jedes dieser Produkte konnte vollständig in 50 ml Wasser gelöst werden.

Beispiel 3

1 g pulverförmiges Pachyman wurde in 50 ml einer wässrigen Lösung von Gruanidin-hydrochlorid einer Konzentration von 3 Mol/l gelöst und die Suspension wurde 24 Stunden bei 70⁰C gerührt, wonach die Suspension in eine nahezu klare Lösung übergegangen war. Die erhaltene Lösung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 120 mg eines amorphen trockenen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver wurde in 50 ml Wasser vollständig gelöst.

Beispiel 4

1 g pulverförmiges Lentinan, das aus handelsüblichem Lentinus edodes extrahiert worden war, wurde in 50 ml einer wässrigen Harnstofflösung der Konzentration 6 Mol/l gegeben und 24 Stunden bei 60⁰C gerührt. Unlösliche Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt und die überstehende Flüssigkeit wurde während 48 Stunden gegen fließendes Wasser und anschließend 24 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die nicht dialysierbare Lösung

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wurde mit der 3-fachen Volumenmenge an Methanol vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen, wobei 720 mg eines trockenen amorphen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver wurde vollständig in 50 ml Wasser gelöst, während 1 g des unbehandelten lentinans in 50 ml Wasser nicht gelöst werden konnte,

Beispiel 5

1 g pulverförmiges Pachymaran wurde in 50 ml einer wässrigen Harnstoff lösung von 4 Mol/l gegeben und 24 Stunden bei 80⁰C gehalten. Die erhaltene lösung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 70 mg eines amorphen trockenen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver löste sich vollständig in 50 ml Wasser, während die Löslichkeit des unbehandelten Pachymarans in Wasser nur etwa 5 mg/50 ml Wasser betrug.

Beispiel 6

1 g pulverförmiges Xylan wurde in 50 ml einer wässrigen Harnetofflösung von 4 Mol/l gegeben und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt. Dabei wurden 220 mg eines trockenen amorphen Pulvers erhalten. Das Pulver löste sich in 50 ml Wasser, während nur 45 mg des unbehandelten Xylans in 50 ml Wasser gelöst werden konnten.

Beispiel 7

10 g des Mycels von Coriolus versicolor wurden in 500 ml einer wässrigen Harnstofflösung von 4 Mol/l homogenisiert und 24 Stunden bei 80⁰C gerührt. Die unlöslichen Substanzen wurden durch Filtration entfernt und das Piltrat wurde auf 60 ml konzentriert und dialysiert. Die nicht dialysierbare lösung wurde mit 240 ml Methanol vermischt und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 590 mg eines amorphen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver löste sich in 50 ml Wasser vollständig.

Andererseits wurden 10 g des gleichen Mycels in 500 ml V/asser homogenisiert und in gleicher Weise wie vorstehend behandelt, mit

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der Abänderung, daß das Volumen des konzentrierten Filtrate 70 ml und das Volumen des zugemischten Methanols 350 ml betrugen. In· diesem Fall betrug die Ausbeute des trockenen amorphen Pulvers 160 mg.

Beispiel 8

2,3 g des trockenen Mycels von Poria cocos wurden in 200 ml einer wässrigen Harnstofflösung von 6 Mol/l gegeben und 24 Stunden bei 70⁰C gerührt. Unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt, das Filtrat wurde auf 50 ml konzentriert und 48 Stunden gegen fließendes Wasser und anschließend 24 Stunden gegen destilliertes V/asser dialysiert. Sie nicht dialysierbare Lösung wurde mit dem dreifachen Volumen Methanol vermischt, der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Methanol, Äther und anschließend mit Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wurden mg eines amorphen Pulvers erhalten. Das Pulver war ein wasserlösliches Polysaccharid, das überwiegend aus Glucoseeinheitea bestand.

Andererseits wurden 2,3 g des gleichen Mycels in 400 ml Wasser gegeben und 48 Stunden gekocht. Unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt, das Filtrat wurde mit dem 5-fachen Volumen an Methanol vermischt; es bildete sich jedoch kein Niederschlag.

Wenn bei der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise die wässrige Harnst off lösung durch "i^S-igs wässrige Natriumhydroxidlösung ersetzt wurde, wurden 701 mg de3 Polysaccharidpulvers erhalten, die Löslichkeit des Polysaccharids betrug jedoch nur 1,8 mg/dl bei 120 G.

Beispiel 9

50 g Goriolus hirsutus (hergestellt in Shiraoi Town, Hokkaido) wurden in 1 1 einer wässrigen Harnstofflösung von 6 Mol/l gegeben und 5 Stunden bei 70⁰C gerührt. Nach der Lösungsstufe folgte

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die gleiche Behandlung wie in der in Beispiel 8 angewendeten Methode und die nicht dialysierbare lösung wurde dann gefriergetrocknet. Dabei wurden 8,3 g eines wasserlöslichen Polysaccharidpulvers erhalten.

Wenn in der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise die wässrige Harnstofflösung durch 41 Wasser ersetzt wurde, wurden 5,9g des Polysaccharidpulvers erhalten.

Beispiel 10

60 g entfettete Poria cocos wurden in 2 1 einer wässrigen Harnstoff lösung von 6 Mol/l gegeben und 16 Stunden bei 100⁰C gerührt. Unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt, das FiI-trat wurde unter vermindertem Druck auf 500 ml konzentriert und mit dem fünfachen Volumen an Methanol vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde nach der in Beispiel 8 angewendeten Methode dialysiert und getrocknet, wobei 23,3 g eines wasserlöslichen Pachymanpulvers erhalten wurden.

Beispiel 11

10 g des Mycels von Trametes sanguinea wurden in 500 ml einer wässrigen Harnstofflösung von 8 Mol/l gegeben, mit Hilfe eines Homogenisators gemahlen und gemischt und unter Rühren 20 Stunden bei 80⁰G gehalten. Unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt, 450 ml des Filtrats wurden auf 70 ml konzentriert und mit 350 ml Methanol vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Alkohol gewaschen und getrocknet, wobei 1,7 g eines wasserlöslichen Polysaccharide mit ß-1,3-Glucosid-Verknüpfungen als Hauptkette erhalten wurden.

Andererseits wurde die wässrige Harnstofflösung durch 500 ml Wasser ersetzt und die Behandlung wurde in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Ausbeute des Polysaccharidpulvers betrug in diesem Fall nur 160 mg.

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Beispiel 12

10 g aus Weizenstroh isolierte Holocellulose wurde in 500 ml einer wässrigen Harnstofflösung von 8 Mol/l gegeben und 24 Stunden unter Rühren bei 70⁰G gehalten. Unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt, das Filtrat wurde dialysiert und auf 100 ml konzentriert und der konzentrierten Lösung wurden 400 ml Äthanol zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Alkohol gewaschen und getrocknet, wobei 15*1 g eines wasserlöslichen Polysaccharidpulvers erhalten wurden, das vorherrschend aus Xylan bestand.

Andererseits wurden 10 g der gleichen Holocellulose in 1 1 n-Natriumhydroxidlösung anstelle der wässrigen Harnstofflösung gegeben, 10 Stunden bei 25⁰C gerührt und anschließend in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben behandelt. Dabei wurden 11g des
Polysaccharidpulvers erhalten. Das Pulver enthielt nur eine geringe Menge an Xylan.

Beispiel 13 /

2o g zerkleinerte Substanz einer Hemlock-Tanne, die mit Aceton
entfettet und vorher getrocknet worden war, wurden in 2 1 einer
wässrigen Harnstofflösung von 8 Mol/l gegeben und unter Rühren
24 Stunden bei 70⁰C gehalten. Unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt, das Filtrat wurde unter vermindertem Druck
auf 100 ml konzentriert, dialysiert und mit der dreifachen VoIu-

WUiTuG

menmenge an Äthanol vermischt. Der gebildete Niederschlag/abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei 2,4 g des wasserlöslichen Polysaccharidpulvers erhalten wurden» Das Pulper enthielt hauptsächlich Galactoglucomannan.

Wenn bei diesem Verfahren anstelle der wässrigen Harnstofflösung als Extraktionsmittel Wasser verwendet wurde \inä die Behandlung nach der gleichen Methode wie vorstehend beschrieben

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durchgeführt wurde, wurden nur 0,2 mg trockenes Galactoglucomannanpu!ver erhalten, das einen niederen Galactosegehalt hatte,

Beispiel 14

500 mg Pachyman wurden in 50 ml einer wässrigen N-Methylharnßtoff-Iösung von 3 Mol/l gegeben und 24 Stunden unter Rühren bei 70⁰C gehalten. Unlösliche Substanzen wurden durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde mit Methanol vermischt. Der gebildete Niederschlag wurde isoliert, gewaschen und dann getrocknet. Die Ausbeute des wasserlöslichen Pachymans betrug 408 mg.

Beispiel 15

Die in Beispiel 14 verwendete wässrige Harnstofflösung wurde durch eine wässrige lösung von je 3 Mol/l Thioharnstoff, N, N-Dimethylharnstoff_f N,N'-Dimethylharnstoff, N,N,N¹,N'-Tetramethylharnstoff oder 1,1,3,3-Tetramethylguanidin-hydroehlorid ersetzt. Jede Behandlung wurde nach der in Beispiel 14 beschriebenen Methode durchgeführt. Die Ausbeuten an wasserlöslichem Pachyman betrugen 442 mg, 224 mg, 170 mg, 329mg bzw. 102 mg.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

it» Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Polysaccharide, dadurch gekennzeichnet , daß ein natürliches Polysaccharid oder eine dieses enthaltende Pflanze oder ein Mikroorganismus mit einer wässrigen lösung behandelt wird, die
Harnstoff oder ein Harnstoffderivat der Formel

₁
R₂/ \

C=X

enthält, in der X für Sauerstoff, Schwefel oder eine NH-Gruppe
steht und jeder der Reste R₁, Rg, R* und R. ein Wasserstoffatom oder eine Alky!gruppe mit 1 "bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als natürliches Polysaccharid ein aus einem Fungus, einem Bakterium, einer Hefe, einem Baum oder einem Graminaceae-Gras extrahiertes Polysaccharid verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als natürliches Polysaccharid Pachyman, lentinan,
ein aus Coriolus versicolor, Coriolus hirsutus oder Trametes
sanguinea extrahiertes Polysaccharid, Holocellulose,,Xylan oder Galactoglucomannan verwendet wird.

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4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als natürliches Polysaccharid ß-1,3-Glucan verwendet wird.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine wässrige Lösung von Harnstoff oder eines Harnstoffderivats verwendet wird, deren Konzentration mehr als 2 Mol/l beträgt.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das natürliche Polysaccharid oder die dieses enthaltende Pflanze oder der Mikroorganismus länger als 1 Stunde in die lösung des Harnstoffs oder Harnstoffderivats eingetaucht wird.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Temperatur der lösung zwischen 40 und 70⁰C gehalten wird.

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