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Verfahren zum Reinigen und Fraktionieren von Dextranen
Die Erfindung
bezieht sich auf die Gewinnung, Reinigung, Zerlegung und Fraktionierung von rohen
Dextranen, insbesondere auf ein verbessertes Verfahren zur Isolierung der Dextrane,
bei dem diese aus einer Lösung als Erdalkali-Dextran-Komplex gefällt und nach dem
die gefällten Produkte mit Säure behandelt werden, um die Dextrane daraus in Freiheit
zu setzen.
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Bei der mikrobiologischen Herstellung von Gummidextran durch Gärung
von Zuckerlösungen durch die species der Arten Leuconostoc, z. B. Stämme von Leuconostoc
mesenteroides und Leuconostoc dextranicum, wird eine sterile Zuckerlösung, die anorganische
Nährsalze enthält und durch notwendigeAminosäuren und Vitamine verstärkt ist, mit
einer aktiven wachsenden Reinkultur der genus Leuconostoc beimpft, die fähig ist,
Dextran zu synthetisieren, und der Zucker wird enzymatisch im Dextran und Fruktose
neben geringeren Nebenprodukten übergeführt.
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Das allgemein angewandte Verfahren für die Gewinnung von Gummidextran
aus den Gärungsflüssigkeiten besteht darin, die kolloidale Dispersion von Dextran
zu entwässern und durch Zugabe von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln
zur Kulturflüssigkeit instabil zu machen. Methyl-, Äthyl-oder Isopropylalkohol,
Aceton und Methyläthylketon sind im allgemeinen geeignet. Die Lösungsmittelkonzentration
beträgt gewöhnlich 50 bis 70 0/,, und das gereinigte Produkt wird durch mehrfache
Umfällung mit Lösungsmitteln aus Wasser gereinigt.
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Die Erfindung schafft ein neues technisches Verfahren der Isolierung
von Dextranen aus den Gärungsflüssigkeiten, das die Verwendung von organischen
Lösungsmitteln
nicht erfordert und zur Herstellung von neuen und wertvollen chemischen Komplexverbindungen
führt, nämlich komplexen Additionsprodukten aus Calciumhydroxyd und Dextran.
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Das Verfahren, welches entweder zur Abtrennung von Rohdextran aus
der Gärungsflüssigkeit oder von Rohdextran, das durch andere Verfahren hergestellt,
isoliert und wieder in Lösung gebracht ist, oder auf teilweise abgebautes Dextran
angewendet wird, besteht darin, daß Calciumhydroxyd zur wäßrigen Lösung, die Dextran
enthält, in einer Menge von etwa I Mol je Glucoseäquivalent zugegeben wird, um unlösliche
Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexe zu bilden, worauf diese isoliert und aus ihnen
die Dextrane mittels einer Säure, die ein wasserunlösliches bzw. wasserschwerlösliches
Calciumsalz bildet, wieder in Freiheit gesetzt werden.
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Die Fällung und Reinigung von Dextran aus roher wäßriger Lösung wurde
bisher im allgemeinen durch Zugabe von Alkohol oder Aceton vorgenommen. Auch ist
aus »Industrie agricole et alimentaire, 68 (I95I), S. I3 bis 22, bekannt, daß man
Dextran mit Barytlauge in einen wasserunlöslichen Bariumkomplex überführen kann,
aus dem durch Zersetzung mit Säure das Dextran wieder freigelegt wurde. Die Verwendung
von Schwefelsäure war hierfür jedoch ungeeignet, da das Bariumsulfat aus der erhaltenen
viskosen Dextranlösung nicht vollständig abgetrennt werden konnte. Es wurde daher
Zersetzung des Komplexes mit Salzsäure und Dialyse des Calciumchlorids empfohlen.
Vom Calciumhydroxyd wurde angenommen, daß es mit Dextran keinen fällbaren Komplex
bildet.
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Überraschenderweise hat sich nun herausgestellt, daß gerade Calciumhydroxyd
besonders geeignet ist, um Dextran aus unreinen Lösungen als Komplex auszufällen,
aus dem das Dextran durch Zugabe einer Säure, die mit dem Calcium ein schwer lösliches
Salz bildet, in einfacher Weise wieder in Freiheit gesetzt werden kann, da die ausfallenden,
schwer löslichen Calciumsalze sich leicht abtrennen lassen.
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Bei einer besonders geeigneten Durchführungsform des Verfahrens wird
das Calciumhydroxyd in situ erzeugt, indem ein lösliches Calciumsalz, wie das Chlorid
oder Nitrat, und ein starkes Alkali, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, der
Dextranlösung zugefügt wird. Die Fällung des Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexes erfolgt
unter diesen Bedingungen praktisch sofort.
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Die gefällten Komplexe aus Calciumhydroxyd und rohem Dextran sind
weiße flockige Fällungen, die durch Filtrieren und Zentrifugieren leicht aus der
Gärungsflüssigkeit isoliert werden. Nach dem Waschen mit Wasser können die Komplexverbindungen
getrocknet und als solche verkauft werden.
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Die gefällten Calcium-Dextran-Komplexe können leicht zur Ab trennung
von Dextran mit Säure behandelt werden. So wird der Calciumkomplex, wenn es wünschenswert
ist, das reine Dextran zu isolieren, in Wasser suspendiert und unter Entfernung
der metallischen Komponente behandelt. So kann man Kohlendioxyd durch die Suspension
perlen lassen, und der Calciumkomplex wird unter Gewinnung einer Dextranlösung oder
einer Lösung von Dextran und Fruktose und einer Suspension von Calciumcarbonat zersetzt.
Dieses wird durch Zentrifugieren gewonnen und kann nach Zersetzung durch Wärme in
Kohlendioxyd und Calciumoxyd wieder verwendet werden. Die Dextranlösung kann durch
Behandlung mit Ionenaustauschern vollständig von Mineralstoffen befreit werden und
durch Zerstäubungstrocknung oder Trommeltrocknung getrocknet werden. Falls in der
rohen Flüssigkeit auch Fruktose vorhanden ist und mit dem Dextran als Calciumhydroxyd-Komplex
gefällt wird, kann das gemeinsam gefällte Produkt mit Säure behandelt werden, um
das Dextran und die Fruktose in Freiheit zu setzen, wenn es gewünscht ist, ein Produkt
zu gewinnen, daß diese beiden Produkte enthält, zum Beispiel in der Nahrungsmittelindustrie
oder der pharmazeutischen Industrie.
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Das Freisetzen des Calciumhydroxyds aus dem Dextran wird mit einer
Säure bewirkt, die ein unlösliches Calciumsalz bildet, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure,
schweflige Säure und Kohlensäure usw.
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Wenn Fruktose in den Gärungsflüssigkeiten vorhanden ist und in einem
gemeinsam gefällten Komplex mit Dextran nicht erwünscht ist, wird das Verfahren
vorteilhaft dahin modifiziert, daß man die Gärungsflüssigkeit einer Hefegärung unterwirft,
um die Fruktose zu entfernen, bevor das Dextran gefällt wird. An Stelle rohes Dextran
zu behandeln, um es als Calciumhydroxyd-Komplex abzutrennen, kann ein teilweise
abgebautes Dextran in ähnlicher Weise gefällt werden und diese Fällung kann vorteilhaft
mit einer Fraktionierung des teilweise abgebauten Dextrans verbunden werden. Solche
teilweise abgebauten Dextrane sind von Interesse als Blutersatz für intravenöse
Anwendung und als Hilfe in anderen Phasen der Speicherung von Blut und Blutderivaten
für medizinische Zwecke. Die Molekülgröße des Dextrans ist für jede Anwendung sehr
spezifisch, und es ist wichtig, daß die Unterschiede der Molekülgrößen im Dextran
für eine bestimmte Anwendung begrenzt werden.
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Somit ist rohes Dextran, so wie es aus der Gärungsflüssigkeit isoliert
wird, im allgemeinen von sehr hohem mittlerem Molekulargewicht und besitzt eine
Intrinsic-Viskosität von 0,7 bis o, g. Dextran, das als Blutplasmaersatz geeignet
ist, hat eine Intrinsic-Viskosität von etwa 0,24 bis 0,25. Dextran mit einer Intrinsic-Viskosität
von 0,4 ist bekanntlich durch seine sedimentierende Wirkung auf die roten Blutkörperchen
für die Trennung von roten und weißen Blutkörperchen in vitro geeignet. Bei intravenöser
Anwendung wird ein Dextran mit einer Intrinsic-Viskosität unter 0,2 schnell durch
die Funktion der Nieren ausgeschieden, und Dextran hat von einer Intrinsic-Viskosität
von 0,3 an aufwärts einen beschleunigenden Effekt auf die Sedimentation von roten
Blutkörperchen.
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Das Verfahren stellt ein wertvolles Verfahren für die Fraktionierung
von Rohdextran dar, wenn dieses ein Gemisch von Verbindungen mit verschiedenen Viskositäten
und verschiedenen Molekulargewichten ist, insbesondere für die Fraktionierung von
teilweise abgebautem Dextran, wie es durch milde Säurehydrolyse aus rohem Dextran
erhalten wird.
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Die Erfindung ist auf der Feststellung gegründet, daß Gemische von
Dextranen, insbesondere Gemische
teilweise abgebauter Dextrane,
unlösliche Komplexe mit Calciumhydroxyden bilden, die bei gegebenem pH-Wert und
gegebener Calciumionenkonzentration in der Löslichkeit wesentlich voneinander differieren,
und daß verschiedene Dextranfraktionen unter Ausnutzung solcher verschiedener Löslichkeit
und Stabilität voneinander getrennt werden können.
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Es wurde gefunden, daß die teilweise abgebauten Dextrane vollständig
als Calciumhydroxyd-Komplexe gefällt werden können und daß, wenn die gefällten Komplexe
sorgfältig und teilweise angesäuert werden, das Dextran mit höherem Molekulargewicht
bevorzugt gelöst und von der zurückbleibenden Fällung abgetrennt werden kann, und
daß bei weiterhin sorgfältiger Regulierung der Zugabe der Säure aufeinanderfolgende
Fraktionen mit fallender Molekülgröße in Lösung erhalten werden können.
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Es wurde ferner gefunden, daß, wenn so ein teilweise abgebautes Dextranprodukt
selektiv und teilweise mit Calciumhydroxyd umgesetzt wird, die Dextranfraktionen
mit geringerem Molekulargewicht als erste als unlösliche Komplexe ausfallen und
von den anderen Fraktionen, die in Lösung bleiben, getrennt werden können, welche
durch nachfolgende und stufenweise Zugabe von Calciumhydroxyd und durch Bildung
von unlöslichen Komplexen weiter fraktioniert werden können.
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Im Gegensatz zur fällenden Wirkung von Alkoholen auf Dextranlösungen,
wobei die höhermolekularen Dextrane zuerst gefällt werden und die niedermolekularen
Dextrane in Lösung verbleiben, besteht das Verfahren der vorliegenden Erfindung
darin, daß die Dextranfraktionen mit niederem Molekulargewicht selektiv als Calciumhydroxydkomplexe
gefällt werden und die Dextrane mit höherem Molekulargewicht später gefällt werden,
und daß, wenn die Dextranfraktionen vollständig als Calciumhydroxydkomplexe gefällt
sind, es die Dextranfraktionen mit höherem Molekulargewicht sind, die als erste
durch fraktioniertes Ansäuern unter Abtrennung des Calciumhydroxyds aus solchen
Komplexen gelöst werden.
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Wenn die Dextranfraktionen stufenweise und fraktioniert als Calciumhydroxydkomplexe
gefällt werden, kann das Dextran aus diesen Komplexen durch Behandlung mit Säure
unter Freisetzung des Dextrans gewonnen werden, wobei eine Säure verwendet wird,
die eine unlösliche Fällung mit Calcium gibt. Die resultierende Lösung der Dextranfraktion
kann weiter unter Entfernung der zurückbleibenden anorganischen Salze durch Dialyse
oder Behandlung mit ionenaustauschenden Harzen gereinigt werden.
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Wenn die Dextrane vollständig als Calciumhydroxydkomplexe gefällt
werden und selektiv durch stufenweise Behandlungen mit Säure gelöst werden, werden
die stufenweise gewonnenen Lösungen mit weiterer Säure behandelt, um die vollständige
Abtrennung von Erdalkalimetallen aus den Komplexen sicherzustellen, dann können
die Dextrane aus der Lösung gewonnen werden.
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Das Verfahren zur Fraktionierung von Dextranen ist auf Dextrane mit
hohem Molekulargewicht, z. B.
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Mischungen von rohen oder nicht hydrolysierten Dextranen anwendbar,
ist aber besonders vorteilhaft für die Fraktionierung von teilweise abgebautem Dextran
und wird besonders in Verbindung hiermit beschrieben.
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Der teilweise Abbau oder die Depolymerisation des rohen Dextrans
wird bekanntlich durch Behandlung einer Lösung von rohem Dextran mit Säure erreicht
und unter Regelung der Erhitzungszeit, der Säuremenge und der Temperatur der Reaktion,
um den gewünschten Grad des teilweisen Abbaus des Dextrans zu erreichen, wie er
z. B. in der USA.-Patentschrift 2 437 5I8 von A. J. P. Grönwall u. a. ausgegeben,
am 9. März I948 beschrieben ist.
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Eine vorteilhafte Form der Durchführung des Verfahrens besteht im
Fällen der teilweise abgebauten Dextrane im wesentlichen vollständig als Calciumhydroxydkomplexe.
Die Dextrane können durch Zugabe eines konzentrierten Schlammes oder einer Lösung
des Calciumhydroxyds gefällt werden. Die Calciumhydroxyd-Dextran-Verbindungen sind
rein weiße voluminöse Fällungen, die aus der Suspension durch Zentrifugieren oder
Filtrieren leicht abgetrennt werden. Wegen der geringen Löslichkeit des Calciumhydroxyds
ist es vorteilhafter, das Calciumhydroxyd in der Dextranlösung durch Umsetzung eines
löslichen Calciumsalzes, z. B. des Chlorids, Nitrats oder Acetats, mit einer löslichen
Base, wie Natrium-, Kalium-oder Ammoniumhydroxyd, zu erzeugen. Es ist vorteilhaft,
die ganze Menge des Calciumsalzes zu Anfang zuzugeben und dann die Alkalilösung
langsam hinzuzufügen, bis vollständige Fällung des Calciumhydroxyds-Dextran-Komplexes
erfolgt ist.
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Der Mindest-pEI-Wert für die im wesentlichen voll ständige Fällung
der Dextrankomplexe liegt bei etwa I2,5. Die gefällten Dextrankomplexe werden vorteilhaft
mit gesättigtem Kalkwasser gewaschen, um Verunreinigungen, die an der voluminösen
Fällung adsorbiert sind, zu entfernen, bevor die Fällung einer Fraktionierung unterworfen
wird.
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Die fraktionierte Zerlegung der gefällten Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexe
nach der Molekülgröße der Dextrane wird durch Zugabe einer Säuremenge zu einer wäßrigen
Aufschlämmung der Fällung erreicht, die hinreicht, um einen Teil der Dextrane in
Lösung zu bringen, aber den Rest der Dextrane in der Fällung zu belassen, und durch
Abtrennung der entstehenden Lösung. Durch Zufügung einer weiteren Säuremenge wird
ein weiterer Teil der Dextrane durch die Säure in Lösung freigesetzt und kann in
ähnlicher Weise abgetrennt werden, bis die letzte Säurezugabe die letzte Fraktion
der Fällung auflöst.
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Das Dextran, welches somit in aufeinanderfolgenden Fraktionen in
Lösung freigesetzt wird, ist durch die Calciumsalze der freimachenden Säure verunreinigt,
und gegebenenfalls muß eine Trennung des Dextrans vom Salz vorgenommen werden. Um
das Problem dieser Reinigungsstufe zu vermindern, ist vorteilhaft eine Säure zu
verwenden, die bei der Zugabe zum Calciumhydroxyd-Dextran-Komplex ein unlösliches
Calciumsalz bildet. Säuren, wie Schwefelsäure, Kohlensäure, schweflige Säure, Phosphorsäure
und Oxalsäure, können somit verwendet werden, etwas abhängig von dem im Komplex
enthaltenen Calciumhydroxyd.
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Der p,-Wert der Suspension nimmt mit den aufeinanderfolgenden Säurezugaben
etwas ab, z. B. von
etwa 12,8 auf etwa 12,1. Um eine praktisch vollständige
Entfernung der Erdalkalüonen aus den Lösungen sicherzustellen, werden sie weiter
bis auf einen pl3-Wert von rund 6,5, vorteilhaft mit einer Säure, die ein unlösliches
Calciumsalz bildet, angesäuert. Die resultierenden Lösungen der verschiedenen Dextranfraktionen
werden dann weiter z. B. durch Dialyse oder durch Behandlung mit einem ionenaustauschenden
Harz gereinigt, worauf die Dextranfraktionen aus den Lösungen durch Eindampfung
im Vakuum oder äquivalente Mittel gewonnen werden können.
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Es ist ein Vorteil dieses Verfahrens, daß die ganze Fraktionierung
und Gewinnung bei gewöhnlichen Temperaturen von etwa 15 bis 35° durchgeführt werden
kann. Obgleich das Dextran bei den hohen verwendeten p-Werten verhältnismäßig stabil
ist, ist es ratsam, das Verfahren bei Temperaturen unter 50° durchzuführen.
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Die für die Bildung der Additionsverbindungen mit Dextran oder abgebautem
Dextran oder Fruktose erforderliche Calciumhydroxydmenge beträgt angenähert I Mol
Base je Mol Fruktose und angenähert I Mol oder etwas mehr als I Mol Base je Mol
Glukoseäquivalent (C6 H10 05) im Dextran oder abgebautem Dextran.
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Eine ausreichende Calciumhydroxydmenge soll zugegeben oder gebildet
werden, um der Menge des Dextrans und der Fruktose zur Bildung des Metallhydroxydkomplexes
zu genügen. Wünschenswert wird ein Überschuß von etwa 10% des Erdalkalihydroxyds
verwendet.
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Die Zusammensetzung des gefällten Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexes
schwankt etwas in Abhängigkeit der Fällungsbedingungen. Produkte mit etwa 21 bis
etwa 29 0/, Calciumoxyd (CaO) werden bei der gemeinsamen Fällung von Dextran und
Fruktosekomplexen mit Calciumhydroxyd sowie auch im Calciumhydroxyd-Dextran-Komplex
erhalten.
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Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 erläutert eine vorteilhafte Arbeitsweise zur Durchführung der Gärung
für die Herstellung von Rohdextran vor der Fällung des Dextrans als Calciumhydroxydkomplex.
In diesem Beispiel wird Hefe zunächst in einer verdünnten Rohzuckerlösung unter
Bildung eines Nährmediums gezüchtet, gefolgt von der Sterilisierung und Verstärkung
mit Saccharose und mit nachfolgender Durchführung der Dextrangärung.
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Beispiel I Die folgenden Bestandteile werden miteinander vermischt
und durch Erhitzen auf II5° während 10 Minuten sterilisiert: Rohzucker .....................
10,0 Teile KH2PO4 ..................... 5,0 MgSO4.7H20 . 7H20 . . . . . . . . .
. . 0,2 NaCl I, . . . . . . . 1,0 (NH4)2SO4..................... 0,6 # Wassr aufgefüllt
auf .......... 1000 # p-Wert eingestellt auf 4,8 mittels Schwefelsäure.
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Nach dem Abkühlen auf 28° wurde eine aktive Kultur von Saccharomyces
cerevisiae, die in einer ähnlichen Flüssigkeit wächst, zugefügt. Die Impfung beträgt
3 Volumprozent der Gärungsflüssigkeit. Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von
0,5 Volumen Luft je Volumen Gärungsflüssigkeit und Minute durchgeblasen. Nach 10
Stunden ist die Flüssigkeit frei von Zucker und enthält je ccm 6 # 105 Hefezellen.
Sie wird durch Erhitzen auf 805 während 130 Minuten pasteurisiert und dann filtriert.
100 Teile granulierte raffinierte Saccharose werden zum Filtrat gegeben, und der
p-Wert wird mit NaOH auf 7,0 eingestellt.
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Die resultierende Gärungsflüssigkeit wird 10 Minuten bei 125° sterilisiert.
Nach dem Abkühlen auf 25° wird es mit einer aktiven I2-Stunden-Kultur von Leuconostoc
mesenteroides beimpft, die in einer identischen Flüssigkeit wächst. Die Impfmenge
beträgt 5 Volumprozent. Die Gärungsflüssigkeit wird nach mehreren Stunden opaleszierend,
und man beobachtet ein schnelles Ansteigen der Viskosität, das in etwa 32 Stunden
ein Maximum erreicht. Analysen der glatten, viskosen Gärungsflüssigkeit haben die
Anwesenheit von 42,7 Teilen Dextran, 48,4 Teilen reduzierendem Zucker, berechnet
als Fruktose, und nur 9,5 Teilen restliche Sucrose ergeben.
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Die Beispiele 2 bis 5 erläutern das neue Zerlegungsverfahren unter
Anwendung auf das Dextrangärungsprodukt nach Beispiel 1, aber es sei verstanden,
daß sie auch auf Dextrangärungsprodukte anwendbar sind, die durch andere Verfahren
gewonnen wurden.
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Das Beispiel erläutert die Behandlung einer Gärungsflüssigkeit zur
gleichzeitigen Ausfällung von Dextran und Fruktose.
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Beispiel 2 Die vergorene Flüssigkeit nach Beispiel 1 wird im folgenden
zur Gewinnung der Gärprodukte Dextran und Fruktose behandelt. Die vergorene Flüssigkeit,
deren pE-Wert mit Kalk auf 7,5 eingestellt wird, wird zur Herabsetzung der Viskosität
mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt und nach einer Sterilisierung von 10
Minuten bei 125° durch Zentrifugieren in einer schnell laufenden Superzentrifuge
geklärt und auf 5° abgekühlt. Auf je 1000 Teile verdünnte geklärte Flüssigkeit werden
100 Teile 3 n-Calciumchloridlösung zugefügt. Dann werden unter kräftigem Rühren
200 Teile 3n-Natronlauge zugegeben. Es erfolgt eine sofortige quantitative Ausfällung
der Calciumhydroxyd-Dextran- und Calciumhydroxyd-Fruktose-Komplexe, die abzentrifugiert
und mit gesättigtem Kalkwasser gewaschen werden; Dieses gemeinsam ausgefällte Produkt
kann mit hinreichender Kohlensäure behandelt werden, um sowohl das Dextran als auch
die Fruktose freizusetzen und eine Lösung von Dextran und Fruktose zu geben.
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Das folgende Beispiel erläutert die weitere Behandlung der Gärungsflüssigkeit
nach Beispiel I unter Entfernung der Fruktose, bevor das Dextran mit Calciumhydroxyd
ausgefällt wird.
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Beispiel 3 Die Gärungsflüssigkeit nach Beispiel 1 wurde 28 Stunden
nach derBeimpfungmit Leuconostocmesenteroides mit einer aktiven Hefekultur Saccharomyces
cerevisiae (5 01o des Gärvolumens) beimpft. Innerhalb von 4 Stunden erreicht die
Dextranbildung ein Maxi-
mum, und dann erfolgt eine schnelle Vergärung
des Nebenproduktes Fruktose, was durch die Gasentwicklung (CO2) bewiesen wird. 24
Stunden nach der Beimpfung mit Hefe wird die nunmehr fruktosefreie Flüssigkeit mit
dem gleichen Volumen Wasser verdünnt und der p,-Wert mit Kalk auf 8,o eingestellt.
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Dann wird 10 Minuten bei I250 sterilisiert.
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Nach dem Zentrifugieren wird die geklärte Flüssigkeit mit Calciumchlorid
und Natriumhydroxyd wie im Beispiel 2 zur Fällung des Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexes
behandelt, der abzentrifugiert und mit gesättigtem Kalkwasser gewaschen wird. Die
gewaschene Fällung wird in Wasser suspendiert und Kohlendioxyd hindurchgeleitet.
Calciumcarbonat wird gefällt und Dextran in die Lösung freigesetzt. Die Zentrifugierung
ergibt eine Dextranlösung, die durch Eindampfung konzentriert und gegebenenfalls
auf einem mit Dampf beheizten Drehtrommeltrockner zu durchscheinenden dünnen weißen
Blättern getrocknet wird.
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Beispiel 4 Dieses Beispiel erläutert das Verfahren, bei welchem teilweise
abgebaute Dextrane vollständig als Kalk-Dextran-Komplexe gefällt werden und durch
stufenweise Säurebehandlung diese Fällung fraktioniert wird.
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50 Teile Rohgummidextran, die aus der Gärungsflüssigkeit von Leuconostoc
mesenteroides, die in einer Saccharose-Hefeextrakt-Flüssigkeit gezüchtet war, isoliert
wurden, werden in IOOO Teile 0,02 n-Salzsäure gelöst.
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Nach einstündigem Erhitzen auf 90° wurde das Reaktionsgemisch auf
250 abgekühlt und mit In-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die resultierende
Lösung von teilweise hydrolysiertem Dextran wurde mit 2000 Teilen Wasser verdünnt.
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56,8 Teile Calciumchlorid (Ca Cl2 2 H2 0) wurden in der Dextranlösung
gelöst und 950 Teile 1 n-Natronlauge langsam unter kräftigem Rühren zugegeben (p,-Wert
I2,8). Eine voluminöse weiße Fällung von Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexen wurde
erhalten. Die Fällung wurde abzentrifugiert und wieder in IOOO Teilen gesättigtem
Kalkwasser suspendiert. Die Fällung wurde aus dieser Waschbehandlung wieder durch
Zentrifugieren gewonnen. Die gewaschene Fällung wurde in Wasser unter Bildung von
IOOO Teilen Schlamm suspendiert.
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50 Teile In-Schwefelsäure wurden dann langsam zu der kräftig gerührten
Suspension im Verlauf von Io Minuten zugegeben, und man läßt das Gemisch unter Rühren
in 20 Minuten zum Gleichgewicht kommen. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert
und die zentrifugierte Lösung zur Gewinnung der ersten Dextranfraktion abgetrennt.
Die zentrifugierte Lösung wurde sofort mit I n-Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,
neutralisiert und das ausgefällte Calciumsulfat abfiltriert. Das Filtrat wurde mit
dem unter der Handelsbezeichnung » Amberlite IRC-50« erhältlichen Ionenaustauscher
in der Säurestufe und mit »Amberlite IRA-4006 (Handelsbezeichnung) in der Alkalistufe
behandelt, bis die Leitfähigkeit der Lösung auf unter 80 Mikroohm vermindert wurde.
Die Harze wurden abgesiebt und das Filtrat im Vakuum konzentriert und dann in dünner
Schicht in einem flachen Trog bei 70° in einem Vakuumofen getrocknet. Das Dextran
trocknete in einem dünnen durchscheinenden Blatt, welches gepulvert und verpackt
wurde. Dieses Produkt wird als Fraktion I bezeichnet.
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Die restliche Fällung des Kalk-Dextran-Komplexes aus der ersten Ansäuerungsstufe
wurde wieder auf I000 Teile mit Wasser suspendiert und die Ansäuerung mit 50 Teilen
1 n-Schwefelsäure unter Gewinnung einer zweiten Fraktion wiederholt. Die restliche
Fällung von der zweiten Fraktion wurde wieder mit 600 Teilen Wasser suspendiert
und die Ansäuerung mit 50 Teilen In-Schwefelsäure wiederholt unter Gewinnung der
dritten Fraktion. Die restliche Fällung der dritten Säurebehandlung wird in 500
Teilen Wasser wieder aufgeschlämmt und die Säurebehandlung mit 50 Teilen 1 n-Schwefelsäure
unter Gewinnung der vierten Fraktion wiederholt.
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Eine fünfte und sechste Fraktion wurde durch erneutes Suspendieren
der restlichen Fällung in 400 Teilen Wasser und schließlich auf 250 Teile Wasser
und ähnliche Säurebehandlung unter Gewinnung einer fünften und sechsten Fraktion
behandelt.
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Die in jeder Fraktion in Gewichtsteilen gewonnene Dextranmenge und
die relative Viskosität jeder Fraktion sowie ihre innere Viskosität sind in der
Tabelle I zusammengestellt, zusammen mit dem pn-Wert der Lösung, bei dem die Extraktion
der aufeinanderfolgenden Fraktionen stattfand. Wie durch diese Tabelle angegeben
wird, gab die fraktionierte Säurebehandlung des vollständig gefällten Dextrankomplexes
Dextranfraktionen mit fortschreitend geringerer innerer Viskosität.
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Tabelle I Fraktionierte Säurebehandlung von Kalk-Dextran-Komplexverbindungen,
die aus teilweise hydrolysiertem Dextran gewonnen wurden
| Relative |
| Ausbeute des |
| Fraktion Gewichtsttiele Gesamtedextrans Viskosität Intrinsic- |
| Nr. PH % (2%ige Lösung Viskostiät |
| bie 30°) |
| bei 300) |
| I I2,6 4,3 II,I I,92 0,312 |
| 2 12,5 9,3 23,8 1,82 o, 298 |
| 3 I2,2 6,8 I7,4 I,80 0,292 |
| 4 12,4 7,2 I8,6 I,79 0,286 |
| 5 I2,2 6,6 I7,I I,78 0,281 |
| 6 12,1 4,2 10,8 I,77 o, 276 |
Beispiel 5 Dieses Beispiel erläutert die fraktionierte Fällung
des Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexes aus teilweise abgebautem Dextran.
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50 Teile Rohdextran wurden mit 0,02n-Sazlzsäure, wie im Beispiel
6 beschrieben, hydrolysiert. Calciumchlorid (56,8 Teile Ca Cl2. 2 H2 0) wurden zum
neutralisierten Hydrolysat gegeben, und dann wurde 1 n-Natriumlauge sehr langsam
unter kräftigem Rühren zugesetzt. Nach je I50 Teilen Alkalilösung wurde das Reaktionsgemisch
unter Gewinnung einer Fraktion der Calciumhydroxyd-Dextran-Komplex-Fällung zentrifugiert.
Die Zugabe einer ähnlichen Alkalimenge zur zentrifugierten Lösung wurde dann zur
Gewinnung einer weiteren Fraktion fortgesetzt. Insgesamt wurden goo Teile Alkali
zugegeben und sechs Fraktionen isoliert.
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Jede Fraktion wurde mit In-Schwefelsäure bis auf einen PH-Wert fon
6,5 behandelt und das Calciumsulfat entfernt. Restliche Ionen wurden wie im Beispiel
6 mit einem Gemisch der ionenaustauschenden Harze Amberlite IRC-50 und Amberlite
IRA-400 (Handelsbezeichnungen) entfernt. Die von Ionen freigemachten Filtrate wurden
im Vakuum konzentriert und als Film in flachen Trögen getrocknet.
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Die in jeder Fraktion gewonnenen Gewichtsmengen Dextran und ihre
physikalischen Konstanten sind in Tabelle II zusammengestellt, zusammen mit dem
p11-Wert der Lösung, aus der sie als Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexe gefällt wurden.
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Tabelle II Fraktionierte Fällung von Calciumhydroxyd-Dextran-Komplexverbindungen,
die aus teilweise hydrolysiertem Dextran gewonnen wurden
| Relative |
| Fraktion |
| Nr. Ph Geasamtdextrans (2%ige Lösung Viskostiät |
| % bie 30°) |
| 1 11,6 2,0 5,2 1,69 0,270 |
| 2 I2,2 7,6 I9,6 1,82 0,322 |
| 3 I2,2 28,9 74,6 I,88 0,348 |
| 4 I2,6 0,20 0,5 |
| 5 12,6 Spuren - - |
| 6 12,8 Spuren - - |
Es ist ersichtlich, daß praktisch alles Dextran in den ersten drei Fraktionen gewonnen
wurde und das Dextran mit der niedrigsten Viskosität zuerst als Calciumhydroxyd-Dextran-Komplex
gefällt wurde, und daß bei Fortsetzung der Zugabe von Alkali Dextranfällungen mit
Steigen höherer Viskosität erhalten werden.
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Das folgende Beispiel erläutert die Kombination der Behandlung von
Rohdextran unter Bildung des Calciumhydroxydkomplexes mit nachfolgender Hydrolyse
des aus dem Komplex freigesetzten Dextrans und Fraktionierung des hydrolysierten
Produktes. Dieses kombinierte Verfahren hat den Vorteil, daß das aus dem anfänglichen
Komplex freigesetzte Dextran nicht getrocknet und wieder gelöst zu werden braucht,
sondern direkt in Lösung für die Behandlung mit Säure verwendet werden kann, so
daß das Verfahren als Ganzes ohne die Verwendung von organischen Lösungsmitteln
in irgendeiner Stufe des Verfahrens durchgeführt werden kann.
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Beispiel 6 Eine Kultur von Leuconostoc mesenteroides wurde in einer
geeigneten Gärungsflüssigkeit gezüchtet, die IO °/0 Saccharose, Hefeextrakt und
anorganische Nährmittel enthält. Nach 26stündigem Wachstum war der größere Teil
der Saccharose in Dextran und Fruktose umgewandelt, und die Flüssigkeit wird mit
einer aktiven Hefekultur (Saccharomyces cerevisiae, 3 Volumprozent) beimpft. Nach
weiteren 36 Stunden Gärung sind die Fruktose und die restlichen Zucker durch die
Hefe entfernt, wobei das Dextran in der zuckerfreien Gärungsflüssigkeit zurückbleibt.
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Die resultierende Gärungsflüssigkeit wird mit Calciumchlorid unter
Verwendung von I600 g Calciumchlorid (CaCl2 2H2 2H20) für 321 Gärungsflüssigkeit
behandelt und der pH-Wert der Lösung mit Kalk auf einen Wert von 8,o eingestellt.
Die Mischung wird dann durch Zentrifugieren in einer Superzentrifuge unter Entfernung
von Bakterien und Hefezellen und anderen Verunreinigungen einschließlich einiger
Calciumsalze und eiweißartigen Stoffen behandelt.
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Die geldärte Lösung wird mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt.
5 n-Natronlauge (4,6 1) werden langsam unter kräftigem Rühren zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wird in einer festen Kammerzentrifuge zentrifugiert, und das voluminöse weiße Präzipitat
von Calciumhydroxyd-Dextran-Komplex wird in 301 gesättigtem Kalkwasser wieder suspendiert.
Nach einer erneuten Zentrifugierung wird die so erhaltene Fällung in 32 1 Wasser
wieder suspendiert. Kohlendioxyd wird dann durch die Suspension perlen gelassen,
bis ein pH-Wert von 8,5 erreicht ist. Dies führt zur Zersetzung des Calciumhydroxydkomplexes,
Fällung von Calciumcarbonat und zur Bildung einer Dextranlösung.
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Nach Filtration zur Entfernung des Calciumcarbonats wird die Dextranlösung
in einer Form erhalten, die unmittelbar für die Säurehydrolyse verwendet werden
kann. Diese Lösung wird dann verwendet wie das Rohmaterial in den Verfahren, die
durch die Beispiele 6 und 7 erläutert sind.
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Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß sie die Verwendung
flüchtiger organischer Lösungsmittel für die Fällung oder Fraktionierung der Dextrane
und Feuer- und Explosionsgefahren sowie auch die Kosten der Verarbeitung großer
Mengen Lösungsmittel vermeidet.
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Es ist ein weiterer Vorteil, daß die gefällten Erdalkalihydroxyd-Dextran-Komplexe
leicht handbare flockige Fällungen zum Unterschied zu den schwieriger handbaren
Produkten der Lösungsmittelfällung sind.
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Es ist ein weiterer Vorteil des Verfahrens, bei Anwendung zur Fraktionierung
von teilweise abgebautem Dextran, daß es die verschiedenen Fraktionen trennt, die
sich auf die verschiedenen Löslichkeiten der Calciumhydroxydkomplexe gründet, wobei
eine Trennung leicht ohne die Verwendung organischer Lösungsmittel erzielt wird.