DE2046596C3

DE2046596C3 - Verfahren zur Herstellung von zur Einarbeitung in Waschmittel geeigneten Proteasepulvern hoher Aktivität

Info

Publication number: DE2046596C3
Application number: DE2046596A
Authority: DE
Inventors: Jacques Nesle Pelluet, (Frankreich)
Original assignee: LES PRODUITS ORGANIQUES DU SANTERRE ORSAN PARIS
Current assignee: LES PRODUITS ORGANIQUES DU SANTERRE ORSAN PARIS
Priority date: 1969-09-23
Filing date: 1970-09-22
Publication date: 1974-04-25
Also published as: NL7010918A; DE2046596B2; GB1318563A; FR2060252A1; FR2096390A2; FR2096390B2; FR2060252B1; US3705085A; DE2046596A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteasepulvern, die zur Einarbeitung in Waschmittel bestimmt sind, wobei die Enzyme aus einer Fermentation von Kulturen von Bacillus subtilis erhalten wurden.

Verfahren zur Extraktion von Exo-Enzymen aus Gärbrühen sind bekannt. Sie lassen sich in folgende Gruppen unterteilen:

a) Ausfällung mit Alkoholen und Ketonen,

b) Ausfällung mit Mineralsalzen,

c) Ausfällung mit Hilfe von Tannin (s. britische Patentschrift 969 936),

d) Selektive Adsorption und Desorption (s. i. B USA.-Patentschrift 2 952 586).

Die obigen Methoden können einzeln oder in Kombination angewandt werden.

Von den Fällmitteln in Form von Alkoholen und Ketonen seien als Beispiele gcnani.t: Aceton, Isopropylalkohol, Äthylalkohol und Methylalkohol. Als Beispiele für Fällmittel in Form v».n Mineralsalzen mögen Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Magnesiumsulfat dienen.

Die Verwendung von Adsorbentien wie Tonerde, die die zu gewinnenden Enzyme selektiv adsorbieren, führt zu Verfahren, die im allgemeinen unter Kombination mit einer der obengenannten Methoden durchgeführt werde 1.

Bei sämtlichen bekannten Verfahren, die heute durchgeführt werden, bestehen noch verschiedene Schwierigkeiten.

Die Verfahren, die unter Verwendung eines Lösungsmittels als Fällmittel arbeiten, sind durch geringe Se'ektivität gekennzeichnet. Man erhält nach diesen Verfahren nur unreine Produkte von geringer Aktivität, die vor der technischen Verwendung einer zweiten Behandlung bedürfen.

Setzt man der zu behandelnden Brühe Aceton zu, so erfolgt die Ausfällung sämtlicher unlöslicher organischer Materialien, d. h. von Stoffen sowohl enzymatischer wie nicht enzymatischer Art, ferner fällt die Hauptmenge der Mineralsalze aus.

Die Zusammensetzung eines derart erhaltenen Produkts hängt auch von der Konzentration des Lösungsmittels in der Brühe ab. Sowohl bei vorgängig konzentrierten wie nicht konzentrierten Gärbrühen sind die Mengen an Fällmittel jeweils beträchtlich. Bei einer vorgängigen Konzentration beobachtet man im allgemeinen unter anderem einen Aktivitätsverlust.

Gegenüber dem obigen Verfahren, das mit Lösungsmitteln als Fällmittel arbeitet, zeichnen sich die Verfahren unter Verwendung von Mineralsalzen durch den Vorteil der Selektivität aus. Auch mit diesen Verfahren erhält man im allgemeinen keine reinen Lnzympulver hoher Aktivität, da es schwierig ist, die Ausflockung zu isolieren. Der flockige Niederschlag enthält unter anderem aus den Mutterlaugen stammende Verunreinigungen und eine nicht vernachlässig^! re Menge des zur Ausfällung verwendeten Salzes.

Verwendet man beispielsweise als Fällmittel Ammoniumsulfat, so erhält man Enzympuiver mit hohem Ammonsalzgehalt. Arbeitet man dieses Produkt direkt in alkalische Detergentien ein, so erhalten diese einen unangenehmen Geruch nach Ammoniak.

Die Verwendung anderer S;i'ze, beispielsweise von Magnesiumsulfat, Dinatriumphosphat u. dgl., rechtfertigt sich nur in solchen Fällen, in denen das Endprodukt ein ausreichend hohen Verkaufswert besitzt.

Bei den mit Adsorption und anschließender Desorption arbeitenden Verfahren liegt d-<" Hauptnachtei! in dem zusätzlichen Erfordernis eines der beiden obigen Extraktionsverfahren. Verfahren unter Anwendung von Adsorption und Desorption bind daher bis heute auf den Laboratoriumsmaßstab oder auf Produkte besonderer Qualifikation, z. B. für Nahrungsoder pharmazeutische Zwecke, beschränkt.

Im ertmdungsgemäßen Verfahren wird als Fällmittel Natriumsulfat verwendet. Unt»r bestimmten Betriebsbedingungen kann man mit diesem Salz eine selektive Fällung der organischen Verbindungen mit Enzymwirksamkeit hervorrufen. Weiterhin wird erfindungsgemäß ein bestimmtes Filterhilfsmittel verwendet, und man erhält auf diese Weise Produkte definierter Zusammensetzung mit erhöhter Aktivität.

Ein geeignetes Filterhilfsmittel muß folgende Bedingungen erfüllen:

a) Es muß hinsichtlich der späteren Verwendung des Gemische, in welches es eingeht, verträglich sein;

b) es muß im zu filtrierenden Milieu praktisch unlöslich sein;

c) es muß selbst gut filtrierbar sein.

Theoretisch scheinen zahlreiche Verbindungen für obigen Zweck brauchbar. Es wurde jedoch gefunden, daß im erfindur.gsgemäßen Verfahren das Calciumsulfatdihydrat am besten geeignet ist.

Es wurde ferner festgestellt, daß die zur Reinigung von Gärbrühen bekannten mechanischen Methoden zur Entfernung \on Peptiden und anderen Verbindungen hohen Molekulargewichts, die für die Trübung der Gärbrühe verantwortlich sind, sowie von Hakteriellen Bestandteilen, d. h. Sporen, die während der Fermentation gebildet werden und deren Vernichtung vom Verbrauchei der Enzympulver im allgemeinen verlangt ν ird, nicht ausreichen.

Es wurde nun gefunden, daß der Zusatz eines bestimmten Ausflockungsmittels zur Gärbrühe zur Folge h;U. daß man nach dem Zentrifugieren eine klare

3 4

Brühe erhält, die von den obengenannten unerwiinsch- Geruch oder irgendwelche nachteiligen physikalischen

ten Bestandteilen frei ist. Eigenschaften. Das Calciumion wirkt zum Schutz der

Das erfindungsgemäß eingesetzte Ausflcckungs- Proteasen.

mittel ist ein Kondensationsprodukt aus Äthylenoxyd Gegenüber dem aus der britischen Patentschrift

und Oleylamin, das 5 bis 12 Mol Äihylenoxyd pro 5 969 936 bekannten Verfahrer ergeben sich folgende

Mol Oleylamin aufweisen kann. Die Brühe wird nach Vorteile:

seinem Zusatz sofort zentrifugiert. 1. Im erfindungsgemäfien Verfahren wird die vor-

Die Verwendung des oben beschriebenen Konden- gegebene Menge an Fermentationsmedium wesentlich

sationsprodukts als Ausflockungsmittel hat zum Ziel, rascher aufgearbeitet; sämtliche vorkommende Stufen

eine Ausflockung der Verunreinigungen hohen Mole- io mit Trennungen von Feststoff zu Flüssigkeit sind er-

kulargewichts hervorzurufen, ohne daß dabei gleich- leichtert.

zeitig das Enzym ausgefällt wird; ferner soll das 2. Das erfindungsgemäße Produkt enthält 84%

Kondensationsprodukt eine bakterizide Wirkung auf der ursprünglich vorhandenen Proteaseaktivität, das

die Mikroorganismen ausüben, die die Biosynthese Produkt des Vergleichsverfahrens hingegen nur 55%.

durchgeführt haben. Bei den bisher bekannten Ver- 15 3. Die spezifische Aktivität des erfindungsgemäß

fahren wurde von einem Ausflockungsmittel lediglich erhaltenen Endproduktes kann höher sein als die des

die erste Wirkung verlangt, und somit Avar eine Sterili- Vergleichsproduktes: Sie kann 610O Nesle-Einheiten/

sation mit Äthylenoxyd nach der Extraktion noch mg organisches Material betragen, während sie im

erforderlich. Dieser Arbeitsgang wird erfindungsgemäß Produkt des Vergleichsversuchs gemäß der britischen

überflüssig. 30 Patentschrift 969 936 nur 4700 NesIe-Einheiten/mg

Gegenstand vorliegender Erfindung ist somit ein organisches Material beträgt (vgl. den nachstehenden

Verfahren zur Herstellung von zur Einarbeitung in Vergleichsversuch).

Waschmittel geeigneten Proteasepulvern hoher Akti- 4. Das erfindungsgemäß erhaltene Produkt besitzt

vität aus Gärbrühen von Bacillus subtilis, das dadurch die bessere Lagerbeständigkeit,

gekennzeichnet ist, daß man das Ausgangsmaterial 25 Zum Nachweis von beim erfindungsgemäßen Ver-

Cärbrühe durch Zusatz eines Kondensationspro- fahren erzielbaren Vorteilen wurden Vergleichsver-

duktes aus Äthylenoxyd und einem Oleylamin als suche mit einem Fällverfahren (britische Patentschrift

Flockungsmittel und anschließende Zentrifugierung 969 936) und einem Adsorptions-Desorptionsverfahren

lur Entfernung der Ausflockung vorreinigt, daß man (USA.-Fatentschrift 2 952 586) durchgeführt:

der so vorgereinigten Gärbrühe bei einer Temperatur 30 I. Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit

zwischen 28 und 6O⁰C, vorzugsweise zwischen 35 und dem Verfahren gemäß der britischen Patentschrift

4O⁰C, und bei einem pH-Wert zwischen 6 ind 11, 969 936.

vorzugsweise zwischen 6,5 und 8, Natriumsulfat in Fs wurde mit Proben von jeweils 1 1 einer durch einer Menge zusetzt, die eine Natriumsulfat-Konzen- Fermentation von Bacillus subtilis erhaltenen Gär-Iration in der Lösung von mindestens 28% ergibt, 35 brühe gearbeitet, deren Aktivität 6200 NE/ml (NE 4aß man den Niederschlag über ein Filter mit einer - Nesle-Einheiten) = 25 AE/1 (AE -- Anson-Ein-Anschwemmschicht von Calciumsulfatdihydrat ab- heilen) betrug. Eine der Proben wurde nach dem erlaugt und daß man das trockene Endprodukt mit der findungsgemäßen Verfahren behandelt, die andere wie Protease durch Abkratzen einer oberflächlichen Zone folgt:
der Anschwemmschicht gewinnt. 40 Dac Fermentationsmedium wurde unter Verwen-

Das trockene Endprodukt kann in beliebiger Ver- dung eines durch Erhitzt von vulkanischem Liparit-

dünnung erhalten werden, je nach der Dicke der oder Quarzporphyrglas auf über 1200^rC erhabenen

Schicht, die vom Filter abgenommen wird, d. h. mit Filterhilfsmiitels (sogenannter expandierter Perlit, s.

einer beliebig "wischen 600 und 4000 Nesle-Einheiten R ö m ρ ρ -- Chemielexikon [1966], 4764) mit einem

pro Milligramm (auf Gesamtfestsioff bezogen) ein- 45 Buchner-Filter abgesaugt. Da sich die Filterschicht

gestellten Aktivität. rasch verstopfte, wurden zum Filtrieren der ange-

Die vorliegende Erfindung bringt folgende Vorteile gebenen Menge 3 Stunden benötigt (entsprechend

tnit sich: einer durchschnittlichen Filterleistung von 20 bis

Der abnitrierte trockene Niederschlag auf dem 40 ]/m²/Stunde). Ein Waschen des Filterkuchens war Filter muß nicht weiter gereinigt werden, vielmehr 5» unmöglich. Vom Filterhilfsmittel wurden auf diese stellt er das Endprodukt zur Einarbeitung in Wasch- Weise etwa 10% der Gesiimtaktivität der Ausgangsmittel dar. brire 7urickj:elalten.

Die Wiedergewinnung des Fällmittels ist einfach Die geklärte Brühe ergab folgende Meßwerte:

und mit guten Ausbeuten durchführbar, nämlich η ■ κ rv h η ·?η

durch Kristallisation der Mutterlauge unter Ab- 55 Optische Diente u,ju

kühlung. PH 6,9

Auf Grund der einfachen Arbeitsgänge benötigt Aktivität 56S0 NE/ml

das erfindungsgemäße Verfahren nur geringe Arbeits- (=22 AE/1)
geräteschaften, verglichen mit den Verfahren mit

Aceton oder Ammoniumsiilfat oder mit den selek- 60 Erfindungsgemäß war die Brühe unter Zusatz des

tiven Adsorptions- und Desorptionsverfahren. Kondensaiionsprodukts aus Äthylenoxyd und Oleyl-

Die zur Durchführung des Verfahrens erforder- amin innerhalb weniger Minuten durch Zentrifugieren

liehen Stoffe sind billig, insbesondere Natriumsulfat geklärt worden:

ist in beliebiger Menge vorhanden und billig im Handel . , ^. , _n ,,

erhältlich: das gleiche gilt für das Calciumsulfatdi- 6_S Optische Diente u,jd

hydrat. P^H ' ⁷>¹⁰

Diese Stoffe sind mit den Proteasen aus Bacillus Aktivität 61C0 NE/ml

subtilis völlig verträglich; sie verursachen keinen (= 24 AE/1)

5 " 6

Der Vergleichsbrühe wurden sodann entsprechend Die geklärte Lösung wurde dann nach der Vorder Vorschrift des Beispiels 2 der britischen Patent- schrift vom Beispiel 3 der USA.-Patentschrift 2 952 586 schrift 969 936 Ammoniumsulfat und Tannin züge- an einem Ionenaustauscherharz aus einem Styrolfügt. Mit 10 n-HCl wurde der pH auf 5,8 eingestellt. Mischpolymerisat behandelt. Die Fraktionen mit dem Eine Temperaturerhöhung über 30⁰C wurde sorg- 5 größten Teil der Enzymaktivität wurden vereinigt, fältig vermieden. Nach 2stündigem Stehen wurde Daraus wurden bei der Ausfällung des Enzym-5 Minuten lang mit 2500 G zentr.fugiert. Nach Ab- Komplexes 300 mg Produkt mit einer Aktivität von dekantieren der überstehenden Flüssigkeit wurde der 30 000 NE/mg (= 120 AE/g) erhalten. Spezifische Niederschlag mit 20 ml Wasser (etwa das 5fache seines Aktivität und Reinheit des Produkts sind ausgezeich-Volumens) gewaschen. Die nach dem Zentrifugieren io net. Von der im Ausgangsmaterial enthaltenen Enzymüberstehende Flüssigkeit war nicht ganz klar, sondern aktivität werden jedoch nur 50% im Produkt erhalten, enthielt suspendierte Teilchen. Die Untersuchung der Ein derart hochgereinigtes Protease-Produkt kommt anfallenden Flüssigkeiten (einschließlich Waschwasser) allerdings zur Einarbeitung in Waschmittel wohl kaum ergab eine proteolytische Aktivität in der Größenord- in Frage. nung 200 N E/ml (= 0,8 A E/I). 15

Der Niederschlag wurde dann zunächst mit 60%, Beispiel 1 dann 50% und danach 40% Aceton in Wasser in

Dekantiergefäßen extrahiert. Da die Phasentrennung 10 m³ einer einem technischen Fermentationsver-

nur langsam erfolgte, war diese Verfahrensstufe sehr fahren unter Verwendung eines Gemisches aus zeitraubend. Beim Vereinigen der Extrakte wurden 20 Glucose und Maisquellflüssigkeit entstammenden Gär-

350 ml einer Lösung mit der optischen Dichte 0,20 brühe mit Bacillus subtilis als Protease-Erzeuger mit

erhalten. einer proteolytischen Aktivität von 8500 NE/ml wer-

Die wäßrig-acetonische Lösung wurde über ein den beim natürlichen pH-Wert unter schwachem Papierfilter mit geringem Porendurchmesser filtriert. Rühren mit 15 kg eines Kondensationsprodukts aus Bei einer Filterfläche von etwa 1 dm² und einem Druck 35 Äthylenoxid und Oleylamin versetzt, dann läßt man von 2 kg/cm^a benötigte man zum Filtrieren 2 Stunden. 10 Minuten lang ruhen und zentrifugiert bei 30⁰C DasFiltrat enthielt 12000 NE/ml (= 47 AE/1). Dann mit einer Durchlauf-Zentrifuge unter einer Zuführwurden 1800 ml Aceton zugegeben, der Niederschlag geschwindigkeit von 5 m³ pro Stunde. Die Trübung wurde unter Verwendung eines Papierfilters abfiltriert des Zentrifugats variiert zwischen 100 und 120 Kaolin- und dreimal mit 5 ml Aceton gewaschen. 30 grad/ml im Gegensatz zu mehr als 500 Kaolingrad/ml

Der so erhaltene Rückstand wurde im Vakuum ohne Flockungsmittel.

getrocknet, dabei wurden 0,80 g eines Produkts mit Hierzu werden 28 Gewichtsprozent wasserfreies

folgenden Analysenwerten erhalten: Natriumsulfat bei einer Temperatur von 40°C zu-

_ . , _nna. gegeben. Die erhaltene Suspension wird auf ein Filter

Trockensubstanz .... 99% _{35 mit dner Vorschicht aus} Calciumsulfatdihydrat und

Asche 1°% einer filtrierenden Oberfläche von 1 m² aufgegeben.

organisches Material. 90% Die Drehgeschwindigkeit der Trommel beträgt

Aktivität 4200 NE/mg = 16,5 AE/g 20 Drehungen pro Stunde, und im Inneren der

(auf Gesamtfeststoff be- Trommel herrscht ein Vakuum von 200 Torr.

zogen, d. h. 4700 NE/mg 4° Hierbei werden 750 g Calciumsulfat pro Stunde

organisches Material) entfernt.

Farbe helles Beige ^Nac^ !ständiger Betriebszeit wurden so 5001

~ , . ... der Suspension behandelt, und man erhält ein Pulver

^Geruch charaktenstisch _{mit folgender} Zusammensetzung und folgender Ak-

Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Ver- *5 tivität:
fahrens wurden ausgehend von 11 der obigen Gärbrühe

1,3 g Enzympulver mit folgenden Analysenwerten Gehalt an

erhalten: Calciumsulfat .. 42,8%

Trockensubstanz.. 99% ₅₀ ^GÄ"_sulfat... 19,5%

^Asche ³⁵°/o Gehaltan

organisches organischem

Material 65% Material 37,7%

Aktivität 4000 NE/mg = 15,7 AE/g proteolytische

(auf Gesamtfeststoff bezogen, ⁵⁵ Aktivität bei

d. h. 6100 NE/mg organisches pH 9 2300 NE/mg, d. h. 6000 NE/

Material) _mg organisches Material)

Farbe beige

^Geruch charakteristisch _{6o Unter Verwendung der gleichen} Gärbrühe, die

II. Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens jedoch ohne Zusatz des Flockungsmittels zentrifugiert mit dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 952 586. wurde, wird die Filtrationsleistung auf 2001 pro Qua-Bei der gemäß der Entgegenhaltung vorgesehenen dratmeter filtrierender Oberfläche pro Stunde herabzweimaligen Filtration ergaben sich die gleichen gesetzt.

Schwierigkeiten wie bei dem Versuch unter I. Die 65 Nach dieser lstündigen Betriebszeit wird die

zweite Filtration erfulgte mit einem »Milliporen«- Schichtdicke derart verändert, daß pro Stunde 1500 g

Filter, Filtsrleistung bei 3 cm Filterdurchmesser Calciumsulfat entfernt werden. Unter diesen Be-

5 ml/Std. dingungen werden 5001 der Suspension innerhalb

40 Minuten filtriert. Das pulverförmigc Produkt weist folgende Zusammensetzung und Aktivität auf:

Calciumsulfat 50,3%

Natriumsulfat 16,5%

organisches

Material 33,2%

Aktivität bei pH 9 2000 (NE/mg, d. h.

6000 NE/mg organisches

Material)

Beispiel 2

Zum Vergleich wurden noch folgende Versuche durchgeführt:

Eine Gärbrühe von Bacillus subtilis wird in zwei Portionen geteilt. Die erste Portion wird direkt zentrifugiert, wobei man eine Brühe mit einer Trübung von

855 Kaolingraden erhält. Hierzu werden 2 Volumteile reines Aceton zugesetzt. Der Enzymniederschlag wird mit Hilfe eines Filters mit Anschwemmschicht filtriert. Nach der Trocknung bei niedrigen Temperaturen im Vakuum weist das so erhaltene Enzympulver eine Aktivität von 1300 NE/mg auf.

Die zweite Portion der Gärbrühe wird nach Zusatz von 1,5% des '^m Beispiel 1 verwendeten Flockungsmittels zentrifugiert. Die Trübung des Zentrifugats

ίο beträgt 60 Kaolingrade. Diese Lösung wird dann analog wie die erste Lösung behandelt, wobei man ein Enzympulver mit einer Aktivität von 1900 NE/mg erhält.

Die proteolytische Aktivität wurde jeweils beim pH-Wert 9 bei 40⁰C mit Casein als Substrat bestimmt. Die Menge der nach 40 Minuten freigesetzten Aminosäuren wurde nach der Methode von Folin-CiocaHer ermittelt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von zur Einarbeitung in Waschmittel geeigneten Proteasepulvern hoher Aktivität aus Gärbrühec von Bacillus subtilis, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausgangsmaterial Gärbrühe durch Zusatz eines Kondensationsproduktes aus Äthylenoxyd und einem Oleylamin als Flockungsmittel und anschließende Zentrifugierung zur Entfernung der Ausflockung vorreinigt, daß man der so vorgereinigten Gärbrühe bei einer Temperatur zwischen 28 und 60°C, vorzugsweise zwischen 35 und 40° C, und bei einem pH-Wert zwischen 6 und 11, vorzugsweise zwischen 6,5 und 8, Natriumsulfat in einer Menge zusetzt, die eine Natriumsulfat-Konzentrathn in der Lösung von mindestens 28% ergibt, daß man den Niederschlag über ein Filter mit einer Anschwemmschicht von Calciumsulfatdihydrat absaugt und da2 man das trockene Endprodukt mit der Protease durch Abkratzen einer oberflächlichen Zone der Anschwemmschicht gewinnt.