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Verfahren zur Gewinnung von Fumagillin Die Erfindung bezieht sich
in Weiterausbildung des Verfahrens zur Herstellung von Fumagillin nach Patent 895
96o auf die Gewinnung von Fumagillin aus mit fumagillinbildenden Mikroorganismen
fermentierten Nährlösungen, wobei das Fumagillin durch Ansäuern der fermentierten
Nährlösung auf pH-Werte von i bis 4 ausgefällt wird. Aus dem so erhaltenen Rohprodukt
kann man leicht gereinigtes Fumagillin herstellen.
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Fumagillin ist ein Antibiotikum, das durch die Wirkung des fumagillinerzeugenden
Aspergillus fumigatus H-3 (NRRL 2319) auf ein Dextrin-Maiswasser-Medium oder ähnliche
Nährmedien erhalten wird. Es erweist sich als nützlich zur Behandlung verschiedener
pathologischer Zustände, insbesondere von Infektionen mit Endamoeba histolytica
(H a n s o n und E b 1 e, J. Bacteriology 58, S. 528 [1949]; Mc Cowen und Mitarb.,
Science 113, S.:202 [I951]). Es bildet weiße Kristalle mit der empirischen
Formel C,7H3607; Schmelzpunkt igo bis igi°; optische Drehung (a) D =-26,6°; Molekulargew
ficht etwa 475 bis 49o, spezifischer Auslöschungskoeffizient (h) 145 bis
148 bei 351 ,u. Es bildet einen Methylester vom Schmelzpunkt 145
bis
1q.7°, ein Octabromid vom Schmelzpunkt 118 bis 122° und ein 2, 4-Dinitrophenylhydrazon
vom Schmelzpunkt 123 bis 126°.
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Bei der Gewinnung von Antibiotika aus fermentierten Nährlösungen ist
es üblich, die neutrale fermentierte Nährlösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren
Lösungsmittel, wie Chloroform, zu extrahieren. Verwendet man diese Arbeitsweise
zur Gewinnung von Fumagillin, aus einer fum:agillinhaltigen fermentierten Nährlösung,
so ist das aus dem Extrakt gewonnene Produkt mit ebenfalls aus der Nährlösung extrahierten
Fremdstoffen verunreinigt. Die Anwesenheit dieser Fremdstoffe führt trotz des hohen
Lösungsvermögens des Chloroforms für Fumagillin zu einer so großen Erschwerung der
Weiterverarbeitung des Fumagillinextraktes, daß die Gesamtausbeute gering ist.
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Es wurde nun gefunden, daß Fumagillin im Gegensatz zu anderen Antibiotika
aus äußerst verdünnten Lösungen, wie sie fermentierte Nährlösungen darstellen, ausgefällt
werden kann, wenn man den pH-Wert der Lösung auf etwa i bis 4 einstellt. , Auf diese
Weise bleiben die wasserlöslichen Verunreinigungen, die bei den früheren Methoden
aus der neutralen Nährlösung extrahiert wurden, in Lösung, und man kann leicht ein
rohes Fumagillin leicht abtrennen, aus dem man durch geeignete Extraktions- und
Kristallisationsverfahren reines Fumagillin gewinnen kann.
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Es wurde ferner gefunden, daß das rohe, aus der angesäuerten Fermentationsflüssigkeit
abgetrennte Fumagillin gereinigt werden kann, indem man das nasse Rohprodukt mit
Aceton oder einem anderen niedrigsiedenden hydrophilen Lösungsmittel, wie Äthanol,
Methanol, Propanol, Butanol oder Äthylacetat, extrahiert, aus dem Extrakt ein zweites
Rohfumagillin abscheidet, das nasse zweite Rohfumagillin mit Chloroform od. dgl.
wasserunlöslichen Lösungsmitteln, wie Methylenchlorid; Methylisobutylketon oder
Butanol, extrahiert, die so erhaltene Lösung mit einem geeigneten Trocknungsmittel,
wie wasserfreiem Natriumsulfat, Chlorkalzium,. Magnesiumsulfat oder Kieselsäuregel,
oder mittels eines anderen Trennungsverfahrens, wie Zentrifugieren, durch das die
darin gelösten wasserlöslichen Produkte entfernt werden, trocknet und aus der so
erhaltenen wasserfreien Lösung das Fumagillin gewinnt.
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Unter »niedrigsiedenden Lösungsmitteln« sind solche zu verstehen,
deren Siedepunkt genügend niedrig ist, um sie aus ihren wäßrigen Lösungen abzudestillieren.
Ihr Siedepunkt oder derjenige ihrer azeotropen Mischungen mit Wasser, sofern sie
solche bilden, sollte niedriger sein als der Siedepunkt des Wassers.
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Gewünschtenfalls kann man das so gewonnene Furnagillin weiterreinigen,
indem man es aus Methanol oder ähnlichen Lösungsmitteln, wie Äthanol, Aceton, Butanol
oder Methyläthylketon, denen, insbesondere im Falle der mit Wässer mischbaren Lösungsmittel
Methanol, Äthanol und Aceton, Wasser zugesetzt werden kann, um die Ausfällung des
Fumagillins einzuleiten, umkristallisiert. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens empfiehlt es sich, zuerst die Nährlösung zu klären und manchmal zu entfetten,,
indem man sie beispielsweise mit oder ohne Filtrierhilfsmittel bei einem pH-Wert
über etwa 6 und unter etwa 8 filtriert, um das mit dem Impfstoff eingeführte Mycel
zu entfernen. Dies hat den Vorteil, daß unerwünschte ölige Verunreinigungen im Mycel
nicht in die folgenden Extrakte übergehen. Gewünschtenfalls kann man die neutrale
Nährlösung (pH = 6 bis 8) mit einem raffinierten Petroläther oder einem anderen
Lösungsmittel auf Kohlenwasserstoffbasis extrahieren, um sie nach der Filtration
zu entfetten. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn man Specköl als schaumverhinderndes
Mittel bei der Fermentierung-verwendet. Die so gereinigte und entfettete Nährlösung
wird dann aufgearbeitet, um das Fumagillin zu gewinnen.
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Die neutrale Nährlösung wird vor oder nach der Klärung und Entfettung,
jedoch vorzugsweise-nach einer Klärbehandlung auf pH 1 bis 4 angesäuert. Der Säuregrad
wird vorzugsweise auf pH 2 eingestellt, wo die Löslichkeit des Fumagillins ein Minimum
erreicht: Da die Löslichkeit des Fumagillins eine Funktion des pH-Wertes ist, ist
die Art der verwendeten Säure mit Ausnahme von wirtschaftlichen Überlegungen ohne
Bedeutung, und man kann deshalb Schwefel-, Salz-, Essig-, Chloressig- und Phosphorsäuren
verwenden. Das Ansäuern mit einer dieser Säuren auf pH 1 bis 4, vorzugsweise 2,
bewirkt eine Ausfällung des Fumagillins in feindisperser Form, das dann durch Filtration
in einer Filterpresse oder durch Zentrifugieren abgetrennt werden kann.
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Die Filtration erfolgt vorteilhaft in Gegenwart eines Filtrierhilfsmittels,
um die Ausflockung des feinverteilten Niederschlags zu erleichtern. Behandelt man
die das dispergierte Fumagillin enthaltende Flüssigkeit mit feinverteilter Diatomeenerde,
so flocken die Fumagillinteilchen auf den Teilchen des Filtrierhilfsmittels aus
und lassen sich leichter von der Flüssigkeit trennen. Die Ausfällung und Gewinnung
des Fumagillins ist unter diesen Bedingungen so vollständig, daß es weder notwendig
noch erwünscht ist, das verbrauchte Filtrat für eine weitere Verwendung im Verfahren
zurückzugewinnen.
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Der nasse Filterkuchen wird nun mit Aceton extrahiert. Dieses kann
geschehen, indem man den Kuchen auf der Filterpresse oder in einer Zentrifuge auswäscht,
oder indem man den Kuchen in Aceton aufschlämmt und nochmals filtriert, um das Filtrierhilfsmittel
zu entfernen. Das Aceton kann wesentliche Mengen Wasser enthalten, doch sollte dieser
Wassergehalt vorzugsweise 50 %, nicht übersteigen. Bei Verwendung einer Filterpresse
ist es von Vorteil, das Aceton wasserfrei oder mindestens so wasserfrei als wirtschaftlich
tragbar zu verwenden, und es sollte für diesen Zweck nicht mehr als 5 1/u Wasser
enthalten. Andere mit Wasser mischbare Lösungsmittel können Wasser in den gleichen
Mengen enthalten. Bei Verwendung von Äthylalkohol empfiehlt sich die Anwendung des
gewöhnlichen
95o/oigen Produktes. Verwendet man mit Wasser nicht
mischbare Lösungsmittel, wie Butanol, so können diese Wasser bis zur Löslichkeitsgrenze
enthalten.
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Die so erhaltene Lösung wird nun durch Verdampfen des Lösungsmittels
konzentriert. Gewünschtenfalls kann die Lösung zuerst teilweise oder ganz mit Natronlauge
oder sonst einer löslichen Base neutralisiert werden, um die Entwicklung eines übermäßigen
Säuregrades im Konzentrat zu verhindern. Vorzugsweise erfolgt das Eindampfen im
Vakuum, um die Temperatur verhältnismäßig niedrig zu halten. Vorzugsweise erfolgt
die Destillation in einem so hohen Vakuum, wie es mit einem barometrischen Kondenser
erreichbar ist, vorzugsweise bei weniger als z27 mm Quecksilberdruck. Bei Verwendung
von Butanol oder sonst einem mit Wasser ein azeotropes Gemisch bildenden Lösungsmittel
kann man während der Destillation Wasser zusetzen, bis alles Lösungsmittel überdestilliert
ist. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels verbleibt eine wäßrige Aufschwämmung
des Fumagillins. Das Wasser stammt aus dem nassen Filterkuchen und dem im Lösungsmittel
enthaltenen oder während der Destillation zugesetzten Wasser. Die Bildung dieser
Aufschlämmung hat den Vorteil, daß wasserlösliche Verunreinigungen in Lösung bleiben
und so durch Filtration entfernt werden können.
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Das halbraffinierte Fumagillin oder zweite Rohfumagillin wird weitergereinigt,
indem man es mit Chloroform oder einem ähnlichen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel
extrahiert. Zweckmäßigerweise erfolgt dies nach Abfiltrieren des Wassers, so daß
die wasserlöslichen Stoffe nicht auch mitextrahiert werden. Man kann deshalb den
nassen Filterkuchen entweder auf der Filterpresse oder in der Zentrifuge extrahieren
oder im Chloroform oder anderen Lösungsmitteln aufschlämmen, doch kann man gewünschtenfalls
die wäßrige Dispersion in einem geeigneten Extraktionsapparat, z. B. einem Podbielniakextraktor,
direkt mit Chloroform extrahieren.
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Man erhält so eine Lösung von noch reinerem Fumagillin in Chloroform
oder einem anderen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, aus dem das Fumagillin
gewonnen wird, indem man die Lösung zuerst trocknet, um das aus dem nassen Filterkuchen
oder der wäßrigen Aufschlämmung aufgenommene Wasser zu entfernen, wonach man das
Lösungsmittel verdampft. Wenn die Trocknung nach einem Ausscheidungsverfahren erfolgt,
z. B. durch Adsorption oder Zentrifugieren des Wassers, findet eine noch weitergehende
Abtrennung der wasserlöslichen Verunreinigung statt. Das so erhaltene gereinigte
Fumagillin kann durch Auflösen in einem Lösungsmittel, aus dem es leicht kristallisiert,
und ein- oder mehrmaliger Umkristallisation aus einem solchen Lösungsmittel weitergereinigt
werden. Wasserfreies Methanol erwies sich als besonders vorteilhaft, und oft ist
der Zusatz einer kleinen Menge Wasser vorteilhaft, um die Kristallisation einzuleiten.
Eine wirksame Kristallisation erreicht man beispielsweise, indem man den Fumagillinextrakt
in kochendem wasserfreiem Methanol aufnimmt und mit oder ohne Zusatz von bis zu
etwa 50'/o Wasser auf etwa -4o° abkühlt. Andere Lösungsmittel, die sich gleich gut
zum Umkrigtallisieren des gereinigten Fumagillins eignen, sind Äthanol, Aceton,
Butanol und Met'hyläthylketon. Mit Vorteil kann man das Lösungsmittel dem Chloroformextrakt
zusetzen, bevor alles Chloroform verdampft ist. So kann man der Chloroformlösung
Methanol zusetzen und dann das Chloroform abdestillieren, wobei eine Lösung zurückbleibt,
aus der beim Abkühlen das Fumagillin leicht kristallisiert.
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Die folgenden Beispiele, in denen die Teile Gewichtsteile sind, sollen
die Erfindung noch eingehender erläutern. Beispiel i 6o561 einer 4 Tage fermentierten
Kultur von Aspergillus fumigatus H-3 wird gegen S. aureus phage (Plattenversuch)
geprüft und zeigt eine Wirksamkeit von 95,ug pro cm3 oder einen Totalgehalt von
58o g Fumagillin. Die Lösung wird ohne Filtrierhilfsmittel filtriert und die geklärte
Lösung, die 345 g Fumagillin enthält, durch Extraktion mit 7571 raffiniertem Petroläther
entfettet. Zur entfetteten Lösung, die 26o g Fumagillin enthält, gibt man 68,1 kg
kieselgurhaltiges Filtrierhilfsmittel und stellt den pH-Wert mit konzentrierter
Schwefelsäure auf- 3. Das ausgefällte Fumagillin und das Filtrierhilfsmittel werden
auf einer Platten- und Rahmenpresse filtriert und der Preßkuchen dreimal mit ioo
l/@ Aceton extrahiert, die vereinigten Acetonextrakte (567,75 1) werden mit Natronlauge
auf pH = 6 gestellt und im Vakuum zu einer wäßrigen Suspension konzentriert. Das
Vakuum wird hier und in den anderen Beispielen mit einem barometrischen Kondenser,
z. B. einem Dampfstrahlaspirator und Kondenser, der ein Vakuum von weniger als z27
mm Quecksilbersäule erzeugt, hergestellt. Die wäßrige Suspension wird dreimal mit
Chloroform extrahiert. Der 22,71 1 betragende Chloroformextrakt enthält entsprechend
der biologischen Prüfung 253 g Fumagillin. Die Chloroformlösung wird im Vakuum zu
einem halbfesten Rückstand konzentriert, den man in Methanol auflöst. Die 41 betragende
Methanollösung wird über Nacht bei -40° aufbewahrt, und man erhält eine erste Fraktion
von 9o g roher Kristalle. Nach Konzentration der Mutterlauge erhält man eine zweite
Fraktion von 69,5 g und eine dritte Fraktion von 12,i g. Nach Umkristallisieren
der Rohkristalle durch Auflösen in heißem Methanol, Filtrieren und Abkühlen auf
tiefe Temperatur erhält man ioi,6 g weiße Kristalle.
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Die in diesem Beispiel verwendete Fermentationslösung wird wie folgt
hergestellt: A. Herstellung der Impfkulturen von Aspergillus fumigatus H-3 Eine
vegetative Zucht und Sporen von A. fumigatus H-3, die auf Agrarplatten gewachsen
ist,
wird in mehrere 50o-cm3-Kolben gebracht, von denen jeder ioo
cm3 des folgenden Nährmediums enthält: Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . io
g Natriumchlorid . . . . . . . . . 5 g Mais-Einweichwasser .... 32 g Calcium-Karbonat
...... i g Leitungswasser auf ...... i 1 aufgefüllt.
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Das Medium wird durch Zugabe von Natronlauge auf pH = 6,7 eingestellt,
sterilisiert und von Agrarplatten beimpft. Es wird dann bei 24° während 48 Stunden
geschüttelt (belüftete untergetauchte Kultur). Diese Kultur von A. fumigatus H-3
kann -direkt zur Beimpfung der Erzeugungstanks für Fumagillin (C) oder zur Herstellung
eines größeren Volumens des Impfstoffes- verwendet werden (B). B. Herstellung von
Impfstoff Zu 61 eines die unter A erwähnten Bestandteile enthaltenden Mediums gibt
man in einem i91 fassenden Kolben, der mit Rührwerk und Belüftwngse,inr.ichtung
versehen ist, 5 Volumprozent des gemäß A erhaltenen Impfstoffes. Man bebrütet unter
Belüftung 48 Stunden bei 24°. Nach dieser Zeit kann die Kultur zur Beimpfung großer
Tanks verwendet werden. C. Herstellung der Fermentationslösung 6056 1 des
unter A beschriebenen Mediums in einem mit Glas ausgekleideten Gärtank von
7570 1 Inhalt werden mit 283,9 1 der 48stündigen vegetativen Kultur von A.
fumigatits H-3, hergestellt wie unter B beschrieben, versetzt. Man fermentiert während
42 Stunden bei 24° unter Rühren und Einblasen von etwa 2,265 ms Luft pro Minute.
Beispiel e 6056 1 der wie oben hergestellten Fermentationsflüssigkeit, die
aber 3040 g Fumagillin enthält, wird ohne Filtrierhilfsmittel filtriert. Der pH-Wert
der klaren Flüssigkeit wird mit H2 S 04 auf 2 eingestellt, wobei man 45,3 kg Filtrierhilfsmittel
zusetzt. Der Niederschlag wird auf einer Filterpresse abfiltriert und der Preßkuchen
in der Presse mit Aceton extrahiert, die Acetonextrakte (5491) werden im Vakuum
zu -einer wäßrigen Suspension konzentriert. Das suspendierte'Fumagillin wird mit
einer kleinen Menge Filtrierhilfsmittel abfiltriert und der Filterkuchen mit Chloroform
extrahiert. Der Chloroformextrakt wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und im Vakuum konzentriert, indem man das Chloroform von Zeit zu Zeit durch Methanol
ersetzt, bis man etwa 15 1 Lösung hat, die nach Abkühlung gemäß Beispiel
i 55o g rohes kristallines Fumagillin ergibt. Die rohen Kristalle werden in 2o 1
warmem Methanol gelöst, filtriert und tiefgekühlt. Die ausgeschiedenen weißen Kristalle
werden abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält so 72 g bei r93° schmelzender
Kristalle, deren Reinheit nach der UV-Analyse 99,6 1/a beträgt.