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Mikrobiologisches Verfahren zur Gewinnung von Cobalaminen
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EMI2.2
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<tb> derNährsubstrat: <SEP> 4 <SEP> % <SEP> Glukose
<tb> 2 <SEP> % <SEP> Laktose
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Pepton
<tb> 0, <SEP> 24% <SEP> Hefeextrakt
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> KH <SEP> PO
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> NaHO
<tb> 1 <SEP> NaCl
<tb> 10 <SEP> Millionstel <SEP> Teile <SEP> COC1
<tb>
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Nach Sterilisieren und Kühlen auf 330C werden 50 1 Substrat mit 100 cm3 einer Suspension geimpft, die durch Waschen einer Kultur auf einem Kuchen aus Nähragar erhalten wurde. Die Masse wird 25-40 h bei 330C vergoren und dabei mit 30 - 50 I durchgeblasener Luft/min durchlüftet und mit 150 - 300 U/min gerührt.
Wenn die Trübung der Kultur einem Trockengewicht von 3 bis 5 mg/cms entspricht, wird die erhaltene Kultur zum Impfen eines grösseren Substratvolumensin einem Gärbehälter verwendet.
Das in dieser Stufe verwendete Substrat hat die oben angegebene Zusammensetzung zuzüglich 100 y/cnr'2, 3, 5-Triamlnotoluol-hydrochlorid, das nach Sterilisation in wässeriger Lösung oder durch zweistündige Berührung mit 95% igem Alkohol zugesetzt wird.
Nach vollständiger Durchführung der Gärung erhält man 45 1 einer vergorenen Maische, die nach Zusatz von 0, 5% NaCN 30 min lang in einem Autoklaven bei 120 C erhitzt werden. Das Mycelium wird durch Abschleudern und Waschen in Wasser abgetrennt, wobei die Waschablaugen der klaren Flüssigkeit zugesetzt werden, die dadurch auf ein Volumen von 48 1 gebracht wird. Diese Flüssigkeit wird mit 620 cm* Kresol gesättigt und zuerst mit 3% igem und dann mit eigen Kresol im Gemisch mit Tetrachlorkohlenstoff in einem Volumenverhältnis von 40 : 60 extrahiert. Nach Zusatz von 34fro Pyridin zu dem Extrakt wird das Gemisch zweimal mit demselben Volumen Wasser gerührt. Die Vitamin B und das Cobalaminanaloge enthaltende wässerige Lösung wird über Amberlite IRA 401 in einem Acetatzyklus geführt.
Das Vitamin B und das Cobalaminanaloge bleiben im Effluenten und werden nach Zusatz des zum Waschen des Harzes verwendeten Wassers wie vorstehend beschrieben durch Behandlung mit Kresol und Chloroform von dem flüssigen Effluenten extrahiert.
Bei Zusatz von Aceton und Äther zu dem Extrakt erhält man einen flockigen Niederschlag, der nach Zusatz von Supercel auf einem Filter aufgefangen und in 150 cm3 Wasser gelöst wird. Die Lösung enthält 200 mg Vitamin B und Cobalaminanaloge. Diese werden auf 200 cm3 mit Cyanursäure behandeltem Amberlite IRA 401 adsorbiert und von diesem Harz mit einer 5% gen wässerigen Essigsäurelösung eluiert.
In dieser Stufe tritt kein Aktivitätsverlust ein. Nach der Extraktion mit Kresol und Tetrachlorkohlenstoff, Umfällen und Filtrieren mit Cellit wie vorstehend beschrieben wird der Niederschlag in Methanol gelöst, die Lösung auf 20 cm3 eingeengt, 48 Stunden bei 50C gelagert, filtriert und mit 25 cm3 Wasser behandelt.
Dann wird die Lösung auf 20 cm3 eingeengt und mit 70 cm3 Aceton versetzt.
Man erhält 129, 4 mg Kristalle mit einem Gehalt von 82,7 mg eines Gemisches von B und den beiden elektropositiven Cobalaminanalogen Bund C. Je 40 mg dieses Gemisches werden in 4 cm3 O. Sn- Essigsäure gelöst und in eine Kolonne zur Elektrophorese auf Papier nach Dellweg (a. a. O.) eingebracht.
Die Einrichtung wird 48 h lang einer EMF von 1000 V ausgesetzt, worauf die die elektropositiven Faktoren enthaltenden Schichten am Ende der Zellulosekolonne deutlich erkennbar sind. Dann wird der Strom abgeschaltet und werden die Schichten einzeln mit 0, 5n-Essigsäure eluiert.
Aus den vereinigten Lösungen aller Elektrophoreseverfahren werden nach den in Beispiel 1 beschriebenen Methoden die Cobalaminanaloge B und C mit Kresol extrahiert und aus Wasser und Aceton umkristallisiert. Man erhält nadelförmige Kristalle, die bei 370C unter Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet werden.
Aus der am stärksten elektropositiven Fraktion gewinnt man 26, 8 mg Kristalle (Gehalt 86, 5%). Die weniger elektropositive Fraktion wird erneut der Elektrophorese unterworfen, um die etwa noch darin enthaltenen kleineren Mengen des stärker elektropositiven Faktors zu beseitigen.
Schliesslich erhält man 39, 9 mg Kristalle von 83, 04%.