AT209494B - Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums 
 EMI1.1 
 

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 EMI2.1 
 

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   ZüchtungIn allen Fällen zeigen sowohl das wie oben erwähnt erhaltene als auch das weiter gereinigte Produkt stets die erwähnten biologischen Eigenschaften, wodurch die praktische Verwendbarkeit des Antibiotikums gegeben ist. 



   Das neue Antibiotikum ist eine stickstoffhaltige Verbindung mit saurem Charakter ; sie ist in Wasser kaum löslich, während das Natriumsalz wasserlöslich ist ; sie enthält keinen Schwefel. Sie ist sehr gut löslich in Chloroform und Äthylzellosolve, löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Pyridin, Dimethylformamid, kaum löslich in Azeton und Äthylazetat und unlöslich in Äther, Benzin und   Petroläther.   Mit konzentrierter Schwefelsäure entsteht eine rotbraune Farbe. Die Lösung von FI 1163 in Methanol zeigt Ultraviolett-Spektren mit drei Absorptionsspitzen bei den folgenden Wellenlängen : 290,304 und 318   IJ1. t,  
Das Infrarot-Absorptions-Spektrum in KBr ist in der angefügten Zeichnung dargestellt, in welcher die Ordinate die Prozentdurchlässigkeit und die Abszisse die Wellenlänge in   IJ   angeben. 



   Zur vollständigeren Charakterisierung des neuen Produktes werden nachfolgend die Rf-Werte angegeben, welche bei chromatographischen Untersuchungen auf Whatman-Papier   Nr. l   mit aufsteigender Entwicklung und bioautographischer Sichtbarmachung auf mit"Candida albicans"geimpften Platten erhalten wurden. 
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<tb> 
<tb> 



  Lösungsmittel-System <SEP> Rf
<tb> l. <SEP> Butanol-Essigsäure-Wasser <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 75
<tb> 2. <SEP> Benzol-Essigsäure-Wasser <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0,21
<tb> 3. <SEP> Butanol-Pyridin-Wasser <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0,60
<tb> 4. <SEP> Butanol, <SEP> gesättigt <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> + <SEP> 2%
<tb> Ammoniumhydrat <SEP> 0,06
<tb> 
 
FI 1163 im festen Zustand ist sehr stabil, insbesondere in Abwesenheit von Licht und Luft. 



   Die neutralen wässerigen Lösungen behalten, wenn sie bei   +5 C   gelagert werden, ihre Aktivität mehrere Tage lang unverändert bei. Bei Aufbewahrung der gleichen Lösungen bei Zimmertemperatur nimmt jedoch die   Aktivität   rasch ab. 



   Wie aus den oben erwähnten Eigenschaften hervorgeht, gehört die erfindungsgemäss gefundene Substanz zur Gruppe der mehrfach ungesättigten Antibiotika mit einem tetraenischen Chromophor. Die ersten beiden Vertreter dieser Gruppe wurden 1951 beschrieben, nämlich   Nistatin (E. L.   Hazen und R. Brown, 
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 Terramycin hervorbringt) gewonnen werden. 



   Später wurde das Antimycetin (F. Raubitschek et al. Ibid. 2, 179   [1952])   beschrieben, eine Substanz, welche dem Nistatin sehr ähnlich ist und aus Streptomyces aureus gewonnen wird, und das Cromin, das durch Züchten eines Stammes   ähnlich   dem Streptomyces antibioticus (S.   Wakakietal. I. Antibiotics,   Japan, 5, 677   [1952])   gewonnen wird. 



   Ein tetraenisches Chromophor findet sich auch in Amphotericin A, das kürzlich durch Züchtung von Streptomyces M-4574 (J. Vandeputte et al. Antibiotics   Annual 1955-56, S. 587)   gewonnen wurde. 



   Die Art Streptomyces lucensis unterscheidet sich auf Grund ihrer morphologischen und Kultureigenschaften eindeutig von andern Arten, welche andere fungizide Antibiotika hervorbringen, insbesondere 
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   Die durch FI 1163 gebildete Substanz zeigt chemische und physikochemische Eigenschaften, welche ihre Unterscheidung von den erwähnten andern Substanzen ermöglichen. 



   Die fungizide Aktivität von FI 1163 wird durch die im folgenden angegebenen biologischen Eigenschaften der Substanz bestätigt. In der nachstehenden Tabelle werden die Daten angegeben, welche sich auf die antibiotische   Aktivität"in vitro"von FI   1163 beziehen. 



   Die Untersuchungen an Blastomycetes und Schizomycetes wurden auf einer mit Glukose versetzten Fleischbrühe durchgeführt. Diejenigen an den sogenannten Hyphomycetes wurden auf einem flüssigen   Sabouraud-Medium durchgeführt.    



   Die Messungen erfolgten nach 8 Tagen bei   30 C.   

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  Tabelle 
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<tb> 
<tb> Minimale <SEP> Inhibitioasdosis <SEP> (MID) <SEP> in <SEP> blglmi
<tb> l. <SEP> Actinomyces <SEP> boströmi <SEP> A <SEP> > <SEP> 100
<tb> 2. <SEP> Nocardia <SEP> asteroides <SEP> > <SEP> 100
<tb> 3. <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 4. <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> val. <SEP> 0,7
<tb> 5. <SEP> Debaryomyces <SEP> hudeloi <SEP> 0,7
<tb> 6. <SEP> iieoformans <SEP> 0. <SEP> 6
<tb> 7, <SEP> n <SEP> tyrocola <SEP> 8
<tb> 8. <SEP> " <SEP> marylandii <SEP> 2
<tb> 9."guillermondii <SEP> 3
<tb> 10."cannensis'0, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 11. <SEP> Torulopsis <SEP> neoformans <SEP> 0,3
<tb> 12. <SEP> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 2
<tb> 13. <SEP> Eremothecium <SEP> hashbyii <SEP> 25
<tb> 14. <SEP> Penicillium <SEP> sp. <SEP> 20
<tb> 15. <SEP> Aspergillus <SEP> sp. <SEP> (T) <SEP> 10
<tb> 16."niger <SEP> 20
<tb> 17.

   <SEP> Glenospora <SEP> graphii <SEP> 100
<tb> 18. <SEP> Glenosporella <SEP> dermatitidis <SEP> < <SEP> 10
<tb> 19. <SEP> Pseudomycoderma <SEP> matalense <SEP> 1
<tb> 20. <SEP> Trichophyton <SEP> faviforme <SEP> ochraceum <SEP> 30
<tb> 21. <SEP> " <SEP> maggini <SEP> 30
<tb> 22. <SEP> radians <SEP> 30
<tb> 23."rhodainii <SEP> 30 <SEP> 
<tb> 24, <SEP> n <SEP> plicatile <SEP> < <SEP> 10
<tb> 25. <SEP> mentagrophytes <SEP> 30
<tb> 26. <SEP> Epidermophyton <SEP> floccosum <SEP> < <SEP> 10
<tb> 27. <SEP> Sabouraudites <SEP> gypseus <SEP> < <SEP> 10
<tb> 28. <SEP> Histoplasma <SEP> Capsulatum <SEP> (Myceliumphase) <SEP> < <SEP> 10
<tb> 
 
Impfung : Etwa 1000 Zellen bei Blastomycetes und   Schizomycetes ; Bruchstücke   einer jungen Kultur bei den sogenannten Hyphomycetes.

   Es wurde ausserdem festgestellt, dass die Anwesenheit   von 1010   Serum im Kulturmedium nur eine schwache Veränderung von MID zur Folge hat. 



   Toxizität Die akute Toxizität von   FI 1163   ist gering. da die LD50, bestimmt an Ratten bei verschiedenartiger Verabreichung weit über den therapeutischen Dosen liegen. 



     Beispiel l :   Es werden 40 300 ml Erlenmeyer-Kolben bereitgestellt, die je 60 ml eines Mediums 
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 Kasein 5. Kalziumkarbonat 4, Ammoniumsulfat 1, Kaliumdiphosphat 0,1 (PH des Mediums : 6, 7). Diese Kolben werden 20 Minuten lang bei 1200C sterilisiert und dann je mit 0,2 ml einer Suspension von Sporen geimpft, welche aus einer 20 Tage alten Kultur durch Spülen mit 10 ml sterilem destillierten Wasser erhalten wurde. 



   Die Kolben werden bei 200C gehalten und durch wechselnde Rotationsbewegung mit 220   Umdr/min   während 60 Stunden gerührt. 



   Wie aus den folgenden Angaben hervorgeht, erreicht die Aktivität nach 40 Stunden ihren Maximalwert : 

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<tb> 
<tb> Fermentierungs- <SEP> PH <SEP> der <SEP> Kultur-Durchmesser <SEP> des <SEP> Hemmungsdauer <SEP> brühe <SEP> hofes <SEP> auf <SEP> Debar. <SEP> maryl. <SEP> 
<tb> 



  Stunden <SEP> (Agarschalen) <SEP> mm
<tb> 38 <SEP> 6,4 <SEP> 33
<tb> 41 <SEP> 6,6 <SEP> 34,5
<tb> 47 <SEP> 7,8 <SEP> 31,5
<tb> 54 <SEP> 7,8 <SEP> 30,25
<tb> 61 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 28 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI5.2 
 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> Dextrin <SEP> 20%
<tb> Getreidequellflüssigkeit <SEP> 3%
<tb> CaCO3 <SEP> 4%
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> (technisch) <SEP> lob
<tb> Kasein <SEP> 5%
<tb> K2HPO4 <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb> 
 
 EMI5.4 
 dem Nachwaschen dieses Behälters erhalten wurde.

   Es werden folgende Fermentierungsbedingungen eingehalten : 
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<tb> 
<tb> Rührung <SEP> 400 <SEP> Umdr/min
<tb> Belüftung <SEP> 1 <SEP> l/l/min
<tb> Temperatur <SEP> 270C
<tb> Dauer <SEP> 24 <SEP> Stunden
<tb> 
 
Für die Produktion wird ein 10 1-Fermentierungsgefässmit6000mleinesMediumsmitfolgender Zusammensetzung verwendet : 
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<tb> 
<tb> Saccharose <SEP> 20%
<tb> Dextrose <SEP> 100/0
<tb> Dextrin <SEP> 100/0
<tb> Getreidequellflüssigkeit <SEP> 10%
<tb> CaCOs <SEP> 4%
<tb> KHPO <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> (technisch) <SEP> 1%
<tb> Silikon <SEP> (flUssig) <SEP> 1%
<tb> 
 
 EMI5.7 
 den separat während 20 Minuten bei 1200C sterilisiert. Nach der Sterilisation beträgt der PH 7, 04. Das Medium wird mit 2, 5% eines 24 Stunden alten vegetativen Mycels geimpft. 



   Es werden folgende Fermentierungsbedingungen eingehalten : 
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<tb> 
<tb> Rührung <SEP> 450 <SEP> Umdr/min
<tb> Belüftung <SEP> 11/1/min
<tb> Temperatur <SEP> 270C
<tb> 
 

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 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> Fermentierungsverlauf
<tb> Alter <SEP> PH <SEP> Gehalt <SEP>  g/ml
<tb> Beginn <SEP> 7, <SEP> 0- <SEP> 
<tb> 24 <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> 200 <SEP> 
<tb> 48 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 580
<tb> 55 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 1020
<tb> 
   Beispiel 3 :   Die Fermentierung wird gleich durchgeführt wie im vorhergehenden Beispiel, wobei man aber als Medium für die Produktionsstufe ein solches mit der gleichen Zusammensetzung wie bei der vegetativen Stufe verwendet. 



  Maximaler Gehalt : 280   ug/ml   nach 48 Stunden. 



   Beispiel 4 : Die Fermentierung wird gleich durchgeführt wie im Beispiel 2 und 3, wobei man an
Stelle des Mediums der Produktionsstufe ein solches von folgender Zusammensetzung verwendet : 
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<tb> 
<tb> Saccharose <SEP> 20%
<tb> Dextrose <SEP> 10%
<tb> 0 <SEP> NaCl <SEP> 3%
<tb> (NHSC4 <SEP> (technisch) <SEP> 20% <SEP> 
<tb> CaCOs <SEP> 10%
<tb> Silikon <SEP> (flüssig) <SEP> 1%
<tb> 
 
Maximaler Gehalt   : 230/lg/ml   nach 24 Stunden. 



  Beispiel 5: Die Fermentierung erfolgt gleich wie in den Beispielen 2, 3 und 4, wobei man in der
Produktionsstufe. ein Medium mit der folgenden Zusammensetzung verwendet : 
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<tb> 
<tb> Dextrose <SEP> 200/o
<tb> Nach <SEP> 3% <SEP> 
<tb> Getreidequellflüssigkeit <SEP> 20%
<tb> (NH4)2SO4(technisch) <SEP> 3%
<tb> CaCO3 <SEP> 10%
<tb> Silikon <SEP> (flüssig) <SEP> 1%
<tb> 
 
Maximaler   Gehalt : 170/lg (ml   nach 24 Stunden. 



   Beispiel 6 : 18 1 einer gemäss Beispiels erhaltenen Kulturbrühe werden mit Supercel als Hilfsstoff filtriert. Das erhaltene Mycel wird durch Rühren mit 3 Portionen n-Butylalkohol extrahiert, welche 2,5 und nochmal 5 1 umfassen. Die filtrierte Brühe   (17,   11) wird mit 3 Portionen Butanol extrahiert (Gesamtmenge 6,6   1).   Sämtliche Auszüge werden vereinigt und mit Wasser (2 l) gewaschen und dann unter Vakuum bei einer Temperatur unterhalb   400C   eingedampft. Aus der erhaltenen konzentrierten Flüssigkeit wird das Antibiotikum durch Zusatz von Petroläther ausgefällt. Ausbeute 16,6 g. 



   Beispiel 7 : 128 g rohes Antibiotikum, welches nach einem Verfahren ähnlich demjenigen von Beispiel 6 erhalten wurde, werden in 1250 ml einer gesättigten Natriumbikarbonatlösung gelöst. Diese Operation erfolgt unter Durchleiten eines Stickstoffstromes durch die Flüssigkeit. 



   Nach Verdünnen mit einem gleichen Volumen zentrifugiert man die Suspension und stellt den PHWert der erhaltenen braunen Lösung durch Zugabe von 6-n Salzsäure auf 4,5. 



   Das Antibiotikum, welches als freie Säure ausfällt, wird durch Zentrifugieren abgetrennt und getrocknet. Ausbeute : 95 g. 

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE : l. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums mit fungizider Wirkung durch Züchtung von Streptomyceten in einem Nährmedium, welches assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sowie Salze enthält, und nachfolgende Isolierung des fungiziden Antibiotikums, vorzugsweise durch Extraktion mit Lösungsmitteln, wie Alkoholen, Chloroform, wässerigen Alkoholen und wässerigem Azeton aus dem Zuchtmedium bzw. dem Mycel, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces lucensis (Registriernummer 3783 der Rutgers University. New Brunswick, N.

   J.) oder ein durch Mutation davon abgeleiteter Stamm <Desc/Clms Page number 7> vorzugsweise unter Belüftung und Rührung bei einer Temperatur zwischen 24 und 300C 2 - 6 Tage lang gezüchtet und anschliessend das in der Kulturflüssigkeit und im Mycel enthaltende Antibiotikum nach an sich bekannten Methoden isoliert wird.

   2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man das neue Antibiotikum aus seinen neutralen oder schwach alkalischen wässerigen Lösungen gewinnt, indem man den pH-Wert auf 3 - 6 stellt und den erhaltenen Niederschlag abtrennt.