DE2100918A1 - - Google Patents

Description

DR.-ING. RICHARD GLAWE

MDNCHEN

PAtENTANWAL¹TE DIPL-ING. KLAUS DELFS · DIPL-PHYS. DR. WALTER WOLL HAMBURG MÖNCHEN

210051'»

8000 München 22 · UebherrstraBe 20 ■ Tel. (0811) 22 «5 48 2000 Hamburg 52 · Walzstraße 12 ■ Tel. (0411) 8722 55

IHR ZEICHEN IHRE NACHRICHT VOM

a 7 MÖNCHEN 8. Januar 1971

BETRIFFT:

Prof.Dr. Nera BELLAVITA, geb. CAGNOLI Perugia/ Italien

"Glycoside und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Ein erster Gegenstand der Erfindung ist ein antibiotisches (antibakterielles und antiraykotiaches) Produkt, das aus der Hauptmenge von Verbindungen besteht, die als äthanolischer Gesamtextrakt einer besonderen Fungus-Art vorliegen.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind die einzelnen Verbindungen, die selektiv als antibakterielle und/oder anti-

109820/1950

POSTSCHECK. HAMBURG H7i 07 · BANKi COMMERZBANK, HAMBURG, 53/22904 · TELEGR.ι SPECHTZIES HAMBURG bzw. SPECHTZIES MÖNCHEN

210091a

mykotische Produkte angewandt und für die Umwandlung zu antibakteriellen und/oder antimykotischen Produkten verwendet werden können.

Ein anderes Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des äthanolischen Gesamtextraktes und der Herstellung von mehreren Verbindungen, die in dem erwähnten Extrakt zugegen sind.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind Verfahren zur Umwandlung von zumindest einer, einen Teil des Gesamtextraktes ausmachenden Verbindungen zu einer verschiedenartigen Verbindung, die noch in dem erwähnten Gesamtextrakt enthalten ist.

Es ist ein Ziel der Erfindung, neue Antibiotika mit einer hohen antibakteriellen und/oder antimykotischen Wirkung durch industriell ökonomische, bequeme Verfahren zu erhalten.

Diese und andere Ziele ergeben sich für den Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung.

Die Erfindung betrifft eines oder mehrere Glycoside (die nachstehend als Glycoside A, B, C, D, E, F, G, H bezeichnet

109829/1950

werden) mit der allgemeinen Formel a)

0CH2

OH H

in welcher R Wasserstoff oder Hydroxyl und X eine Carboxyl-Gruppe (COOH) oder eine -CH-OH-Gruppe sein kann, der Formel b)

worin R die gleiche Bedeutung wie oben besitzt und Y -CHO oder -CH₂OH ist, mit der Ausnahme, daß in dem Fall, wo

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Y eine -CHgOH-Gruppe ist, R Wasserstoff bedeutet, und der Formel c)

CH2OH OCHi

OH H

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung :

a) den gesamt-äthanolischen Extrakt der Pilzkultur von Oospora Virescens (Link) Wallr; ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine antibiotische Aktivität;

b) neue, aus dem gesamt-äthanolischen Extrakt der Pilzkultur abtrennbare Glycoside; Verfahren zur Abtrennung derselben und deren antibiotische Aktivität;

c) insbesondere zwei dieser Glycoside (D und E) mit ausgeprägter antxmykotischer Aktivität und deren halbsynthetische Herstellung unter Verwendung der Glycoside A, B, P, G.

In den Zeichnungen zeigen Fig.l bis Fig.8 die IR-Spektra der Glycoside, die in der Beschreibung mit den Buchstaben

A bis H bezeichnet sind;

109829/1950 . _R .

Fig.9 zeigt eine Dünnschicht-Chromatographie der acht abgetrennten Glycoside.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß man aus den Pilzkulturen von Oospora Virescens (Link) Wallr einen gesamt-äthanolischen Extrakt mit einer ausgeprägten antibiotischen Aktivität erhalten kann, aus welchem acht Stoffwechselprodukte von glycosidischer Natur isoliert wurden, die nachstehend durch die Buchstaben A bis H bezeichnet werden:

Tabelle I

Chemische und physikalische Eigenschaften der Glycoside

A bis H

	Summen-
	Formel
A	C26H42°8
B	C26H42O7
C	C26H4O°7
D	C26H38°6
E	C26H38°7
F	C26H4O°9
G	C26H4O°8
H	C26H4O°6

Fp.

M⁺

(Molekularionen)

IR

130°
110°
l6O-2⁽

188-19O⁽

192-194⁽

17O-2⁽

-42,7°	-	Fig.l
-32,3°	-	Fig. 2
-71,4°	-	Fig. 3
123°	446	Fig. 4
113°	462	Fig. 5
-82,3°	-	Fig.6
-85,2°	-	Fig. 7
149°	448	Fig. 8

Die erwähnten Stoffwechselprodukte haben die folgenden Struktur-Formeln :

109829/1950

Glycosid A R = OH

Glycosid BR=H

CH₂OH O C H₂

Glycosid C

OCH

Givcosid E R-OH
Glycosid Ü R " H

on ι: L Yl

on i:

Glycosid H

Glycosid FR=- GH
GI vcosid G R - H

Ό O CD

mm 7 mm

Gemäß einem ersten Basisgegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft diese daher einen äthanolischen Gesamtextrakt, d.h., eine Mischling der acht Glycoside A bis H, erhalten durch Extraktion mit heißem Äthanol aus der gefriergetrockneten Kultur von Oospora Virescens (Link) Wallr.

Gemäß einem anderen Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft diese einige der Glycoside (D und E), die antibiotische Wirkung (d.h. antibakterielle und gleichfalls antimykotische Wirkungen) aufweisen und die auf direktem Wege durch chromatographische Reinigung des Gesamtextraktes erhalten werden.

Gemäß einem anderen Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft diese zwei der Glycoside (P und G) mit antimykotischer Wirkung insbesondere gegen Cryptococcus Neoformans, die als Natriumsalze durch Kristallisation aus dem äthanolischen Extrakt der gefriergetrockneten Kultur von Oospora Virescens und anschließendem Ansäuern ihrer wässerigen Lösung und chromatographischer Reinigung erhalten werden. Daneben können sie als Zwischenverbxndung für die Gewinnung anderer antibiotischer Glycoside (D und E) verwendet werden.

Gemäß einem anderen Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft diese zwei Glycoside (A und B) mit antimykotischer Wirkung, die durch äthanolische Extraktion aus der gefriergetrockneten Kultur von Oospora Virescens (Link) Wallr und

109829/19 50 " ⁸ "

anschließender chromatographischer Reinigung erhalten werden; daneben können sie als Zwischenverbindungen für die Gewinnung anderer antibiotischer Glycoside (D und E) verwendet werden.

Gemäß einem weiteren Gegenstand der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Herstellung der erwähnten acht glycosidisehen Substanzen, das die Herstellung und die Züchtung einer Kultur von Oospora Virescens (Link) Wallr, die Gefriertrocknung der Kultur, die Extraktion und das Trocknen der in Äthylalkohol löslichen Glycoside umfaßt.

Für die Abtrennung der Glycoside A bis H wird eine Chromatographier-Säule mit Kieselgel verwendet.

Gemäß einem anderen Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Herstellung der erwähnten glycosidischen Substanzen, das die Herstellung und die Züchtung einer Kultur von "Oospora Virescens" (Link) Wallr, die Gefriertrocknung der Kultur, die Extraktion der in Äthylalkohol löslichen Glycoside, die Ausfällung durch Abkühlen der Natriumsalze (von P und G), deren Ansäuern zur Entfernung von Natrium und die chromatographische Reinigung umfaßt.

Gemäß einem anderen Gegenstand der vorliegenden Erfindung sieht diese vor, daß die Glycoside (A und B), die in dem

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äthanolischen Extrakt in hohen Konzentrationen vorhanden sind, einer Oxydo-Eliminierung unterworfen werden können, um diese in aktive Glycoside (D und E) umzuwandeln.

Gemäß einem anderen Gegenstand betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glycosiden, nach welchem die Glycoside (P und G) aus dem äthanolischen Extrakt als Natriumsalze auskristallisiert, angesäuert und λ chromatographisch abgetrennt, und dann einer Reduktion unterworfen werden, um die in Äthanol löslichen Glycoside (A und B) zu erhalten; diese letzteren werden chromatographisch isoliert und einer Oxydo-Eliminierung unterworfen, um die Glycoside D und E zu erhalten.

Die antimykotische Aktivität der vorerwähnten Glycoside wird in der nachstehenden Tabelle II gezeigt:

- 10 109829/1950

Tabelle II

,, . Minimale inhibierende Konzentration in ug/ml Versuchs-

Organismen

BCDEPGH

Trichophyton _{25 12 5} rubrum '

Candida _{100 100}

albicans

Cryptococcus _{0 l8 0 ?8} neoformans ' "

⁰I

Histplasma CAPSULATUM

Aspergillus fumigatus

ο Aspergillus
flavus

^MU? ⁵° ⁵° ⁵° ¹²'⁵ " ¹⁰° ¹⁰° ⁵°

^{12j5 25 5}° ¹²'^{5 25 10}° ⁵° ⁵°

Epidermophyton _{5Q 3 12 25 25 50 100 50 100} floccosum

¹²'^{5 3}'^{12 25 25 50 5}° ⁵° ⁵°

12	,5	25	25 04	100	56	25	,18	50	100918
50 6	,25	6, 0,		100 1,		50 0		100 50
12	,5	50

Alle Verbindungen A bis H besitzen ein breites antimykotisches Spektrum, und inhibieren das Wachstum von pathogenen Sproßpilzen (C. albicans, Crypt. neoformans etc.), von Hautpilzen (M. canis, E. floccosum, T. rubrum etc.) und von möglicherweise pathogenen Saprophyten wie A. fumigatus und A. flavus.

Im allgemeinen sind die Produkte A, B, C, P, G, H besonders gegen Cryptococcus neoformans wirksam.

Die Produkte D und E besitzen jedoch die stärkste Antipilz-Aktivität.

Im allgemeinen ist das Produkt D wirksamer als das Produkt E gegenüber fadenförmigen Pilzen, insofern, als seine Aktivität bei, gegenüber dem anderen, niedrigeren Konzentrationen vorhanden ist.

Das Produkt E ist insbesondere aktiver gegen gewisse pathogene Sproßpilze (vor allem Cryptococeus neoformans), wobei es sogar bei extrem niedrigen Konzentrationen wirksam ist.

Die Antipilz-Aktivität wurde in vitro auf einem Flüssig-Nährboden nach Sabouraud plus Chloramphenicol (0,5 Z>) bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt.

- 12 -

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Zwei der acht Glycoside (D und E) zeigen ein breites Aktivitätsspektrum sowohl in vitro und in vivo, indem sie das Wachstum von menschlichen und tierischen Pilz-Parasiten inhibieren; daher sind diese Produkte biologisch interessanter.

Die sehr niedrige Toxizität der Glycoside D und E ist von besonderem Interesse.

Der LDp-Q-Wert von D bei der Maus betrug 250 mg/kg

bei subkutaner Verabreichung.

Der LDcQ-Wert von E bei der Maus betrug 250 mg/kg

bei subkutaner Verabreichung.

Die Verbindungen D und E wurden bei Menschen und Tieren bei der äußerlichen Therapie am besten in Form von Pudern oder Tinkturen oder Salben verabreicht mit einem Gehalt von 500 mg an aktiver Substanz.

Die Salbe enthielt als Träger Lanolin oder Fettsäuren (z.B. Undecyl- und Caprylsäure).

Außerdem können die Verbindungen D und E an Menschen und Tiere in Tagesdosen von mehreren Gramm ohne irgendwelche ungünstige Wirkungen verabreicht werden.

Die Tabletten und Kapseln, welche nach wohlbekannten Verfahren hergestellt werden, enthalten 70 mg aktive Substanzen, 25 mg Ascorbinsäure und 3 mg Kaliummetabisulfit.

109829/1950 ~¹³"

Das neue Glycosid D kann gegen verschiedenartige Hautmykosen, die durch Dermatophyten verursacht werden (Alopezie, Ekzem, Herpes, Herpes tonsurans, Herpes favus) und Histoplasmose verwendet werden.

Das neue Glycosid E kann in der Therapie von besonderen Infektionen angewandt werden, die heute gewöhnlich als Candidiase oder Moniliase (Soor) und Cryptococcose bezeichnet werden.

Außerdem sind die Glycoside D und E besonders interessant, da sie auf einen weiten Bereich von Dermatophyten und patogenen Sproßpilzen, einschließlich Candida albicans, formalerweise als Monilia albicans bekannt, reagieren, die, soweit bisher bekannt, gegenüber jeder Antipilz-Therapie resistent war.

Die Stoffwechselprodukte D und E besitzen ebenso die Eigenschaft, in vitro das Wachstum von Gram-positiven und Gramnegativen Bakterien, wie z.B. von Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli zu inhibieren.

- 14 109829/1950

21QÜ918

Tabelle III

Antibakterielles	Spektrum von	D und E
Organismus	MICx)	mcg/ml
	Glycosid D	Glycosid E
Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Escherichia coli	4 3 10	5 5 15

' MIC = Minimale inhibierende Konzentration.

Der alkoholische Gesamtextrakt, welcher eine

= 500 mg/kg (subkutan)

= 500 mg/kg (intraperitoneal) aufweist, zeigt in vitro eine ausgeprägte antimykotische und antibakterielle Aktivität gegen die vorerwähnt aufgeführten Mittel.

Für die Durchführung der Untersuchung, die das Ziel der vorliegenden Arbeit war, wurde ein Stamm von Oospora Virescens (Link) Wallr Deuteromyceten der Gattung Moniliaceae verwendet, der außergewöhnlich selten natürlich vorkommt und von abgestorbenen Zweigen des Maulbeerbaumes isoliert und der sich nach Zuchtwahl in Agar-Malz aus einer Gruppe von den anderen deutlich durch raschere und intensivere Sporulation unterschied.

109829/1950 ~ ¹⁵ ~

Kulturelle, morphologische und physiologische Eigenschaften der Pilze

Auf organischen, festen oder flüssigen, auf Malz basierenden Nährmedien und auf pflanzlichen Auszügen, mit oder ohne Glucose (Weizenkörnern, oder Getreidekörnern oder Haferkörnern oder Möhren oder französischen Bohnen, etc.) sind die Pilz-Kolonien rund mit einem leicht gekrümmten Umfang zunächst flach und weiß und dann allmählich erhaben; sie verändern sich mit dem Grad der Entwicklung und werden grün, und mit zunehmendem Alter dunkelgrün mit olivenfarbigem Ton und samtartigem Aussehen.

Die grüne Farbe rührt von der Sporen-tragenden Farbschicht her und ist intensiver, wenn die Sporenbildung reichlich ist.

Das vegetative Mycel besteht aus durchsichtigen, verzweigten, durch eine Wand getrennte Hyphen, ungefähr 2,5 μ breit, das zahlreiche Conidiophoren versorgt, welche reichlich verkettete Sporen tragen, erzeugt in basipetaler Aufeinanderfolge in sehr langen gewundenen Ketten.

Die Konidienfäden sind einfach, durchsichtig, aufrecht oder gebogen, 30 bis ΊΟ μ lang, an der Basis leicht gequollen und gegen das Ende zu enger werdend.

Die Sporen sind spindelförmig, glatt, etwa 7 bis 8 μ lang 109829/1950 -16-

und 2,5 bis 3 μ breit, von grüner oder olivgrüner Farbe in der Hauptmenge.

Auf den vorerwähnten Medien erzeugt der Pilz oftmals ein diffusionsfähiges braunes Pigment_v

Auf synthetischen Medien (Czapek, Veindeling) wächst der Pilz schlecht ohne Befruchtung.

Das Wachstum von Oospora Virescens ist langsam bei einer Temperatur von 1O⁰C, am besten bei 23 bis 25°C, wohingegen bei 30 C kein Wachstum beobachtet wurde.

In submersen Kulturen (magnetisch gerührte flüssige Medien) wächst der Pilz sehr langsam ohne Sporenbildung: die acht Glycoside A bis H werden nicht erzeugt.

Daher wird die Oberflächen-Methode bei stationären (d.h. nicht-geschüttelten) Kulturen in den nachfolgenden Beispielen angewandt:

Beispiel A (Stationäre Kulturen auf synthetischen flüssigen Medien)

1) Czapek's modifizierte Flüssigkeit (p_R-Wert 6 bis 6,5 nach Sterilisierung)

- 17 109829/1950

ι ε

7H₂O 0,5 g

KCl 0,5 g

FeSO₄ 0,01 g

NaNO 2 g

Glucose 20 g

deionisiertes Wasser ad 1 Liter

2) Veindeling's Flüssigkeit (p_R-Wert 4,5 bis nach Sterilisation)

NH₁₁OCO(CHCH)₂COONh. 2 g

KH₂PO₄ Ig

MgSO₄.7H₂O Ig

Glucose 25 g

Mikro-Elem.-Lsg. 1 ml

deionisiertes Wasser ad 1 Liter.

Die Züchtungsmedien werden nach Aufteilung (150 ml/Flasche) in 1000 ml-Roux-Flaschen und Sterilisation während 3 bis 4 Minuten bei einem Druck von 1,69 kg/cm (24 psi) mit 2 ml einer sterilen, wässerigen Suspension, reich an Sporen, hergestellt aus gut-sporenbildenden, 20 bis 40 Tage alten Kulturen von 0. virescens, auf Hafer-Agar-Schrägkulturen, geimpft .

Nach der Impfung wird der Pilz in stationärer Kultur bei

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210(1918

.Raumtemperatur von 23 bis 25°C im Tageslicht gezüchtet.

Auf den vorerwähnten Medien (1 und 2) wächst der Pilz schlecht und bildet keine Sporen; die Stoffwechselprodukte A bis H werden nicht erzeugt.

Beispiel B

(Stationäre Kulturen auf organischen, flüssigen Medien ohne

Glucose)

Flüssige Auszüge (in deionisiertem Wasser) von:

1) Möhren (250 g/l Liter; p^-Wert etwa 6 nach d. Sterilisatior.

2) Weizenkörner (150 g/l Liter; p_H~Wert etwa 6 nach d. " " )

3) Kornkörner (200 g/l Liter;p_R-Wert etwa 6,4 nach d. " " )

4) Französische Bohnen-Samen

(100 g/l Liter;p_H-Wert 6,2 nach d. " " )

5) Erbsen-Samen (100 g/l Liter;p_H-Wert etwa 6 nach d. " " )

6) Linsen-Samen (100 g/l Liter; p_H"-Wert etwa 6 nach d. " " )

7) Kartoffel (200 g/l Liter; p_H-Wert etwa 5,5 nach d. " " )

Die Medien werden verteilt, im Autoklav behandelt, geimpft und wie in Beispiel A kultiviert.

Das vegetative Wachstum ist mehr oder weniger reichlich und die Sporenbildung gut oder gemäßigt; Stoffwechselprodukte A bis H werden nicht erzeugt.

- 19 109829/1950

Beispiel C

(Stationäre Kulturen auf organischen, flüssigen Medien mit

Zuckern)

Bouillons (in Leitungswasser) von:

1) Malzextrakt (Pulver) (15 g/l LiterjBe l,6;p_H-Wert etwa 6 nach St.)

2) Glucose (2%) HefeextraktO g/l Liter;p_H~Wert etwa 7,8 nach St.)

Glucose (230 Auszüge, hergestellt wie in Beispiel B (1-7)» von:

3) Möhren (p_R-Wert etwa 5,5 nach St.);

4) Weizenkörner (p„-Wert etwa 5»8 nach St.);

5) Kornkörner (p_H~Wert etwa 5,5 nach St.);

6) FRanzösisehe Bohnen-Samen (p_H-Wert etwa 6 nach St.);

7) Erbsen-Samen (p„-Wert etwa 5,8 nach St.);

Ii

8) Linsen-Samen (p_H~Wert etwa 6 nach St.);

9) Kartoffel (p_H~Wert etwa 5»5 nach St.);

Db Medien wurden aufgeteilt, im Autoklav behandelt, geimpft und wie in Beispiel A kultiviert.

Das vegetative Wachstum und die Sporenbildung waren sehr stark und reichlich auf Medien von Malz (1), Glucose-Möhre (3), Glucose-Weizen (4) und Glucose-Korn (5).

Das Wachstum ist gut, jedoch mit schlechter Sporenbildung auf Medien von Glucose-Hefe (2), Glucose-französische Bohnen (6), Qlucose-Erbsen (7), Glucose-Linsen (8), Glucose-Kartoffel (9).

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In den oben erwähnten Medien, jedoch insbesondere in den Medien von Malz, Möhre, Korn und Weizen, mit Ausnahme von Kartoffel, erzeugt der Pilz die Stoffwechselprodukte A, B, C, P, G innerhalb von 10 bis 30 Wachsturnstagen.

Beispiel D

(Stationäre Kulturen auf organischen flüssigen Glucose-Medien bei verschiedenen p_H-Werten)

Die Medien von Glucose-Möhre und Glucose-Korn (wie in Beispiel C, 3), 5), welche sich als die besten für die Entwicklung des Pilzes und der Erzeugung gewisser Stoffwechselprodukte erwiesen, wurden nach der Sterilisation auf die folgenden p„-Werte eingestellt:

1) a-Glucose-Möhre-Auszug, ρ -Wert etwa 5

Il It Il

c- " " " " " " 8,6 bis 8,8 ψ 2) a-Glucose-Kornkörner-Auszug, p_H-Wert etwa 5

Jj_ Il Il Il Il Il Il η

c- " " " " " " 8,6 bis 8,8

Die Medien werden wie in Beispiel A hergestellt, geimpft und kultiviert.

Ganz allgemein hielt sich in l)a, l)b und 2)a, 2)b der anfängliche p_H~Wert der eingestellten Medien, unabhängig von der Anwesenheit eines Pilzes, konstant, wohingegen sich der

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jj in l)c und 2)c langsam, innerhalb von 50 Stunden, gegen neutrale Werte hin änderte.

Nach einer Inkubationszeit von 20 bis 30 Tagen ist in den Medien l)a und 2)a die Assimilation von Glucose langsam und der anfängliche p^-Wert steigt auf neutrale Werte.

In den Medien l)b, l)c und 2)b₉ 2)c ist die Assimilation der Glucose schneller und die Reaktion des Mediums geht gegen

einen p^-Wert von 9·

In den Medien l)b, l)c und 2)b, 2)c ist das Wachstum und die Sporenbildung rascher und reichlicher.

In den Medien l)c und 2)c werden nach einer Inkubationszeit von 15 Tagen die Stoffwechselprodukte A, B, C, F, G erzeugt; nach 30 Tagen ebenso die Stoffwechselprodukte D, E und H.

Lediglich l)c ist das beste Medium für die Herstellung von D und E.

Extraktion, Abtrennung und Reinigung der Stoffwechselprodukte

Extraktion und chromatographische Abtrennung: 3 Liter von Oospora Virescens (Link) Wallr-Pilzkulturen werden gefriergetrocknet und im Soxhlet mit Äthanol extrahiert. Aus dem äthanolischen Extrakt wird beim langsamen Abkühlen P und Q unter Bildung der Natriumsalze ausgefällt; der

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äthanolische Extrakt, filtriert und im Vakuum getrocknet, wird auf eine Säule von Silicagel (Kieselgel 0,05 bis 0,2 mm, Merck) aufgegeben und das Chromatogramm mit einer Mischung von Chloroform-Methanol entwickelt.

Fraktionen mit einem Gehalt an Glycosid D von 250 mg werden zuerst eluiert und anschließend in der nachfolgenden Reihenfolge : C 50 mg, H 300 mg, E 300 mg, B 2000 mg, A 4000 mg.

Die wässerige Lösung der Natriumsalze von P und G von 5000 mg werden mit η-Salzsäure angesäuert und liefern P und G, die über einer chromatographischen Säule gereinigt werden, wobei das Elutionsmittel Chloroform-Methanol ist.

Unter Idealbedingungen für das Pilzwachstum ist die Erzeugung der Stoffwechselprodukte D und E stets begrenzt.

™ Eine weitere Entwicklung der vorliegenden Entwicklung besteht in der halb-synthetischen Herstellung der Stoffwechselprodukte D und E, wobei man von den am reichlichsten vorhandenen Produkten B, G bzw. A, P ausgeht.

Halb-synthetische Herstellung von D

1) Das Stoffwechselprodukt B ergibt nach Tritylierung, Acetylierung, Detritylierung, OxydoelxBxnierung mit Doering's Reagens und anschließender Deacetyliening mit Natriummethoxyd

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in Methanol 50 % Ausbeute an D.

2) Das Stoffwechselprodukt G liefert nach Reduktion mit LiAlIK und anschließender Behandlung wie in (1) D.

Halb-synthetische Herstellung von E

1) Das Stoffwechselprodukt A gibt nach Tritylierung, Acetylierung, Detritylierung, Oxydoeliminierung mit Doering's Reagens und anschließender Deacetylierung mit Natriummethoxyd in Methanol E in ^O^-iger Ausbeute.

2) Das Stoffwechselprodukt F liefert nach Reduktion mit LiAlH₁^ und anschließender Behandlung wie in (1) E.

Experimenteller Teil

Herstellung des Kulturmediums für Züchtung und Sporenbildung von fungus Oospora Virescens (Link) Wallr

(Beispiel D, Ic)

Das Medium wird mit Möhren-Auszügen in deionisiertem Wasser (250 g/Liter) im Autoklaven bei einer Temperatur von etwa 120 C während 2 bis 3 Minuten erhalten. Der Auszug wird unter Verwendung von Baumwolle filtriert, mit Glucose (2%) angereichert und auf 3000 ml-Lepin-Flaschen (300 ml/Flasche)(mit rechtwinkeligem Schnitt) verteilt und im Autoklav bei einer Temperatur von 120° etwa 3 bis 4 Minuten behandelt. Nach Abkühlen wird das Medium auf einen p_H~Wert von 8,6 bis 8,8 mit steriler, n-Natriumhydroxyd-Lösung eingestellt und

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- 2k -

mit 5 ml einer sterilen wässerigen Suspension mit reichlich Sporen geimpft; die Impf- und Kulturbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel A.

Das Wachstum und die Sporenbildung sind lebhaft und reichlich. Nach 15-tägiger Inkubationszeit werden die antibiotischen Stoffwechselprodukte A, B, C, P, G erzeugt; nach 30 Tagen die Stoffwechselprodukte D, E, H.

Die Glycoside A bis H sind sowohl im Mycel als auch in der Fermentationsflüssigkeit enthalten.

Reinigung des äthanolischen Gesamtextraktes 3 Liter einer gefriergetrockneten Kultur (D, l)c) (10 Lepin-Flaschen), werden im Soxhlet vollständig mit Äthanol extrahiert und auf 2/3 konzentriert; nach langsamem Abkühlen kristallisieren 5 g Natriumsalze von F und G aus; die Mischung wird filtriert und im Vakuum zur Trockene (12 g) eingedampft. Der rohe Extrakt (12 g), der die Stoffwechselprodukte A, B, C, D, E, H enthält, wird an einer Säule von 250 g Silicagel (Kieselgel G 0,05 bis 0,2 mm Merck) chromatographiert. Die Säule wird mit einer Mischung von Chloroform-Methanol (93 : 7) eluiert. Es werden nacheinander eluiert:

- 25 -

103623/1050

D - 250 mg : löslich in Äthanol, Methanol, chloroform, Äthylacetat; es fällt aus Lösungen von Äthylacetat amorph aus.
Co]p° = -123° (C = 0,96; Methanol);

^C26^H38°6^{(M+ = 446)}

Ultraviolett-Spektrum bei 258 mu (E = 6000;

Äthanol)

Das Infrarot-Spektrum zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm , bei der Untersuchung in einer KBr-Scheibe: 3401, 3077, 2959, 2924, 2899, 2874, 2833, 2817, 1681, 1639, 1471, 146O, 1439, 1429, 1383, 1370, 1344, 1325, 1292, 1274, 1221, 1178, 1138, 1091, 1047, 1015, 1000, 961, 952, 930, 909, 893,

885, 868, 856, 826, 813.

Dünnschicht-Chromatographie³^: R^. = 0,65,

purpurfarbener Fleck.

C - 50 mg : löslich in Äthanol, Methanol, Chloroform,

kristallisierbar aus Äthylacetat, Pp. I6O-I62⁰. [a]j*° = -71,4° (c s 0,98; Methanol); C₂₆H₁₁₀O₇. Das Ultraviolett-Spektrum zeigt keine Absorptions-Maxima zwischen 220 bis 400 my.

Das Infrarot-Spektrum zeigt Peaks bei den

-"1 folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm ,

bei der Untersuchung in einer KBr-Scheibe :

10ÖÖ29/i9BÖ

210U918

3584, 3401, 3086, 3058, 2976, 2950, 2907, .2865,

2825, 2801, 1709, 1681, 1667, 1639, 1490, 1471,

1460, 1449, 1439, 1425, 1412, 1387, 1364, 1342,

I33O, 1311, 1290, 1266, 1250, 1230, 1214, II76,

II56, 1143, II38, 1114, IIO5, 1095, IO72, IO26,

1008, 980, 963, 951, 945, 909, 886, 873,

869, 853, 839, 806, 749, 741.

χ)

Dünnschicht-Chromatographie ': R^ - 0,52, roter

Fleck.

H - 300 mg : löslich in Äthanol, Methanol, Chloroform,

kristallisierbar ausÄthanol, Pp. 170 bis 172°.
° = -149° (c = 0,72; Methanol);

^C26^H4O°6 ^(M+ =

Das Ultraviolett-Spektrum zeigt keine Absorptions

Maxima zwischen 220 bis 400 m\i.
Das Infrat-Spektrum zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm , bei der
Untersuchung in einer KBr-Scheibe: 3534, 3448,
3086, 3040, 2959, 295Ο, 2924, 2899, 2865, 2817, 1689, 168I, 1639, 1471, 1447, 1429, 1412, 138I, 1337, 1206, 1186, 1124, 1084, IO58, 1047, 1026, 1000, 921, 811, 790.

Dünnschicht-Chromatographie*).: R_f = 0,42,
purpurfarbener Fleck.

- 27 -100829/1050

E - 3QO mg ·: löslich in Äthanol, Methanol, Chloroform, Äthylacetat; es fällt aus einer Lösung von Äthylacetat/Petroläther amorph aus. [ct]p° = -113° (c = 0,97; Methanol);

Co<H,_öO„ (M⁺ =462) 2b 3o 7

Das Ultraviolett-Spektrum hat Absorptions-Maxima bei 258 my (E = 6000, Äthanol). Das Infrarot-Spektrum zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm , bei der Untersuchung in einer KBr-Scheibe : 3401, 3077, 2959, 2915, 2874, 2841, 2817, 1695, 1639, 1449, 1431, 1414, 1387, 1372, 1342, 1179, 1149, 1089·, IO58, 1000, 926, 910, 885, 862,

826.

Dünnschicht-Chromatographie*': R_f = 0,36, brauner Fleck.

B - 2000 mg: löslich in Äthanol, Methanol, Chloroform; es fällt aus einer Lösung von Äthylacetat amorph aus, Fp. bei etwa 110°. [a]p° = -32,3° (c= 1,05; Methanol); C₂₆H₄₂O₇.

Das Ultraviolett-Spektrum zeigte keine Absorptions-Maxima zwischen 220 bis 400 my. Das Infrarot-Spektrum zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm, bei der Untersuchung in einer KBr-Scheibe : 3401, 3086, 2924, 2874, 2817, 1639, 1447, 1425,

109829/19 60

- 28 -

1412, 1383, 1372, 1330, 129V 1285, ¹²⁶7» 1215, 1143, 1138, 1086, 1015, 1000, 966, 952, 909,

879, 856, 833, 830.

Dünnschicht-Chromatographie ' : R^ = 0,34, brauner Fleck.

A - 4000 mg: löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform; es fällt aus Aceton, Äthylacetat amorph aus;

Pp. bei etwa 130 .

[a]p° = -42,7° (c = 1,03 ; Methanol); ^C26^H42°8*

Das Ultraviolett-Spektrum zeigt keine Absorptions-Maxima zwischen 220 bis 400 πιμ.

Das Infrarot-Spektrum zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm , bei der Untersuchung in einer KBr-Scheibe: 3401, 3086, 2959, 2907, 2825, 1637, 1451, 1443, 1425, 1414, 1383,.1372, II56, II38, IO7O, 1010, 966, 941, 934, 909, 883, 832, 829, 782. Dünnschicht-Chromatographie ' : R„ = 0,16, grüner Fleck.

Dünnschicht-Chromatographie (Kieselgel H Fluka), 60 Minuten lang bei 110° aktiviert und mit Chloroform-Methanol-Mischung (85 : 15) eluiert; Entwicklung: Schwefelsäure bei 110° während 5 Minuten.

- 29 109829/19SÖ

Abtrennung der Produkte F und G

Die Zugabe von η-Salzsäure unter Rühren zu einer Lösung von 5 S der Natriumsalze von P und G in 200 ml Wasser ergibt F und G. Der durch Zentrifugieren erhaltene iiederschlag von etwa 4 g wird nach Trocknen im Vakuum an einer Chromatographier-Säule von 100 g (Orthokieselsäure/Celite 3:1), Chloroform-Methanol-Mischung (90:10) gereinigt: G und F werden nacheinander eluiert.

G - 1400 mg: löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform;

es fällt aus Äthanol amorph aus; Fp. 192 bis

194°.

[a]p° = -85,2° (c = 1,1; Methanol); ^C26^H4O°8

Das Ultraviolett-Spektrum zeigt keine Absorptions-Maxima zwischen 220 bis 400 mu. Das Infrarot-Spektrum des Carboxymethylesters von G zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm , bei der Untersuchung in einer KBr-Scheibe: 3425, 3086, 3003, 2959, 2950, 2933, 2924, 2865, 2849, 2833, 1745, 1639, 1468, 1449, 1437, 1412, 1383, 1350, 1299, I29O, 1220, 1142, IO95, 1086, IO78, IO56, 1046, 1011, 1010, 992, 943, 900, 881, 858, 847, 840, 806, 781.

- 30 109329/1960

Halb-synthetische Herstellung von D und E Herstellung von D

1 D) IgB wird mit 1 g Triphenylchlormethan und 4 ml Pyridin 72 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt; nachdem die Mischung auf O⁰C abgekühlt worden ist, werden 6 ml Pyridin und 6 ml Essiganhydrid zugegeben. Nach 24-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird die Mischung in Eiswasser gegossen und der Niederschlag gesammelt} das Rohprodukt wird an Silicagel (Kieselgel G 0,05 bis 0,2 mm, Merck) chromatographiert, mit Benzol-Äthylacetat (90:10) eluiert; nach Verdampfen des Lösungsmittels wird eine Ausbeute von 2,2 g an monotrityliertem und acetyliertem Produkt erhalten.

Die Detritylierung des Produktes wird durch Essigsäure (80£) bei 110 bewirkt; nach chromatographischer Abtrennung wird das erhaltene Tetraacetyl-Derivat (1,2 g) der Oxydo-Eliminierung mit Doering's Reagens (SO - Pyridin - DMSO und Triäthylamin) unterworfen und man erhält das Triacetyl-Derivat von D (0,9 g). Das letztere ergibt durch Deacetylierung mit 2 ml Natriummethoxyd in Methanol (1 g Natrium gelöst in 100 ml Methanol) während 15 Minuten bei 60°, gefolgt von einem Zeitraum von 45 Minuten, während welchem die Lösung Raumtemperatur erreicht, 500 mg der Verbindung D.

2 D) Ig der Verbindung G, gelöst in Tetrahydrofuran, wird zu 1 g LiAlH₄ im Verlaufe von 60 Minuten bei Raumtemperatur

109829/1950 _₃₂_

Dünnschicht-Chromatographie*' : R_f = 0,32, brauner Fleck.

P - 2000 mg: löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform;

es fällt aus Äthanol amorph aus; Fp. = 188 bis

190°.

^[a3D° ⁼ ~⁸²»³° ^{ic = 1}^¹⁵J Methanol); ^C26^HiJO°9

Das Ultraviolett-Spektrum zeigt keine Absorptions-Maxima zwischen 220 bis 400 m\i. Das Infrarot-Spektrum zeigt Peaks bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in cm , bei der Untersuchung in einer KBr-Scheibe: 3546, 3401, 3086, 2967, 2950, 2899, 2865, 2833, 2817, 1730, 1667, 1639, 1471, 1451, 1414, 1389, 1372, 1319, 1282, 1227, II52, II36, 1081, 1000, 961, 951, 934, 917, 893, 855, 826, 813. Dünns chi cht- Chromatographie ' : R^. = 0,18, grüner Fleck.

Dünnschicht-Chromatographie (Kieselgel H Fluka), aktiviert 60 Minuten lang bei 110° und eluiert mit Chloroform-Methanol-Essigsäure-Mischung (80:15:5); Entwicklung: Schwefelsäure 5035 bei 110° 5 Minuten lang.

- 31 109829/1950

zugegeben. Die Mischung wird in üblicher Weise behandelt und man erhält nach chromatographischer Reinigung 1 g der Verbindung B. Dieses Produkt liefert bei der Behandlung, wie sie unter (1) oben beschrieben ist, 500 mg der Verbindung D.

Herstellung von E

1 E) Ig der Verbindung A, behandelt wie in (ID) oben beschrieben, ergibt die Verbindung E (400 mg).

2 E) Ig der Verbindung F, behandelt wie in (2D) oben beschrieben, ergibt die Verbindung E (400 mg).

Bezugnahme auf die Beschreibung von D durch Ersatz von B durch A, G durch P und D durch E.

- 33 109029/1950

Claims (30)

1. Patentansprüche

   Verbindung der allgemeinen Formel

   OH- H

   in welcher R Wasserstoff oder Hydroxyl darstellt (Verbindungen A, B, F, G), der allgemeinen Formel

   in welcher R die gleiche Bedeutung wie oben besitzt und

   Y die Bedeutung von -CHO oder -CHpOH mit der Bedingung hat,

   daß, falls Y -CHpOH ist, R Wasserstoff bedeutet (Verbindungen D, E, H), und

   (Verbindung C)
2. 2. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

   (Verbindung G)

   OH H

   109829/1960
3. 3. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

   (Verbindung

   UH H
4. 4. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

   (Verbindung G)

   OH

   109829/1960
5. 5. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

   CHU tf

   vCHo ·«

   (Verbindung E)
6. 6. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

   (Verbindung D)

   OH H

   109S29/1960
7. 7. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

   (VerlDindung H)
8. 8. Mischung der Verbindungen der Formeln gemäß Anspruch 1 in Äthanol.
9. 9. Salz der Verbindung nach Anspruch 3·
10. 10. Natriumsalz der Verbindung nach Anspruch
11. 11. Salz der Verbindung nach Anspruch 4.
12. 12. Natriumsalz der Verbindung nach Anspruch k.
13. 13. Verfahren zur Herstellung einer äthanolischen Mischung, enthaltend Verbindungen der Formeln nach Anspruch 1, dadurch

    - 38 -

    109829/19SÖ

    - 3δ -

    2 1 U ϋ O 1 8

    gekennzeichnet, daß man einen Glycosid-erzeugenden Stamm von Oospora Virescens (Link) Wallr in einem Medium eines wässerigen Glucose-organischen Auszugs bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 25 C während eines Zeitraumes von zumindest 10 Tagen in einer stationären Kultur kultiviert, wobei der organische Auszug ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malz, Glucose-Hefe, Glucose-Möhre, Glucose-Weizenkörnern, Glucose-Kornkörnern, Glucose-französische Bohnen-Samen, Glucose-Erbsen-Samen und Glucose-Linsen-Samen mit einem basischen p_H~Wert, gefriertrocknet und mit Äthanol extrahiert.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur im Bereich von 23 bis 25°C liegt.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium ein Glucose-Möhren-Auszug ist.
16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß der p_H~Wert im Bereich von 8,6 bis 8,8 liegt.
17. 17. Verfahren zur Trennung der nach Anspruch 13 erhaltenen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die äthanolische Lösung kühlt, filtriert, die Verbindungen in dem FiI-trat an einer chromatographischen Säule voneinander trennt,

    - 39 109829/1950

    - 33 -

    2 1 O Ü 9.1 8

    den Niederschlag aus der Pilterstufe ansäuert und die zurückbleibenden Verbindungen an einer chromatographischen Säule auftrennt.
18. 18. Verfahren zur halb-synthetischen Herstellung der Verbindung (D) nach Anspruch 6, ausgehend von der Verbindung (G) nach Anspruch M, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen der Reduktion der erwähnten Verbindung durch LiAlHh, Tritylierung, Acetylierung, Detritylierung, Oxydo-Elimination mit Doering's Reagens und Deacetylierung umfaßt.
19. 19· Verfahren zur halb-synthetischen Herstellung der Verbindung (D), ausgehend von der Verbindung der allgemeinen Formel

    OH H

    dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen der Tritylierung, Acetylierung, Detritylierung, Oxydo-Eliminierung mit

    109829/1950 -4ο-

    Doering's Reagens und Deacetylierung umfaßt.
20. 20. Verfahren zur halb-synthetischen Herstellung der Verbindung (E) nach Anspruch 5» ausgehend von derVerbindung (F) nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen der Reduktion der erwähnten Verbindung durch LiAlH^, Tritylierung, Acetylierung, Detritylierung, Oxydo-Eliminierung mit Doering's Reagens und Deacetylierung umfaßt.
21. 21. Verfahren zur halb-synthetischen Herstellung der Verbindung (E) nach Anspruch 5, ausgehend von der Verbindung der allgemeinen Formel

    dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen der Tritylierung, Acetylierung, Detritylierung, Oxydo-Eliminierung mit Doering^fs Reagens und Deacetylierung umfaßt.

    - 41 -

    109829/1960
22. 22. Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von Pilzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Pilze mit zumindest einer Verbindung nach Anspruch 1 behandelt.
23. 23· Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte Verbindung die Verbindung nach Anspruch ist.
24. 24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet,

    daß die erwähnte Verbindung die Verbindung nach Anspruch ist.
25. 25. Verfahren nach Anspruch 23* dadurch gekennzeichnet, daß der Pilz Candida albieans ist.
26. 26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Pilz Candida albieans ist.
27. 27- Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte Verbindung die Verbindung aus Anspruch ist und der erwähnte Pilz Candida albieans ist.
28. 28. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die Verbindung nach Anspruch H ist und der erwähnte Pilz Candida albieans ist.

    109829/1950
29. 29. Eine Salbe zur Inhibierung des Wachstums von Pilzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil zumindest eine Verbindung der Ansprüche 3, 4, 5 und 6 enthält.
30. 30. Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß es die Behandlung der Bakterien mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen der nachstehenden allgemeinen Formel

    in welcher R Wasserstoff oder Hydroxyl ist, umfaßt,

    109829/1960