DE2347682C2 - Rapamycin, Verfahren zu seiner Herstellung und pharmazeutisches Mittel - Google Patents

Description

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und 288 nm (E¹^_n, 416);

ein Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Fig. 1; g) ein NMR-Spektrum gemäß Fi g. 2; und h) eine LD₅₀ (i-P-, Maus) von 597,3 ± 28,1 mg/kg und eine LDso (p. o.. Maus) von > 2500 mg/kg,

wobei die F:g. 1 und 2 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verfahren zur Herstellung des Rapamycins gemäß Anspruch 1, äadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces hygroscoprius NRRL 5491 in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet, bis die Fermentationsmischung durch Erzeugung von Rapamycin eine wesentliche antifungische Wirksamkeit aufweist und daß man das Rapamycin aus der Fermentationsmischung isoliert und reinigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35° C und bei einem Anfangs-pH zwischen 6,5 und 7,5 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung von Rapamycin

a) durch Extraktion der Fermentationsmischung mit einem mit Wasser im wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel, Einengen des so erhaltenen Extraktes auf einen Rückstand, Extraktion des Rückstandes mit einem wassermischbaren Lösungsmittel, Filtration des letzteren Extraktes, Einengen des Filtrates und Reinigen des so erhaltenen rohen Rapamycins erfolgt, oder

b) durch Abtrennen des Mycels von der Fermentationsmischung, Extrahieren der mycelfrelen Fermentationsmischung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, Einengen des so erhaltenen Extraktes zu einem Rückstand, Extrahieren des Rückstandes mit einem wassermischbaren Lösungsmittel. Filtrieren des letzteren Extraktes, Einengen des Filtrates und Reinigen des so erhaltenen Rapamycins erfolgt, oder

c) durch Abtrennen des Mycels von der Fermentationsmischung. Extrahieren des Mycels mit

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einem wassermischbaren Lösungsmittel, Einengen des so erhaltenen Extrakts auf die wäßrige Phase, Extrahieren der wäßrigen Phase mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, Einengen des letzteren Extraktes und Reinigen des so erhaltenen Rapamycins

erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung des rohen Rapamycins durch Auflösen des rohen Rapamycins in einem im wesentlichen nicht polaren ersten Lösungsmitlei und Behandeln der resultierenden Lösung mit einem Absorptionsmittel, Abtrennen des Absorptionsmittels, Eluieren des Rapamycins aus dem Absorptionsmitte) mit einem zweiten Lösungsmittel, das polarer als das erste Lösungsmittel ist, und Einengen des Eluates erfolgt.

6. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine wirksame Menge Antibiotikum nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

25 Die Erfindung betrifft das Antibiotikum Rapamycin, Verfahren zu seiner Herstellung und pharmazeutische Mittel, die Rapamycin enthalten (vgl. hierzu die Patentansprüche 1 bis 6).

Das erfindungsgemäße Antibiotikum läßt sich leicht anhand seiner ausgeprägten antifungischen Wirksamkeit und seiner relativ geringen Toxizität von bekannten Verbindungen seiner Klasse unterscheiden.

Das in der vorliegenden Beschreibung angegebene Ultraviolettspektrum von Rapamycin zeigt an, daß die Verbindung zur Klasse der Antibiotika gehört, die als Trien-Antibiotika bekannt sind. In dieser speziellen Klasse sind bisher nur fünf Verbindungen beschrieben worden.

. Trienin, beschrieben von Λ. Aszaios et al.. J. Antibiotics, 21. 611 (1968), ist ein Trien-Antibiotikum mit Antitumonvirksamkeit, das auch bemerkenswerte Wirksamkeit gegenüber grampositiven Organismen und nur geringe Wirksamkeit gegenüber Candida-

Stämmen aufweist. Das von J. J. Armstrong et al.. Nature, 206, 399 (1965), beschriebene antifungische Trien und das von C. Coronelli et al., J. Antibiotics. 20, 329 (1967), beschriebene Mycotrienin sind vermutlich identisch. Beide haben geringe antifungische Wirksamkeit (MIC gegenüber C. albicans: 5 ng/ml) und weisen hohe Toxizität aui (LD₅₀ bei Mäusen: 15 mg/kg). Die beiden restlichen Antibiotika - Resistaphyiin, S. Aezalva et al.. J. Antibiotics, 24, 393 (1971) und Proticin, G. Nesemann et al., Naturwissenschaften, 59, 81 (1972) - lassen sich leicht von dem Rapamycin der vorliegenden Erfindung unterscheiden, da sie antibakterielle, aber keine antifungische Wirksamkeit aufweisen. Rapamycin Ist eine chemische Verbindung, die sich durch Züchtung von Streptomyces hygroscopicus NRRL S491 in einem wäßrigen Nährmedium herstellen läßt. Die Verbindung vermag dem Wachstum von Fungi, ζ. B. von Candida albicans und Micorsporum gypseum entgegenzuwirken. Rapamycin kann daher zur Verhütung des Wachstums oder zur Verringerung der

Zahl bestimmter Fungi in verschiedenem Milieu verwendet werden.

Der für die vorliegende Erfindung verwendete Rapamycin erzeugende Organismus. Strcptomyces

hygroscopicus NRRL 5491, wurde aus dem Boden der Osterinseln gewonnen, und Proben davon sind ohne Vorbehalt bei der Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service,

U. S. Department of Agriculture, Peario, Illinois, USA., s hinterlegt worden.

Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 entwickelt sich reichlich in Kulturmedien, die üblicherweise für die Züchtung anderer Organismen der gleichen Gattung verwendet werden. Dieser Organismus vermag bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 35° C, vorzugsweise bei etwa 28° C, auf Czapek's-Agar, Glucose-Aspargin-Agar, Glyzerin-Asparagin-Agar, Stärke-Agar und Pepton-Rindfleisch-Agar zu wachsen. Der Organismus gedeiht auch sehr gut auf Hefeextrakt-Agar, Malzextrakt-Agar, Stärke-anorganische Salze-Agar, Hafermehl-Agar, Hafermehl-Tomaten-Agar und Bennet's- Agar. Auf Kartoffelscheiben gibt es kein Luftmycel, der Substratwuchs ist jedoch gut entwickelt und hautfarben. Auf allen Medien ist der Luftwuchs zuerst weiß, dann graulich mit schwarzen Flecken. Die Sporophoren sind oft kompakt und bilden eine Spirale aus mehr als zehn Sporen. Der Substratwuchs ist hellgelb bis fast farblos und bei einigen Medien blaßbraun. Gelegentlich wird ein gelbliches Pigment gebildet. Der Organismus ist H₂S- und melaninnegativ.

Die Kohlenhydratverwertung durch Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 wurde bei Kohlenstoff-Verwertungsagar (ISP Medium 9) nach dem durch »International Streptomyces Projekt (iSP)« standardisierten Verfahren untersucht.

Die am besten verwerteten Kohlenhydrate waren D-Glucose, Inosit, D-Fructose und D-Mannit; weniger gut verwertete Kohlenhydrate waren Rhamnose. Raffinose, Xylose, Stärke und Arabinose. Die Kohlenhydrate Saccharose und Cellulose wurden nicht verwertet.

Die Milieu- und Ernährungsbedingungen für die Fermentierung von Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 entsprechen denjenigen, die für die Erzeugung von Antibiotika durch andere aerobe Microorganismen erforderlich sind. Aerobiose kann somit in einem flüssigen Nährmediiim, angeimpft mit einer sterilen Kultur, bebrütet in Kolben, die sich auf Schüttelmaschinen befinden, unterhalten werden. Für die industrielle Erzeugung können Metalltanks mit Innenbelüftung und Rührung mit Hilfe von FlügeirTnrern verwendet werden. Rapamycin wird auch von Oberflächenkulturen erzeugt. Der Microorganismus benötigt als Nährstoffelemente assimilierbaren Kohlenstoff und organische stickstoffhaltige Substanzen. Pie Anwesenheit von Mineralsalzen ist wünschenswert. Die Züchtung geht am besten, wenn der Anfangs-pH des Kulturmediums zwischen 6,5 und 7,5 liegt, der günstigste pH liegt bei 6,8 bis 7,3.

Die brauchbaren Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff zur Erzeugung des Antibiotikums sind sehr verschieden, dazu gehören Zucker (?. B. Glucose. D-Fructose, D-Mannit, Mallose, Arabinose, Rhamnose, Raffinose, Xylose und dergleichen). Dextrin, Stärken verschiedenen Ursprungs, Glyzerin (und andere Polyal- M) kohole). Inosit und tierische und pflanzliche Fette, sowie deren Ester. J3ie Quellen für organischen assimilierbaren Stickstoff, die das Wachstum aktiv stimulieren und die Bildung von Rapamycin begünstigen, sind Substanzen, wie Sojaschrot, Baumwollschrot und andere pflanzliche Schrotarten (Vollschrot oder teilweise oder ganz entfettet), Fleischrr.ohle oder tierische Eingeweide, verschiedene Peptone, Caseinhydrolysate. Sojabohnenhydrolysate, Hefehydrolysate, Lactalbumin, Weizenglutine, lösliche Brennereirückstände, Maisquellwasser, Melasse, Harnstoff und Aminosäuren.

Mineralsalze, z. B. die Chloride, Nitrate, Sulfate, Carbonate und Phosphate von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium, sollten in den angemessenen Konzentrationen vorhanden sein. Das Nährmedium sollte auch Spurenelemente, wie Magnesium, Eisen, Mangan und Zink, enthalten.

Das obige Medium wird für die Fermentierung mit einer frischen Kultur von Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 angeimpft.

Unter den beschriebenen Bedingungen und bei der Züchtungstemperatur von etwa 20 bis 35° C, vorzugsweise bei 25° C, erzielt man eine maximale Bildung von Rapamycin in etwa 2 bis etwa 8 Tagen in Tanks.

Anschließend können verschiedene Verfahren für die Isolierung und Reinigung des Rapamycins angewendet werden, z. B. Lösungsmittelextraktion, Verteilungschromatograprae, Chromatographie an Silicagel, Flüssigkeits-Flüssigkeitsverteilung in eine: Craig-Vorrichtung und Kristallisation aus Lösungsmitteln. Lösungsmittelextraktionsverfahren bevorzugt man für die technische Gewinnung, soweit sie einen geringeren Zeitaufwand erfordern und nicht so teuer sind.

Rapa.:sycin kann nach einer der folgenden Methoden gewonnen werden.

a) Die Fermentierungsmischung wird mit einem Lösungsmittel extrahiert, das mit Wasser im wesentlichen nicht mischbar ist, vorzugsweise mit einem Niedrigalkanol, z. B. mit n-ButanoI, n-Pentanol oder dem technischen Pentanolgemisch, bekannt als »Pentasol« oder mit n-Hexanol oder einem im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Niedrigaikyl-niedrigalkanoat, z. B. mit Äthylacetat, Butylacetat, Amylacetat oder dem technischen Amylacetatgemisch oder mit einem mit Wasser im wesentlichen nicht mischbaren halogenieren aliphatischen Kohlenwasserstoff, z. B. mit Chloroform, Methylenchiorid oder Dichloräthan. Die Extrakte werden getrocknet und unter vermindertem Drc:k eingeengt und ergeben einen öligen Rückstand, der wieder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise mit einem Niedrigalkanol, z. B. mit Methanol oder Äthanol extrahiert wird. Diese letztgenannten Extrakte werden durch Diatom^enerde filtriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man einen öligen Rückstand erhält, der rohes Rapamycin enthält.

b) Die Fermentierungsmischung wird durch eine Schicht aus Diatomeenerde filtriert, und der das Mycel enthaltende Filterkuchen wird, wie unten unter (c) beschrieben, extrahiert. Das Filtrat, das heißt, die mycelfreie Fermentierungsmischung, wird mehrmals mit einem im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, z. B. mit einen Nledrigalkanol, Niedrigaikyl-niedrigalkanoat odir mit einem halogenieren aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie oben unter Abschnitt (a) exemplifiziert. Man trocknet die Extrakte und engt jnter verminüertem Druck ein. dabei erhält man sinen öligen Rückstand, der mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise mit einem Niedrigalkanol, z. B. mit Methanol oder Äthanol extrahiert wird. Die letztgenannten Extrakte werden in gleicher Weise, wie oben unter (a) beschrieben, behandelt und ergeben eiüen öligsn Rückstand, der das rohe Rapamycin enthält.

c) Man trennt das Mycel von der Fermentierungsmischung ab und extrahiert mit einem geeigneten mit

Wasser mischbaren Lösungsmittel, voi/.ugswej.se mit einem Niedrigalkanol. z. B. mit Methanol oder Äthanol. Der Extrakt wird durch Verdampfen bis zur wäßrigen Phase eingeengt, die wiederum mit einem im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert wird. z. B. mit einem Nledrigalkyl-niedrigalkanoat. mit einem halogenieren aliphatischen Kohlenwasserstoff oder einem im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Niedrigalkanol. wie oben beschrieben, oder mit einem aromatischen Kohlenwasserstoff, z. B. mit in Benzol oder Toluol. Der letztere Extrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft und ergibt einen öligen Rückstand, der das rohe Rapamvcin enthält.

Das rohe Rapamyun, erhalten nach einem der in den Anschnitten (a). (b) oder (c) beschriebenen Verfahren. wird dann nach verschiedenen Methoden gereinigt, siehe ι B. die oben genannten Methoden. Bevorzugt ist üif Aiisoipüori des rohen Rupumycip.s au! einem Absorptionsmittel, z. B. Kohle oder Silicagel. aus einer Lösung in einem im wesentlichen nicht polaren ersten in Lösungsmittel und die anschließende Eluierung mit einem zweiten Lösungsmittel, das polarer ist als das erste Lösungsmittel. Die weitere Aufarbeitung erfolgt dann durch Einengen des Eluats.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vnrliegenden Erfindung wird Rapamvcin auf folgende Weise hergesiellt:

Ein geeignetes Fermentationsgefäß wird mil Produktionsrr.edium 8KM (siehe Beispiel 1) beschickt. Nach dem Sterilisieren und Abkühlen wird das Medium mit einem Implpraparat der ersten Stufe von Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 angeimpft.

Ein maximaler Gehalt von 20 bis 100 jig/ml Antibiotikum wird nach 2 bis 8 Tagen, gewöhnlich nach etwa 5 Tagen, in der Fermenialionsmischung erreicht, was mit Hufe der Becherplauenmethorie und unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus bestimmt wird Das Mycel wird durch Filtration über Diatomeenerde isoliert. Dann wird das Rapamycin mit einem wassermischbaren Lösungsmittel, z. B. mit einem -to NijdrUalkanol. vorzugsweise mit Methanol oder Äthanol, aus dem Mycel extrahiert. Der letztere Extrakt wird dann eingeengt, vorzugsweise unter vermindertem Druck, und die resultierende wäßrige Phase wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Ein bevorzugtes mit Wasser niehl mischbares Lösungsmittel für diesen Zweck ist Methylenchlorid, man kann aber auch Chloroform. Tetrachlorkohlenstoff. Benzol. n-Butanol und dergleichen verwenden. Der letztere Exuakt wird eingeengt, vorzugsweise unter vermindertem Druck, und ergibt das Rohprodukt als Öl.

Das Produkt kann auf verschiedene Weise weiter gereinigt werden. Eine bevorzugte Reinigungsmethode ist die. das Rohprodukt in einem im wesentlichen nicht polaren ersten Lösungsmittel, z. B. in Petroläther oder Hexan, zu lösen und die erhaltene Lösung mit einem geeigneten Absorbens, z. B. mit Kohle oder Silicagel, zu behandein, so daß das Antibiotikum auf dem Absorptionsmittel absorbiert wird. Das Absorptionsmittel wird dann abgetrennt und mit einem zweiten Lösungsmittel, das polarer als das erste Lösungsmittel ist. z. B. mit .Äthylacetat. Meihylenchlorid oder einer Mischung aus Methyienchiorid und Äther (bevorzugt), gewaschen oder eluiert. Danach erhält man beim Einengen der Waschlösung oder des Eluates im wesentlichen reines Rapamycin. Eine weitere Reinigung wird durch partielle Ausfällung mit einem nicht polaren Lösungsmittel, z.B. mit Petroläther, Hexan, Pentan und dergleichen, aus einer Lösung des Rapamycins in einem polareren Lösungsmittel, z. B. Äther. Äthylacetat, Benzol und dergleichen, erzielt. Eine noch weitere Reinigung erzielt man durch Säulenchromatographie, vorzugsweise unter Verwendung von Silicagel, und durch Kristallisation des Rapamycins aus Äther.

Rapamycin ist durch die nachfolgenden Parameter gekennzeichnet:

a) Gereinigtes Rapamycin ist eine farblose kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 183 bis 185° C nach Umkristallisation aus Äther;

b) Rapamycin ist in Äther, Chloroform, Aceton, Methanol und Dimethylformamid löslich; sehr schwach löslich in Hexan und Petroläther und im wesentlichen unlöslich in Wasser;

c) Rapamycin zeigt einen einheitlichen 1 leck auf ntinnschichtplatten aus Silicagel G. entwickelt mit mannigfaltigen Lösungsmittclsystemen für Dünnschichtchromatographie; z. B. Äther/Hexan = 40 : 60 (Rf = 0,42), isopropylalkohol/Benzol = 15 : 85 (Rf = 0,5) und Äthanol/Benzol = 20 : 80 (RF = 0,43);

d) von vier aufeinanderfolgenden Fermentationsansätzen erhaltenes Rapamycin ergab die folgenden Werte für wiederholte Elementaranalysen:

Durchschnitt

c%	67,24	66,14	67,26	66,72	66.84
H%	8,93	8.72	8,92	8.9	8,84
N%	1,39	1.37	1,28	1,38	1,37

e) Rapamycin weist die folgenden charakteristischen Absorptionsmaxima in seinem Ultraviolettabsorptionssnektrum auf (95% Äthanol):

267 nm (E',"_ot 417), 277 nm
und 288 nm (e!'" 416);

541)

f) Das Infrarotabsorptionsspektrum von Rapamycin in Chloroform ist in der Fig. 1 wiedergegeben, es zeigt charakteristische Absorptionsbanden bei 3560, 3430. 1730, 1705 und 1630-1610 cm¹;

weitere Infrarotabsorptionsbanden sind durch die folgenden Zahlenwerte, die in cm"¹ angegeben sind, gekennzeichnet, wobei (s) eine starke, (m) eine mittlere und (w) eine schwache Bande bezeichnet. Diese Klassifizierung ist willkürlich gewählt, so daß eine F.-nde als stark (s) bezeichnet wird, wenn ihre Spitzenabsorption zu mehr als Vj über dem Untergrund im gleichen Gebiet liegt; als mittelmäßig (m) wird eine Bande bezeichnet, wenn ihr Peak zwischen Ά und Vj über dem Untergrund im gleichen Gebiet liegt, und als schwach (w) wird eine Bande bezeichnet, wenn ihr Peak sich zu weniger als Ά über den Untergrund im gleichen Gebiet erhebt.

2999cm-'(m) 1440cm-¹ (s) 1158cm-'(m) 1020cm-'(m; 2955cm->(s) 1365cm-'(m) 1129cm-'(s) 978crn-'(s) 2919cm-'(s) 1316cm-'(m) 1080cm-'(s) 905Cm-Km; 2858cm-'(s) 1277Cm-Km)IOOOCm-Hs) 888crrr'(w) s) 1040cm-'(m) 866cnr'(w)

g) Das kernmagnetische Resonanzspektrum vor Rapamycin in Deuterochloroform ist in der Fig. Ί

wiedergegeben;

h) die Mindesthemmkonzentrationen von Rapamycin gegenüber verschiedenen Microorganismen sind folgende:

Organismus	Rapamycin ^ig/nil)	20
Candiik albicans (5 Stämme)	0,02 bis 0,1
C. catenulata	<0,l
C. lipolytica	2,5
C. stellatoidea	<0,l
C. tropiialis	0.1
C. pseudtropicalis	> 5,0
C. parapsilosis	<0.l
C. morrera	<0,l
C iniciiMciiiü	^- η ι ^ \j, t
C. M. gypseum	12,5
T. mentagrophytes	> 1000

i) Rapamycin weist eine LD₅₀ U. p., Maus) von 597,3 ± 28.! mg/kg und eine LD™ (ρ. ο.. Maus) von > 2500 mg/kg auf.

Rapamycin ist brauchbar als antifungisches Mittel gegen eine Vielzahl pathogener Fungi; z. B. gegen Candida albicans und andere Candida Spezien, gegen Microsporum gypseum, Trichophyton mentogrophytes. AspeMllus sp. und Sporotrichum sp.

Die Hemmwirkung von Rapamycin ist besonders ausgeprägt gegenüber Candida albicans, und dieser letztgenannte Organismus kann in vorteilhafter Weise für Prüfungszwecke verwendet werden.

Die antifungische Wirksamkeit der vorliegenden Verbindung läßt sich in Standardtests, die für diese Zwecke verwendet werden, demonstrieren, z. B. anhand von Tests, die in »Antiseptics, Disinfectants, Fungicides and Sterilization«, G. F. Reddish, Ed., 2. Auflage, -ίο Lea und Febiger, Philadelphia, 1957 oder von D. C. Grove und W. A. Randall in »Assay Methods of Antibiotics«. Med. Encycl., Inc.. New York 1955, beschrieben sind.

Wird das erfindungsgemäße Antibiotikum als anti- -»5 fungisches Mittel bei warmblütigen Lebewesen, z. B. bei Ratten, verwendet, so kann es alleine oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern verwendet werden, deren Anteil durch die Löslichkeit und chemische Natur der Verbindung, den gewählten Verabreichungsweg und die biologische Standardpraxis bestimmt wird. Beispielsweise kann eine antifungisch wirksame Menge des Antibiotikums oral in einer festen Form, die Verdünnungsmittel wie Stärke, Zucker, bestimmte Tontypen usw. enthält, verabreicht werden. Ebenso kann eine solche Menge auch oral in Form von Lösungen oder Suspensionen verabreicht werden, oder das Antibiotikum kann parenteral injiziert werden. Für die parenterale Verabreichung kann das Antibiotikum in Form einer sterilen Lösung oder Suspension verwendet werden, die andere gelöste Substanzen oder Suspendiermittel enthält, z. B. so viel Salz oder Glucose, daß die Lösung isotonisch ist, Gallensalze, Gelatine, Sorbitanmonoleat, Sorbit-Oleatester und seine Anhydride kopolymerisiert mit Äthylenoxyd und dergleichen.

Die Dosis des erfindungsgemäßen Antibiotikums schwankt in Abhängigkeit von der Form der Verabreichung und der gewählten speziellen Verbindung. Sie richtet sich auch nach dem speziellen zu behandelnden Patienten. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleinen Dosen, die wesentlich kleiner als die optimale Dosis der Verbindung sind, begonnen. Danach uircl die Dosis in kleinen Schritten erhöhl, bis der optimale Effekt unter den gegebenen Umständen erreicht ist. Im allgemeinen wird das Rapamycin der vorliegenden Erfindung bei einer Konzentration angewendet, die gute antifungische Ergebnisse liefert, ohne nachteilige oder schädliche Nebenwirkungen zu verursachen, vorzugsweise wird sie in einer Menge im Bereich von etwa 1,0 mg bis etwa 250 mg pro kg pro Tag angewendet, obgleich - wie oben erwähnt - Variationen vorgenommen werden können. Eine Dosis Im Bereich von etwa 10 mg bis etwa 100 mg pro kg pro Tag wird jedoch zur Erzielung guter Ergebnisse bevorzugt.

Das Mittel kann außerdem topisch angewendet werden. Für die topische Anwendung kann es in die Form von Lösungen. Crems oder Lotionen in pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, die 0,1 bis 5"n. vorzugssveise 2%, von dem Mittel enthalten, formuliert werden und auf die befallene Hautstelle topisch aufgebracht werden.

Rapamycin kann auch verwendet werden, um Laboratoriumsgeräte, chirurgische Instrumente, Umkleideräume oder Duschräume von Fungi zu reinigen und zu desinfizieren. Für solche Zwecke verwendet man vorzugsweise 0,1 bis lO^ige Lösungen von Rapamycin in einem Niedrigalkanol, vorzugsweise in Methanol, verdünnt mit 10 bis 100 Volumina Wasser, das 0,001 bis 0,1¹V, eines nicht ionischen oberflächenaktiven Mittels enthält, unmittelbar bevor man es auf die zu reinigenden und zu desinfizierenden Gegenstände aufbringt.

Bei der Untersuchung der Schutzwirkung wurden Mäuse durch intravenöse Injektion von C. albicans ATCC 11651 infiziert. Eine, vier und 24 Stunden nach der Infektion wurde Mäusen 10 mg/kg (s. c.) Rapamycin verabreicht. Mit dieser Dosis wurden 50% der Mäuse geschützt. Behandlung mit 25 mg/kg (s. c.) bot einen vollständigen Schutz. Wurde Rapamycin oral in einer Menge von 10 mg/kg verabreicht, so überlebten 4 von 10 Mäusen und mit 25 mg/kg wurde vollständiger Schutz festgestellt.

Eine l%ige Suspension (0,2 ml) von Rapamycin in Wasser, das 1,5% Polysorbat 80 enthält, verursachte bei der intradermalen Injektion in das Ohr eines Kaninchens keine Reizung. Ebenso verursachten zwei Tropfen einer Obigen Suspension, aufgebracht auf das Auge eines Kaninchens, keine Reizung.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1
Microorganismus

Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 wurde auf Hafermehl/Tomatenpaste/Schrägagar (T. G. Pridham et al.. Antibiotic Annual 1956-1957, Medical Encyclopedia Inc., New York, Seite 947) und in Roux-Kolben, die das gleiche Medium enthalten, gezüchtet und unterhalten. Nach 7tägiger Bebrütung bei 28° C war gutes Wachstum erreicht. Aus einem Roux-Kolben wurden die Sporen herausgewaschen und in 50 ml sterilem, destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde zum Animpfen der ersten Impfkultur verwendet. Das Medium der ersten Impfkultur bestand aus Emer-

son-Brühe (R. L. Emerson et al., J. Bacteriol, 52, 357 [19461) 0,4%; Pepton, 0,4%; Natriumchlorid, 0,25%; Hel'eextrakt, 0,1%; und Glucose, 1%; pH = 7,0; Kolben, die das obige Medium enthielten, wurden mit 1% der oben beschriebenen Sporensuspension angeimpft. Die angeimpften kolben wurden 30 Stunden lang bei 28° C auf einer Schüttelvorrichtung, die auf 65 Upm (Hüblänge 10,16 cm) eingestellt war, bebrütet.

Produktionsstufe:

Die Produktion erfolgte in 2501 New Brunswlck-Fermentcrn, Modell F-250, ausgestattet mit automatischem Antischaum-Zugabesystem und pH-Kontrollschreiber. Die Fermenter wurden mit 1601 eines wäßrigen Produktionsmediums (8 KM) beschickt, bestehend aus den folgenden Bestandteilen:

lösliche Stärke

(NH₄J₂SO₄

K₂HPO₄

Glucose

MgSO₄

ZnSO₄

MnSO₄

FeSO₄ 7H₂O

CaCO₃

Endmelasse

hydrolisiertes Casein

Specköl

pH 7,1 bis 7,3

1,0%

0,5%

0,5%

1,5%

0,025%

0,005%

0,001%

0,002%

0,2%

0,5%

0,5%

0,5%

Die Fermenter wurden bei 12TC 45 Minuten lang sterilisiert, abgekühlt und mit einem Kolben (2% Inoculum) Impfkultur der ersten Stufe angeimpft. Bebrütungstemperatur: 28° C: Belüftung: 0,5 Volumen/Volumen/Minute; Rührung: 250 Upm.

Innnerhalb 5 Tagen wurde ein Gehalt von ca. 20 ng/ml erreicht, bestimmt durch mikrobiologische Prüfung auf Agarplatten mit Candia albicans-Saat. Die Fermentation wurde beendet.

Die Extraktion und Isolierung des Antibiotikums erfolgte nach einer der folgenden Methoden: öligen Rückstand eingedampft, der rohes Rapamycln enthalt.

c) Das gemäß Abschnitt (b) erhaltene Mycel wurde mil I bis 2 Volumina Wasser gewaschen. Das gewaschene Mycel wurde dreimal mit je 5 Volumina Methanol pro Gewichtseinheit feuchtes Mycel gewaschen. Man vereinigte die methanollschen Extrakte und engte unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen wäßrige Phase ein, die ungefähr 10% Vol./Vol. Methanol enthielt. Diese wäßrige Phase wurde dreimal mit einem Volumen Methylenchlorid extrahiert; die Methylenchloridextrakte wurden vereinigt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft und ergaben einen öligen Rückstand.

Der ölige Rückstand wurde mit 1 Volumen Peiolälher verdünnt, dann wurden 30% (Gewicht/Volumen) Kohle zugegeben. Die Mischung wurde '/, Stunde lang gerührt und dann fiitrieri. Die Ko'nle, die im wesentlichen das gesamte Produkt zurückhielt, wurde zweimal mit 1 Volumen Petroläther gewaschen, dann wurde die Kohle dreimal mit 5 Volumen (bezogen auf das Gewicht der Kohle) einer Mischung aus Methylenchlorid und Äther (50:50) elulert. Die Methylenchlorld/Ätherextrakte wurden zur Trockene eingedampft und der Rückstand in einer kleinen Menge Äther gelöst. Das rohe Produkt erhielt man durch Ausfällung aus der Ätherlösung mit kaltem Petroläther.

Andererseits wurde der nach einem der oben beschriebenen Extraktionsverfahren erhaltene ölige Rückstand mit einem Volumen Hexan verdünnt und über eine präparative Silicagel G-Säule geschickt. Das Produkt wurde auf der Säule adsorbiert. Das das adsorbierte Produkt enthaltende Silicagel G wurde mit mehreren Volumina Hexan und 50 : 50 Hexan/Äther-

Gemischen gewaschen. Das Produkt wurde mit Äther von der Säule eiuierl. Das Eluierungsrrütte! Äther wurde auf ein kleines Volumen eingedampft und das Rohprodukt durch Ausfällung mit kaltem Petroläther aus der Ätherlösung erhalten.

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Extraktion

a) Die Fermentationsmischung wurde zweimal mit 1 Vol./Vol. n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte wurden mit 1 Vol./Vol. Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei S5 man einen Rückstand erhielt. Der ölige Rückstand wurde dreimal mit 2 1 Methanol extrahiert. Die vereinigten Methanolextrakte wurden durch Diatomeenerde geschickt und zur Trockene eingedampft und ergaben einen öligen Rückstand, der rohes Rapamycin enthält.

b) Die FermenUerungsmischung wurde über Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat wurde zweimal mit 1 Vol./Vol. Äthylacetat extrahiert. Man wusch die Äthylacetatextrakte mit 1 Volumen Wasser, trocknete mit wasserfreiem Natriumsulfat und dampfte unter vermindertenj Druck zur Trockene ein. Der Rückstand wurde zweimal mit 1 I Methanol extrahiert. Die Methanolextrakte wurden unter vermindertem Druck zu einem Reinigung

Das obige Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel G (50: 1 Gew./Vol.) in Hexan/Äther (50 : 50) weiter gereinigt. Man eluierte das Produkt mit Äther von der Säule. Das Athereluat wurde auf ein kleines Volumen eingedampft, und gereinigtes Rapamycin wurde mit Petroläther ausgefällt. Die Analvsenproben wurden durch Kristallisation aus Äther hergestellt, Fp = 183 bis 185° C.

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Beispiel 2

Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, die Sporen erhielt man ebenfalls entsprechend Beispiel 1.

Erste Impfkultur

Man füllte Erlenmeyer-Kolben (500 ml) mit je 100 ml des folgenden Mediums (die Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsteile/Volumenteile):

Sojabohnenmehl 4%

Glucose ²%

Ammoniumsulfat 0.3%

Calciumcarbonat 0,15%

Wasser ad ¹⁰°

Per pH dieser Mischung betrug 7,1 bis 7.3.

Die Kolben wurden 35 Minuten bei 121⁰C sterilisiert und auf 25° C abgekühlt. Man Impfte die Kolben mit 4i\) (4 ml) obiger Sporensuspension und bebrütete auf einer Schüttelvorrichtung (Hublänge 5,08 cm), die auf 240 Upm eingestellt war, 24 Stunden bei 25" C.

Zweite Impfkultur

24 Liter-Kolben mit flachem Boden, die 3,2 Liter der obigen Impfkultur mit einem pH von 7.1 bis 7,3 enthielten, wurden in einem Autoklaven 35 Minuten bei 121⁰C sterilisiert, geschüttelt, um unlösliches Material wieder zu suspendieren, und weitere 45 Minuten sterilisiert. Die Kolben wurden auf 25° C abgekühlt, mit 64 ml der ersten Impfkultur angeimpft und 18 Stunden bei 25° C auf einer Schüttelvorrichtung (Hublänge iO,I6cm), die auf 65 Upm eingestellt war, bebrütet.

Produktionsstufe

Die Produktion erfolgte in 250-Liter-New Brunswick-Fermentern, Modell F-250, ausgestattet mit automatischem Antischaumzugabesystem und pH-KontroII-schreiber. Die Fermenter wurden mit 160 Liter eines wäßrigen Produktionsmediums beschickt, bestehend aus den folgenden Bestandteilen (die Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsteile/Volumenteile):

Sojabohnenmehl
Glucose

Ammoniumsulfat
Kaliumphosphat (einbasisch)
Antischaummittel

in

20

3% 2% 0,1% 0,5%

0.05"';,

30

Die Fermenter wurden 30 Minuten bei 121°C sterilisiert und abgekühlt, der pH wurde mit Ammoniumhydroxid auf 5,8 bis 6,2 eingestellt. Die Fermenter werden dann mit dem Inhalt eines Kolbens (2°ö) der zweiten Impfkultur angeimpft. Die Fermentierung erfolgt bei 25⁼ C mit Belüftung von 0,25 Vol./Vol./Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 200 Upm.

Der pH der Fermentierungsmischung beginnt nach 30 bis 35 Stunden zu fallen und wird, falls erforderlich, durch Zugabe von Ammoniumhydroxid bis zum Ende der Fermentierung bei 6,0 gehalten. Nach etwa 48 Stunden fällt die Glukosekonzentration in der Mischung auf etwa 0,5v Man gibt dann bis zum Ende dr.r Ferment'erung kontinuierlich eine 40%ige Glukoselösung in einer Menge von 3.75Ύ, des Volumens an Fermentierungsmischung pro Tag zu. In 4 bis 5 Tagen wurde ein Gehalt von ungefähr 60 ng/ml erreicht, der durch mikrobiologische Prüfung auf mit Candida albicans angeimpften Agarplatten bestimmt wurde. Die Fermentk.ur.g wurde dann gestoppt.

Extraktion und Isolieruni; des Antiblotkums erfolgten nach der folgenden Methode:

Die Fermentierungsmischung wurde über Diatomeenerde filtriert. Ein 400-Liter-Ansatz aus drei Fermentern ergab auf diese Weise ungefähr 60 kg nasses Mycel. Das nasse Mycel wurde mit einem Volumenteil/Gewichtsteil Methanol unter Rühren vermischt und Οίε Mischung 2mal mit 2 Volumentellen Trichioräthan extrahiert, wobei man ungefähr 250 Liter Trichloritthanextrakt erhielt, der ungefähr 22 bis 24 g Rapamycin enthielt. Das Trichioräthan wird unter vermindertem Druck bis zur Trockene abgezogen. Man erhielt 1 bis 1,4 kg eines öligen Rückstandes, der langsam unter Rühren zu 5 Volumenteilen Aceton gegeben wurde. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und die Acetonlösung unter vermindertem Druck bis zur Trokkene eingedampft, wobei man erneut einen öligen Rückstand erhielt. Dieser wurde 2mal mit 2 bzw. I Volumenteil Methanol extrahiert. Die vereinigten Methanolextrakte wurden filtriert und der ölige Rückstand verworfen. Der das Rapamycin enthaltende Methanolextrakt wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft, man erhielt 200 bis 300 g eines öligen Rückstandes, der in 5 Volumenteilen/Gewichtsteil einer Lösung von 15".i Aceton in Hexan gelöst wurde. Zu dieser Lösung gab man Kieselgel in einer Menge, die dem doppelten Gewicht des öligen Rückstandes entsprach, und rührte die Mischung ungefähr 1 Stunde. Die Mischung wurde durch eine gesinterte Glasnutsche filtriert und das Filtrai verworlen. Das das Rapamycin enthaltende Kieselgel wurde mit mehreren Volumenteilen einer Lösung von 15\. Aceton in Hexan gewaschen. Das gewaschene Kieselgel wurde mit einer Lösung von 30°., Aceton in Hexan cluiert, das Eluierungsmittel wurde zur Trockene verdampft, wobei man ungefähr 60 bis 150 g eines trokkenen Rückstandes erhielt. Nach Lösen des trtikenen Rückstandes in Äther kristallisierte das reine Rapamycin. Normalerweise erhält man aus 24 g rohem Rapamycin auf diese Weise etwa 10 bis 14 g reines kristallines Produkt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Farbloses, kristallines Rapamycin, gekennzeichnet, durch S

einen Schmelzpunkt von 183 bis 185° C nach Umkristallisation aus Äther,
Löslichkeit in Äther, Chloroform, Aceton, Methanol und Dimethylformamid, sehr geringe Löslichkeit in Hexan und Petroläther und praktische Unlöslichkeit in Wasser, einen einheitlichen Fleck auf Silikagel-Dünnschichtplatten;

folsende durchschnittliche Elementaranalyse: C 66,48%; H 8,84%; N 1,37%;
folgende charakteristische Absorptionsmaxima im UV-Absorptionsspektrum (95%iges Äthanol): 267 ivr

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