DE1042841B

DE1042841B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Novobiocin auf biologischem Wege

Info

Publication number: DE1042841B
Application number: DEU3967A
Authority: DE
Inventors: Alma Dietz; Clarence Deboer; Charles Giles Smith; Malcolm Edward Bergy; Herman Hoeksema
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1955-06-20
Filing date: 1956-06-19
Publication date: 1958-11-06

Description

Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Novobiocin auf biologischem Wege Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Novobiocin sowie dessen Überführung in die Salzform. Novobiocin hat folgende Formel: und ist sowohl in freier Form als auch in Form seiner Salze gegen gram.negative als auch grampositive Bakterien wirksam.
Es wurde gefunden, daß man durch Kultivierung einer bisher nicht beschriebenen Mikroorganismenart Streptomyces niveus, die aus einer Bodenprobe, welche in Oueens Village, New York, entnommen wurde, isoliert wurde unter kontrolliertenBedingungen und auf einem geeigneten Nährmedium Novobiocin erhalten kann. Eine Kultur des lebenden Mikroorganismus ist bei der Abteilung für Fermentation des Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, deponiert und in die dortige Sammlung als NRRL 2466 aufgenommen.

Eine sorgfältige Studie der Morphologie und Physiologie von S. niveus, zeigt, daB dieser Organismus von allen bisher in Bergey's »Manual of Determinative Bacteriology«, 6. Auflage, S. 929 bis 977, und Waksman und Lechevaliers, »Actinomycetes and Their Antibiotics«, beschriebenen Streptomycesarten deutlich verschieden ist.-Der Mikroorganismus wird in Tabelle I charakterisiert. Alle Impfungen erfolgten mit einem lebensfähigen Inokulum, das in 100 ccm Trypton-Hefewürze auf einem hin- und hergehenden Schüttelapparat bei 28° C gezüchtet wurde. Nach 48 Stunden wurde das Inokulum während einer Minute gemischt (Waring-Mischer) und dann jedem Reagenzrohr 0,2 ccm Inokulum zugesetzt. Die Ablesungen erfolgten am 4., 7. und 14. Tag.

Tabelle I

Kulturcharakteristiken von S. niveus

*Medium Vegetatives Wachstum Wachstum an der Luft Bemerkungen

'Gewöhnliche Gelatine - Verflüssigung ein Drittel der

Tiefe des Mediums

zNährgelatine -f- - Verflüssigung ein Drittel der

Tiefe des Mediums

-E- = Wachstum.

- = kein Wachstum; Inkubationstemperatur, 28°C; Gelatine, 24°C.

*Die Ingredienzien dieser Medien (g/11 werden unten angegeben. Die Medien wurden bei einem Druck von 1,05 kg/cma, 120° C, 15 Mi-

nuten im Autoklav behandelt.

Gewöhnliche Gelatine (Gelatine 120),

ßNährgelatine (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Gelatine 120, eingestellt- auf pg 7,0),

Fortsetzung Tabelle i

Kulturcharakteristiken von S. niveus

*Medium " I ;.y _- J Vegetatives Wachstum- I Wachstum an der Luft Bemerkungen

3Nähragar -f- ziemlich gut, grauweiß Rückseite rahmfarbig;

schwachgelbes Pigment

4Nährbouillon . -@- schnee- bis ascheweiß

- Ring an der Oberfläche; flok-

"-. kiges Wachstum am Boden

äd-Glukosebouillon schnee- bis ascheweiß

Ring und Häutchen an der

_ Oberfläche; flockiges Wachs-

tum am Boden

6 d-Glukose-Agar -)- schnee- bis ascheweiß Rückseite gelb; gelbes Pigment

7Triptonbouillon + schnee- bis grauweiß

Häutchen an der Oberfläche,

flockiges Wachstum am

Boden

$Tripton-Hefeextrakt- + schnee- bis grauweiß

bouillon Häutchen an der Oberfläche,

flockiges Wachstum am

Boden

sN,@raksman's -)- ziemlich gut; grauweiß Rückseite rahmfarbig,

schwachgelbes Pigment

10Tyrosinbouillon -j- - gute Rosafarbe; löslich

flockiges Wachstum am

Boden

11Czapek's Sucrose-Agar -)- rahmweiß Rückseite rahmfarbig;

schwachgelbes Pigment

12Lalzmusmilch - Peptonisierung

Ring an der Oberfläche; flok-

kiges Wachstum am Boden

13Nährnitratbouillon + schnee- bis ascheweiß Nitrate nicht reduziert

Häutchen an der Oberfläche,

flockiges Wachstum am

Boden

11Synthetische Nitrat- -)- schwach; weiß Nitrate nicht reduziert

bouillon Ring an der Oberfläche; flok-

kiges Wachstum überall

15Pepton-Eisen-Agar - keine H2SverdunkelndeRück

Wachstum schlecht; Kultur- seitenfarbe des Mediums;

farbe des Mediums schwachgelbes Pigment

-[- = Wachstum.

- = kein Wachstum: Inkubationstemperatur, 28° C; Gelatine, 24° C.

* Die Ingredienzien dieser Medien (g/1) werden unten angegeben. Die Medien wurden bei einem Druck von 1,05 kg/cm2, 120 ° C, 15 Mi-

nuten im Autoklav behandelt.

"Nähragar (Fleischextrakt 3,0, "Pepton 5,0, eingestellt auf pg 7,0, Agar 15,0),

4Nährbouillon (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0),

5d-Glukosebouillon (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Glukose 10,0),

cd-Glukosebouillon (Fleischextrakt 3,0, Pepton 5,0, Glukose 10,0, eingestellt auf pg 7,0, Agar 15,0),

7Tryptonbouillon (Trypton 10,0),

aTrypton-Hefeextraktbouillon. (Trypton 5,0 g und Hefeextrakt 3,0 g),

9'%7G'alvman's Tyrosin-Agar (Glukose 10,0, Tyrosin 1,0,

0,5, K2HPO4 0,5, pg eingestellt auf 7,0, Agar 15,0),

1°Tyrosinbouillon (Tyrosin 1,0, eingestellt auf pg 7,0),

"Czapek's Sucrose-Agar (NaN03 2,0, K2HPO4 1,0, M9S04. 7H20 0,5, -KCl 0,5, FeS04# 711.0 0,01, Sucrose 30,0, eingestellt auf

pg 6,6, Agar 15,0),

i2Lakmusmilch (Trockenmilch mit Lakmusfarbstofr),

1"NährnitratbouiIlon (Fleische%-trakt 3,0, Pepton 5,0, KNO3 1,0),

14Synthetische Nitratbouillon (KZHPO4 0,5, NaCl 0,5, M9S04# 7H20 0,2, NaN03 2,0, Glukose 10,0),

11>Pepton-Eisen-Agar (Pepton 15,0, Proteosepepton -[Hydrolysat von animalischem Protein mit hohem Molekulargewicht]) 5,0, Ferri-

Ammoniumcitrat 0,5, Dikaliumphosphat 1;0, hTatriumthiosulfat 0,08; Agar 15,0),

Fortsetzung Tabelle I

Kulturcharakteristiken von S. niveus

*Medium Vegetatives Wachstum Wachstum an der Luft Bemerkungen -

isBennett's Agar gut; rahmweiß Rückseite gelb; Pigment gelb

i7Calciummalat-Agar rahmweiß Rückseite rahmfarbig;

schwachgelbes Pigment

18 Maltose-Trypton -f- rahmweiß Rückseite gelb ;gelbes Pigment

i9 Caseinstärke-Agar rahmfarbig Rückseite gelb; gelbes Pigment

2oNährstärke-Agar rahmrosa Rückseite gelb; Hydrolyse gut

2i Waksman's rahmfarbig Rückseite rahmfarbig; Hydro-

Stärke-Agar A lyse schwach

22 Waksman's -j- rahmfarbig Rückseite rahmfarbig; Hydro-

Stärke-Agar B lyse gut

= Wachstum.

- =kein Wachstum: Inkubationstemperatur, 28° C; Gelatine, 24° C.

* Die Indegredienzien dieser Medien (g/1) werden unten angegeben. Die Medien wurden bei einem Druck von 1,05 kg/cm@,120° C, 15 Mi-

nuten im Autoklav behandelt.

18Bennet's Agar (Hefeextrakt 1,0, Fleischextrakt 1,0, N-2-Amin A [enzymatisch abgebautes Casein] 2,0, Glukose 10,0, eingestellt auf

pg 7,0, Agar 15,0),

17Calciummalat-Agar (Calciummalat 10,0, NH4C1 0,5, K,HP04 0,5, eingestellt auf pH 7,0, Agar 18,0),

18Maltose-Trypton-Agar (Maltose 10,0, Trypton 5,0 [Pankreasabbauprodukt von Casein mit hohem Tryptophatgehalt],

K,HP04 0,5, NaCI 0,5, FeS04# 7H,0 Spuren, Agar 15,0),

leCaseinstärke (Na-Caseinat 2,0, lösliche Stärke 1,0; K,HP04 0,2, M9S04# 7H,0 0,2, FeS04# 7H,0 Spuren, Agar 15,0),

=0Nährstärke-Agar (Fleischextrakt 3,0, Pepton [Hydrolysat von animalischem Protein mit niedrigem Molekulargewicht] 5,0, lösliche

Stärke 2,0, eingestellt auf pH 7,0, Agar 15,0),

a1Waksman's Stärke-Agar A (Maisstärke 2,0, K,HP04 0,3, M9C03 1,0, NaCI 0,5, NaN03 1,0, auf pH 7,0 eingestellt, Agar 15,0),

a3Waksman'sStärke-AgarB(löslicheStärke2,0,K,HP040,5,MgS04# 7H,00,2,CaC1,0,05,NaN030,05,Asparagin0,05,FeS04# 7H,0

Spuren, eingestellt auf pH 7,4, Agar 20,0).

Die Verwertung von Kohlenstoffverbindungen durch S. niveus in einem synthetischen Medium ist in Tabelle II gezeigt. Man arbeitete nach der Methode von Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, S. 107 bis 114 (1948), mit folgenden Abänderungen: (1) Geschüttelte Kolben wurden mit einer Bodenprobe von S. niveus geimpft. Die Kolben wurden auf einer hin- und hergehenden Schüttelmaschine bei 28° C bebrütet.

(2) Nach 120 Stunden wird das Überstehende abdekantiert, der Rückstand mit 100 ccm sterilem destilliertem Wasser gewaschen und das Überstehende wiederum abdekantiert. Dann gibt man zum gewaschenen Produkt 100 ccm steriles destilliertes Wasser und schüttelt weiter bei 28° C auf der Maschine.
(3) Nach weiteren 48 Stunden wird das Überstehende abdekantiert, der Rückstand wie oben gewaschen und 1 Minute im Waring-Mischer mit 100 ccm sterilem destilliertem Wasser vermischt.
(4) Die Agarkeile werden mit 0,2 ccm des gemischten Inokulums beimpft.

Die Kultur von S. niveus bildet verästelte fadenförmige Mycele, die aus den Luftmycelien sich erhebenden Conidiophoren sind unten gerade und oben korkzieherförmig. Die fruchtbaren Zweige treten in Büscheln auf und tragen längliche Conidien. Bei der Kultur auf Bennett's Agar (14 Tage Bebrütung bei 28° C) haben die Kolonien eine lederartige Textur mit kompakter Peripherie. Die sporenbildende Zone ist von blaß rahmweißer Farbe, die Rückseite von rahmgelber Farbe (Maerz und Paul, »A Dictionary of Color«, 2. Auflage, McGraw-Hill BookCo. 1950; Tafel 10, A-1, S. 43, und Tafel 11, F-4, S. 45). Das Wachstum und die Sporenbildung sind gut

Tabelle I1

Animilierung von Kohlenstoffverbindungen durch S. niveus

im synthetischen Medium von Fridham und Gottlieb

Medium ( Ergebnis Medium Ergebnis

Kontrollversuch . + Inulin . . . . . . . . . . - f-

d-Xylose. . . . . . . . + lösliche Stärke .

1-Arabinose ..... Glycerin . . . . . . .

1-Rhamnose ..... Dulcit . . . . . . . . -t-

d-Fructose ... + d-Mannit ......

d-Galactose ..... d-Sorbit . .. . ...

d-Glukose ..... --E- dl-Inosit ...... -4-

d-Mannose .... -f- Salicin.......... -E-

Maltose ....... Na-formiat ....

Sucrose . . . . . . . . Na-oxalat ...... Lactose . . . . . . . -f- Na-tartrat ...... Cellobiose ....... + Na-salicylat .... -

Raffinose ....... -f- Na-acetat ....... Dextrin......... Na-citrat ......

Phenol . . . . . . . . - Na-succinat ..... Kresol ........ -

positive Assimilierung.

- = negative Assimilierung.

-/- = positive Assimilierung - nur schwaches Wachstum.

bei Temperaturen zwischen etwa 24 und 32° C. Auf Bennett's Agar findet bei 37° C kein Wachstum statt.

Obschon S. niveus in einigen Beziehungen ähnlich ist wie S. albus NRRL B-1333 und S. cellulosae ATCC 3313 unterscheiden ihn seine in Tabelle III zusammengestellten Kulturcharakteristika von diesen Mikroorganismen.

Tabelle III

Unterscheidende Merkmale von S. niveus, S. albus NRRLB-1333 und S. cellulosae ATCC 3313

Medium - S.. niveus S. albus S. cellulosae

NRRL 2266 - -NRLL B-1333 ATGC 3313

Bennett's Agar kein Wachstum bei 37°C gutes Wachstum und gutes Wachstum, geringe

Sporenbildung bei 37° C Sporenbildung bei 37° C

d-Glucose-Agar schnee- bis aschenweiße rahmfarbige Sporen- rahmweiße Sporenbildung;

Sporenbildung, gelbe Bildung, Rückseite Rückseite gelblichbraun;

Rückseite, gelbes Chartreuse, gelbes gelblichbraunes Pigment

Pigment Pigment

Waksman's Tyrosin- hell-grau-weiße Sporen- schwaches Wachstum; schwaches Wachstum;

Agar bildung;Rückseite rahm- keine Sporenbildung; keine Sporenbildung;

farbig, schwachgelbes Rückseite Farbe des Rückseite Farbe des

Pigment Mediums Mediums

Caseinstärke-Agar rahmfarbige Sporen- schwach rahmfarbige rahmrosa Sporenbildung;

Bildung ; Rückseite Sporenbildung, Rück- Rückseite gelb

rahmfarbig seite gelb

Assimilierung von Kohlenstoffverbindungen

1-Rhamnose ............ - @+

d-Fructose ............. -E- -f-

Sucrose ................ -E- -

Lactose................. + -1-

Raffinose . . . . . . . . . . . . . . . + - (-)

Inulin ................. - (-)

Dulcit . . . . . . . . : . . . . . . . . . - (-)

dl-Inosit................

Na-Formiat ............ - (-)

Na-Oxalat .. . . . . . . . . . . . . = - (-)

Na-Tartrat.............. - (-)

-[- = positive Assimilierung.

(J = positive Assimilierung - nur geringes Wachstum.

= keine Assimilierung.

(-j = schwaches Wachstum - keine Assimilierung.

Zur Herstellung von N ovobiocin wird S. niveus im wäßrigen Medium, das vorteilhafterweise assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter sübmersen aeroben Bedingungen fermentiert. Wird jedoch frisch gesammelte Erde, die mit Sporen von S. niveus inoculiert ist, bei 28° C 10 Tage bebrütet, so finden sich keine Anzeichen einer antibiotischen Aktivität.

Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit werden für die Nov obiocinfermentierung gewisse Kulturmedien bevorzugt. Die zur Zeit bevorzugten Kohlenstofflieferanten im Nährmedium sind z. B. Kohlehydrate, wie Glucose, Sucrose, Dextrin und/oder eine Mischung von Glucose und Stärke. Andere Lieferanten sind Melassen, Maltose, Fructose, Inulin, Raffinose, Xylan, Lactose, Glycerin u. dgl. Der bevorzugte Stickstoftlieferant ist vDistiller's solublesc (getrocknetes Filtrat eines bei der Hefegärung erhaltenen Destillationsrückstandes). Andere Lieferanten sind Baumwollsamenmehl und dessen Derivate, Eiprodukte (Eipepton, ganzes Ei, Eigelb u. dgl.), Brauereihefe, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl und seine Derivate, Maisglutenmehl (Rückstand aus der Stärke und Glutenfabrikation), Fleischextrakt, Fleischprodukte wie Fleischmehl und Knochenschrot, tierischer Leim u. dgl., Guarsamenmehlprotein (Rückstand aus Samen von Cyamopsis tetragonalabus), Maiseinweichwasser, Fischmehl, Leinsamenmehl, getrockneter Kehricht, Lebermehl, Hefeextrakt (ein wasserlösliches, durch Autolyse von Hefe erhaltenes Produkt), Milchprotein u. dgl.
Anorganische Nährsalze, die sich mit Vorteil verwenden lassen, sind assimilierbare Salze, die Ionen wie Natrium, Kalium, Kalzium, Phosphat, Sulfat u. dgl. abgeben. Anorganische Stickstofflieferanten wie Nitrate oder Ammöniumsalze können ebenfalls Verwendung finden.
Wichtige Spurenelemente wie Magnesium, Mangan, Zink, Eisen u. dgl. können für die Kultur von S. niveus ebenfalls im Nährmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente werden meist bei der Zugabe der andern Komponenten des Mediums als Verunreinigungen eingeführt.
Zur Erzielung des besten Wachstums und der besten Entwicklung von S. niveus sollte das Kulturmedium vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus auf ein p" zwischen 7,5 und 8,5, vorzugsweise etwa 8,0, eingestellt werden.
Bei der Herstellung großer Mengen Novobiocin bevorzugt man submerse aerobe Kulturbedingungen. Zur Herstellung beschränkter Mengen des Antibiotikums kann man in Schüttelflaschen oder mit Oberflächenkulturen in Flaschen arbeiten. Erfolgt die Kultur in großen Behältern oder Tanks, bevorzugt man zur Beimpfung die vegetative Form des Mikroorganismus, um eine ausgesprochene Verzögerung der Bildung des Antibiotikums und dadurch eine schlechte Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Es wird deshalb bevorzugt, zunächst ein vegetatives Inokulum herzustellen, indem man eine verhältnismäßig kleine Menge des Kulturmediums mit Sporen des Mikroorganismus beimpft, und wenn ein junges aktives, vegetatives Inokulum entstanden ist, dieses aseptisch in die großen Behälter oder Tanks einführt. Das Medium, in dem das Inokulum erzeugt wird, kann gleich sein wie das Kulturmedium oder von diesem verschieden.
Die besten Ausbeuten an Novobiocin werden erhalten, wenn das Kulturmedium bei Temperaturen zwischen etwa 24 und etwa 32°C, vorzugsweise bei etwa 28°C, gehalten wird.
Das Verfahren der Erfindung beschränkt sich nicht auf die Erzeugung von Novobiocin durch S. niveus oder Organismen, welche den vorstehenden Charakteristiken voll entsprechen, die nur zur Illustration angeführt wurden. Es versteht sich, daß das Fermentierungsverfahren der vorliegenden Erfindung auch andere Novobiocin bildende Stämme von S. niveus, die man leicht durch routinemäßige Verfahren erzeugen und isolieren kann oder durch Modifizierungsverfahren, indem man einen gezüchteten Organismus auswählt und diesen modifizierenden Einflüssen wie Röntgenstrahlen, ultraviolettem Licht und Mutationen bewirkenden- Chemikalien, wie Stickstoffsenfen u. dgl., aussetzt. Die Geschwindigkeit der Novobiocinproduktion und die Konzentration des Antibiotikums im Kulturmedium lassen sich während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus durch Prüfung von entnommenen .Proben des Kulturmediums auf ihre Wirksamkeit gegen einen Organismus, von dem man weiß, daß er auf das Antibiotikum anspricht, wie K. pneumoniae (ATCC 10 031), leicht verfolgen. Hierzu empfiehlt sich ein Test, in welchem serienweise Verdünnungen der Kulturproben hergestellt werden, von denen man Portionen geschmolzenen Nähragars zusetzt, den Agar in einer Petrischale fest werden läßt, die Platte mit einer jungen Kultur von K. pneumoniae (ATCC 10 031) beimpft und die höchste Verdünnung des Kulturmediums feststellt, die noch eine vollständige Hemmung des Wachstums des Mikroorganismus auf dem Nähragar bewirkt.
Die Bildung des Novobiocins kann auch durch Prüfung der Trübung, wie sie bei der Herstellung anderer Antibiotika allgemein Anwendung findet, verfolgt werden. Im allgemeinen findet nach der Beimpfung die maximale Bildung des Antibiotikums bei submersen aeroben Kulturen zwischen etwa 2 und 6 Tagen statt.
Das antibiotische Material kann aus dem Kulturmedium durch Extraktion oder Adsorption, z. B. auf Ionenaustauschharzen, wie Permutit D. R. (ein poröses anionisches Polymer mit schwachem Anionenaustauschvermögen fürstarkeSäuren [s.U SA.-Patentschrift2702263, 2. Kolonne, Zeilen 62 bis 73]) u. dgl., und Eluierung des Antibiotikums. mit Eluiermitteln, wie wäßrige niedrige Alkanole u. dgl., isoliert werden. Für die technische Herstellung werden die Extraktionsverfahren bevorzugt, da sie wirtschaftlich und weniger zeitraubend sind.
Ein geeignetes Isolierungsverfahren- besteht darin-, das fermentierte Nährmedium anzusäuern - und - den erhaltenen Niederschlag zu trocknen. Man kann aber . den Niederschlag auch in einem wäßrigen Medium lösen und dann der `Gefriertrocknung unterwerfen, um das antibiotisch wirksame Material in Salzform zu erhalten.
Nach einer bevorzugten Methode zur Isolierung der antibiotisch aktiven Komponente wird das fermentierte Nährmedium in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem niedrigen Alkanol oder Alkylacetat, Alkylketon usw., extrahiert, - der erhaltene Lösungsmittelextrakt auf ein verhältnismäßig kleines Volumen eingeengt und aus dem erhaltenen Konzentrat - das Antibiotikum mit einem weiteren Lösungsmittel, das sich mit dem ExträktiönsmitteI mischt, ausgeführt. Hierbei fällt das Antibiotikum, in amorpher Form an. _ Nach einer weiteren Methode zur Isolierung von Novobiocin wird die ganze Kultur beim p$ 7 bis -10, vorzugsweise 8, filtriert; das. Filtrat mit Mineralsäure, wie H Cl, HIS 04, Phosphorsäure usw., auf einen pH-Wert zwischen 2 -und 7, vorzugsweise 6, eingestellt und das antibiotische Material mit einem niedrigen Alkylacetät@ vorzugsweise mit Amylacetät, Äthylacetät, Butylacetat od. dgl:, extrahiert. Man kann als Extraktionsmittel auch reit Wasser nicht mischbare niedrige Alkanole, wie n-Butanol, n-Amylalkohol, Isoamylalkohol u. dgl., wasserunlösliche Ketone, wie Methyl isobutylketon, Methyl-isopropylketon u. dgl.,. benutzen. Der Extrakt wird im Vakuum öder in sonst geeigneter Urleise konzentriert und dem Konzentrat ein Kohlenwasserstoff mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, d. h. Skellysolve Lösungsmittel, vorzugsweise solche mit 6 oder 7 Kohlenstoffatomen, wie Hexan (Skellysolve B) oder Heptan, zugesetzt. Das Antibiotikum wird ausgefällt und getrocknet, wobei man ein teilweise gereinigtes Produkt erhält. Zur weiteren Reinigung kann das Produkt bei saurem p$, z. B. unterhalb von etwa 4, aus Wasser-Aceton umkristallisiert werden: Novobiocin besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: Optische Drehung[a] bis 211 p - -63,0° (Konz.l °/a in absolutem Äthanol, 2 dm).
In kristalliner Form hat das Novobiocin zwei verschiedene Schmelz- oder Zersetzungspunkte. Eine Form, d. h. Form 1, schmilzt zwischen 174 und 178°C; die andere Form 2 zwischen 149 und 151'C (nach vielmaligem Umkristallisieren beträgt der Schmelzpunkt 152 bis 156°C).

Die Form 1 des kristallinen Novobiocins weist folgende Röntgendaten auf:

2 Flächenabstände t1
6,16 ........................ 14,34
9,02 ........................ 9,79
11,52 ........................ 7,67
13,18 ........................ 6,71
14,33 ........................ 6,17
15,88 ........................ 5,58
23,10 ........................ 3,85
25,90 ........................ 3,44
42,28 ........................ 2,14
49,05 ........................ 1,86

Die Form 2 des kristallinen Novobiocins weist folgende Röntgendaten auf

2 Flächenabstände t1

7,27 ........................ 12,16

12,27 ........................ 7,21

14,63 ...........:............ 6,05

21,14 ........................ 4,20

23,65 ........................ 3,76

25,95 ............:........... 3,43 .

28,21 ........................ 3,16

Die Daten wurden nach der Pulvermethode in einer Picker-Waite-Beugungseinrichtung mit nickelfiltrierter Kupfer-Kal-Strahlung ermittelt.

Kristallographische Eigenschaften

System ... ........, ... Orthorhombisch

Klasse ... : ... . ..... .. . Rhombisch Dipyramidal

Vorhandene Formen .... Makroprismatisch .... (210)

Brachydom . ......... (913).

Flächenwinkel . . - . . . . . 2107" 210 = 54,5°

013 @., 013 = 1440

Achsenverhältnis ....... 0,514:1:0,324

Zellendimension . . . . . . . . a = 13,56 A

`- b = 26,38 Ä

c = 8,54A.

Optisches: Vorzeichen ... negativ

Dispersion .. . . . . . . ... . : : . extrem, z > u

Allgemeine. Orientierung geneigte spitzwinklige Halbier

rungslinie ,

Brechungsindizes . . : . .-. a = 1,608

ß = 1,638

y = 1,654

Optischer Achswinkel ... 2 K = 71

Optische Orientierung . . a = x -

b-y -. a

3

Molare Refraktion ...... a, ß, y = 1,633,

Dichte = 1,3448

Mr = 164,23 (D)

Molekulargewicht ....... Röntgenkristallographische

Messungen ergeben ein

Molekulargewicht von 618

Novobiöcin ist in wäßrigen Medien bei p11-Werten oberhalb 'von etwa 7,5 löslich (> 100 mg/ccm). Mit Abnahme des pA-U'ertes von 9,0 nach 5,0 nimmt die Löslichkeit ab. Das Antibiotikum löst sich in niedrigen Alkanolen, wie Methanol, Äthanol u. dgl., niedrigen Alkylacetaten, wie Äthylacetat ü. dgl., Methyläthylketon und Aceton.

Die Elementaranalyse des Novobiocins ergibt folgende Werte

Element

C ... . ............................ 59,406/o

H ....................:.......... 6,446/6

............................... 4,54-6/6

0 (Differenz) ..................... 29,626/6

aus vorstehenden U"erten berechnet sich die Bruttoformel des Novobiocins zu C36_32H38-42011-12N2# Die elektrometrische Titration in Wasser zeigt die Anwesenheit von zwei sauren ('Truppen an pKa, (Niederschlag), pKa, = 9,1. Die Absorptionsspektren im Ultraviolett bei verschiedenen pH-Werten (zwischen 1 und 7) in Wasser ergeben ein pKa, von 4,3, In Dimethylformamid sind zwei Umkehrpunkte: pKal = 5,7 und pKa, = 11,9. Das berechnete Äquivalenzgewicht für C36HseO12N2 und C31H42011N2 = 618; gefunden 636.
Die polarographische Untersuchung von Novobiocin (Form 1 und 2) ergab, daß die Verbindung in 1:1-Äthanol-Wasser-Lösung, die 0,001 n-H2S04, 0,05 n-(CH3)4NCI oder 0,001 n-K O H als Elektrolyt enthielt, an der Quecksilbertropfelektrode nicht reduzierbar ist. Die Potentialbereiche waren 0 bis -1,5, 0 bis -2,0 und 0 bis -2,0 Volt gegen S. C. E. für saure, neutrale bzw. alkalische Lösungen.
Kristallines Novobiocin ist etwas lichtempfindlich, indem es am Licht gelb wird und etwas seiner biologischen Wirksamkeit einbüßt. Lösungen sind beim p$ 2 bis 10 und 4'C 60 Tage stabil.

Nach viehmaligem Umkristallisieren erhielt man folgende Elementaranalyse:

Element

C ................................. 59,696j6

H ............................... 6,666/6

N ...............................- 4,486/6

0 (Differenz) ..................... 29,176/6

Verdünnte wäßrige Lösungen, d. h. 0,1 bis 1 mg/ccm, die 60 Tage bei 25°C gehalten wurden, zeigten bei Prüfung in vitro folgende Stabilität:

p$ Halbwertszeit

2 ............................... >60 Tage*

7 bis 10 ........................ 60 Tage

12 ............................ . 3 Tage

Keine Anzeichen von Verlust au biologischer Wirksamkeit

nach 60 Tagen.

Mit dem Beckman-Quarz-Spektrophotometer Modell DU oder dem Carry-Registrierspektrophotometer ergibt Novobiocin (Form 1 und 2) folgende UV-Spektten: In 956/6igem Äthanol mit 0,01 n-H2S04-Gehalt gelöst (Fig. 1, gestrichelt)

Maxima , - Wendepunkte

334 m#t, EE.6. = 437,0 250 m#t, E'1'"". = 210,8

262 m#t, El..-. = 192,8

282 m#t, Ei m = 206,8

304 mp" E,".". = 273,1

In 956/6igem Äthanol mit 0,01 n-KOH-Gehalt gelöst (Fig.1, ausgezogen):

Maxima Minima Wendepunkte

311 m#t, Ei m = 512,4 263 mit,, El l%.. = 162,5 237 mit,, Ei m = 313,8

255 m#t, Ei ö = 205,4

287 m#t, EIL = 347,6

Das charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum (Natriumchloridprisma) des kristallinen Novobiocins der Form 1 (Fig. 2) in Mineralölsuspension zeigt Absorptionsbanden (in cm-1 ausgedrückt), bei folgenden Frequenzen: 3500, 3445, 3395, 1744, 1738, 1694, 1642, 1607, 1542, 1500, 1374, 1360, 1320, 1294, 1280, 1252, 1235, 1219, 1162, 1138, 1124, 1103, 1091, 1080, 1062, 1029, 1000, 969, 930, 904, 879, 846, 800, 789, 770, 755, 739 und 716.

Das Infrarotabsorptionsspektrum (Natriumchloridprisma) der kristallinen Form 2 (Fig. 3) zeigt Absorptionsbanden (in cm-' ausgedrückt) bei folgenden Frequenzen: 3480, 3360, 3280, 1715, 1690, 1635, 1610, 1586, 1507, 1374, 1344, 1315, 1293, 1259, 1186, 1157, 1121, 1084, 1064, 1022, 998, 972, 934, 919, 837, 818, 809, 789, 781, 761, 753 und 741.
Die sauren und/oder neutralen Metallsalze des Novobiocins einschließlich der Alkali- und Erdalkalisalze stellt man in der Weise her, daß man eine wäßrige oder organische Lösung oder Suspension des Antibiotikums ein oder zwei Äquivalente einer wäßrigen Base wie NaOH, K O H, [(Ca(O H)2 Ba(0 H) 2] u. dgl. oder den entsprechenden Alkoxyden, wie Methoxyden (in wasserfreiem Medium), zugibt und trocknet, indem man die Lösung entweder im Vakuum zur Trockne eindampft oder der Gefriertrocknung unterwirft. Verwendet man beispielsweise ein Äquivalent der Base, so erhält man das entsprechende Monoalkali- bzw. -erdalkalisalz des Novobiocins.
Saure Salze des Novobiocins erhält man auch durch Zusatz eines Salzes einer schwächeren Säure, d. h. eines .Mkalicarbonats, -bicarbonats, -acetats od. dgl., zu einer wäßrigen oder organischen Lösung oder Suspension des Antibiotikums und vorzugsweise zu einer organischen Lösung desselben, ein Eindampfen oder Abfiltrieren des Niederschlags vom organischen Lösungsmittel.
Eine weitere Methode zur Herstellung der sauren Salze des Novobiocins ist die doppelte Umsetzung, bei der ein saures Salz des Antibiotikums mit einem anorganischen Salz umgesetzt wird; gibt man beispielsweise saures Natriumnovobiocin zu einer wäßrigen oder organischen, z. B. äthanolischen Lösung von Calciumchlorid, so erhält man das saure Calciumnovobiocin als weißen Niederschlag.
In analoger Weise erhält man bei Behandlung des Antibiotikums mit zwei Äquivalenten einer Base wie NaOH, KOH, Ca(OH)2 oder Ba(OH)2 u. dgl. die entsprechenden Neutralsalze des Novobiocins.
Das neutrale Dinatriumsalz des Novobiocins hat folgende Bruttoformel: C36_32H36--46N2011-12Na2-

Berechnet für C36Hs6N2012Na2 und-C"H46N2011Na2:

Na 6,94;

gefunden .............................. Na 6,77.

Das neutrale Dikaliumsalz des Novobiocins hat die Bruttoformel C36-32Hs6-46N2011-12K2.

Berechnet für C36H86N2012K2 und C"H46N2011K2#

K 11,25;

gefunden .............................. K 11,14.

Das charakteristische Infrarotspektrum des neutralen Dinatriumsalzes des Novobiocins mit einem Natriumchloridprisma in Mineralölsuspension zeigt Absorptionsbanden (Fig.4), in cm-' ausgedrückt bei folgenden Frequenzen: 3360, 2190, 1718, 1645, 1605, 1525, 1465, 1425, 1377, 1325, 1265, 1217, 1132, 1115, 1084, 1022, 995, 969, 955, 825, 797, 771, 740 und 717.
Zur Herstellung der Amin- oder Ammoniumsalze des Novobiocins wird eine Lösung des Antibiotikums in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Propanol (und dessen Isomeren), Butanol (und dessen Isomeren) u. dgl., Amylacetat usw. mit einem Äquivalent Ammoniak oder des gewünschten Amins, wie Mono-, Di-und Trimethylamin, Mono-, Di- und Triäthylamin, Mono-, Di- und Tripropylamin (iso- und normal), Äthyldimethylamin, Benzyldiäthylamin, Cyclohexylamin,Benzylamin, Dibenzylamin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin, bis-(Ortho-methoxyphenylisopropyl)-amin und ähnlichen niedrigaliphatischen, niedrigcyclöaliphatischen und niedrigarylaliphatischen Aminen mit bis einschließlich 8 Kohlenstoffatomen; heterocyclischen Aminen, wie Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, Piperazin und deren niedrige Alkylderivate, wie 1-Methylpiperidin, 4-Äthylmorpholin, 1-Isopropylpyrrohdin, 1,4-Dimethylpiperazin, 1-n-Butylpiperidin, 2-Methylpiperidin, 1-Äthyl-2-methylpiperidin, Aminen, die wasserlöslichmachende oder hydrophile Gruppen enthalten, wie Mono-, Di- und Triäthanolamin, Äthyldiäthanolamin, n-Butyl-monoäthanolamin, 2-Amino-l-butanol, 2-Arnino-2-äthyl-1,3-propandiol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Trisoxymethyl-aminomethan, Phenylmonoäthanolamin, p-Tertiäramylphenyldiäthanolamin, und Galactamin, N-Methylglucamin, N-Methylglucosamin, Ephedrin, Phenylephedrin, Epinepherin, Procain, usw. ; Tetraäthylammoniumhydroxyd u. dgl., quaternäre Ammoniumhydroxyde; Guanidin u. dgl., umgesetzt.
In analoger Weise kann man andere Salze des Novobiocins herstellen, indem man das Antibiotikum mit komplexeren Aminen, wie N eomycinen (einschließlich Neamin, Neomycin und Neomycin C), Erythromycinen (Erythromycin und Erythromycin B), Tetracyclinen usw. umsetzt.

Novobiocin und dessen Salze kennzeichnen-sich durch ihre große antibakterielle Wirkungsbreite. Die Wirksamkeit des Antibiotikums gegen verschiedene Mikroorganismen ist in der folgenden Tabelle .zusammengestellt:

Tabelle IV

Antibakterielle Wirkungsbreite - Minimale Hemmungskonzentration (mg/ml)

*Minimale Hemmungskonzentration in mg/ml

Organismus IHirn-Herz-MediumI ' 2 Synthetisches Medium (7 AW) An äere Medien

Grampositiv

M. aureus 284 .................................. 0,1 0,04

S. hemolyticus C 203 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,1 0,39

S. hemolyticus L-2 .............................. 0,78

S. viridans U 25-11 .............................. 0,78 25

S. viridans L-17 .............................. 25

S.fecalis 176 ................................... 1,56 0,78

S.fecalis 6057 .................................. 1,56 -

S. uberis 175 ................................... 6,2

S. agalactiae 7077 ............................... - 0,39

D. pneumoniae FI ............................... 1,56 0,78

C.sporogenes ................................... - 25

C. novyi UC 213 ................................ 25 12,5

M..albus 151 .................................... 0,2 -

B. subtilis (Ill. strain) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 -

L. mesenteroides ................................ 2,5

L. citrovornm UC-221 . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 -

C. faciens UC 168 ................. ......... . .... - 1,56 3Difco NIH

C. diphtheriae .................................. - 0,04

C. diphtheroides................................: - 3,1

L. monocytogenes ............................... - 1,5

B. anthracis .................................... - - 1,0

Gramnegativ

A. aerogenes ATCC 8308 ......................... 12,5 - i

A. aerogenes 1-1 ................................ 50

E. coli ATCC 26 ................................ 50 -

E. coli 9-12 .................................... - > 100

E. coli L-74 .................................... - > 1,00

P. vulgaris ATCC 8427 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,25 -

P. vulgaris ATCC 6380 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - > 100

P. vulgaris P-2 ................................. - > 100

P. vulgaris 43 ................................... 3,1 `100

P. vulgaris 47 ................................... 25 400

P.vulgaris 58 ................................... 6,2 > 400

P. vulgaris ATCC 6897 . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 25

P. vulgaris 347 .................................. 3,1 100

P. morgani 59 .................................. 400 > 400

P. morgani 99 .................................. 50 200

P. morgani 118 ................................. 200 j > 400 ,

Fortsetzung Tabelle IV

Organismus *Minimale Minimale Hemmungskonzentration in mg/ml

Organismus zSynthetisches

1Hirn-Herz-Medium l Medium (7 AW) I Andere Medien

Gramnegativ

P. rettgeri 74 ,.................................. > 100 > 400

P.rettgeri 100 ....................... .......... 6,2 50

P. rettgeri 121 .................................. > 100 > 400

Ps. aeruginosa ATCC 9027 ....................... > 400 -

Ps. aeruginosa 10 145 . .......................... - > 100

Ps. aeruginosa L-55 ............................. - > 100

Ps. aeruginosa YED ............................. - > 100

Pseudomonas sp. B 20 ........................... > 400 > 400

Pseudomonas sp. B 22 ........................... > 400 > 400

Pseudornonas sp. C 33 ............................ 12,5 12,5

Pseudomonas sp. C 40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12,5 12,5

Pseudomonas sp. C 77 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12,5 12,5

Pseudomonas sp. C 79 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12,5 12,5

Pseudomonas sp. C 85 ............................ > 400 > 400

S. paratyphi B Ho. 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 400 > 100

S. pullorum 75 .................................. 50 > 100

S.typhi TG-3 ................................:. 12,5 > 100

S. marcescens ATCC 60 .......................... 25 -

K. pneumoniae AD .............................. 6,25 > 100

K. pneumoniae K 2 ................... . ........ - 100

P. multocida 449 .............................. 1,56 0,78

S. gallinarum 74 . . . . . . . . . . . . . ._. . . . . . : . " "........... - > 100

S. fiesneri 77 ... : . . . . . . . . . . . . . . . . . . : . . . .-. . . . _ . : . - > 100

S.flexneri 73 ................................... - > 100

X. pruni .............................. ,........ - - 3 Difco NIH

X. campestris . .. . . .. . . .. .. . . ... . . . . .. . . .. . . . . . . . 50 - 1;56 Difco NIH

A. tumefaciens ........................ . . .... . . 100 - ° 1,56 Difco NIH

E. carotovora .......................... ........ > 100 -

E. Amslovora ......... ...................... > 100 = 100 Difco N IH

N. gonorrheae 337 . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 1,5 25 4(Blut-Agar)

N. meningitidis UC-546 . ..... . . . . . . . . . .. . . . . .. .. . 1,5

N. meningitidis UC-548 .-................ ...... . ` 0,39

N. meningitidis UC-549 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 0,09

S. enteriditis .................................... - - 50,0

Shig.fiexneri ................................... - - 50,0

Malleomwes mallei . . .... . ... . . . .. . . . .. . . ... . ... . - - 3,0

P. pestis ....................................... - - 30,0

Brucella suis .................................... - - 3,0

teilweise bei 1,0

Bacterium tularense ............................. - - = 3,0

-teilweise bei 1,0

Säurefest

11. tuberculosis H 37 Rv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 2,5 (7 Tage Test)

- (5Kirchner's

Nährbouillon)

*iNiedrigste Konzentration des Antibiotikums, welche das Wachstum bei 37' C innerhalb 18 bis 24 Stunden vollkommen verhindert.

'Infusion von Kalbshirn 200, Infusion von Rinderherz 250, Proteosepepton (teilweise hydrolysiertes Protein) 10,0, Dextrose 2,0,

Natriumchlorid 5,0, Dinatriumphosphat 2,5 (Bestandteile in g11).

=Synthetisches Medium (7 AW Medium)

Glukose ....................................... 2,5 g Z3racil........................................... 0,5 mg

N acl ......................................... 2,5 g Nicotinsäure . ................................ O ,l mg

KF.=P04 .. ................................... 3,0 g Thiamin-Chlorhydrat.......................... .... 0,1 mg

N-7--Amin A ... . .... .............. . 4,0 g M9S 04 .................................. - ....... 100 mg

HefeAxtral,-t (Fleischmann Ho. 3) ..... ..... . .. ... 0,5 mg MnS04 . . .. .. . . . ... . . .. . . . . . . .. . . . . ... . . .. .... . .. 510M9

Tyrr>in ...................................... 0125M9 FeS 04 ................. ....... ,................. 510M9

Try--tophan .... .. . . . ... . . ..... 7,0 mg Aqua dest. .. .. .. ............1000 ml

mit @ 3,1 1-NaOH auf pg 7,5 eingestellt, 10 Minuten im Autoklav bei 120° C und #6,8 kg Druck behandelt.

"In Cramm pro Liter: Cassitone (Panlreasabbauprodukt des Caseins) 15,0, Hefeextrakt 5,0, Dextrose 1,0, latriumchlorid 2,5,

1-Cystein 0,05. 10 Minuten bei 120'C und 6,8 kg Druck im Autoklav behandelt.

-'In Gramm pro Liter: Proteose Pepton 15,0, Dextrose 2,0, lösliche Stärke 10,0, Natriumchlorid 5,0, Dinatriumphosphat 3,0, Gelatine

20,0 und Agar 10,0. 15 Minuten bei 121° C und 16,8 kg Druck im Autoklav behandelt, auf 45 bis 50' C abgekühlt und mit 50 ml ent-

&briniertem Blut pro Liter versetzt.

sln Gramm pro Liter: Asparagin 5,0 Mononatriumsulfat 0 ,6, `atriumcitrat 2,5, Feriammoniumcitrat 0,05, Glycerin 20 ml, Poly-

sorbat 80, 0,5 r71. 10 Minuten bei 120'C und 6,8 kg Druck im Autoklav, dann Zusatz von 20/0 Rinderserumalbumin.

Infolge seines hohen Wirkungsspiegels gegen L. mesenteroides, den Organismus, der die Verstopfung der Leitungen in der Zuckerindustrie hervorruft (Frobisher, Fundamentals of Bacteriology, S. 555, 3. Auflage, 1944) sind Novobivein und dessen Derivate wertvoll zur Behebung dieses unerwünschten Zustandes. Das Antibiotikum wird in der ersten Stufe des Raffinationsprozesses der Rohzuckerlösung in Mengen von 1 bis 10 mcg/ ml zugesetzt, worauf die Lösung die folgenden Raffinationsstufen durchläuft. Novobiocin und dessen Derivate eignen sich auch in Form einer Zerstäubung (Konzentrationen von 0,5 bis 5 mcg/ml) zur Behandlung der Kronengalle, die durch A. tumefaciens an Wurzelpflanzen und der durch X. campestris hervorgerufenen Welkkrankheit.

ovobiocin und seine Derivate sind zur Bekämpfung vieler bei Mensch und Tier durch Mikroorganismen hervorgerufenen Infektionskrankheiten wertvoll. Hierfür wird das antibiotische Material zweckmäßig mit einem pharmazeutisch geeigneten flüssigen oder festen Träger gemischt und in geeignete Dosierungsformen gebracht. Falls gewünscht, können weitere Antibiotika und andere therapeutische Mittel, z. B. Sulfonamide, zugesetzt werden.

Beispiel 1 In einen 500 ccm fassenden Erlenmeyerkolben gibt man:

Glukosemonohydrat . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g

Baumwollsamenöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0 g

Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml

Man sterilisiert im Autoldav 20 Minuten bei 120°C und 6,8 kg Druck. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit einer wäßrigen Sporensuspension von S. niveus NRRL 2466, erhalten auf einem Maitose-Trypton-Schrägagar (Zusammensetzung in g/1 Maltose 10, Trypton 5, K2 H P 04 0,5, Fe S04 - 7H30 0,1, Agar 15) und bebrütet 3 Tage bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine nach Gump (250 Touren pro Minute mit 6 cm Rüttelbewegung). 0,2 ccm dieses vegetativen Saatgutes verwendet man für die Beimpfung eines 500-ccm-Erlenmeyerkolbens, der folgendes Medium enthält

Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,8 g

Distillers solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 g

Wasser q. s. ...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ml

Na OH bis zum p, 7,8 bis 8,0

Vor der Beimpfung wurde der Kolben im Dampfautoklav bei 120°C und 6,8 kg Druck, 20 Minuten sterilisiert (das pH des Mediums nach der Sterilisation war zwischen 6,2 und 7,5). Das Kulturmedium wird nach dem Abkühlen und Impfen auf einer rotierenden Schüttelmaschine nach Gump (250 Umdrehungen pro Minute und 6 cm Rüttelbewegung) bei 28°C bebrütet. Am 3., 4. und 5. Tag wurde die Wirksamkeit des Mediums bestimmt. Während des Wachstums der Kultur fällt das Anfangs-pH von 6,5 auf etwa 6,0, wonach es ständig auf 8,0 bis 8,5 ansteigt. Nach 5 bis 6 Tagen war die unter diesen Bedingungen erzielbare Höchstproduktion etwa 400 mcg/ccm.

Erhöht man die Menge des @>Distillers solublesr auf etwa- 4,0 g, so erhält man eine merkliche Erhöhung des antibiotischen Titers. Ersetzt man Glukosemonohydrat durch Sucrose (etwa 2,5 bis 4,0 g/100 ccm Medium), so erhält man ebenfalls eine wesentliche Steigerung des antibiotischen Titers.
Die antibiotische Wirksamkeit wurde mittels des Standard-Diffusionsversuchs bestimmt, indem man die Zone der Inhibierung gegen K. pneumoniae (ATCC10031) um ein mit der zu prüfenden Lösung getränktes Filterpapier mißt, das auf ein mit dem Testorganismus beimpftes Prüfagarmedium für Novobiocin gelegt ist.

Beispiel 2 In einen 500-ccm-Erlenmeyerkolben gibt man 100 ccm des folgenden sterilen Mediums: Medium A

Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g

Natriumchlorid . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 59

Pepton (hydrolysiertes Fleischprotein) ....... 5 g

Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g

Leitungswasser q. s. .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1

Nach Beimpfung mit einer wäßrigen Sporensuspension von S. niveus wird auf einem hin- und hergehenden Schütteltisch bei 28°C 72 Stunden bebrütet. Die erhaltene Kultur wird Vorkultur genannt.

Ein 25-1-Fermentierbehälter aus rostfreiem Stahl, der 121 des folgenden sterilen Mediums enthielt Medium B

Brauner Zucker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g

Glycerin .................................. 5 g

Lactose .................................. 5 g

Dextrin .......... . ................. 5 g

Distillers solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 g

Bierhefe (S. cerevisiae für alkoholische Gärung) . 2 g

Natriumchlorid ........... » ............... 5 g

Ammoniumnitrat ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g

Maiseinweichwasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g

Calciumcarbonat .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 g

Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 1 1

wird mit 25 ccm der oben erhaltenen Vorkultur beimpft. Man bebrütet 2 Tage bei 28°C. Die erhaltene Kultur wird Saat genannt.

In einen 3781 (100 Gallonen) fassenden Gärtank aus Stahl, der mit Harz ausgekleidet ist und 2401 des sterilen Mediums B enthält, gibt man 121 der vorstehend erhaltenen Saat. Das Fermentiermedium wird auf 28°C gehalten und unter Rühren (280 Touren pro Minute - Saugrohrtyp-Rührer) mit 5,66 m3 Luft pro Stunde belüftet. Zur Schaumbekämpfung gibt man am Anfang 300 ml Lardöl zu und im Verlauf der Fermentation weitere 800 ml einer 1°/@gen Lösung von Octadecanol in Lardöl. Nach 91 Stunden wird die Würze geerntet.
Eine aliquote Probe von 250 ccm der Würze, die 300 mcg/ccm Antibiotikum enthält, wird durch Zusatz von 140 ccm 50°/Qiger Natronlauge auf p$ 8,0 eingestellt: Man filtriert unter Verwendung von 12 g Dicalite (Infusorienerdefilter). Durch Zugabe von 12 n-Schwefelsäure steilt man das Filtrat auf ein konstantes pH von 2,0. Der Niederschlag wird abgetrennt, in Wasser wieder gelöst, indem man das pg mit Natronlauge auf 9,0 stellt. Die Lösung wird dann der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält so 117 mg Dinatriumnovobiocin mit einer Wirksamkeit von 500 mcg/mg (K. pneumoniae, biologischer Test).

Beispiel 3 Zu sechs Erlenmeyerkolben von j e 500 ccm Inhalt gibt man je 100 ccm des folgenden sterilen Mediums:

Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g

Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 g

Pepton ................................... 5 g

Fleischextrakt ............................ 10 g

Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1

Nach Beimpfung werden die Kolben auf einer Schüttelvorrichtung 72 Stunden bei 28°C bebrütet. Man erhält so die Vorkultur: 3001 des folgenden sterilen Mediums:

Glukosemonohydrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 g

Baumwollsamenmehl (extrahiert) . . . . . . . . . . . . 40 g

Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1

werden in einem mit Harz ausgekleideten, 9081 fassenden Stahltank mit 600 ccm der oben erhaltenen Vorkultur geimpft. Man belüftet mit 2261 Luft pro Minute und rührt mit einem kührer mit gebogenen Flügeln mit 200 Touren pro Minute bei 28°C während 48 Stunden. Zur Verhinderung des Schäumens gibt man am Anfang 300 ccm Lardöl und während der Fermentierung 1100 ccm einer 10Joigen Lösung von Octadecanol in Lardöl. Die erhaltene Kultur ist das Saatgut.

Zu 50001 des folgenden sterilen Fermentationsmediums:

Glukosemonohydrat ....................... 14 g

Stärke ................................... 12,5 g

Distillers solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g

Genügend Na OH zur Einstellung des pA auf 8,0

Leitungswasser q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1

in einem 75701 fassenden Tank aus rostfreiem Stahl gibt man 3001 der oben erhaltenen Saat. Man hält bei 28° C, belüftet 22601 Luft pro Minute und rührt mit zwei Turborührern mit gebogenen Flügeln bei 166 Touren pro Minute. Zur Verhinderung des Schäumens setzt man am Anfang 51 Lardöl zu und während der Fermentation 12,51 einer einprozentigen Lösung von Octadecanol in Lardöl. Nach 115 Stunden wird die Kultur geerntet.

2251 der Kultur werden mit 140 ccm 50°/oiger Natronlauge auf pn 8,1 gestellt. Man filtriert mit 10 kg Dicalite. Das p1; der geklärten Lösung wird durch Zusatz von 30 ccm konzentrierter Schwefelsäure auf 6,0 gestellt, wonach man mit 701 Amylacetat extrahiert. 100 ccm des Amy lacetates werden mit 600 ccm Skellysolve B behandelt und der Niederschlag abfiltriert. Das feste Material wird in einer Mischung von 400 ccm Aceton und 350 ccm Wasser gelöst und mit 25 ccm 1 n-Salzsäure und 100 ccm Wasser versetzt. Das erhaltene kristalline Material wird durch Filtration gewonnen. Man erhält so Novobiocin in praktisch reiner Form 1000 mcg/mg (K. pneumoniae biologische Plattenprüfung) vom Schmp. 149 bis 151'C. Nach viermaligem Umkristallisieren aus Aceton-Wasser-Mischung erhält man ein bei 152 bis 156°C schmelzendes Produkt.
Beispiel 4 Zu 10g kristallinem Novobiocin in 300 ccm Wasser gibt man 32 ccm (2 Äquivalente) 1 n-Natriumhydroxyd. Die Lösung wird filtriert und der Gefriertrocknung unterw-orfen. Man erhält das Dinatriumsalz (neutrales Natriumsalz) des Novobiocins als weißes amorphes Produkt. Die Prüfung ergibt 960 mcgjmg (K. pneumoniae, biologische Prüfung). Das feste Produkt ist wasserlöslich. Beispiel 5 Zu 1 g in 20 ccm Amylacetat gelöstem Novobiocin gibt man 0,162 g (1 Äquivalent) di-n-Propylamin. Der erhaltene weiße, amorphe Niederschlag, das saure di-n-Propylaminsalz des Novobiecins (1,1 g) wird abgetrennt und getrocknet.

Analyse für C"H"01.2-X;3:

Berechnet ...... N 5,99;

gefunden........ N 5,72.

Das charakteristische Infrarotabsorptionsspektrum dieses Salzes (in hlineralölsuspension) zeigt, in cm-' ausgedrückt, Absorptionsbanden bei folgenden Frequenzen: 3370, 3190, 1709, 1633, 1602, 1527, 1494, 1335, 1275, 1215, 1137, 1119, 1090, 1022, 995, 971, 952, 818, 774, 762, 744 und 719.
Arbeitet man gleich wie im Beispiel 5, ersetzt aber das di-n-Propylamin durch 0,162 g Triäthylamin, so erhält man das Triäthylaminsalz des Novobiocins.
Beispiel 6 25 g (40,5 Millimol) Novobiocin werden in 167 ccm Methyläthylketon gelöst. Die Lösung gibt man in einen 250-ccm-Dreihalskolben und setzt 2,7 ccm Wasser zu. Zu der kräftig gerührten Lösung gibt man im Verlauf von 30 Minuten insgesamt 2,13 ccm 19 n-Natronlauge. Während des Alkalizusatzes hält man die Lösung zwischen 50 und 60°C und rührt dann weitere 45 Minuten bei dieser Temperatur. Man läßt dann auf 40°C abkühlen und rührt bei dieser Temperatur eine weitere Stunde. Man filtriert vom so erhaltenen kristallinen Mononatriumnovobiocin ab, trocknet etwa 1 Stunde an der Luft und über Nacht im Vakuum. Man erhält 23,94 g kristallines Produkt, dessen Prüfung 940 bis 950 Mikrogramm pro Milligramm ergibt und das folgende Eigenschaften aufweist: ein Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 304 m#t, Eil = 345; Absorptionsbänder im Infrarot (Mineralölsuspension) bei folgenden Frequenzen in cm-1: 3480, 3340, 1715, 1705, 1655, 1630, 1600, 1522, 1498, 1426, 1370, 1327, 1270, 1215, 1165, 1134, 1115, 1085, 1020, 996, 969, 950, 890, 817, 785, 771, 739 und 715 (Fig. 5). Beispiel 7 Zu 61,8 g (0,1 Mol) Novobiocin, die in 250 ccm Aceton suspendiert sind, gibt man eine Lösung von 4,0 g (0,1 Mol) Natriumhydroxyd in 50 ccm Wasser. Unter Bildung des Mononatriumsalzes erhält man eine klare Lösung. Zu dieser Lösung gibt man 12,7 ccm 4 n-Calciumchlorid (1 Äquivalent), erwärmt schwach und rührt, bis die Kristallisation gut eingesetzt hat (etwa 45 Minuten). Unter ständigem Rühren füllt man langsam mit Wasser auf 600 ccm auf. Die so erhaltene Suspension von Monocalciumnovobiocin wird über Nacht im Kühlschrank gehalten und dann filtriert. Das Produkt wird mit etwa 100 ccm Wasser gewaschen, abgepreßt und auf Filterpapier ausgebreitet an der Luft getrocknet. Nach 24 Stunden wird das saure Calciumsalz im Vakuum getrocknet, wonach man 54,8 g (86 °/o Ausbeute) eines beinahe weißen mikrokristallinen Pulvers erhält.
Das Infrarotabsorptionsspektrum des Monocalciumnovobiocins (in Mineralölsuspension) zeigt Absorptionsbanden bei folgenden Frequenzen (Fig. 6), in cm-' ausgedrückt: 3480, 3340, 1715, 1702, 1650, 1620, 1600, 1521; 1500, 1425, 1330, 1262, 1214, 1170, 1132, 1111, 1085, 1020, 993, 969, 958, 895, 817, 785, 767, 760, 737 und 712. Beispiel 8 Zu einer Suspension von 10 g Novobiocin in 100 ml Wasser gibt man 32,4 ccm (2 Äquivalente) 1 n-Kaliumhydroxyd. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält 11,0 g amorphes @Dikaliumnovobiocin, dessen Prüfung 900 mcg/mg ergibt. Beispiel 9 Zu einer Suspension von 10 g Novobiocin in 100 ccm Wasser gibt man 1,2 g (2 Äquivalente) Calciumhydroxyd. Die erhaltene Lösung wird filtriert und das Filtrat der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält 9,6 g Dicalciumnovobiocin in amorpher Form mit einem Gehalt von 780 mcg/mg.
Das Infrarotabsorptionsspektrum (in Mineralölsuspension) zeigt Bänder bei folgenden Frequenzen in cm-': 3340, 3200, 1715, 1702, 1650, 1602, 1525, 1430, 1332, 1265, 1217, 1135, 1090, 1030, 995, 968, 955, 820 und 767 (Fig. 7).

Claims

PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von Streptomyces niveus und dessen Mutanten und Varianten für die Herstellung von Novobiocin auf üblichem biologischem Wege, gegebenenfalls Geyvinnung des Antibiotikums aus dem Gärmedium durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und gegebenenfalls Überführung des Antibiotikums in seine Salze.