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Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin Gegenstand des Patents
1184 457 ist eine weitere Ausbildung des Verfahrens nach Patent
1109 834 zur Herstellung von Griseofulvin durch aerobe Submerskultur eines
Griseofulvin produzierenden Organismus in einem dafür geeigneten Nährmedium, wobei
das Nährmedium zunächst frei von oder zum mindesten arm an Kohlehydraten gehalten
und nach steilem Aufstieg des pH-Wertes durch wiederholte Zugaben von Kohlehydraten
zu der Kultur der etwa optimale pH-Wert aufrechterhalten wird und diese Kohlehydratzugaben
in bestimmten Mengen und Zeitabständen erfolgen, welche darin besteht, daß der Stickstoffanteil
im Nährmedium mehr als 0,3 °/o, vorzugsweise jedoch nicht mehr als 0,5 °/s, vorteilhaft
nicht mehr als 0,45 °/fl beträgt.
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In weiterer Ausbildung dieses Verfahrens wurde nun ein Verfahren gefunden,
um Griseofulvin in erhöhten Ausbeuten zu erhalten, bei dem ein Teil des assimilierbaren
organischen Stickstoffs durch Ammoniak oder Ammoniumsalz ersetzt wird.
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Durch diese Ersetzung wird, abgesehen von einer wesentlichen Verbesserung
der Fermentation vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt aus, eine wesentliche Verbesserung
des erzielbaren Titers ermöglicht. Es ergibt sich, daß durch den Einschluß von Ammoniak
oder Ammoniumsalzen, die rasch assimilierbar sind, in das Medium im Vergleich mit
den organischen Stickstoffquellen sich eine Stimulierung des Wachstums des Organismus
in den frühen Fermentationsstufen erzielen läßt und daß diese Stimulierung sehr
günstig ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin durch
aerobe Submerskultur eines Griseofulvin erzeugenden Organismus in einem dafür geeigneten
Nährmedium besteht darin, daß der assimilierbare Stickstoff in diesem Medium durch
mindestens eine komplexe Stickstoffquelle und durch Ammoniak oder ein Ammonsalz
geliefert wird.
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Das komplexe organische stickstoffhaltige Material kann beispielsweise
von irgendeiner bei der technologischen Fermentierung gebräuchlicherweise verwendeten
Art sein, wobei geeignete Materialien Maisquellflüssigkeit, Baumwolisamenmehl, Sojabohnenmehl,
Penicillin-Mycelfilz, gemahlenes Nußmehi, Mais-Glutenmehl, lösliche Destillationsrückstände,
tierische stickstoffhaltige Materialien, wie z. B. Fleischextrakte, tierische Lagerprodukte
(Federmehl janimal tankage - feathermeal]), stickstoffhaltige Milchprodukte, z.B.
Buttermilch, Molkenpulver, flüssige Molke u. dgi., sind. Es wurde gefunden, daß
im allgemeinen Maisquellflüssigkeit die bevorzugte komplexe Stickstoffquelle ist,
obwohl besonders vorteilhafte Ergebnisse erzielt werden bei Verwendung einer Mischung
von Maisqueliflüssigkeit und löslichen Destillationsrückständen (distillers solubies).
Mischungen, in welchen das Verhältnis, bezogen auf Stickstoff, von Maisquellflüssigkeit
zu löslichen Destillationsrückständen zwischen 1 : 4 und 4: 1, bezogen auf das Gewicht,
liegt, sind zufriedenstellend, wobei Mischungen, welche gleiche Mengen Stickstoff,
auf das Gewicht bezogen, von beiden Quellen ergeben, besonders vorteilhaft sind.
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Falls ein Ammoniumsalz verwendet wird, sollte es natürlich eines sein,
dessen Anion nicht toxisch gegenüber dem Griseofulvin erzeugenden Organismus ist.
Geeignete Salze sind beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumacetat u. ä. Ammoniumsulfat ist besonders günstig. Es ist natürlich selbstverständlich,
daß an Stelle von Ammoniak oder einem Ammonsalz Substanzen verwendet werden können,
welche Anlaß zur Anwesenheit
von Ammoniak oder Ammoniumsalzen in
dem Medium geben; derartige Substanzen sind beispielsweise Harnstoff und Calciumcyanamid,
welche mindestens teilweise bei der Sterilisierung des Mediums in Ammoniak übergeführt
werden. Es wurde gefunden, daß es bequem ist, eine Mischung aus Ammoniak oder einem
Ammonsalz zusammen mit Harnstoff zu verwenden.
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Die relativen Verhältnisse der beiden Arten Stickstoffquellen können
im weiten Umfang variieren; im allgemeinen wird bevorzugt, daß von dem gesamten
verfügbaren Stickstoff 5 Gewichtsprozent als N und vorzugsweise mindestens 10 Gewichtsprozent
aus Ammoniak oder einem Ammonsalz bestehen sollten. Im allgemeinen können bis zu
20 Gewichtsprozent des Gesamtstickstoffs (als N) mit Vorteil durch Ammoniak oder
eine Ammoniumsalz-Stickstoffquelle gegeben werden, jedoch können bis zu 40 Gewichtsprozent
und selbst mehr angewandt werden. Die komplexe Stickstoffquelle bildet vorzugsweise
den größeren Anteil (auf N bezogen) der gesamten stickstoffhaltigen Nährstoffe.
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Zur Durchführung der Fermentierung kann das Medium so angesetzt werden,
daß es den gesamten assimilierbaren Stickstoffbei Beginn der Fermentierung enthält,
oder es kann einiges des stickstoffhaltigen Materials in einer späteren Stufe zugegeben
werden, insbesondere kann die gesamte oder teilweise komplexe Stickstoffquelle in
einer späteren Stufe, beispielshalber nach guter Entwicklung des Wachstums des Organismus,
z. B. nach etwa 90 Stunden, zugegeben werden.
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Zur Erzielung guter Resultate sind natürlich verschiedene andere Faktoren
notwendig, denen Aufmerksamkeit gewidmet werden muß bei der Durchführung der Herstellung
von Griseofulvin durch Submersfermentierung, wie sie im allgemeinen in der britischen
Patentschrift 784 618 abgehandelt ist.
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Im allgemeinen wird jedoch bevorzugt, die Fermentierung entsprechend
dem Verfahren, welches in dem Patent 1184 457 beschrieben ist, wonach ein
Kohlehydrat als Nährstoff wiederholt (kontinuierlich oder ansatzweise) zu der Fermentierung
in dem Maß, wie sie fortschreitet, in solchen Mengen und zu solchen Zeitpunkten
zugegeben wird, daß der pH-Wert des Mediums einer kontrollierten pH-Kurve folgt,
wie sie in jener Beschreibung definiert ist. Im allgemeinen wird bevorzugt, daß
der pH-Wert des Mediums zwischen 6,6 und 7,6 und vorzugsweise zwischen 6,8 und 7,2
für den größeren Teil der Fermentierung gehalten wird. Zu den geeigneten Kohlehydraten
gehören Glukose, Laktose, Saccharose, hydrolysierte Stärke, Invertzucker, Melasse,
Invertmelasse und Stärke, wovon Glukose bevorzugt wird.
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Wie in der britischen Patentschrift 784 618 ausgeführt, ist die Gesamthöhe
des in dem Medium verwendeten assimilierbaren Stickstoffs wichtig. Nach dieser Patentschrift
soll der gesamte assimilierbare Stickstoff zwischen 0,04 und 0,3 % (als 1,41)
und vorzugsweise zwischen 0,075 und 0,25 °/o N liegen. In dem Patent 1184
457 ist jedoch ausgeführt, daß es, bestimmte andere Bedingungen vorausgesetzt, möglich
ist, mit Vorteil Stickstoffhöhen über 0,3 °/o N zu verwenden. Erfindungsgemäß ist
es wünschenswert, daß der gesamte vorhandene Stickstoff (als N), d. h. der in der
komplexen Stickstoffquelle und dem Ammoniak oder Ammonsalz (und gegebenenfalls Harnstoff)
vorhandene Stickstoff innerhalb dem in der britischen Patentschrift 784 618 angegebenen
Bereich liegen sollte, außer wenn die Bedingungen angewandt werden, die in dem deutschen
Patent 1184 457 zur Anwendung kommen, wobei Gesamthöhen an Stickstoff oberhalb
0,3 °/o vorteilhaft verwendet werden können.
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Es wurde gefunden, daß es vorteilhaft bei dem vorliegenden Verfahren
ist, in das Medium eine assimilierbare Schwefelquelle einzuschließen, zu welchem
Zweck Sulfate und Thiosulfate u. dgl. verwendet werden können, wobei bevorzugte
Substanzen Alkali-, z. B. Natrium- oder Kaliumsulfat und -thiosulfate ebenso wie
Schwefelsäure selbst sind. Falls Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle verwendet wird,
ergibt diese Substanz natürlich auch Sulfat.
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Im allgemeinen sollte die Schwefelquelle in das Medium eingeschlossen
werden, um eine Schwefelhöhe (als S) zwischen 0,01 und 0,05 Gewichtsprozent, vorzugsweise
0,02 bis 0,040/" zu ergeben.
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Wünschenswerterweise sollte das Medium weiterhin ein wasserlösliches
Phosphat, vorzugsweise von einem Alkalimetall, enthalten, wobei z. B. Natrium- oder
Kaliumdihydrogenphosphat zufriedenstellend ist. Das Phosphat kann beispielshalber
in dem Medium in einer Menge zwischen 0,4 und 0,8 Gewichtsprozent vorhanden sein.
Das Medium sollte weiterhin ein lösliches Chlorid enthalten, dessen Menge mindestens
ausreichend sein sollte, um das gesamte Chlor in dem erhaltenen Griseofulvin zu
ergeben. Geeignete Chloride sind die Alkalichloride, wie z. B. Natrium- und Kaliumchlorid,
welche im allgemeinen vorzugsweise mit einer Höhe von mindestens 0,20/, und vorzugsweise
mit mindestens 0,3 Gewichtsprozent verwendet werden. Ammoniumchlorid ist ebenso
eine brauchbare Chloridquelle, die ebenso natürlich als Stickstoffquelle verwendet
wird. Es ist ebenso vorteilhaft, einen Methyldonator vorliegen zu haben, wie in
dem Patent 1183 630 beschrieben, wobei eine geeignete Substanz Cholin ist.
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Es ist selbstverständlich, daß die genauen Verhältnisse, in welchen
die verschiedenen Bestandteile des Mediums angewandt werden, im gewissen Ausmaß
von der speziellen Kombination der verwendeten Nährstoffe und von anderen Bedingungen,
z. B. Belüftung und dem Ausmaß des angewandten Fermentierungsgefäßes, abhängig sind.
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Es können verschiedene Griseofulvin erzeugende Arten des Stammes Penicillium
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und insbesondere diejenigen,
die in der britischen Patentschrift 784 618 beschrieben sind. Der bevorzugte Organismus
ist jedoch Penicillium patulum CMI 39809, NRRL 989.
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Abgesehen von den hier aufgeführten Bedingungen wird die Fermentierung
in bequemer Weise entsprechend der allgemeinen Praxis der Fermentierung durchgeführt.
So wird der Organismus vorzugsweise in das Produktionsmedium als vegetatives Inoculum
eingeführt, wobei etwa 7,5 bis 10 °/o Inoculum vorzugsweise angewandt werden. Die
Rührgeschwindigkeit und die Belüftungsgeschwindigkeit in dem Medium hängt zur Erzielung
optimaler Ergebnisse von der Form des verwendeten Fermentierungsgefäßes ab und muß
für den speziell verwendeten Kessel bestimmt werden. Im allgemeinen ist es wünschenswert,
die Fermentierung mit niederen Luftströmungsgeschwindigkeiten anzufangen, die gesteigert
werden, wenn die Fermentierung fortschreitet. Antischaummittel, z. B. der Art des
weißen Mineralöls, können verwendet werden, um eine übermäßige Schäumwirkung in
dem Medium zu kontrollieren.
Die folgenden Beispiele dienen zur
weiteren Erläuterung der Erfindung.
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Beispiell Die Versuche Wurden durchgeführt in konischen Kolben von
100 ml, welche 30 ml Medium enthielten und auf einer rotierenden Schüttelmaschine
mit 200 bis 220 Umdr./Min. geschüttelt wurden. Das Standardmedium bestand aus dem
Maisquellflüssigkeitsmedium (C.S.L.), welches nachfolgend aufgeführt ist. Zu den
Versuchskolben wurde Ammoniumsulfat zugegeben, um 0,10/0 Stickstoff zu ergeben.
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C.S.L.-Medium °/a Gewicht/Volumen Maisquellflüssigkeits-Stickstoff
....... 0,15 Lactose ........................... 7,0 KH,P04 ..........................
0,4 KCl .............................. 0,25 Kalkstein .........................
0,8 Das Medium wurde auf pH 5,0 eingeregelt und mit einem Dampfdruck von 1,05 atü
während 20 Minuten sterilisiert. Das Inoculum wurde erhalten durch Beimpfen mit
Sporen, die aus einer Kultur von P. patulum, die auf Czapek-Dox-Agar gewachsen war,
erhalten worden waren, in ein aus folgenden Bestandteilen bestehendes Medium:
% Gewicht/Volumen Maisquellflüssigkeits-Stickstoff ....... 0,30 Saccharose
........................ 2,0 Kalk ............................. 1,0 Medium vor der
Sterilisierung auf pH 6,5 eingeregelt. 1,5 ml einer 48-Stunden-Kultur wurden in
das Produktionsmedium inoculiert, welches die folgenden Titer ergab:
| Behandlung Griseofulvin (mgm/1) am |
| 7. Tag I 12. Tag |
| i |
| (NHJIS04 als % |
| Stickstoff |
| (Kontrolle) .... 2370 4450 |
| 0,1 ........... 3270 4790 |
Beispiel 2 Die stimulierende Wirkung von NH2S04 während des frühen Teils der Fermentierung
in einem Medium aus C.S.L. und löslichen Brennereirückständen, das unter denselben
Bedingungen wie vorhergehend fermentiert wurde, ist nachfolgend gezeigt: °/o Gewicht/Volumen
Maisquellflüssigkeits-Stickstoff ....... 0,075 Getrocknete lösliche Brennereirückstände-Stickstoff
................. 0,075 Lactose ........................... 8,00 KH$P04 ..........................
0,40_ KCl .............................. 0,15 Kalkstein .........................
0,80
| °/o organischer (NH4)zSO4 Griseofulvin (mgm/1) |
| am |
| N °/o N I °/o S |
| 6. Tag 19. Tag 13. Tag |
| 0,15 (Kontrolle) - 0,026 3220 5780 8200 |
| 0,15 . . . . . . . . . . 0,025 0,027 3850 6610 8580 |
Der Schwefel in dem Kontrollkolben wurde als 0,1
% Na2Sz03 zugesetzt.
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Beispiel 3 Ersetzung von Maisquellflüssigkeit durch Ammoniumsulfat
oder Ersetzung von Medien, die das erstere enthalten, mit dem letzteren in gerührtem
Behälter von 37851 Medium C.S.L.-Stickstoff .... s. Tabelle und Text Ammoniumsulfat-Stickstoff
. . . . . . . . s. Tabelle und Text KHZPO4 . . . . .. . .. .. 0,40°/o Gewicht/Volumen
KCl . . . . . . . . . . . . . . . 0,10 °/o Gewicht/Volumen CaCO3 . . . . . . . .
. . . . 0,40 % Gewicht/Volumen H,S04 . . . . . . . . . . . . . 0,0125
% Volumen/Volumen Vorinoculierungsvolumen ......... 30281 Fermentationstemperatur
............ 25°C Inoculierungsvolumen 100/0 Mobilpar S (Antischaummittel)
.... 0,0275 °/o Gewicht/Volumen Weißes Mineralöl ... 0,0275°/o Gewicht/Volumen
Die Versuche wurden mit 37851 durchgeführt. Drei Schnellrührer mit 45,6 cm (1'6")
Durchmesser mit 220 Umdr./Min. wurden angewandt. Die Belüftungsgeschwindigkeiten
betrugen von 0 bis 5 Stunden 1,13 m3 (40 c.f.m.), von 5 bis 10 Stunden 2,27 m3 (80
c.f.m.) und nach 10 Stunden 3,54 m3 (125 c.f.m.). Das Vor-Inoculierungsvolumen war
30281. Das Inoculum wurde während etwa 40 Stunden auf dem folgenden Nährmedium gewachsen
Maisquellflüssigkeits-Stickstoff . . . . . . . . . 0,30°/o Gewicht/Volumen Brauner
Zucker ..... 2,0 % Gewicht/Volumen Kalk . . . . . . . . . . . . .
. . 1,0°/o Gewicht/Volumen Maisöl . . . . . . . . . . . . . 1,0 % Gewicht/Volumen
Hodag MF . . . . . . . . . 0,033 % Volumen/Volumen Dieses wurde mit einer
Sporensuspension von Penicillium patulum (11 enthielt 3 bis 5 - 10' Sporen
je Milliliter) inoculiert und bei 25°C in einem unbewegten Behälter von 3751 dem
Wachstum überlassen. Es wurde im Alter von 40 Stunden übergeführt, und zwar, wenn
das Mycelvolumen nach 10minütigem Raschrühren bei 3000 Umdr./Min. über 250/0 betrug.
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Die Fermentation wurde durch Zugabe von roher Glucose (50°/oige wäßrige
Lösung), die außerdem Chlorid enthielt (1,5°/o KCl), stets in der Gegend des optimalen
pH-Wertes gehalten. In der Zeichnung sind der optimale pH-Wert ebenso wie die tatsächlich
erzielte pH-Kurve sowie die Geschwindigkeit der Glucosezugabe (für Versuch 5) ebenso
wie der erzielte Titer der Maische dargestellt.
Die Versuche sind
in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt. In der Tabelle sind die Mengen vorhandenen
Stickstoffs sowohl als Gesamtmenge als auch aufgeteilt auf Maisquellflüssigkeit
und Ammoniumsulfat aufgeführt. Gleichzeitig ist die Steigerung der einzelnen Mengen
in Prozent angegeben, wozu der Versuch 1 als Vergleichsbasis genommen wurde. Weiterhin
sind die Ausbeuten an Griseofulvin in Gramm sowie die relativen Ausbeuten in Prozent
nach 250 Stunden angegeben, wobei wiederum die bei Versuch 1 erzielte Ausbeute mit
100% als Vergleichsbasis genommen wurde.
| Gewichtsprozent Stickstoff/Volumen Gramm Griseofulvin/Liter
Relative |
| Ver- als Mais ' als Äm nach Ausbeute |
| such quell- Steigerung monium Steigerung insgesamt @tei run
10 150 1 200 250 |
| flüssigkeit (°%) |
| sulfat |
| (°/o) |
| (°#/o) g Stunden (°/a) |
| @ I , I |
| 1 0,25 ` 0 0,0 0 0,25 0 2,4 4,9 6,0 8,0 100 |
| 2 0,25 0 0,025 10 0,275 10 . 2,6 4,8 8,0 9,5 119 |
| 3 0,30 ; 20 0,025 10 0,325 30 3,0 6,9 8,9 11,7 146 |
| 4 0,30 20 I 0,5 20 0,35 40 2,1 6,2 9,5 12,9 161 |
| 5 0,35 40 0,5 20 0,40 60 3,4 7,0 10,7 14,0 175 |
| 6 0,40 60 i 0,0 i 0 0,40 60 2,8 I 4,8 8,1 10,7 133 |
Aus den Werten der vorstehenden Tabelle ergibt sich eindeutig die in keiner Weise
vorhersehbare Steigerung der Ausbeute, die sich ergibt, wenn man zu der organischen
Stickstoffquelle Ammoniumsuifat zusetzt oder einen Teil der organischen Stickstoffquelle
durch Ammoniumsulfat ersetzt. Aus einem Vergleich der Versuche 1 und 6 ergibt sich,
daß bei einer Steigerung der organischen Stickstoffmenge um 600/D, entsprechend
einer Gesamtsteigerung von 60"/o, die relative Ausbeute um 3.301, erhöht wird; wenn
man wie in Versuch 5 die Gesamtsteigerung um 600/D an Gesamtstickstoff durch eine
Steigerung von 4001, des organischen Stickstoffs und 200/D des Ammoniumsulfates
herbeiführt, erhält man hingegen eine Ausbeutesteigerung um 75 "/o. Nach Versuch
4 erhält man bei einer Gesamtsteigerung um 400/, durch Erhöhen der organischen Stickstoffmenge
um 201110 und Erhöhen der Ammoniumsulfatmenge um 20°/o eine Ausbeutensteigerung
um 610/", und sogar bei einer Gesamtsteigerung des Stickstoffgehaltes um nur 300J0
durch Erhöhung des organischen Stickstoffs um .20°/0 und des Ammoniumsulfates um
10°1D (Versuch3) erhält man eine Ausbeutesteigerung um 46 0/D, d. h., die bei diesem
Versuch durch eine Steigerung um 30°/o erzielte Ausbeute ist noch um 13 "/o höher
als die nach Versuch 6 bei einer Steigerung der Stickstoffmenge um 60% erzielte
Ausbeute. Selbst bei Versucht wird durch eine Steigerung des Ammoniumsulfates um
100/0 noch eine Ausbeutensteigerung um 19 % erreicht.
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Die Wirkung des Ammoniumsulfates muß insofern als überraschend bezeichnet
werden, als sich im Vergleich zu der organischen Stickstoffquelle ein etwa äquivalentes
Verhalten hätte erwarten lassen. Es wäre also bei Versuch 5 bei einer Steigerung
um 60°/0 Gesamtstickstoff etwa eine dem Versuch 6 entsprechende Ausbeutensteigerung
in der Gegend von 33 "/o zu erwarten gewesen, nicht jedoch eine mehr als das Doppelte
betragende, anscheinend synergistische Ausbeutensteigerung von 75 0/D.
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Beispie14 Es wurde ein Medium hergestellt, welches aus optimalen Mengen
organischen Stickstoffs, Ammoniumsulfat und Harnstoff, Schwefelionen, Cholinchlorid,
Zucker, Kalkstein, Kaliumphosphat und Kaliumchlorid in folgenden Mengen bestand:
°/9 Gewicht[Volumen Lösliche Brennereirückstände
...... 0,075 0/D h` C.S.L...........................
0,075°/o N (NHq)gS04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,025 0/D N Lactose
. .. . . ... . . . . . . . . . . . . . . . .. 10,08/0 Cholinchlorid ...................
0,10/,0 Kalkstein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,80/0
KH,P04
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,40/, KCI............................
0,3°/o Die Entwicklung des Inoculums und die angewandten Produktionsstufen-Fermentationstechniken
waren mit denjenigen, die im Beispiel 1 angewandt wurden, identisch. Unterschiedliche
Mengen Maisquellflüssigkeits-Stickstoff in diesen Medium wurden durch Harnstoff
ersetzt, ohne daß irgendein Verlust an Griseofulvinausbeute eintrat, wie nachfolgend
zu sehen:
| °/o Stickstoff als Griseofulvin (mgmll) am |
| (NH4)2S04 Lösliche |
| Brennereirückstände G. S. L. , Harnstoff Harnstoff 7.
Tag 10. Tag I 13. Tag |
| 0,025 0,075 0,075 - 6015 9750 10655 |
| 0,025 0,075 0,05 0,025 6040 9250 9495 |
| 0,025 0,075 0,037 0,037 6000 9575 I 10750 |
| 0,025 0,075 0,025 0,050 5890 9560 11140 |
| 0,025 0,075 - 0,075 5970 9120 10740 |
Beispiels Ein ähnlicher Versuch, wie im Beispiel 3 beschrieben,
wurde mit 37851 mit den nachfolgend angegebenen Kombinationen der Stickstoffquellen
Harnstoff, Ammoniumsulfat und Maisquellflüssigkeit durchgeführt. Die Kontrollfermentierung
-wurde in genau der gleichen Weise durchgeführt.
| °/° N aus den Quellen g/1 Griseofulvin zur Stunde |
| C. S. L. Harnstoff |
| monium- 100 150 200 250 |
| sulfat |
| 0,35 - 0,05 3,4 7,0 10,7 14,0 |
| 0,30 0,05 0,05 2,0 4,3 7,8 11,1 |
| 0,20 0,10 0,05 3,3 6,3 9,2 13,4 |
Beispiel 6 In diesem Beispiel ist die stimulierende Wirkung von Ammoniumhydroxyd-
auf die Griseofulvinerzeugung aufgeführt. Die Impfentwicklung und Incubierungsbedingungen
waren wie im Beispiel 1 beschrieben. Fermentationsmedium °/° Gewicht/Volumen Lactose
........................... 10 Kalkstein ......................... 0,8 KH2P04 .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,4 KCl ..............................
0,3 Chlorchlorid ....................... 0,1
| °/° Stickstoff als Griseofulvin (mgml1) am |
| C. S. L. 1 lösliche (V.SO ( NH.OH 6. Tag I 9. Tag I 12. Tag |
| Brennereirückstände |
| 0,075 0,075 0,025 ohne 4690 7380 9790 |
| 0,037 0,075 0,025 0,037 4540 7700 10130 |
| 0,05 0,05 0,025 0,05 4820 7270 10290 |
Der pH-Wert der Medien, die Ammoniumhydroxyd enthielten, wurde mit Salzsäure vor
der Sterilisierung auf
121'C während 20 Minuten auf - 5,0 eingeregelt. Beispiel
? In diesem Beispiel ist die Verwendung von zwei Ammoniumsalzen erläutert. Die Fermentationsbedingungen
waren wie in dem vorhergehenden Beispiel.
| °/° Stickstoff als Griseofulvin (mgmll) am |
| lösliche CH$COONHd |
| C. S. L. 1 Brennereirückstände I (N4)3S04 4. Tag I 10.
Tag 1 13. Tag |
| 0,075 0,075 0,025 ohne 2130 7970 11990 |
| 0,05 0,05 0,025 0,05 780 6200 13070 |
| 0,037 0,075 0,025 0,037 780 6650 11500 |
Beispiel 8 Verbesserungen bezüglich der Ausbeute an Griseofulvin können durch die
Zugabe einer komplexen Stickstoffquelle während der Fermentierung hervorgerufen
werden. Das Inoculum wurde wie im Beispiel l entwickelt. Das Fermentationsmedium
wurde wie folgt hergestellt: Maisquellflüssigkeit-Stickstoff
..... 0,0625
g N Löslicher Brennereirückstände-Stickstoff ..................... 0,0625 g N (NH4)ZS04
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,025 g N KH,P04 . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 0,40 g KC1............................ 0,30 g Kalk ...........................
0,80 g Lactose ......................... 10,0 g Wasser .........................
auf 100 ml Der pH-Wert wurde auf 5,0 eingeregelt, jeweils 30 ml Medium in eine Reihe
von 100 ml konischen Kolben gegeben und durch Erhitzen sterilisiert. Nach der Inoculierung
wurden die Kolben auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 200 bis 220 Umdr./Min.
geschüttelt. Während der Fermentierung erfolgten drei Zugaben jeweils von 1,5 ml
des Mediums 1 am 7. und 9. Tag und ein oder zwei Zugaben von 1,5 ml des Mediums
2.
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Medium 1 Lactose .......................... 50 g Kaliumchlorid . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g Wasser .......................... auf 100
ml Medium 2 Löslicher Brennereirückstände-Stickstoff . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 0,5 g Maisquelhlüssigkeit-Stickstoff
...... 0,5 g Wasser ..........................
auf 100 ml
| Behandlung Griseofulvin (mg/1) am |
| Medium 2 Gesamt- |
| zugegeben an stickstoff 7. Tag 12. Tag |
| den Tagen |
| °/° |
| - 0,15 5806 11700 |
| 7 0,20 5676 11684 |
| 7, 9 0,25 6089 11628 |
| 7, 9 0,30 5903 I 11425 |