DE936413C - Herstellung von Erythromycin - Google Patents

Description

• Herstellung von Erythromycin Die Erfindung bezieht sich auf die Züchtung von Gärungskulturen erythromycinbildender Mikroorganismen und insbesondere auf Verfahren und Zusammensetzungen von Nährmedien zur Erzielung höherer Erythromycinausbeuten, wobei man den Nährböden der erythromycinbildenden Organismen wasserlösliche Salze der Propionsäure zusetzt.
• Ein Ziel der Erfindung sind neue und verbesserte Verfahren zur Herstellung von Erythromycin. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Entwicklung von neuen und verbesserten Nährmedien zur Züchtung von Kulturen der erythromycinbildenden Organismen. Ferner bezieht sich die Erfindung auf Zusatzmittel, die bei Zugabe zu den Nährmedien die Erythromycinausbeute verbessern. Weitere Ziele gehen aus der Beschreibung hervor.
• Diese Ziele werden nach der Erfindung dadurch erreicht, daß man bei Herstellung der Nährmedien für die Züchtung von Gärungskulturen der erythromycinbildenden Organismen wasserlösliche Salze der Propionsäure in solchen Mengen zusetzt, die zur Förderung der Erythromycinbildung ausreichen. Durch die Zugabe wasserlöslicher Salze der Propionsäure zu den Nährböden der genannten Kulturen wird eine wesentlich größere Erythromycinausbeute erhalten als beiAbwesenheit der wasserlöslichen Propionsäuresalze. Bei der Durchführung des Verfahrens züchtet man die Kulturen der erythromycinbüdenden Organismen, z. B. des Streptomyces erythreus 2338, auf einem erfindungsgemäßen Nährboden, wobei man bekannte Verfahren und Vorrichtungen anwendet, (s. hierzu das südafrikanische Patent 16 073 und »Antibiotics and Chemotherapyu, Nr. 2, S. 281 bis 283 [Juni z952]). Man züchtet die Kulturen unter aeroben Bedingungen und vorteilhaft nach dem submersen Verfahren, wobei man den pH-Wert des Nährmediums anfänglich auf einen zwischen 6 und'-7,5 liegenden Wert, am besten auf etwa 6,5, einstellt. Während der Erythromycinbildung steigt der pH-Wert gewöhnlich auf 9,5 an. Es ist zweckmäßig, die Temperatur zwischen etwa 25 und etwa 37°, vorzugsweise zwischen 26 und 32°, zu halten. In dieser und in anderer Hinsicht hält man zweckmäßig das in dem obenerwähnten südafrikanischen Patent 16 073 beschriebene Verfahren ein.
• Der Hauptbestandteil der Nährmedien sind Kohlehydrate. Bevorzugte Kohlehydratquellen sind Stärke und Dextrose (Glukose). Weitere Stoffe, die verwendet werden oder an Stelle von Stärke und Dextrose treten können, sind Saccharose, Dextrin, Melasse, brauner Zucker, Maltose u. dgl. Die Nährböden enthalten vorteilhafterweise außerdem Stickstoffquellen, vorzugsweise organischer Art, z. B. Maiseinquellwasser, Sojabohnenmehl, lösliche Destillationsrückstände, Kasein, Aminosäurengemische, Peptone (sowohl von Fleisch als auch von Sojabohnen), Brauereihefe, Erdnußkörner, Erdnußmehl u. dgl. Man kann auch anorganische Stickstoffquellen, z. B. Nitrate oder Ammoniumsalze, anwenden. Die Nährböden können ferner auch anorganische Nährsalze enthalten, die' Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Sulfat- und ähnliche Ionen liefern. Wichtige Spurenelemente, wie Kobalt, Magnesium, Eisen und Mangan, können außerdem zugesetzt werden, obgleich genügende Mengen dieser Elemente gewöhnlich schon durch die anderen Bestandteile des Nährbodens geliefert werden.
• Ein geeignetes Grundnährmedium für erythromycinbildende Kulturen enthält vorteilhafterweise etwa 0,5 bis etwa =o °/o Kohlehydratquellen, etwa 0,5 bis etwa =o °/o Stickstoffquellen, bis zu etwa i0/, Nährsalze und bis zu etwa 0,504 Calciumcarbonat oder ähnliche Puffersalze; der Rest besteht hauptsächlich aus Wasser. Zu dieser Grundnährlösung setzt; man nach vorliegender Erfindung wasserlösliche Propionsäuresalze in einer zur Förderung der Erythromycinbildung ausreichenden Menge zu. Gewöhnlich liegt diese Menge nicht höher als etwa 10/0. Jedoch kann man auch kleinere Mengen bis hinunter zu einer Mindestgrenze der Wirksamkeit anwenden. Gewöhnlich ist es nicht zweckmäßig, weniger als etwa 0,i °/o zu nehmen, obgleich eine wirksame Förderung auch schon bei schwächeren Konzentrationen bis zu etwa 0,05 °/o hinunter beobachtet wurde. (Die hier angegebenen Teile und Prozentsätze sind gewichtsbezogen,, sofern nichts anderes vermerkt ist).
• Das nach der Erfindung verwendete Zusatzmittel wird am besten vor oder gleichzeitig mit der Impfung zu dem Erythromycinnährmedium gegeben. Es kann zugefügt werden, bevor das Substratmedium sterilisiert wird oder in sterilisiertem Zustand hinterher, jedoch vor der Impfung. Man kann die gewünschte Menge des oder der Zusatzmittel entweder auf einmal zu Beginn, oder in Teilmengen nacheinander während der Erythromycinbildung zugeben. Im letzteren Fall kann die Gesamtmenge des Zusatzmittels auch über 10/, liegen. Das Mittel kann ferner der Flüssigkeit derart einverleibt werden, daß man das Salz erst in dem Medium bildet, z. B. Propionsäure zusetzt und den p11-Wert wieder einstellt. In diesem Fall liegt dann das Propionsäuresalz der zur Einstellung des pH-Wertes verwendeten Base vor.
• Geeignete erfindungsgemäße Zusatzmittel für die Grundnährmedien zur Erhöhung der Erythromycinausbeute sind u. a. Natriumpropionat und andere Alkali- (einschließlich Ammonium-) Salze und Erdalkalimetallsalze (einschließlich Magnesium) oder mit anderen Worten die Leichtmetallsalze. Propionsaure Salze nicht giftiger Schwermetalle, z. B. des Eisens, Kobalts und Mangans, können gleichfalls genommen werden.
• Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verständlich, die zur Erläuterung des Verfahrens und der Zusammensetzung der Nährmedien dienen, aber die Erfindung nicht einschränken sollen. Beispiel i Man erzeugt eine Sporen enthaltende Kultur, indem man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, auf einem Schrägnährboden züchtet. Die Sporen werden in wäßriger Suspension gewonnen und zur Impfung eines weiteren Nährmediums benutzt, in dem das Wachstum der Mikroorganismen sich fortsetzt. Die Sporensuspension wird in einen 500 ccm fassenden Kolben gegeben, der ioo ccm eines Mediums aus folgenden Bestandteilen enthält:

  Dextrose (technisch rein) . . . . . . . . . . . . =o g

  Fleischextrakt ..................... =o g

  Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

  Bacto-Pepton ..................... 59

  Wasser ........................... iooo ccm

  Die Kultur wird bei 28,5° 3 Tage lang unter Schütteln behütet. Dann gibt man Mengen von je 5 ccm der auf diese Weise erhaltenen Kultur in Kolben, die ioo ccm Nährlösung enthalten, und bebrütet diese 7 Tage lang bei 28,5° unter Schütteln, wobei jeweils am fünften, sechsten und siebenten Tag Proben entnommen werden.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich, wobei die verschiedenen angegebenen Zusatzmittel in den in der Tabelle angegebenen Mengen zu einem Nährmedium folgender Zusammensetzung gegeben worden sind:

  Technisch reine Dextrose . . . . . . . . . . . 259

  Sojabohnenmehl (teilweise entfettet) 2-59

  Brauereihefe (entbittert) . . . . . . . . . . . . 59

  Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

  Calciumcaibonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g

  Wasser ........................... iooo ccm

  Tabelle I

  Einfluß verschiedener Zusätze auf die Erythromycin-

  ausbeute

  Konzen- Ausbeute

  Zusatzmittel tration

  in °/o y/ccm

  fünfter sechster i siebenter

  Tag

  Tag Tag

  Erste Reihe

  kein Zusatz .. 0 200 263 184

  Natriumpro-

  pionat ..... 0,4 403 417 349

  Propionsäure* 0,4 293 455 313

  Zweite Reihe

  kein Zusatz . . 0 <I25 148 145

  Natriumpro-

  pionat..... 0,4 405 533 555

  Calciumpro- I

  pionat ..... 0,4 2310 373 343

  Der p"-Wert wurde hierbei durch Zusatz von Natronlauge auf 6,6 eingestellt. In allen anderen Fällen betrug der p"-Wert schon von Anfang an etwa 6,6.
• In der folgenden Tabelle ist der Einfluß der Konzentration des Zusatzmittels auf die Erythromycinausbeute erläutert.

  Tabelle II

  Einfluß verschiedener Mengen Natriumpropionat

  Konzentration von Höchstausbeute

  Natriumpropionat in y/ccm

  in °/o erste Reihe I zweite Reihe

  0,0 250 350

  0,05 305 370

  oj 330 405

  0,2 440 520

  0,4 675 590

  o,8 56o 65o

  In der zweiten Reihe wurde das entfettete Sojabohnenmehl der ersten Reihe durch unbehandeltes Sojabohnenmehl ersetzt. Beispiel 2 Nach dem im Beispiel x beschriebenen Verfahren wurde ein Nährboden für Erythromycinkulturen von folgender Zusammensetzung

  Dextrose ......................... 309

  Erdnußkörner ..................... 259

  Brauereihefe (entbittert) . . . . . . . . . . . . 59

  Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

  Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g

  Zellulose .......................... 10 g

  Wasser ........................... iooo ccm

  hergestellt, geimpft und bei o° unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 61 Luft in der Minute in Mengen von jeweils 81 in 18,91 fassenden und mit Rührwerken (sweep-stirrers) versehenen Flaschen bebrütet. Ebenso wie im Beispiel 1 wurden durchweg aseptische Bedingungen aufrechterhalten. Die Erdnußkörner waren aus ganzen Erdnüssen durch Zerkleinerung auf eine durchschnittliche Teilchengröße zwischen 3,2 und 6,5 mm erhalten worden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:

  Tabelle III

  Einfluß von o,2prozentigem Natriumpropionat in

  Flaschen mit Erdnußkörnern als Substrat (Bebrütung

  unter Rühren)

  Konzentration des Höchstausbeute

  Natriumpropionats in °/o in y; ccm

  0,0 822

  0,2 - 1170

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von wasserlöslichen Propionsäuresalzen, wie Alkali- oder Erdalkalisalzen, vorzugsweise Na- oder Ca-propionat, in Mengen von o,o5 bis 10/, als ausbeutesteigernder Zusatz zu Nährlösungen für die Erythromycingewinnung auf biologischem Wege.