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Herstellung von Erythromycin Die Erfindung bezieht sich auf die Züchtung
von Gärungskulturen erythromycinbildender Mikroorganismen und insbesondere auf Verfahren
und Zusammensetzungen von Nährmedien zur Erzielung höherer Erythromycinausbeuten,
wobei man den Nährböden der erythromycinbildenden Organismen wasserlösliche Salze
der Propionsäure zusetzt.
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Ein Ziel der Erfindung sind neue und verbesserte Verfahren zur Herstellung
von Erythromycin. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Entwicklung von neuen
und verbesserten Nährmedien zur Züchtung von Kulturen der erythromycinbildenden
Organismen. Ferner bezieht sich die Erfindung auf Zusatzmittel, die bei Zugabe zu
den Nährmedien die Erythromycinausbeute verbessern. Weitere Ziele gehen aus der
Beschreibung hervor.
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Diese Ziele werden nach der Erfindung dadurch erreicht, daß man bei
Herstellung der Nährmedien für die Züchtung von Gärungskulturen der erythromycinbildenden
Organismen wasserlösliche Salze der Propionsäure in solchen Mengen zusetzt, die
zur Förderung der Erythromycinbildung ausreichen. Durch die Zugabe wasserlöslicher
Salze der Propionsäure zu den Nährböden der genannten Kulturen wird eine wesentlich
größere Erythromycinausbeute erhalten als beiAbwesenheit der wasserlöslichen Propionsäuresalze.
Bei
der Durchführung des Verfahrens züchtet man die Kulturen der erythromycinbüdenden
Organismen, z. B. des Streptomyces erythreus 2338, auf einem erfindungsgemäßen Nährboden,
wobei man bekannte Verfahren und Vorrichtungen anwendet, (s. hierzu das südafrikanische
Patent 16 073 und »Antibiotics and Chemotherapyu, Nr. 2, S. 281 bis 283 [Juni z952]).
Man züchtet die Kulturen unter aeroben Bedingungen und vorteilhaft nach dem submersen
Verfahren, wobei man den pH-Wert des Nährmediums anfänglich auf einen zwischen 6
und'-7,5 liegenden Wert, am besten auf etwa 6,5, einstellt. Während der Erythromycinbildung
steigt der pH-Wert gewöhnlich auf 9,5 an. Es ist zweckmäßig, die Temperatur zwischen
etwa 25 und etwa 37°, vorzugsweise zwischen 26 und 32°, zu halten. In dieser und
in anderer Hinsicht hält man zweckmäßig das in dem obenerwähnten südafrikanischen
Patent 16 073 beschriebene Verfahren ein.
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Der Hauptbestandteil der Nährmedien sind Kohlehydrate. Bevorzugte
Kohlehydratquellen sind Stärke und Dextrose (Glukose). Weitere Stoffe, die verwendet
werden oder an Stelle von Stärke und Dextrose treten können, sind Saccharose, Dextrin,
Melasse, brauner Zucker, Maltose u. dgl. Die Nährböden enthalten vorteilhafterweise
außerdem Stickstoffquellen, vorzugsweise organischer Art, z. B. Maiseinquellwasser,
Sojabohnenmehl, lösliche Destillationsrückstände, Kasein, Aminosäurengemische, Peptone
(sowohl von Fleisch als auch von Sojabohnen), Brauereihefe, Erdnußkörner, Erdnußmehl
u. dgl. Man kann auch anorganische Stickstoffquellen, z. B. Nitrate oder Ammoniumsalze,
anwenden. Die Nährböden können ferner auch anorganische Nährsalze enthalten, die'
Natrium-, Kalium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid-, Sulfat- und ähnliche Ionen liefern.
Wichtige Spurenelemente, wie Kobalt, Magnesium, Eisen und Mangan, können außerdem
zugesetzt werden, obgleich genügende Mengen dieser Elemente gewöhnlich schon durch
die anderen Bestandteile des Nährbodens geliefert werden.
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Ein geeignetes Grundnährmedium für erythromycinbildende Kulturen enthält
vorteilhafterweise etwa 0,5 bis etwa =o °/o Kohlehydratquellen, etwa 0,5
bis etwa =o °/o Stickstoffquellen, bis zu etwa i0/, Nährsalze und bis zu etwa
0,504 Calciumcarbonat oder ähnliche Puffersalze; der Rest besteht hauptsächlich
aus Wasser. Zu dieser Grundnährlösung setzt; man nach vorliegender Erfindung wasserlösliche
Propionsäuresalze in einer zur Förderung der Erythromycinbildung ausreichenden Menge
zu. Gewöhnlich liegt diese Menge nicht höher als etwa 10/0. Jedoch kann man
auch kleinere Mengen bis hinunter zu einer Mindestgrenze der Wirksamkeit anwenden.
Gewöhnlich ist es nicht zweckmäßig, weniger als etwa 0,i °/o zu nehmen, obgleich
eine wirksame Förderung auch schon bei schwächeren Konzentrationen bis zu etwa
0,05 °/o hinunter beobachtet wurde. (Die hier angegebenen Teile und Prozentsätze
sind gewichtsbezogen,, sofern nichts anderes vermerkt ist).
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Das nach der Erfindung verwendete Zusatzmittel wird am besten vor
oder gleichzeitig mit der Impfung zu dem Erythromycinnährmedium gegeben. Es kann
zugefügt werden, bevor das Substratmedium sterilisiert wird oder in sterilisiertem
Zustand hinterher, jedoch vor der Impfung. Man kann die gewünschte Menge des oder
der Zusatzmittel entweder auf einmal zu Beginn, oder in Teilmengen nacheinander
während der Erythromycinbildung zugeben. Im letzteren Fall kann die Gesamtmenge
des Zusatzmittels auch über 10/, liegen. Das Mittel kann ferner der Flüssigkeit
derart einverleibt werden, daß man das Salz erst in dem Medium bildet, z. B. Propionsäure
zusetzt und den p11-Wert wieder einstellt. In diesem Fall liegt dann das Propionsäuresalz
der zur Einstellung des pH-Wertes verwendeten Base vor.
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Geeignete erfindungsgemäße Zusatzmittel für die Grundnährmedien zur
Erhöhung der Erythromycinausbeute sind u. a. Natriumpropionat und andere Alkali-
(einschließlich Ammonium-) Salze und Erdalkalimetallsalze (einschließlich Magnesium)
oder mit anderen Worten die Leichtmetallsalze. Propionsaure Salze nicht giftiger
Schwermetalle, z. B. des Eisens, Kobalts und Mangans, können gleichfalls genommen
werden.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verständlich,
die zur Erläuterung des Verfahrens und der Zusammensetzung der Nährmedien dienen,
aber die Erfindung nicht einschränken sollen. Beispiel i Man erzeugt eine Sporen
enthaltende Kultur, indem man Streptomyces erythreus, Stamm NRRL 2338, auf einem
Schrägnährboden züchtet. Die Sporen werden in wäßriger Suspension gewonnen und zur
Impfung eines weiteren Nährmediums benutzt, in dem das Wachstum der Mikroorganismen
sich fortsetzt. Die Sporensuspension wird in einen
500 ccm fassenden Kolben
gegeben, der ioo ccm eines Mediums aus folgenden Bestandteilen enthält:
| Dextrose (technisch rein) . . . . . . . . . . . . =o g |
| Fleischextrakt ..................... =o g |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59 |
| Bacto-Pepton ..................... 59 |
| Wasser ........................... iooo ccm |
Die Kultur wird bei 28,5° 3 Tage lang unter Schütteln behütet. Dann gibt man Mengen
von je 5 ccm der auf diese Weise erhaltenen Kultur in Kolben, die ioo ccm Nährlösung
enthalten, und bebrütet diese 7 Tage lang bei 28,5° unter Schütteln, wobei jeweils
am fünften, sechsten und siebenten Tag Proben entnommen werden.
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Die erhaltenen Ergebnisse sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich,
wobei die verschiedenen angegebenen Zusatzmittel in den in der Tabelle angegebenen
Mengen zu einem Nährmedium folgender Zusammensetzung gegeben worden sind:
| Technisch reine Dextrose . . . . . . . . . . . 259 |
| Sojabohnenmehl (teilweise entfettet) 2-59 |
| Brauereihefe (entbittert) . . . . . . . . . . . .
59 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59 |
| Calciumcaibonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g |
| Wasser ........................... iooo ccm |
| Tabelle I |
| Einfluß verschiedener Zusätze auf die Erythromycin- |
| ausbeute |
| Konzen- Ausbeute |
| Zusatzmittel tration |
| in °/o y/ccm |
| fünfter sechster i siebenter |
| Tag |
| Tag Tag |
| Erste Reihe |
| kein Zusatz .. 0 200 263 184 |
| Natriumpro- |
| pionat ..... 0,4 403 417 349 |
| Propionsäure* 0,4 293 455 313 |
| Zweite Reihe |
| kein Zusatz . . 0 <I25 148 145 |
| Natriumpro- |
| pionat..... 0,4 405 533 555 |
| Calciumpro- I |
| pionat ..... 0,4 2310 373 343 |
Der p"-Wert wurde hierbei durch Zusatz von Natronlauge auf 6,6 eingestellt. In allen
anderen Fällen betrug der p"-Wert schon von Anfang an etwa 6,6.
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In der folgenden Tabelle ist der Einfluß der Konzentration des Zusatzmittels
auf die Erythromycinausbeute erläutert.
| Tabelle II |
| Einfluß verschiedener Mengen Natriumpropionat |
| Konzentration von Höchstausbeute |
| Natriumpropionat in y/ccm |
| in °/o erste Reihe I zweite Reihe |
| 0,0 250 350 |
| 0,05 305 370 |
| oj 330 405 |
| 0,2 440 520 |
| 0,4 675 590 |
| o,8 56o 65o |
In der zweiten Reihe wurde das entfettete Sojabohnenmehl der ersten Reihe durch
unbehandeltes Sojabohnenmehl ersetzt. Beispiel 2 Nach dem im Beispiel x beschriebenen
Verfahren wurde ein Nährboden für Erythromycinkulturen von folgender Zusammensetzung
| Dextrose ......................... 309 |
| Erdnußkörner ..................... 259 |
| Brauereihefe (entbittert) . . . . . . . . . . . .
59 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59 |
| Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 g |
| Zellulose .......................... 10 g |
| Wasser ........................... iooo ccm |
hergestellt, geimpft und bei o° unter Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 61
Luft in der Minute in Mengen von jeweils 81 in 18,91 fassenden und mit Rührwerken
(sweep-stirrers) versehenen Flaschen bebrütet. Ebenso wie im Beispiel 1 wurden durchweg
aseptische Bedingungen aufrechterhalten. Die Erdnußkörner waren aus ganzen Erdnüssen
durch Zerkleinerung auf eine durchschnittliche Teilchengröße zwischen 3,2 und 6,5
mm erhalten worden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle
aufgeführt:
| Tabelle III |
| Einfluß von o,2prozentigem Natriumpropionat in |
| Flaschen mit Erdnußkörnern als Substrat (Bebrütung |
| unter Rühren) |
| Konzentration des Höchstausbeute |
| Natriumpropionats in °/o in y; ccm |
| 0,0 822 |
| 0,2 - 1170 |