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Verfahren zur Herstellung eines Produktionsstammes einer Claviceps purpurea (Fr.) Tul.-Kultur zur Erzeugung von Mutterkornalkaloiden
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Produktionsstammes einer Claviceps purpurea (Fr.) TuL-Kultur zur Erzeugung von Mutterkomalkaloiden unter saprophytischen Bedingungen.
Da die Züchtung von Mutterkorn an Kornpflanzen und die Einsammlung des Mutterkorns umständlich, zeitraubend und von Einflüssen der Witterung abhängig ist, bemüht man sich schon seit längerer Zeit, eine Methode zu finden, um Mutterkornalkaloide durch Züchten von Pilzkulturen unter saprophytischen Bedingungen in betrieblichem Massstab zu erzeugen.
Seit Anfang der 1950er-Jahre sind in der Literatur Berichte über die erfolgreiche Produktion von Mutterkomalkaloiden in saprophytischer Kultur vonAutoren erschienen, die die Erzeugung von Alkaloid en nicht nur durch Farbreaktionen oder auf Grund der biologischen Aktivität der Fermentationsflüssigkeit, sondern auch durch präparative Isolierung der Alkaloide nachgewiesen haben. Abe und Mitarbeiter (brit Patentschrift Nr. 757, 696) haben zur Gruppe der damals erkannten Clavin-Alkaloide gehörende,
EMI1.1
über die saprophytischeErzeugung von Ergotamin, Ergocristin und Ergometrin ; aus einer um einige Jahre späteren Mitteilung desselben Autors (Pharm.
Ztg. 103 [1958 J, S. 1269) geht aber hervor, dass es ihm nicht gelungen ist, seine früheren Versuche zu reproduzieren. Chain und Mitarbeiter (deutsche Auslegeschrift 1140 670 : brit Patentschrift Nr. 883, 329) haben durch in betrieblichem Massstab ausgeführte Fer mentation kristallines Lysergsäureamid und Lysergsäure-methylcarbinolamid mit guter Ausbeute hergestellt ; die Produkte können aber nach in entsprechender Weise durchgeführter alkalischer Hydrolyse nur als Ausgangsstoff zur halbsynthetischen Herstellung von pharmakologisch aktiven Alkaloiden verwendet werden.
Nach der österr. Patentschrift Nr. 210065 werden Mutterkornalkaloide durch Kultivation von Claviceps purpurea (Fr.) TuL-Reinkulturen erzeugt, wobei die Fermentation in zwei Phasen durchgeführt wird. Das Ziel der ersten Phase der Kultivation ist die Produktion der Trockensubstanz ; diesem Zwecke werden auch dieKultivationsbedingungen, vor allem intensive Aeration, angepasst. In der zweitenPhase werden die Bedingungen vor allem durch Zugabe von Substanzen, die den Rh-Wert erniedrigen, und durch Luftausschluss so eingestellt, dass die Kultur Alkaloide produziert. Derselbe Effekt kann auch durch Zugabe von Atmungsgiften oder durch Verwendung von defizienten Mengen an assimilierbarem Stickstoff, Phosphor oder Schwefel im Nährmedium erzielt werden.
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K. Winkler und K. Mothes (Planta Medica 10 1ì962 J, S. 208) stellen in ihrem, die bisher erzielten
Ergebnisse zusammenfassend beschreibenden Aufsatz fest, dass die pharmakologisch wichtigen Alkaloide im Jahre 1962 noch immer durch das parasitische Züchten der Pilze an Kompflanzen produziert werden.
Die mit in saprophytischer Weise in Oberflächenkultur Alkaloide erzeugenden Stämmen erzielten Er- gebnisse waren wegen der zur Alkaloidproduktion nötigen langen Zeit von untergeordneter Bedeutung.
In submerser Schüttelkultur waren nur einige Stämme zu einer nennenswerten Produktion fähig, und auch diese haben überwiegend nur Clavin-Alkaloide bzw. in einem Fall Lysergsäureamid produziert. Es wurde von verschiedenen Autoren wiederholt betont, dass die chemische Produktionsfähigkeit nur bei gewissen seltenen Pilzarten auftritt ; auch bei diesen Arten können im Gang der Weiterzüchtung Mu- tationen oder beständige Modifikationen auftreten, durch welche die alkaloidproduzierende Fähigkeit des Stammes wieder verloren geht.
Die Literaturangaben und die praktischen Erfahrungen deuten also gleichermassen darauf hin, dass die industrielle Verwertung der bisherigen Forschungsergebnisse eben deshalb nicht möglich ist, weil die unter saprophytischen Bedingungen Alkaloide produzierenden Stämme, wenn sie auch in sehr seltenen
Fällen vom Gesichtspunkt der Zusammensetzung der produzierten Alkaloide und der Alkaloidausbeute als brauchbar erschienen, ihre Produktionsfähigkeit im Laufe der weiteren Züchtung bzw. der weiteren
Kultivation des Stammes in verhältnismässig kurzer Zeit ganz oder teilweise verloren.
Die Erfindung hat die Überwindung jener Schwierigkeiten zum Ziel, die die industrielle Verwirk- lichung der saprophytischenProduktion von Mutterkomalkaloiden bisher verhindert haben. Die Erfindung bezweckt die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines Produktionsstammes einer Claviceps purpurea (Fr.) TuL-Kultur, die zur Erzeugung von Mutterkomalkaloiden geeignet ist, ohne ihre Alka- loidproduktionsfähigkeit zu verlieren.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine verdünnte Suspension von aus Kornpflanzen stammenden wilden oder vorher durch mutogene Einwirkungen behandelten
Claviceps purpurea (Fr.) TuL-Kulturen bzw.-Stämmen in einem wässerigen Medium bereitet, diese
Suspension in dünner Schicht auf der Oberfläche eines als Kohlenstoffquelle ausschliesslich oder über- wiegend Stärke und/oderDex1rin enthaltenden festen Nährbodens ausbreitet, aus den gebildeten Kolonien diejenigen, welche eine violette bzw.
orangeviolette Färbung zeigen, abtrennt, aus den abgetrennten Kolonien eine Schüttelkultur und/oder eine weitere Suspension herstellt, mit der die Ausbreitung und Abtrennung wiederholt wird, worauf der derart selektierte Stamm auf einem Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden Nährboden weitergezüchtet wird.
Die wilden Claviceps purpurea-Kulturen enthalten stets in kleinerem und die mutogen behandelten Kulturen in verhältnismässig grösserem Mass Mutanten, welche ein von den allgemeinen Eigenschaften der Kultur abweichendes biologisches Verhalten zeigen und zur dauerhaften und gute Ausbeuten bietenden saprophytischen Alkaloidproduktion fähig sind.
Das erfindungsgemässe Verfahren beruht somit auf der Erkenntnis, dass einerseits die unter saprophytischen Bedingungen zur Alkaloidproduktion fähigen Stämme, wenn sie an geeigneten Nährböden in zu einzelnen Kolonien verdünntem Zustand gezüchtet werden, ein charakteristisches Pigment erzeugen und dadurch auf Grund der Farbe der Kolonien mit Sicherheit von den keine Alkaloide produzierenden Stämmen unterschieden werden können ;
und dass anderseits dieProduktionsfähigkeitder derart selektierten Stämme praktisch unbegrenzt aufrecht erhalten und durch fortschreitende Selektion sogar immer mehr stabilisiert werden kann, wenn zur Aufrechterhaltung des Stammes ein Nährboden verwendet wird, welcher günstige Bedingungen zur Entwicklung des alkaloidproduzierenden Mutanten bietet und gleichzeitig die Entwicklung der durch Rückmutation entstehenden, keine Alkaloide produzierenden, revertanten Mutanten hemmt.
Die Ausgangskultur wird im Sinne der Erfindung auf einem differenzierenden Nährboden zu Einzelkolonien verdünnt : dieser Nährboden enthält als Kohlenstoffquelle überwiegend oder ausschliesslich Stärke und/oder Dextrin, neben wenig oder gar keinen Mono- bzw. Disacchariden, ferner eine organische oder anorganischeStickstoffquelleund alsanorganischeSalzeKalium-und PO-Ionen ; sein pH-Wert soll mindestens 6, 5, zweckmässig 6,8 betragen. Auf einem Nährboden von solcher Zusammensetzung erscheinen die Kolonien der zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen Stämme in orangevioletter Farbe, während die reinen Kolonien der vom Gesichtspunkt der Alkaloidproduktion negativen Stämme weiss bleiben und die Mischkolonien eine entsprechend hellere Verfärbung oder nur die Bildung von farbigen Sektoren zeigen.
Auf zahlreichen andern Nährböden, wie z. B. an Malz-, Hefe- oder Fleischbrühe-Agar, können die Kolonien derselben Stämme nicht voneinander unterschieden werden. Auf dem zur Produktion von Alkaloiden verwendeten Zucker-Bemsteinsäure-Nährboden kann eine
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Pigmentbildungzwar gegebenenfalls auftreten, aber-wie Faber und Vining (Can. J. Microbiol, 4 D. 9581,
S. 611) unter Benutzung von 41 verschiedenen Stämmen festgestellt haben-besteht hier kein Zusam- menhang zwischen der auftretenden Pigmentation und der Fähigkeit zur Alkaloidproduktion.
Auf dem erfindungsgemäss zusammengesetzten, differenzierenden Nährboden sind die dominierenden Komponen- ten dieser färbenden Pigmente - bei PH- Werten zwischen 6, 0 und 7, 0 umschlagende, indikatorartige
Farbstoffe von orangegelber bzw. orangevioletter Farbe - tatsächlich zur alkaloldproduzierenden Fähig- keit gebundene charakteristische Produkte dieser Pilze. Von den unter saprophytischen Bedingungen kei- ne Alkaloide erzeugenden Stämmen werden an Kompflanzen, also unter parasitische Lebensbedingun- gen, gleichzeitig mit der Alkaloiderzeugung dieselben Farbstoffe produziert, wie dies durch papier- chromatographische Identifizierung festgestellt werden konnte.
Die Selektion der Kolonien auf Grund ihrer Farbe kann wesentlich schneller durchgeführt werden als die bisher angewendeten Selektionsverfahren, bei welchen die Kolonien einzeln auf einen flüssigen
Nährboden geimpftund dannnach 6 bis 60 Tagen Inkubation die erhaltenen Kulturen auf ihren Alkaloid- gehalt untersucht wurden. Neben seiner Einfachheit und raschenDurchführbarkeit zeigt das neue Verfahren den weiteren wichtigen Vorteil, dass die zur Produktion von Alkaloiden fähigen Individuen auch in
Mischkolonien erkannt werden können, während die aus solchenMischkolonien erhaltenen Kulturen noch keine messbare Alkaloidproduktion zeigen.
In dem aus Sklerotien oder von aus mycelhaltigen Kulturen bereiteten Verdünnungen erhaltenen Kolonien kommen die alkaloldproduzierenden Mutanten überwiegend in solchen Mischkolonien vor ; die Mutanten konnten also nach den bisherigen Verfahren überhaupt nicht erkannt werden.
Die nach dem erfindungsgemässenverfahren auf Grund ihrer violetten oder orangevioletten Färbung abgetrennten Kolonien müssen dann wiederholt einer Verdünnung unterworfen werden : diese Kulturen werden auf einen zur Alkaloidproduktion geeigneten Nährboden geimpft, am Schütteltisch inkubiert, dann wird das erhaltene Hyphengewebe z. B. mittels eines"Turmix"-Apparates zerkleinert und in entsprechender Verdünnung wieder an dem oben beschriebenen Nährboden ausgebreitet. Dieses Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, bis keine weissen oder gemischten Kolonien mehr an den Agarplatten erscheinen.
Die auf diese Weise selektierte Kultur wird dann auf einem Nährboden weitergezüchtet bzw. weiter erhalten, welcher neben organischen Kohlenstoffquellen (Polysaccharide, Zucker, organische Säuren) und anorganischen Salzen 0, 01 bis 3, 0% Glycin als Stickstoffquelle enthält. Es wurde nämlich beobachtet-und diese Beobachtung bildet eine weitere wesentliche Grundlage der Erfindung - dass die zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen Pilze das Glycin als Stickstoffquelle zu ihrer Entwicklung verwerten können, während die unter saprophytischen Bedingungen keine Alkaloide produzierenden Individuen praktisch unfähig zum Assimileren des Glycins sind.
So wird durch Anwendung eines Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden Nährbodens selektiv die Weiterentwicklung der produzierenden Stämme begünstigt, während die nicht produzierenden Individuen unterdrückt werden.
Die Selektion der zu saprophytischer Produktion von Alkaloiden fähigen Kultur kann rascher und vorteilhafter durchgeführt werden, wenn man auch zwischen den einzelnen Agarplatten-Verdünnungen einen Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden flüssigen Nährboden zum in Schüttelkultur erfolgenden Inkubieren der ausgewählten Kolonien verwendet ; es ist ebenfalls vorteilhaft, Glycin als Stickstoffquelle auch in den zum Züchten der Verdünnungskolonien angewendeten Agarplatten zu verwenden.
Dadurch kann schon in der ersten Phase des Verfahrens die relativ schnellere Vermehrung der zur Produktion von Alkaloiden fähigen Individuen erreicht und die Proportion solcher Individuen erhöht werden ; damit wird auch die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von überwiegend aus produzierenden Individuen bestehenden Kolonien erhöht und die Zahl der zur Herstellung einer reinen produzierenden Einkolo- lonien- Kultur nötigen Selektionsschritte vermind ert.
Die nach der beschriebenen Methode isolierten und weitergezüchteten Einkolonien-Kulturen sind zwar auch in diesem Zustand schon mit gutem Erfolg zur betrieblichen saprophytischen Produktion von Mutterkomalkaloiden geeignet, die Einkolonien-Kulturen können jedoch ihrem Wesen nach nicht als homogene, auch vom genetischen Standpunkt einheitliche Kulturen betrachtet werden ; es besteht bei solchen Kulturen immer die Möglichkeit, dass die Kulturen - auch ohne das Auftreten von Mutationen-mit nicht produzierenden Individuen verunreinigt werden. Solche Verunreinigungen können beim Weiterzüchten bzw. bei der Anwendung solcher Stämme zur betrieblichen Produktion zur Verminderung der Produktionsfähigkeit des Stammes führen. Es ist deshalb vorteilhaft, eine auch genetisch einheitliche Einkonidien-Kultur (vgL M.
Jung u. H. Rochelmeyer, Beiträge zur Biologie der Pflanzen, 35 [1960], S. 343) aus der nach dem erfindungsgemässen Verfahren isolierten Einkolonien-Kultur zu züchten.
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Konidien werden von den zur saprophytischen Alkaloidproduktion fähigen Stämmen im allgemeinen nur schwach oder überhaupt nicht produziert. Wenn man aber den zur Alkaloidproduktion verwendeten Nährboden mit überwiegend organische Stickstoffverbindungen enthaltenden natürlichen Zu- sätzen - wie z. B. Maisquellwasser, Pepton usw. - ergänzt oder einen überwiegend organische Stickstoffverbindungen enthaltenden natürlichen Nährboden (z. B. Kartoffelextrakt, Sojamehl, Stärke-Glutengemisch usw.) verwendet, dann kann auf solchen, den parasitischen Lebensbedingungen näherstehenden Nährböden eine intensivere vegetative Entwicklung der Organismen und damit die Bildung von mehr oder weniger Konidien hervorgerufen werden.
Wenn aus der derart gewonnenen Kultur der überwiegende Teil des Hyphengewebes durch Filtrieren entfernt wird, kann man aus der erhaltenen Konidiensuspension in ansich bekannterWeise eine Einzellen-Kultur herstellen. Die aus einem einzigen isolierten Konidium gezüchtete Kultur kann dann in derselben Weise weitergezüchtet werden, wie oben im Fall von Einkolonien-Kulturen beschrieben wurde.
Die praktische Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
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EMI4.2
<tb>
<tb> l:Saccharose <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Bernsteinsäure <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Ca <SEP> (NO,), <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> MgSO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> KILO4 <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb> KC1 <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb> FeSO <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 009 <SEP> g <SEP>
<tb> Zens04 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> g <SEP>
<tb> mit <SEP> Leitungswasser <SEP> ergänzt <SEP> zu <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> PH <SEP> (mit <SEP> 10'figer <SEP> wässeriger
<tb> Ammoniaklösung <SEP> eingestellt) <SEP> 5,2
<tb>
Die Kulturen worden bei 23 C 7 Tage geschüttelt, dann homogenisiert und im Verhältnis von 1 : 10 000 bzw. 1 : 1000000 verdünnt und auf einem differenzierenden Nährboden folgender Zusammensetzung ausgebreitet :
EMI4.3
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> Stärke <SEP> 2, <SEP> 00% <SEP>
<tb> KHPO <SEP> 0, <SEP> 25%
<tb> NH4Cl <SEP> 0, <SEP> 10%
<tb> Agar <SEP> l, <SEP> 80% <SEP>
<tb> PH-Wert <SEP> 6,8
<tb>
Nach 12 Tagen werden aus jenen an der Agaroberfläche gebildeten Kolonien, welche eine violett-weisse Farbe zeigen, Organismen auf schrägen Agar-Nährboden gleicher Zusammensetzung umgeimpft ; nach 8 Tagen werden die gebildeten Kolonien bezüglich ihrer Farbe geprüft, und die von der Agaroberfläche abgewaschenen Kulturen werden in einen flüssigen Nährboden obiger Zusammensetzung übertragen.
Die Kulturen werden wieder am Schütteltisch bei 230C inkubiert ; nach 6 Tagen werden sie, wie oben beschrieben, homogenisiert, verdünnt und wieder am differenzierenden Nährboden ausgebrei- tet. Nach fünfmaliger Wiederholung dieses Verfahrens, wenn keine Kolonien weisser Farbe an der Agaroberfläche mehr zu beobachten sind, wird die Kultur vom schrägen Agar auf einen mit 1% Witte'schem Pepton ergänzten flüssigen Nährboden übertragen ; nach 10 Tagen wird die Kultur durch
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ein Filtertuch steril filtriert, und aus der erhaltenen Konidiensuspension wird mit Hilfe einer Hängetropfen-Kultur eine Einkonidien-Kultur isoliert.
Den Schüttelkulturen, die in nach den einzelnen Selektionen (Verdünnung und Ausbreitung) umgeimpften Kolonien gezüchtet worden sind, wurden Muster entnommen und deren Alkaloidgehalt in be- kannter Weise (vgL Österr. Chem. Ztg. 63 [1962], S. 300) bestimmt ; es wurden in den von verschiedenen Kolonien erhaltenen Schüttelkulturen die folgenden Alkaloidgehalte gefunden :
EMI5.1
<tb>
<tb> nach <SEP> der <SEP> ersten <SEP> Selektion <SEP> 1-10 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> nach <SEP> der <SEP> zweiten <SEP> Selektion <SEP> 1-187/mi <SEP>
<tb> nach <SEP> der <SEP> dritten <SEP> Selektion <SEP> 15-75 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> nach <SEP> der <SEP> vierten <SEP> Selektion <SEP> 40-90 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> nach <SEP> der <SEP> fünften <SEP> Selektion <SEP> 70-90 <SEP> y/ml <SEP>
<tb>
Die in üblicher Weise selektierte Einkonidien-Kultur dieses Stammes produzierte in einer in obiger Weise hergestellten Schüttelkultur in 6 Tagen eine Alkaloidmenge von 110 y/mL
Beispiel 2 :
Aus einem von Kompflanzen stammenden Sklerotium wurden die Pilze in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, und die am Schütteltisch bei 230C 7 Tage inkubierte Kultur wird einer Selektion in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise, aber unter Anwendung eines Nährbodens der folgenden Zusammensetzung, unterworfen :
EMI5.2
<tb>
<tb> Kartoffelextrakt
<tb> (auf <SEP> feuchte <SEP> Kartoffel <SEP> berechnet) <SEP> 50, <SEP> 0% <SEP>
<tb> Glycin <SEP> 0, <SEP> 50/0 <SEP>
<tb> KHPO <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP>
<tb> Agar <SEP> 2, <SEP> 0%
<tb> pH-Wert <SEP> 6,8
<tb>
Die selektierten Kolonien haben in den Schüttelkulturen die folgenden Mengen von Alkaloiden produziert :
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<tb>
<tb> nach <SEP> der <SEP> ersten <SEP> Selektion <SEP> 20 <SEP> - <SEP> 80 <SEP> y/ml
<tb> nach <SEP> der <SEP> zweitenSelektion <SEP> 140-200 <SEP> y/ml <SEP>
<tb> nach <SEP> der <SEP> dritten <SEP> Selektion <SEP> 320-400 <SEP> y/ml <SEP>
<tb>
Eine aus diesem Stamm in üblicher Weise selektierte Einkonidien-Kultur produzierte in einer in obiger Weise hergestellten Schüttelkultur in 6 Tagen eine Alkaloidmenge von 500 y/mL
Beispiel 3 :
Aus einer Kultur eines von Kompflanzen stammenden und einer mutogenen Behandlung durch Röntgenbestrahlung unterworfenen Claviceps purpurea (Fr.) TuL-Stammes, welcher unmittelbar nach der Selektion eine ziemlich gute, aber dann allmählich sinkende Alkaloidproduktion zeigte, wurden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise Verdünnungen und Agarplatte-Ausbreitungen auf einem differenzierenden Nährboden der folgenden Zusammensetzung vorgenommen :
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<tb>
<tb> Stärke <SEP> 2, <SEP> 0% <SEP>
<tb> Tryptophan <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb> KC1 <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb> (NHHPO4 <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> Agar <SEP> 1, <SEP> 8% <SEP>
<tb> PH-Wert <SEP> 6,8
<tb>
Es wurden an der Agaroberfläche neben zahlreichen weissen, zur Alkaloidproduktion unfähigen Kolonien einige violett gefärbte Kolonien erhalten.
Diese wurden dann in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise verdünnt und auf Agarplatten von gleicher Zusammensetzung ausgebreitet. Nach 7 Tagen Inkubation
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wurden die Kolonien von der Agaroberfläche abgewaschen und in einen flüssigen Nährboden der folgenden Zusammensetzung umgeimpft :
EMI6.1
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 5, <SEP> 0% <SEP>
<tb> Bemsteinsäure <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> Glycin <SEP> 0,5% <SEP>
<tb> KHO <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> CaCl <SEP> 0, <SEP> 050/0 <SEP>
<tb> MgSO4 <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP>
<tb> FeSO <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP>
<tb>
Der PH- Wert des Nährbodens wurde mit Natriumhydroxyd auf 5,2 eingestellt. Die Kulturen wurden 2 Tage am Schütteltisch inkubiert, dann wurden sie homogenisiert, verdünnt und ausgebreitet.
Nach einer weiteren Wiederholung dieses Verfahrens, als keine weissen Kolonien mehr an der Agarplatte zu finden waren, wurden die Kolonien von dem schrägen Agar abgewaschen und auf einen Nährboden folgender Zusammensetzung übertragen :
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<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 1%
<tb> Gluten- <SEP> Extrakt <SEP> 10/0 <SEP>
<tb> Agar <SEP> 2%
<tb> KH3PO4 <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> CaCl2 <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP>
<tb> MgS04 <SEP> 0, <SEP> 02%
<tb> FeSO4 <SEP> 0. <SEP> 02%
<tb>
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haltenen Konidiensuspension eine solche Verdünnung hergestellt, welche beim Ausbreiten auf Agarplatten 2 bis 5 Konidien je Platte enthält. Die entstehenden isolierten Kolonien wurden am vierten Tag unter Mikroskop von der Agarplatte entfernt und auf einen differenzierenden schrägen Agar-Nährboden von im Beispiel l angegebener Zusammensetzung umgeimpft.
Die derart erhaltenen und auf Grund ihrer Pigmentproduktion kontrollierten Einkonidien-Kulturen werden auch weiter auf glycinhaltigem Nährboden gehalten, unter wöchentlichem Umimpfen.
Zur Alkaloidproduktion werden die in üblicher Weise hergestellten Schüttelkulturen in einen 6 l fassenden kleineren, dann in einen 200 1 fassenden grösseren, belüfteten Fermentor um geimpft ; bis zum sechsten Tag war einAlkaloidgehalt von 540 γ/ml (durch die nichtspezifische van Urklsche Farbenreaktion bestimmt) erreicht ; die einzelnen Alkaloide wurden durch spezifische Schicht-Chromatographie getrennt und quantitativ bestimmt ; es wurde ein Alkaloidgehalt von 210'Y/ml gefunden, von welchem 60% in der Form von Ergotoxin und Ergometrin in kristalliner Form gewonnen werden konnten.
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