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Verfahren zum Selektieren und Weiterzüchten von in Saprophyten-Kultur
Mutterkornalkaloide erzeugenden Claviceps-Stämmen Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zum Selektieren und Weiterzüchten von Claviceps-Stämmen,
die die Fähigkeit besitzen, Mutterkornalkaloide in saprophytischer Kultur zu erzeugen.
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Das an Kornpflanzen, in parasitischer Weise erfolgende Züchten und
das Einsammeln von Mutterkorn ist ziemlich schwierig und ist den Launen der Witterung
ausgesetzt; deshalb werden schon seit längerer Zeit Versuche zur betrieblichen Erzeugung
von Mutterkornalkaloiden in saprophytischer Kultur geführt.
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Seit Anfang der 1950er Jahre sind in der Literatur Berichte über die
erfolgreiche Produktion von Mutterkornalkaloiden in saprophytischer Kultur von Autoren
erschienen, die das Erzeugen von Alkaloiden nicht nur durch Farbreaktionen oder
auf Grund der biologischen Aktivität der Fermentationsflüssigkeit, sondern auch
durch das tatsächliche präparative Isolieren der Alkaloide nachgewiesen haben. Abe
und seine Mitarbeiter (britische Patentschrift 757 696) haben zur Gruppe der damals
erkannten Clavin-Alkaloide gehörende, klinisch inaktive Alkaloide auf derartige
Weise hergestellt; die von S t o 11 und seinen Mitarbeitern (deutsche Patentschrift
1007 949) von Kornpflanzen abgeimpften Pilze haben dagegen in Oberflächenkultur
auch unter saprophytischen Bedingungen die klassischen Alkaloide erzeugt. Roche
1 m e y e r berichtet in dieser Zeit über die saprophytische Erzeugung von Ergotamin,
Ergocristin und Ergometrin; aus einer um einige Jahre späteren Mitteilung desselben
Autors (Pharm. Ztg., 103, 1269, 1958) geht aber hervor, daß es ihm nicht gelungen
ist, seine früheren Versuche zu reproduzieren. C h a i n und seine Mitarbeiter (deutsche
Auslegeschrift 1140 670 und britische Patentschrift 883 329) haben durch
in betrieblichem Maß ausgeführte Fermentation kristallines Lysergsäureamid und Lysergsäure-methylcarbinolamid
mit guter Ausbeute hergestellt; die Produkte können aber nach in entsprechender
Weise durchgeführter alkalischer Hydrolyse nur als Ausgangsstoff zur halbsynthetischen
Herstellung von pharmakologisch aktiven Alkaloiden verwendet werden.
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K. Winkler und K. Mothes (Planta Medica, 10, 208, 1962) stellten in
ihrem die bisher erzielten Ergebnisse zusammenfassend beschreibenden Aufsatz fest,
daß die pharmakologisch wichtigen Alkaloide auch im Jahre 1962 noch bekannterweise
durch das parasitische Züchten der Pilze an Kornpflanzen produziert werden. Die
mit in saprophytischer Weise in Oberflächenkultur Alkaloide erzeugenden Stämmen
erzielten Ergebnisse waren wegen der zur Alkaloidenproduktion nötigen langen Zeit
von untergeordneter Bedeutung. In submerser Schüttelkultur waren dagegen nur einige
Stämme zur nennenswerten Produktion fähig, und auch diese haben überwiegend nur
Clavinalkaloide bzw. in einem Fall Lysergsäureamid produziert. Es wurde von verschiedenen
Autoren wiederholt betont, daß diese chemische Produktionsfähigkeit nur bei gewissen
seltenen Pilzarten auftritt, und auch bei diesen Arten können im Gang der Weiterzüchtung
Mutationen oder beständige Modifikationen auftreten, durch welche die mit großer
Mühe selektierte alkaloidenproduzierende Fähigkeit des Stammes wieder verlorengeht.
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Die Literaturangaben und die praktischen Erfahrungen weisen also gleichsam
darauf hin, daß die industrielle Verwertung der bisher erzielten Ergebnisse eben
deshalb nicht möglich wurde, weil die unter saprophytischen Bedingungen Alkaloide
produzierenden Stämme, wenn sie auch in sehr seltenen Fällen vom Gesichtspunkt der
Zusammensetzung der produzierten Alkaloide und der Alkaloidenausbeute als brauchbar
erschienen, ihre Produktionsfähigkeit im Laufe der weiteren Züchtung bzw. der weiteren
Aufrechterhaltung des Stammes in verhältnismäßig kurzer Zeit teilweise oder völlig
verloren. Diese Schwierigkeiten, die die industrielle Verwirklichung
der
saprophytischen Produktion von Mutterkornalkaloiden bisher gehindert haben, werden
durch die vorliegende Erfindung behoben, durch welche einerseits eine Möglichkeit
zur Selektion von zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen Individuen
aus von Kornpflanzen stammenden, natürlichen oder einer mutagenen Behandlung unterworfenen
Claviceps-Kulturen und zur Gewinnung von Einkonidien-Kulturen aus solchen Individuen
und andererseits zur entsprechenden Aufrechterhaltung der Produktionsfähigkeit der
derart gewonnenen Stämme geschaffen wird.
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Die Auswahl der zur saprophytischen Alkaloidenproduktion fähigen Stämme
erfolgt im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Selektion aus von der Kornpflanze
stammenden unbehandelten, sogenannten wilden Claviceps-Kulturen oder aus vorher
durch irgendeine mutagene Einwirkung behandelten Kulturen. Die wilden Kulturen enthalten
nämlich stets in kleinerer und die mutagen behandelten Kulturen in verhältnismäßig
größerer Zahl Mutanten, welche ein von den allgemeinen Eigenschaften der Kultur
abweichendes biologisches Verhalten zeigen, darunter auch Mutanten, die zur dauerhaften
und gute Ausbeuten bietenden saprophytischen Alkaloiodenproduktion fähig sind. Solche
mutante Stämme können aber nur dann isoliert gezüchtet werden, wenn eine entsprechende
Methode zur Selektion des produktionsfähigen Mutanten, also zum raschen und zuverlässigen
überprüfen von sehr vielen Individuen bezüglich dieser Eigenschaft zur Verfügung
steht und die Bedingungen der Aufrechterhaltung der Produktionsfähigkeit des selektierten
Stammes gewährleistet werden können.
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Die Lösung dieser Aufgabe wurde durch die Erkenntnis ermöglicht, daß
einerseits die unter saprophytischen Bedingungen zur Alkaloidenproduktion fähigen
Stämme, wenn sie an dazu geeigneten Nährböden in zu einzelnen Kolonien verdünntem
Zustand gezüchtet werden, ein charakteristisches Pigment erzeugen und dadurch auf
Grund der Farbe der Kolonien mit Sicherheit von den keine Alkaloide produzierenden
Stämmen unterschieden werden können und daß andererseits die Produktionsfähigkeit
der derart selektierten Stämme praktisch unbegrenzt aufrechterhalten und durch fortschreitende
Selektion sogar immer mehr stabilisiert werden kann, wenn zur Aufrechterhaltung
des Stammes ein Nährboden verwendet wird, welcher günstige Bedingungen zur Entwicklung
des Alkaloide produzierenden Mutanten bietet und gleichzeitig die Entwicklung der
durch Rückmutation entstehenden, keine Alkaloide produzierenden, revertanten Mutanten
hemmt.
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Die Ausgangskultur wird im Sinne der Erfindung an einem differenzierenden
Nährboden zu Einzelkolonien verdünnt; dieser Nährboden enthält als Kohlenstoffquelle
überwiegend oder ausschließlich Polysaccharide (neben wenig oder gar keinen Mono-bzw.
Disacchariden), ferner eine organische oder anorganische Stickstoffquelle und als
anorganische Salze unbedingt Kalium- und P04 Ionen; sein pH-Wert ist auf mindestens
6,5, zweckmäßig auf 6,8 eingestellt. An einem Nährboden von solcher Zusammensetzung
erscheinen die Kolonien der zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen
Stämme in orangevioletter Farbe, während die reinen Kolonien der vom Gesichtspunkt
der Alkaloidenproduktion negativen Stämme weiß bleiben und die Mischkolonien eine
entsprechend hellere Verfärbung oder nur die Bildung von farbigen Sektoren zeigen.
An zahlreichen anderen Nährböden, wie z. B. an Malz-, Hefe- oder Fleischbrühe-Agar,
können die Kolonien derselben Stämme nicht voneinander unterschieden werden. An
dem zur Produktion von Alkaloiden verwendeten Zucker-Bernsteinsäure-Nährboden kann
eine Pigmentbildung zwar gegebenenfalls auftreten, aber - wie Faber und V i n i
n g (Can. J. Microbiol., 4, 611, 1958) es unter Benutzung von 41 verschiedenen Stämmen
festgestellt haben - hier besteht kein Zusammhang zwischen der auftretenden Pigmentation
und der Fähigkeit zur der auftretenden Pigmentation und der Fähigkeit zur Alkaloidenproduktion
oder kann ein etwaiger meingültig betrachtet werden. Am erfindungsgemäß zusammengestellten,
differenzierenden Nährboden sind die dominierenden Komponenten dieser färbenden
Pigmente - bei pH-Werten zwischen 6,0 und 7,0 umschlagende indikatorartige Farbstoffe
von orangegelber bzw. orangevioletter Farbe - tatsächlich zur alkaloidenproduzierenden
Fähigkeit gebundene charakteristische Produkte dieser Pilze. Von den unter saprophytischen
Bedingungen keine Alkaloide erzeugenden Stämmen werden an Kornpflanzen, also unter
parasitischen Lebensbedingungen, gleichzeitig mit der Alkaloidenerzeugung dieselben
Farbstoffe produziert, wie dies durch papierchromatographischer Identifizierung
festgestellt werden konnte.
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Die Selektion der Kolonien auf Grund ihre Farbe kann wesentlich schneller
vorgenommen werden, als die bisher angewendeten Selektionsverfahren, bei welchen
die Kolonien einzeln auf einen flüssigen Nährboden geimpft wurden und dann nach
6 bis 60 Tagen Inkubation die erhaltenen Kulturen auf ihren Alkaloidgehalt untersucht
wurden. Neben seiner Einfachheit und rascher Durchführbarkeit zeigt das neue Verfahren
den weiteren wichtigen Vorteil, daß die zur Produktion von Alkaloiden fähigen Individuen
auch in Mischkolonien erkannt werden können, während die aus solchen Mischkolonien
erhaltenen Kulturen noch keine meßbare Alkaloidproduktion zeigen. In den aus Sklerotien
oder aus mycelhaltigen Kulturen bereiteten Verdünnungen erhaltenen Kolonien kommen
die alkaloidenproduzierenden Mutanten überwiegend in solchen MischkoIonien vor;
die Mutanten konnten also nach den bisherigen Verfahren überhaupt nicht erkannt
werden.
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Die aus solchen Mischkolonien erhaltenen Kulturen müssen dann wiederholt
einer Verdünnung unterworfen werden; diese Kulturen werden also auf irgendeinen
bekannten, zur Alkaloidenproduktion geeigneten Nährboden geimpft, am Schütteltisch
inkubiert, dann wird das erhaltene Hyphengewebe z. B. mittels eines »Turmix«-Apparates
zerkleinert und in entsprechender Verdünnung wieder an dem oben beschriebenen Nährboden
ausgebreitet. Dieses Verfahren wird dann mehrmals wiederholt, bis keine weißen oder
gemischten Kolonien mehr an den Agrarplatten erscheinen.
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Die auf obige Weise selektierte Kultur wird dann im Sinne der Erfindung
an einem Nährboden weitergezüchtet, bzw. weiter erhalten, welcher neben organischen
Kohlenstoffquellen (Polysaccharide, Zucker, organische Säuren) und anorganischen
Salzen 0,01 bis 3,0 % Glycin als Stickstoffquelle enthält. Man hat
nämlich
beobachtet - und diese Beobachtung bildet eine weitere wesentliche Grundlage der
vorliegenden Erfindung -, daß die zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden
fähigen Pilze das Glycin als Stickstoffquelle zu ihrer Entwicklung verwerten können,
während die unter saprophytischen Bedingungen keine Alkaloide produzierenden Individuen
praktisch unfähig zum Assimilieren des Glycins sind. So wird durch Anwendung eines
Glycins als Stickstoffquelle enthaltenden Nährbodens selektiv die Weiterentwicklung
der produzierenden Stämme begünstigt, während die nicht produzierenden Individuen
unterdrückt werden.
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Die Selektion der zu saprophytischer Produktion von Alkaloiden fähigen
Kultur kann wesentlich rascher und vorteilhafter durchgeführt werden, wenn man auch
zwischen den einzelnen Agarplatten-Verdünnungen einen Glycin als Stickstoffquelle
enthaltenden flüssigen Nährboden zum in Schüttelkultur erfolgenden Inkubieren der
ausgewählten Kolonien verwendet; es ist ebenfalls vorteilhaft, Glycin als Stickstoffquelle
auch in den zum Züchten der Verdünnungskolonien angewendeten Agrarplatten zu verwenden.
Dadurch kann schon in der ersten Phase des Verfahrens die relativ schnellere Vermehrung
der zur Poduktion von Alkaloiden fähigen Individuen erreicht und die Proportion
solcher Individuen erhöht werden, damit wird auch die Wahrscheinlichkeit des Auftretens
von überwiegend aus produzierenden Individuen bestehenden Kolonien erhöht und die
Zahl der zur Herstellung einer reinen produzierenden Einkolonien-Kultur nötigen
Selektionsschritte vermindert.
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Die nach der obigen Methode isolierten und weitergezüchteten Einkolonien-Kulturen
sind zwar auch in diesem Zustand schon mit gutem Erfolg zur betrieblichen saprophytischen
Produktion von Mutterkornalkaloiden geeignet, die Einkolonien-Kulturen können jedoch
ihrem Wesen nach nicht als homogene, auch vom genetischen Standpunkt einheitliche
Kulturen betrachtet werden; es besteht bei solchen Kulturen immer die Möglichkeit,
daß diese Kulturen - auch ohne das Auftreten von Mutationen - mit nicht produzierenden
Individuen verunreinigt werden. Solche Verunreinigungen können beim Weiterzüchten,
bzw. bei der Anwendung solcher Stämme zur betrieblichen Produktion zur Verminderung
der Produktionsfähigkeit des Stammes führen. Es ist deshalb vorteilhaft, eine auch
genetisch einheitliche Einkonidien-Kultur (vgl. M. T u n g und H. R o c h e 1-m
e y e r, Beiträge zur Biologie der Pflanzen, 35, 343 [1960]) aus der nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren isolierten Einkolonien-Kultur zu züchten.
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Konidien werden von den zur saprophytischen Alkaloidenproduktion fähigen
Stämmen im allgemeinen nur schwach oder überhaupt nicht produziert. Wenn man aber
den zur Alkaloidenproduktion angewendeten Nährboden mit überwiegend organische Stickstoffverbindungen
enthaltenden natürlichen Zusätzen, wie z. B. Maisquellwasser, Pepton usw., ergänzt
oder einen überwiegend organische Stickstoffverbindungen enthaltenden natürlichen
Nährboden (z. B. Kartoffelextrakt, Sojamehl, Stärke-Gluten-Gemisch, usw.) verwendet,
dann kann auf solchen den parasitischen Lebensbedingungen näher stehenden Nährböden
eine intensivere vegetative Entwicklung der Organismen und damit die Bildung von
mehr oder weniger Konidien hervorgerufen werden. Wenn aus der derart gewonnenen
Kultur der überwiegende Teil des Hyphengewebes durch Filtrieren entfernt wird, kann
man aus der erhaltenen Konidiensuspension in an sich bekannter Weise eine Einzellen-Kultur
herstellen. Die aus einem einzigen isolierten Konidium gezüchtete Kultur kann dann
in derselben Weise weitergezüchtet werden, wie es oben im Fall von Einkolonien-Kulturen
beschrieben wurde.
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Die praktische Ausführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens wird
durch die nachfolgenden Beispiele näher veranschaulicht.
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Beispiel 1 Eine Claviceps-purpurea-Kultur, die aus einem wilden Sklerotium
einheimischer Herkunft an schrägem Malzextrakt-Agar gezüchtet wurde, wird in einen
flüssigen Nährboden folgender Zusammensetzung umgeimpft: Saccharose ......................
100 g Bernsteinsäure .................. 10 g Ca(NO.)2 ......................
1 g MgS04 ......................... 0,25 g FeS04 .......................... 0,009
g ZnS04 ......................... 0,003 g Mit Leitungswasser ergänzt ....
zu 1000 ml pH (mit 10°/oiger wässeriger Ammoniaklösung eingestellt)
... 5,2 Die Kulturen werden bei 23° C 7 Tage geschüttelt, dann homogenisiert
und im Verhältnis von 1:10 000 bzw. 1:1 000 000 verdünnt und an einem erfindungsgemäßen
differenzierenden Nährboden folgender Zusammensetzung ausgebreitet: Saccharose .....................
0,050/0 Stärke ......................... 2,00% KH2P04 ....................... 0,25%
NH4c1 ......................... 0,10% Agar .......................... 1,80% pH-Wert
....................... 6,8 Nach 12 Tagen werden aus jenen an der Agaroberfläche
gebildeten Kolonien, welche eine violettweiße Farbe zeigen, Organismen auf schrägen
Agar-Nährboden gleicher Zusammensetzung umgeimpft, nach 8 Tagen werden die gebildeten
Kolonien bezüglich ihrer Farbe geprüft, und die von der Agaroberfläche abgewaschenen
Kulturen werden in einen flüssigen Nährboden obiger Zusammensetzung übertragen.
Die Kulturen werden wieder am Schütteltisch bei 23' C inkubiert, nach 6 Tagen
werden sie, wie oben beschrieben, homogenisiert, verdünnt und wieder am obigen differenzierenden
Nährboden ausgebreitet. Nach fünfmaliger Wiederholung dieses Verfahrens, wenn keine
Kolonien weißer Farbe an der Agaroberfläche mehr zu beobachten sind, wird die Kultur
vom schrägen Agar auf einen obigen, aber mit 1% Witteschem Pepton ergänzten flüssigen
Nährboden übertragen; nach 10 Tagen wird die Kultur durch ein Filtertuch steril
filtriert, und aus der erhaltenen Konidiensuspension wird mit Hilfe einer Hängetropfen-Kultur
eine Einkonidien-Kultur isoliert.
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Den Schüttelkulturen, die aus nach den einzelnen Selektionen (Verdünnung
und Ausbreitung) umgeimpften Kolonien gezüchtet worden sind, wurden
Muster
entnommen, und deren Alkaloidgehalt wurde in bekannter Weise (vgl. Österr. Chem.
Ztg., 63, 300, 1962) bestimmt; es wurden in den von verschiedenen Kolonien erhaltenen
Schüttelkulturen die folgenden Alkaloidgehalte gefunden: Nach der ersten Selektion
..... 1 bis 10 y/ml Nach der zweiten Selektion ..... 1 bis 18 y/ml
Nach der dritten Selektion ..... 15 bis 75 ylml Nach der vierten Selektion
..... 40 bis 90 ylml Nach der fünften Selektion ..... 70 bis 90 y/ml
Die in üblicher Weise selektierte Einkonidien-Kultur dieses Stammes produzierte
in einer in obiger Weise hergestellten Schüttelkultur in 6 Tagen eine Alkaloidenmenge
von 110 y/ml.
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Beispiel 2 Aus einem von Kornpflanzen stammenden Sklerotium wurden
die Pilze in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, die am Schütteltisch
bei 23° C 7 Tage inkubierte Kultur wird einer Selektion in der im Beispiel 1 beschriebenen
Weise, aber unter Anwendung eines Nährbodens der folgenden Zusammensetzung unterworfen:
Kartoffelextrakt (auf feuchte Kartoffeln berechnet) ......... 50,0010 Glycin .........................
0,5% KH2P04 ....................... 0,1% Agar .......................... 2,0% pH-Wert
...................... 6,8 Die selektierten Kolonien haben in den Schüttelkulturen
die folgenden Mengen von Alkaloiden produziert: Nach der ersten Selektion
... 20 bis 80 7,/ml Nach der zweiten Selektion ... 140 bis 200 y/ml
Nach der dritten Selektion ... 320 bis 400 ylml Eine aus diesem Stamm in
üblicher Weise selektierte Einkonidien-Kultur produzierte in einer in obiger Weise
hergestellten Schüttelkultur in 6 Tagen eine Alkaloidenmenge von 500 ylml. Beispiel
3 Aus einer Kultur eines von Kornpflanzen stammenden und einer mutogenen Behandlung
durch Röntgenbestrahlung unterworfenen Claviceps-purpurea-Stammes, welcher unmittelbar
nach der Selektion eine ziemlich gute, aber dann allmählich sinkende Alkaloidenproduktion
zeigte, wurden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise Verdünnungen und Agarplatteausbreitungen
an einem differenzierenden Nährboden der folgenden Zusammensetzung vorgenommen:
Stärke .......................... 2,0% Tryptophan ..................... 0,1% KCl
........................... 0,1% (NH4)2HP04 .................... 0,2% Agar ...........................
1,8% pH-Wert ........................ 6,8 Es wurden an der Agaroberfläche neben
zahlreichen weißen, zur Alkaloidenproduktion unfähigen Kolonien einige violett gefärbte
Kolonien erhalten. Diese wurden dann in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise verdünnt
und auf Agarplatten von gleicher Zusammensetzung ausgebreitet. Nach 7 Tagen Inkubation
wurden die Kolonien von der Agaroberfläche abgewaschen und in einen flüssigen Nährboden
der folgenden Zusammensetzung umgeimpft: Saccharose .................... 5,0% Bernsteinsäure
................. 0,2% Glycin ........................ 0,5% KH2P04 . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . (g)5010 CaC12 ... ..................... 0,05010
MgS04 ....................... 0,025% FeS04 ........................ 0,025% Der pH-Wert
des Nährbodens wurde mit Natriumhydroxyd auf 5,2 eingestellt. Die Kulturen wurden
2 Tage am Schütteltisch inkubiert, dann wurden sie homogenisiert, verdünnt und ausgebreitet.
Nach einer weiteren Wiederholung dieses Verfahrens, als keine weißen Kolonien mehr
an der Agarplatte zu finden waren, wurden die Kolonien von dem schrägen Agar abgewaschen
und auf einen Nährboden folgender Zusammensetzung übertragen: Saccharose .......................
1% Gluten-Extrakt .................. 1% Agar ........................... 2% KH2P04
....................... 0,05% CaCl2 .......................... 0,05010 MgS04
......................... 0,02% FeS04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 0,02% Die Kultur wurde nach 9 Tagen Inkubation durch ein Filtertuch filtriert
und aus der als Filtrat erhaltenen Konidiensuspension eine solche Verdünnung hergestellt,
welche beim Ausbreiten an Agarplatten zwei bis fünf Konidien je Platte enthält.
Die entstehenden isolierten Kolonien wurden am vierten Tag unter Mikroskop von der
Agarplatte entfernt und auf einen differentierenden schrägen Agar-Nährboden von
im Beispiel 1 angegebener Zusammensetzung umgeimpft. Die derart erhaltenen und auf
Grund ihrer Pigmentproduktion kontrollierten Einkonidien-Kulturen werden auch weiter
an glycinhaltigem Nährboden gehalten unter wöchentlichem Umimpfen.
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Zur Alkaloidenproduktion werden die in üblicher Weise hergestellten
Schüttelkulturen in einen 61 fassenden kleineren, dann in einen 200 1 fassenden
größeren, belüfteten Fermentor umgeimpft; bis zum sechsten Tag war ein Alkaloidgehalt
von 540 7/ml (durch die nichtspezifische van Urksche Farbenreaktion bestimmt) erreicht;
die einzelnen Alkaloide wurden durch spezifische Schichtchromatographie getrennt
und quantitativ bestimmt; es wurde ein Alkaloidgehalt von 210 ylml gefunden, von
welchem 60% in der Form von Ergotoxin und Ergometrin in kristalliner Form gewonnen
werden konnten.