DE1206384B - Verfahren zum Selektieren und Weiterzuechten von in Saprophyten-Kultur Mutterkornalkaloide erzeugenden Claviceps-Staemmen - Google Patents

Verfahren zum Selektieren und Weiterzuechten von in Saprophyten-Kultur Mutterkornalkaloide erzeugenden Claviceps-Staemmen

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DE1206384B DER37787A DER0037787A DE1206384B DE 1206384 B DE1206384 B DE 1206384B DE R37787 A DER37787 A DE R37787A DE R0037787 A DER0037787 A DE R0037787A DE 1206384 B DE1206384 B DE 1206384B
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Eva Udvardy Nagy Geb Cserei Dr
Geza Wack
Tibor Procs
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Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C12P17/183Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing an indolo[4,3-F,G]quinoleine nucleus, e.g. compound containing the lysergic acid nucleus as well as the dimeric ergot nucleus

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Description

  • Verfahren zum Selektieren und Weiterzüchten von in Saprophyten-Kultur Mutterkornalkaloide erzeugenden Claviceps-Stämmen Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Selektieren und Weiterzüchten von Claviceps-Stämmen, die die Fähigkeit besitzen, Mutterkornalkaloide in saprophytischer Kultur zu erzeugen.
  • Das an Kornpflanzen, in parasitischer Weise erfolgende Züchten und das Einsammeln von Mutterkorn ist ziemlich schwierig und ist den Launen der Witterung ausgesetzt; deshalb werden schon seit längerer Zeit Versuche zur betrieblichen Erzeugung von Mutterkornalkaloiden in saprophytischer Kultur geführt.
  • Seit Anfang der 1950er Jahre sind in der Literatur Berichte über die erfolgreiche Produktion von Mutterkornalkaloiden in saprophytischer Kultur von Autoren erschienen, die das Erzeugen von Alkaloiden nicht nur durch Farbreaktionen oder auf Grund der biologischen Aktivität der Fermentationsflüssigkeit, sondern auch durch das tatsächliche präparative Isolieren der Alkaloide nachgewiesen haben. Abe und seine Mitarbeiter (britische Patentschrift 757 696) haben zur Gruppe der damals erkannten Clavin-Alkaloide gehörende, klinisch inaktive Alkaloide auf derartige Weise hergestellt; die von S t o 11 und seinen Mitarbeitern (deutsche Patentschrift 1007 949) von Kornpflanzen abgeimpften Pilze haben dagegen in Oberflächenkultur auch unter saprophytischen Bedingungen die klassischen Alkaloide erzeugt. Roche 1 m e y e r berichtet in dieser Zeit über die saprophytische Erzeugung von Ergotamin, Ergocristin und Ergometrin; aus einer um einige Jahre späteren Mitteilung desselben Autors (Pharm. Ztg., 103, 1269, 1958) geht aber hervor, daß es ihm nicht gelungen ist, seine früheren Versuche zu reproduzieren. C h a i n und seine Mitarbeiter (deutsche Auslegeschrift 1140 670 und britische Patentschrift 883 329) haben durch in betrieblichem Maß ausgeführte Fermentation kristallines Lysergsäureamid und Lysergsäure-methylcarbinolamid mit guter Ausbeute hergestellt; die Produkte können aber nach in entsprechender Weise durchgeführter alkalischer Hydrolyse nur als Ausgangsstoff zur halbsynthetischen Herstellung von pharmakologisch aktiven Alkaloiden verwendet werden.
  • K. Winkler und K. Mothes (Planta Medica, 10, 208, 1962) stellten in ihrem die bisher erzielten Ergebnisse zusammenfassend beschreibenden Aufsatz fest, daß die pharmakologisch wichtigen Alkaloide auch im Jahre 1962 noch bekannterweise durch das parasitische Züchten der Pilze an Kornpflanzen produziert werden. Die mit in saprophytischer Weise in Oberflächenkultur Alkaloide erzeugenden Stämmen erzielten Ergebnisse waren wegen der zur Alkaloidenproduktion nötigen langen Zeit von untergeordneter Bedeutung. In submerser Schüttelkultur waren dagegen nur einige Stämme zur nennenswerten Produktion fähig, und auch diese haben überwiegend nur Clavinalkaloide bzw. in einem Fall Lysergsäureamid produziert. Es wurde von verschiedenen Autoren wiederholt betont, daß diese chemische Produktionsfähigkeit nur bei gewissen seltenen Pilzarten auftritt, und auch bei diesen Arten können im Gang der Weiterzüchtung Mutationen oder beständige Modifikationen auftreten, durch welche die mit großer Mühe selektierte alkaloidenproduzierende Fähigkeit des Stammes wieder verlorengeht.
  • Die Literaturangaben und die praktischen Erfahrungen weisen also gleichsam darauf hin, daß die industrielle Verwertung der bisher erzielten Ergebnisse eben deshalb nicht möglich wurde, weil die unter saprophytischen Bedingungen Alkaloide produzierenden Stämme, wenn sie auch in sehr seltenen Fällen vom Gesichtspunkt der Zusammensetzung der produzierten Alkaloide und der Alkaloidenausbeute als brauchbar erschienen, ihre Produktionsfähigkeit im Laufe der weiteren Züchtung bzw. der weiteren Aufrechterhaltung des Stammes in verhältnismäßig kurzer Zeit teilweise oder völlig verloren. Diese Schwierigkeiten, die die industrielle Verwirklichung der saprophytischen Produktion von Mutterkornalkaloiden bisher gehindert haben, werden durch die vorliegende Erfindung behoben, durch welche einerseits eine Möglichkeit zur Selektion von zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen Individuen aus von Kornpflanzen stammenden, natürlichen oder einer mutagenen Behandlung unterworfenen Claviceps-Kulturen und zur Gewinnung von Einkonidien-Kulturen aus solchen Individuen und andererseits zur entsprechenden Aufrechterhaltung der Produktionsfähigkeit der derart gewonnenen Stämme geschaffen wird.
  • Die Auswahl der zur saprophytischen Alkaloidenproduktion fähigen Stämme erfolgt im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Selektion aus von der Kornpflanze stammenden unbehandelten, sogenannten wilden Claviceps-Kulturen oder aus vorher durch irgendeine mutagene Einwirkung behandelten Kulturen. Die wilden Kulturen enthalten nämlich stets in kleinerer und die mutagen behandelten Kulturen in verhältnismäßig größerer Zahl Mutanten, welche ein von den allgemeinen Eigenschaften der Kultur abweichendes biologisches Verhalten zeigen, darunter auch Mutanten, die zur dauerhaften und gute Ausbeuten bietenden saprophytischen Alkaloiodenproduktion fähig sind. Solche mutante Stämme können aber nur dann isoliert gezüchtet werden, wenn eine entsprechende Methode zur Selektion des produktionsfähigen Mutanten, also zum raschen und zuverlässigen überprüfen von sehr vielen Individuen bezüglich dieser Eigenschaft zur Verfügung steht und die Bedingungen der Aufrechterhaltung der Produktionsfähigkeit des selektierten Stammes gewährleistet werden können.
  • Die Lösung dieser Aufgabe wurde durch die Erkenntnis ermöglicht, daß einerseits die unter saprophytischen Bedingungen zur Alkaloidenproduktion fähigen Stämme, wenn sie an dazu geeigneten Nährböden in zu einzelnen Kolonien verdünntem Zustand gezüchtet werden, ein charakteristisches Pigment erzeugen und dadurch auf Grund der Farbe der Kolonien mit Sicherheit von den keine Alkaloide produzierenden Stämmen unterschieden werden können und daß andererseits die Produktionsfähigkeit der derart selektierten Stämme praktisch unbegrenzt aufrechterhalten und durch fortschreitende Selektion sogar immer mehr stabilisiert werden kann, wenn zur Aufrechterhaltung des Stammes ein Nährboden verwendet wird, welcher günstige Bedingungen zur Entwicklung des Alkaloide produzierenden Mutanten bietet und gleichzeitig die Entwicklung der durch Rückmutation entstehenden, keine Alkaloide produzierenden, revertanten Mutanten hemmt.
  • Die Ausgangskultur wird im Sinne der Erfindung an einem differenzierenden Nährboden zu Einzelkolonien verdünnt; dieser Nährboden enthält als Kohlenstoffquelle überwiegend oder ausschließlich Polysaccharide (neben wenig oder gar keinen Mono-bzw. Disacchariden), ferner eine organische oder anorganische Stickstoffquelle und als anorganische Salze unbedingt Kalium- und P04 Ionen; sein pH-Wert ist auf mindestens 6,5, zweckmäßig auf 6,8 eingestellt. An einem Nährboden von solcher Zusammensetzung erscheinen die Kolonien der zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen Stämme in orangevioletter Farbe, während die reinen Kolonien der vom Gesichtspunkt der Alkaloidenproduktion negativen Stämme weiß bleiben und die Mischkolonien eine entsprechend hellere Verfärbung oder nur die Bildung von farbigen Sektoren zeigen. An zahlreichen anderen Nährböden, wie z. B. an Malz-, Hefe- oder Fleischbrühe-Agar, können die Kolonien derselben Stämme nicht voneinander unterschieden werden. An dem zur Produktion von Alkaloiden verwendeten Zucker-Bernsteinsäure-Nährboden kann eine Pigmentbildung zwar gegebenenfalls auftreten, aber - wie Faber und V i n i n g (Can. J. Microbiol., 4, 611, 1958) es unter Benutzung von 41 verschiedenen Stämmen festgestellt haben - hier besteht kein Zusammhang zwischen der auftretenden Pigmentation und der Fähigkeit zur der auftretenden Pigmentation und der Fähigkeit zur Alkaloidenproduktion oder kann ein etwaiger meingültig betrachtet werden. Am erfindungsgemäß zusammengestellten, differenzierenden Nährboden sind die dominierenden Komponenten dieser färbenden Pigmente - bei pH-Werten zwischen 6,0 und 7,0 umschlagende indikatorartige Farbstoffe von orangegelber bzw. orangevioletter Farbe - tatsächlich zur alkaloidenproduzierenden Fähigkeit gebundene charakteristische Produkte dieser Pilze. Von den unter saprophytischen Bedingungen keine Alkaloide erzeugenden Stämmen werden an Kornpflanzen, also unter parasitischen Lebensbedingungen, gleichzeitig mit der Alkaloidenerzeugung dieselben Farbstoffe produziert, wie dies durch papierchromatographischer Identifizierung festgestellt werden konnte.
  • Die Selektion der Kolonien auf Grund ihre Farbe kann wesentlich schneller vorgenommen werden, als die bisher angewendeten Selektionsverfahren, bei welchen die Kolonien einzeln auf einen flüssigen Nährboden geimpft wurden und dann nach 6 bis 60 Tagen Inkubation die erhaltenen Kulturen auf ihren Alkaloidgehalt untersucht wurden. Neben seiner Einfachheit und rascher Durchführbarkeit zeigt das neue Verfahren den weiteren wichtigen Vorteil, daß die zur Produktion von Alkaloiden fähigen Individuen auch in Mischkolonien erkannt werden können, während die aus solchen Mischkolonien erhaltenen Kulturen noch keine meßbare Alkaloidproduktion zeigen. In den aus Sklerotien oder aus mycelhaltigen Kulturen bereiteten Verdünnungen erhaltenen Kolonien kommen die alkaloidenproduzierenden Mutanten überwiegend in solchen MischkoIonien vor; die Mutanten konnten also nach den bisherigen Verfahren überhaupt nicht erkannt werden.
  • Die aus solchen Mischkolonien erhaltenen Kulturen müssen dann wiederholt einer Verdünnung unterworfen werden; diese Kulturen werden also auf irgendeinen bekannten, zur Alkaloidenproduktion geeigneten Nährboden geimpft, am Schütteltisch inkubiert, dann wird das erhaltene Hyphengewebe z. B. mittels eines »Turmix«-Apparates zerkleinert und in entsprechender Verdünnung wieder an dem oben beschriebenen Nährboden ausgebreitet. Dieses Verfahren wird dann mehrmals wiederholt, bis keine weißen oder gemischten Kolonien mehr an den Agrarplatten erscheinen.
  • Die auf obige Weise selektierte Kultur wird dann im Sinne der Erfindung an einem Nährboden weitergezüchtet, bzw. weiter erhalten, welcher neben organischen Kohlenstoffquellen (Polysaccharide, Zucker, organische Säuren) und anorganischen Salzen 0,01 bis 3,0 % Glycin als Stickstoffquelle enthält. Man hat nämlich beobachtet - und diese Beobachtung bildet eine weitere wesentliche Grundlage der vorliegenden Erfindung -, daß die zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen Pilze das Glycin als Stickstoffquelle zu ihrer Entwicklung verwerten können, während die unter saprophytischen Bedingungen keine Alkaloide produzierenden Individuen praktisch unfähig zum Assimilieren des Glycins sind. So wird durch Anwendung eines Glycins als Stickstoffquelle enthaltenden Nährbodens selektiv die Weiterentwicklung der produzierenden Stämme begünstigt, während die nicht produzierenden Individuen unterdrückt werden.
  • Die Selektion der zu saprophytischer Produktion von Alkaloiden fähigen Kultur kann wesentlich rascher und vorteilhafter durchgeführt werden, wenn man auch zwischen den einzelnen Agarplatten-Verdünnungen einen Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden flüssigen Nährboden zum in Schüttelkultur erfolgenden Inkubieren der ausgewählten Kolonien verwendet; es ist ebenfalls vorteilhaft, Glycin als Stickstoffquelle auch in den zum Züchten der Verdünnungskolonien angewendeten Agrarplatten zu verwenden. Dadurch kann schon in der ersten Phase des Verfahrens die relativ schnellere Vermehrung der zur Poduktion von Alkaloiden fähigen Individuen erreicht und die Proportion solcher Individuen erhöht werden, damit wird auch die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von überwiegend aus produzierenden Individuen bestehenden Kolonien erhöht und die Zahl der zur Herstellung einer reinen produzierenden Einkolonien-Kultur nötigen Selektionsschritte vermindert.
  • Die nach der obigen Methode isolierten und weitergezüchteten Einkolonien-Kulturen sind zwar auch in diesem Zustand schon mit gutem Erfolg zur betrieblichen saprophytischen Produktion von Mutterkornalkaloiden geeignet, die Einkolonien-Kulturen können jedoch ihrem Wesen nach nicht als homogene, auch vom genetischen Standpunkt einheitliche Kulturen betrachtet werden; es besteht bei solchen Kulturen immer die Möglichkeit, daß diese Kulturen - auch ohne das Auftreten von Mutationen - mit nicht produzierenden Individuen verunreinigt werden. Solche Verunreinigungen können beim Weiterzüchten, bzw. bei der Anwendung solcher Stämme zur betrieblichen Produktion zur Verminderung der Produktionsfähigkeit des Stammes führen. Es ist deshalb vorteilhaft, eine auch genetisch einheitliche Einkonidien-Kultur (vgl. M. T u n g und H. R o c h e 1-m e y e r, Beiträge zur Biologie der Pflanzen, 35, 343 [1960]) aus der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Einkolonien-Kultur zu züchten.
  • Konidien werden von den zur saprophytischen Alkaloidenproduktion fähigen Stämmen im allgemeinen nur schwach oder überhaupt nicht produziert. Wenn man aber den zur Alkaloidenproduktion angewendeten Nährboden mit überwiegend organische Stickstoffverbindungen enthaltenden natürlichen Zusätzen, wie z. B. Maisquellwasser, Pepton usw., ergänzt oder einen überwiegend organische Stickstoffverbindungen enthaltenden natürlichen Nährboden (z. B. Kartoffelextrakt, Sojamehl, Stärke-Gluten-Gemisch, usw.) verwendet, dann kann auf solchen den parasitischen Lebensbedingungen näher stehenden Nährböden eine intensivere vegetative Entwicklung der Organismen und damit die Bildung von mehr oder weniger Konidien hervorgerufen werden. Wenn aus der derart gewonnenen Kultur der überwiegende Teil des Hyphengewebes durch Filtrieren entfernt wird, kann man aus der erhaltenen Konidiensuspension in an sich bekannter Weise eine Einzellen-Kultur herstellen. Die aus einem einzigen isolierten Konidium gezüchtete Kultur kann dann in derselben Weise weitergezüchtet werden, wie es oben im Fall von Einkolonien-Kulturen beschrieben wurde.
  • Die praktische Ausführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch die nachfolgenden Beispiele näher veranschaulicht.
  • Beispiel 1 Eine Claviceps-purpurea-Kultur, die aus einem wilden Sklerotium einheimischer Herkunft an schrägem Malzextrakt-Agar gezüchtet wurde, wird in einen flüssigen Nährboden folgender Zusammensetzung umgeimpft: Saccharose ...................... 100 g Bernsteinsäure .................. 10 g Ca(NO.)2 ...................... 1 g MgS04 ......................... 0,25 g FeS04 .......................... 0,009 g ZnS04 ......................... 0,003 g Mit Leitungswasser ergänzt .... zu 1000 ml pH (mit 10°/oiger wässeriger Ammoniaklösung eingestellt) ... 5,2 Die Kulturen werden bei 23° C 7 Tage geschüttelt, dann homogenisiert und im Verhältnis von 1:10 000 bzw. 1:1 000 000 verdünnt und an einem erfindungsgemäßen differenzierenden Nährboden folgender Zusammensetzung ausgebreitet: Saccharose ..................... 0,050/0 Stärke ......................... 2,00% KH2P04 ....................... 0,25% NH4c1 ......................... 0,10% Agar .......................... 1,80% pH-Wert ....................... 6,8 Nach 12 Tagen werden aus jenen an der Agaroberfläche gebildeten Kolonien, welche eine violettweiße Farbe zeigen, Organismen auf schrägen Agar-Nährboden gleicher Zusammensetzung umgeimpft, nach 8 Tagen werden die gebildeten Kolonien bezüglich ihrer Farbe geprüft, und die von der Agaroberfläche abgewaschenen Kulturen werden in einen flüssigen Nährboden obiger Zusammensetzung übertragen. Die Kulturen werden wieder am Schütteltisch bei 23' C inkubiert, nach 6 Tagen werden sie, wie oben beschrieben, homogenisiert, verdünnt und wieder am obigen differenzierenden Nährboden ausgebreitet. Nach fünfmaliger Wiederholung dieses Verfahrens, wenn keine Kolonien weißer Farbe an der Agaroberfläche mehr zu beobachten sind, wird die Kultur vom schrägen Agar auf einen obigen, aber mit 1% Witteschem Pepton ergänzten flüssigen Nährboden übertragen; nach 10 Tagen wird die Kultur durch ein Filtertuch steril filtriert, und aus der erhaltenen Konidiensuspension wird mit Hilfe einer Hängetropfen-Kultur eine Einkonidien-Kultur isoliert.
  • Den Schüttelkulturen, die aus nach den einzelnen Selektionen (Verdünnung und Ausbreitung) umgeimpften Kolonien gezüchtet worden sind, wurden Muster entnommen, und deren Alkaloidgehalt wurde in bekannter Weise (vgl. Österr. Chem. Ztg., 63, 300, 1962) bestimmt; es wurden in den von verschiedenen Kolonien erhaltenen Schüttelkulturen die folgenden Alkaloidgehalte gefunden: Nach der ersten Selektion ..... 1 bis 10 y/ml Nach der zweiten Selektion ..... 1 bis 18 y/ml Nach der dritten Selektion ..... 15 bis 75 ylml Nach der vierten Selektion ..... 40 bis 90 ylml Nach der fünften Selektion ..... 70 bis 90 y/ml Die in üblicher Weise selektierte Einkonidien-Kultur dieses Stammes produzierte in einer in obiger Weise hergestellten Schüttelkultur in 6 Tagen eine Alkaloidenmenge von 110 y/ml.
  • Beispiel 2 Aus einem von Kornpflanzen stammenden Sklerotium wurden die Pilze in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, die am Schütteltisch bei 23° C 7 Tage inkubierte Kultur wird einer Selektion in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise, aber unter Anwendung eines Nährbodens der folgenden Zusammensetzung unterworfen: Kartoffelextrakt (auf feuchte Kartoffeln berechnet) ......... 50,0010 Glycin ......................... 0,5% KH2P04 ....................... 0,1% Agar .......................... 2,0% pH-Wert ...................... 6,8 Die selektierten Kolonien haben in den Schüttelkulturen die folgenden Mengen von Alkaloiden produziert: Nach der ersten Selektion ... 20 bis 80 7,/ml Nach der zweiten Selektion ... 140 bis 200 y/ml Nach der dritten Selektion ... 320 bis 400 ylml Eine aus diesem Stamm in üblicher Weise selektierte Einkonidien-Kultur produzierte in einer in obiger Weise hergestellten Schüttelkultur in 6 Tagen eine Alkaloidenmenge von 500 ylml. Beispiel 3 Aus einer Kultur eines von Kornpflanzen stammenden und einer mutogenen Behandlung durch Röntgenbestrahlung unterworfenen Claviceps-purpurea-Stammes, welcher unmittelbar nach der Selektion eine ziemlich gute, aber dann allmählich sinkende Alkaloidenproduktion zeigte, wurden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise Verdünnungen und Agarplatteausbreitungen an einem differenzierenden Nährboden der folgenden Zusammensetzung vorgenommen: Stärke .......................... 2,0% Tryptophan ..................... 0,1% KCl ........................... 0,1% (NH4)2HP04 .................... 0,2% Agar ........................... 1,8% pH-Wert ........................ 6,8 Es wurden an der Agaroberfläche neben zahlreichen weißen, zur Alkaloidenproduktion unfähigen Kolonien einige violett gefärbte Kolonien erhalten. Diese wurden dann in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise verdünnt und auf Agarplatten von gleicher Zusammensetzung ausgebreitet. Nach 7 Tagen Inkubation wurden die Kolonien von der Agaroberfläche abgewaschen und in einen flüssigen Nährboden der folgenden Zusammensetzung umgeimpft: Saccharose .................... 5,0% Bernsteinsäure ................. 0,2% Glycin ........................ 0,5% KH2P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (g)5010 CaC12 ... ..................... 0,05010 MgS04 ....................... 0,025% FeS04 ........................ 0,025% Der pH-Wert des Nährbodens wurde mit Natriumhydroxyd auf 5,2 eingestellt. Die Kulturen wurden 2 Tage am Schütteltisch inkubiert, dann wurden sie homogenisiert, verdünnt und ausgebreitet. Nach einer weiteren Wiederholung dieses Verfahrens, als keine weißen Kolonien mehr an der Agarplatte zu finden waren, wurden die Kolonien von dem schrägen Agar abgewaschen und auf einen Nährboden folgender Zusammensetzung übertragen: Saccharose ....................... 1% Gluten-Extrakt .................. 1% Agar ........................... 2% KH2P04 ....................... 0,05% CaCl2 .......................... 0,05010 MgS04 ......................... 0,02% FeS04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,02% Die Kultur wurde nach 9 Tagen Inkubation durch ein Filtertuch filtriert und aus der als Filtrat erhaltenen Konidiensuspension eine solche Verdünnung hergestellt, welche beim Ausbreiten an Agarplatten zwei bis fünf Konidien je Platte enthält. Die entstehenden isolierten Kolonien wurden am vierten Tag unter Mikroskop von der Agarplatte entfernt und auf einen differentierenden schrägen Agar-Nährboden von im Beispiel 1 angegebener Zusammensetzung umgeimpft. Die derart erhaltenen und auf Grund ihrer Pigmentproduktion kontrollierten Einkonidien-Kulturen werden auch weiter an glycinhaltigem Nährboden gehalten unter wöchentlichem Umimpfen.
  • Zur Alkaloidenproduktion werden die in üblicher Weise hergestellten Schüttelkulturen in einen 61 fassenden kleineren, dann in einen 200 1 fassenden größeren, belüfteten Fermentor umgeimpft; bis zum sechsten Tag war ein Alkaloidgehalt von 540 7/ml (durch die nichtspezifische van Urksche Farbenreaktion bestimmt) erreicht; die einzelnen Alkaloide wurden durch spezifische Schichtchromatographie getrennt und quantitativ bestimmt; es wurde ein Alkaloidgehalt von 210 ylml gefunden, von welchem 60% in der Form von Ergotoxin und Ergometrin in kristalliner Form gewonnen werden konnten.

Claims (5)

  1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Selektion und Weitererhalten von zur Produktion von Mutterkornalkaloiden unter saprophytischen Bedingungen fähigen Claviceps - Stämmen, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t, daß man von Kornpflanzen stammende wilde oder vorher durch mutagene Einwirkungen behandelte Claviceps-Kulturen an der Oberfläche eines als Kohlenstoffquelle ausschließlich oder überwiegend Polysaccharide und unter den anorganischen Bestandteilen K+ und PO-4-Ionen enthaltenden Agar-Nährbodens in Verdünnung ausbreitet, aus den gebildeten Kolonien diejenigen, welche eine violette bzw. orangeviolette Färbung zeigen, auswählt, nach Inkubieren in geschütteltem flüssigem Nährboden diese Selektierung an dem obigen Agar-Nährboden wiederholt und dann den derart selektierten Stamm an einem Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden Nährboden weiterzüchtet.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den zur Selektion angewendeten Agar-Nährboden auf einen pH-Wert von mindestens 6,5, zweckmäßig' von 6,8, einstellt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Weiterzüchten des zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähigen Stammes einen 0,01 bis 3,0% Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden flüssigen Nährboden verwendet.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Selektion einen Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden Agar-Nährboden und/oder zum Inkubieren der weiter zu selektierenden Kolonien einen Glycin als Stickstoffquelle enthaltenden flüssigen Nährboden verwendet.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die als zur saprophytischen Produktion von Alkaloiden fähige Kultur selektierten Pilze an einen natürliche stickstoffhaltige organische Stoffe enthaltenden Nährboden zur Konidienbildung bringt und eine aus der erhaltenen, Konidien produzierenden Kultur in an sich bekannter Weise hergestellte Einkonidien-Kultur zum Weiterzüchten des Stammes verwendet.
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