DE1442059C - Verfahren zur mikrobiologischen Her stellung von Penicillin G zu 6 Aminopemcil lansaure spaltenden Enzympraparaten - Google Patents
Verfahren zur mikrobiologischen Her stellung von Penicillin G zu 6 Aminopemcil lansaure spaltenden EnzympraparatenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillansäure
spaltenden Enzympräparaten durch aerobes Züchten von Penicillin spaltenden Escherichia
coli-Zellen in einer Nährlösung, welche praktisch keine fermentierbaren Kohlenhydrate enthält, und
unter Einsatz eines Derivats der Phenylessigsäure.
In der deutschen Auslegeschrift 1114 766 wird
ein Verfahren zur Herstellung von Penicillin spaltenden Enzympräparaten beschrieben, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß Penicillin spaltende Bakterien, insbesondere solche von Escherichia coli,
unter Anwendung üblicher Methoden und unter Belüftung in Nährlösungen gezüchtet werden, welche
höchstens unbedeutende Mengen an fermentierbaren Kohlenhydraten enthalten und welchen Phenylessigsäure
oder ein Derivat derselben in Mengen von 0,002 bis 2°/0 zugesetzt worden ist, wobei gegebenenfalls
während des Wachstums Kohlendioxyd eingeleitet wird.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, dieses bekannte Verfahren zu verbessern, so daß die Fähigkeit
des Enzympräparates zum Spalten des Penicillin G erhöht wird.
Dies wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillansäure
spaltenden Enzympräparaten durch aerobes Züchten von Penicillin spaltenden Escherichia
coli-Zellen in einer Nährlösung, welche praktisch keine fermentierbaren Kohlenhydrate enthält, und
unter Einsatz eines Derivats der Phenylessigsäure erreicht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der
Nährlösung im Verlauf der Fermentation langsam Ammoniumphenylacetat bis zu einer Endkonzentration
von 0,12 bis 2,0 Gewichtsteilen pro Liter Nährlösung zugesetzt wird.
Die Nährlösung kann wie bei dem Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1 114 766 Maisquellwasser
enthalten, doch können auch andere Nährstoffe verwendet werden, beispielsweise Hefeextrakte. Das
Nährmedium kann auch noch andere an sich bekannte Zusatzstoffe enthalten, beispielsweise anorganische
Ionen, Vitamine und das Wachstum fördernde Stoffe, wie sie z. B. in Maisquellwasser enthalten sind.
Die Nährlösung muß im wesentlichen frei von fermentierbaren Kohlenhydraten sein, obwohl sie geringe
Mengen derselben enthalten kann.
Vorzugsweise wird zur Erzielung optimaler Ergebnisse bei dem vorstehenden Verfahren der Erfindung
das Ammoniumphenylacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,3 bis 0,4 Gewichtsteilen pro Liter
Nährlösung zugesetzt, wobei der Zusatz in zeitlichen Abständen während der Fermentation erfolgt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nährlösung zu Beginn der Fermentation
auf einmal Ammoniumsulfat in einer Gesamtmenge von 0,1 bis 1,0 Gewichtsteilen pro
Liter Nährlösung einverleibt, worauf dann erst langsam Ammoniumphenylacetat in den angegebenen
Mengen zugesetzt wird. Auf diese Weise lassen sich Enzympräparate herstellen, welche ein besseres Spaltungsvermögen
für Penicillin G aufweisen, als wenn kein Ammoniumsulfat mitverwendet wird.
Es wurde festgestellt, daß die Penicillin-G-Spaltungswirkung
der Enzympräparate nur geringfügig verbessert wird, wenn man das Ammoniumphenylacetat
zu Beginn der Fermentation auf einmal zusetzt. Auch wenn gemäß der bisher üblichen Arbeitsweise
Natrium- oder Kaliumphenylacetat zu Beginn der Fermentation auf einmal zugesetzt wird und man
dann langsam im Verlauf der Fermentation noch wäßriges Ammoniak oder Ammoniumsulfat zusetzt,
wird das Spaltungsvermögen der Enzympräparate nicht verbessert. Diese Versuche machen deutlich,
daß durch das langsame Zusetzen von Ammoniumphenylacetat im Verlauf der Fermentation nicht nur
der fehlende anorganische Stickstoff im Nährmedium ersetzt wird, sondern daß auch noch andere Einflüsse
von Bedeutung sind.
Es wurden Vergleichsversuche durchgeführt und dabei die nachstehenden Ergebnisse erhalten:
a) Bei zwei gleichlaufenden Fermentationsbehandlungen wurden zu Beginn der Fermentation
jeweils bestimmte Mengen an Natrium- bzw. Ammoniumphenylacetat zur Nährlösung zugesetzt.
Die Ausbeute bei dem Versuch mit dem Ammoniumsalz war um 12°/0 höher als bei dem
Versuch mit dem Natriumsalz.
b) Bei weiteren Versuchsreihen wurden wäßrige Lösungen von Natrium-, Kalium- oder Ammoniumphenylacetat
während der Fermentation langsam zu der Nährlösung zugesetzt. Die Ausbeute bei dem Versuch mit dem Ammoniumsalz
war um 100 °/0 größer als bei den Versuchen mit dem Natrium- bzw. Kaliumsalz.
c) Bei weiteren Versuchen wurde Natriumphenylacetat als Gesamtmenge zu Beginn der Fermentation
zugesetzt, und beim Parallelversuch wurde während der Fermentation wäßriges Ammoniumphenylacetat
zu dem Nährmedium gegeben. Die Ausbeute bei dem Versuch mit dem Ammoniumsalz war um 84°/0 größer als bei dem Versuch
mit dem Natriumsalz.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert.
Ausführungsbeispiel
590 Liter eines 2,25prozentigen (Gewichtsteile pro Liter) Maisquellwassers (entsprechend 13,3 kg Feststoffe)
werden mittels Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und dann 30 Minuten
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lang bei 121° C sterilisiert. Anschließend wird die Nährlösung mit 3 Litern einer vegetativen Besamungskultur von E. coli NCIB 8743 beimpft und dann
bei 24° C unter Belüftung und dauernder Bewegung bebrütet. Dann stellt man eine Lösung von Ammoniumphenylacetat
her, indem zu einer wäßrigen 25prozentigen (Gewichtsteile pro Liter) Lösung von Phenylessigsäure so viel konzentriertes wäßriges Ammoniak
zugesetzt wird, bis der pH-Wert T beträgt. Diese Salzlösung wird 30 Minuten lang bei 1210C
sterilisiert und dann 8 Stunden nach der Beimpfung zu der Nährlösung zugesetzt, und zwar in Abständen
von jeweils 1 Stunde bis zu einer Gesamtzeit von 21 Stunden, wobei die Zugabemenge jeweils 600 ml
Salzlösung entspricht. 22 bis 28 Stunden nach der Beimpfung werden die gebildeten Zellen abgeerntet,
und dieses Enzympräparat wird zum Spalten von Penicillin G verwendet.
Vergleichsversuche
Es werden weitere Vergleichsversuche mit verschiedenen bekannten Penicillin spaltenden Escherichia
coli-Stämmen durchgeführt, wobei einmal gemäß dem Stand der Technik Natriumphenylacetat
zu Beginn der Fermentation auf einmal zugesetzt und das andere Mal erfindungsgemäß Ammoniumphenylacetat
langsam im Verlauf der Fermentation zugesetzt wird. Ansonsten waren die Fermentationsbedingungen identisch.
Die angegebenen Vergleichszahlen beziehen sich auf die Spaltaktivität, bestimmt an Hand der durch
ίο die Spaltung von Penicillin G unter identischen Bedingungen
erzeugten 6-Aminopenicillansäure. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt
und bestätigen die überlegene Wirkung der erfindungsgemäß herstellbaren Enzympräparate.
| Bakterienart | Stand der Technik |
erfindungsgemäß |
| 20 E. coli NCIB 8743 E. coli ATCC 9637 E. coli ATCC 11105 |
100 37 110 |
122 98 137 |
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillansäure spaltenden Enzym-Präparaten
durch aerobes Züchten von Penicillin spaltenden Escherichia coli-Zellen in einer Nährlösung,
welche praktisch keine fermentierbaren Kohlenhydrate enthält, und unter Einsatz eines
Derivates der Phenylessigsäure, dadurch ge- ίο
kennzeichnet, daß der Nährlösung im Verlauf der Fermentation langsam Ammoniumphenylacetat
bis zu einer Endkonzentration von 0,12 bis 2,0 Gewichtsteilen pro Liter Nährlösung zugesetzt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Nährlösung vor dem Zusatz
des Ammoniumphenylacetats Ammoniumsulfat in einer Gesamtmenge von 0,1 bis 1,0 Gewichtsteilen pro Liter Nährlösung einverleibt wird.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB4391063 | 1963-11-07 | ||
| GB43910/63A GB1015554A (en) | 1963-11-07 | 1963-11-07 | Improvements in the production of penicillin-splitting enzymes |
| DEB0079185 | 1964-11-03 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1442059A1 DE1442059A1 (de) | 1968-12-12 |
| DE1442059B2 DE1442059B2 (de) | 1973-01-04 |
| DE1442059C true DE1442059C (de) | 1973-08-09 |
Family
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