DE1695327A1

DE1695327A1 - Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinucleotid

Info

Publication number: DE1695327A1
Application number: DE1967K0063053
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-08-08
Filing date: 1967-08-07
Publication date: 1972-04-20
Also published as: GB1190406A; FR1560257A; US3705080A; DE1695327B2

Description

Kyowa Hakko Kogyo Uompany, Ltd., Tokio, Japan

Verfahren zur Herstellung von Niicotinamidadenindinucleotid

Zusammenfassung dea Inhalts

Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinucleotid durch Kultivierung von Mikroorganismen, die Nikotinamidadenindinucleotid erzeugen können, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit wenigstens eines oberflächenaktiven Mittels. Als Ergebnis der Zugabe des oberflächenaktiven Mittels zu dem Medium sammelt sich Nikotinamidadenindinucleotid in der Kulturflüssigkeit extrazellulär an. Zu besonders bevorzugten oberflächenaktiven Mitteln gehören Cetyltrimethylammoniumbromid und Cetylpyridiniumchlorid, jedoch können viele andere kationische, anionische, nicht-ionische und amphotere Mittel

209817/1557

verwendet werden. Die oberflächenaktiven Mittel können dem Medium entweder oei Beginn oder zu irgendeiner Zeit während der Kultivierung entweder auf einmal oder absatzweise zugesetzt werden.

Die Erfindung Detrifft ein verfahren zur Herstellung von Mkotinamidadenindinucleotid, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mkotinamidadeninainucleotid durch "Fermentierung mit Mikroorganismen.

liikotinamidadenindinucleotid wird in Hefen, Scnimmel und Bakterien angetroffen. Ein Verfahren zur Erzeugung von Nikotinamidadenindinucleotid durch Extrahierung des .Rohmaterials aus Mikroorganismenzellen und .Reinigung derselben ist "bekannt. Dieses Verfahren weist jedoch .Nachteile auf.

Nikotinamidadenindinucleotid ist eine Veroindung, die eine wichtige Rolle bei biochemischen !Reaktionen spielt und ebenfalls geeignet für die alkoholische Gärung von ü-lukose ist. liikotinamidadenindinucleotid, auch bekannt als Coenzym I, Dehydrogenase-Coenzym I, jjiphosphopyridin-

- 3 ~~ 209817/1557

nucleotid -und Cozymase weist die folgende Strukturformel auf:

CH-

HG UM HCOH HC

Q~ OH

- O - P - O - UH

O O

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Uikotinamidadenindinucleotid, welches die Nachteile und Unzulänglichkeiten der "bisherigen Methoden beseitigt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von wikotinamidadenindinucleotid durch Fermentierung, das in wirksamer und einfacher Weise ausgeführt werden kann.

209817/1S57

Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Mikotinamidadenindinucleotid durch Fermentierung in vorteilhafter Weise in industriellem Maßstab unter Erzielung hoher Produktausbeuten durchgeführt werden.

us wurden verschiedene Untersuchungen bezüglich Verfahren zur Herstellung von NikotinamidaüenindinucIeοtid unter Verwendung von Mikroorganismen in einem Fermentationsverfahren vorgenommen. Während der Kultivierung dieser Nikotinamidadenindinucieovid erzeugenden Mikroorganismen wurde gefunden, daß die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln zu dem Kulturmedium zu irgendeiner beliebigen Zeit während der Kultivierung eine beträchtliche Steigerung der Ansammlung von Nikotinamidadenindinucleotid in der Kulturflüssigkeit herbeiführte. Gemäß der Erfindung wurde also gefunden, daß die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln zu Kulturmedien, in denen Uikotinamidadenindinucleotid erzeugende Mikroorganismen kultiviert werden, einen wirksamen Schritt zur Erzielung eines Verfahrens darstellt, welches das Produkt in hohen Ausbeuten ergibt.

Wie oben angegeben, wurde ein Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinucleotid verwendet, das in einer

209817/1557

Extraktionsmethode aus Mikroorganismen und tierischen Geweben besteht. Der einzige Bericht im bisherigen Stand der Technik der u-ewinnung von Nikotinamidadenindinucleotid durch Kultivierung von Mikroorganismen in einer Kulturlösung bezieht sich auf die Verwendung von Hefe, das in der japanischen Patentschrift 29 811/1964 von Kitahara und Mitarbeitern beschrieben ist. Es wurde von auf diesem Gebiet tätigen Fachleuten als äußerst schwierig erachtet, liikotinamidadenindinucleotid in Kulturlösungen durch Kultivierung von Mikroorganismen anzusammeln.

Gemäß vorliegender Erfindung wurde gefunden, daß die Erzeugung und Ansammlung von liikotinamidadenindinucleotid in einer Kulturlösung, die bisher tatsächlich als unmöglich angesehen wurde, allgemein und in wirksamer Weise erreicht werden kann, indem man nach der Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln zu dem Kulturmedium kultiviert. Diese Erfindung ist äußerst vorteilhaft, da die Extraktion von liikotinamidadenindinucleotid aus Bakterienzellen das mechanische und chemische Aufspalten von Zellwänden sowie Behandlungen zur Denaturierung und Zerstörung erfordert. Der Verlust an liikotinamidadenindinucleotid ist in diesen Verfahren groß und außerdem ist auch eine sorgfältige Ver-

209817/1557

fahrenskontrolle zur Abtrennung von den anderen Bakterienzellkomponenten in dem nachfolgenden Reinigungsverfahren erforderlich. Das Disher bekannte Verfahren ist also von vielen Schwierigkeiten begleitet, die schwerwiegende Nachteile für die industrielle Praxis darstellen.

Das vorliegende Verfahren überwindet diese vorerwähnten Schwierigkeiten. Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird Diikotinamidadenindinucleotid direkt in der Kulturlösung extrazellulär angesammelt. Ferner wird angenommen, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, daß gewisse Mikroorganismenarten durch die Zugabe oberflächenaktiver Mittel zu dem Kulturmedium gewisse zwischenprodukte absondern und extrazellulär erzeugen, die zur Herstellung von .wikotinamidadenindinucleotid aus Bakterienzellen, d.h. 5-Phosphoribosylpyrophosphat und Enzyme, erforderlich sind.

Es können beliebige Mikroorganismen, die fähig sind, Uikotinamidadenindinucleotid zu erzeugen, im Verfahren der Erfindung verwendet werden. Somit können Hefen, Bakterien, Actinomycetes und Schimmelarten allgemein angewendet werden.

209817/1557

Bevorzugte Mikroorganismen sind z.B· Hefen, die zu den Genera Sacharomyces, Candida, Torula, Schizosacharomyces, Zygosacharomyces u.dgl. sowie Bakterien, die zu den Genera Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Lactobazillus, Streptokokkus u.dgl. gehören. Diese speziellen Mikroorganismen sind hinsichtlich der Herstellung großer Mengen I¹JXkOtinamidadenindinucleotid überlegen.

Die Wirkungen der Zugabe oberflächenaktiver Mittel auf die Ansammlung von Nikotinamidadenindinucleotid, die mit verschiedenen Mikroorganismen beobachtet wurden, sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Die Versuche wurden durchgeführt, indem Oetyltrimethylammoniumbromid (GTAB) zu dem Kulturmedium 2ü Stunden nach Beginn der Kultivierung in solchen Mengen zugegeben wurde, daß dessen konzentration O, 0,01 bzw. 0,1 Gew.-# betrug.

— 8 —

209817/15 57

- 8 -	•	Herstellung von Nikotin- ami dadenindinucleotid	ATCC 6872 i ⁺	9175 ±	13659 ^±	-	- 9 -	CTAB CTAB 0,01* 0, Ifo züge- zuge geben geben
Tabelle	Mikrο οrgani smen	Keine Zugabe	ATCC 6871 - ⁺	Brevibacterium vitarumen ATCC 10234 -	11402 i	80 ±	_{+ ++}
	Arthrobacter blobiformis ATCC 8010 ±	11822 - ⁺	Corynebacterium rathayi aTCC	15932 ±	±	++ +
	Bacillus cereub ATCC 7004	Brevibacterium imperiale ATCC 8365 -	Corynebacterium tritici ATCC	15452	++ +++
	Brevibacterium ammoniagenes	Brevibacterium linence ATCC	Mikrococcus sodonensis aTCC	++ ++
	Brevibacterium ammoniagenes	Mikrococcus varians ATCC 399 Pseudomonas boreopolis ATCC	++ ++
	Brevibacterium helvolum ATCC	Proteus vulgaris ATCC 19181	+·+ ++
	Serratia marcescens ATCC 191	■f-+ ++
Sarcina lutea ATCC 15176	f+ ++
	n- ++
+ +


+ +
+ +'

209817/1557

Fortsetzung der Tabelle

Mikroorganismen Herstellung von Efikotin-

amidadenindinucleotid

Keine Zugabe CTAB CTAB

züge- zugegeben geben

Streptococcus faecalis -

Candida utilis ATCC 16321 -

Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 -

Torula utilis ATCC 15239 -

Zygosaccharomyces major ATCC 15249 -

Candida tropicalis ATCC 15114 -Penicillium ciirysogenum ATCC 15241

Streptomyces aureus ATCC 3309 Streptomyces flavovirens ATCC 3320

- 10 -

209817/1557

- ίο -

Zu dem gemäß der Erfindung verwendeten Kulturmedium können die oberflächenaktiven Mittel alle auf einmal oder in Abständen zugesetzt werden. Sie können entweder bei Beginn der Kultivierung oder zu irgendeiner Zeit während des Kultivierungsverfahrens zugegeben werden.

Es können verschiedene Substanzen als oberfläcnenaktive Mittel verwendet werden. Zu diesen gehören beliebige der geeigneten bekannten nicht-ionischen, kationischen, anionischen oder amphoteren oberflächenaktiven Mittel. Insbesondere wirksam sind die Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester (⁰Ip^-^IB' ^TweerL Reihe) und die Alkaminsalze davon (Gq-C.g), die Polyoxyäthylenalkylamine (^ci2~^C18''' Nymeen Reihe), die Polyoxyäthylenalkyläther (^C-|2~°18^' ^die ^⁰¹F" oxyäthylenalkylallyläther (Cq-C₁₈), die Alkyltrimethy1-ammoniumhalogenide (^G^2""^Ü18^' die Alkylbenzyldimethylanönoniumhalogenide i^Gi2""^Ci8^» die Alkylpyridiniumhalogenide (0-12""⁰18^» die Alkylbetaine CC₁₂-C₁₈) u.dgl. Spezifische oberflächenaktive Mittel, die verwendet werden können, sind z.B. die in der Technik als kationische oberflächenaktive Mittel bekannten Mittel, beispielsweise Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Cetylpyridiniumchlorid (CPO), Nissan. Kation AB (Trimethyloctadecylammonium-

- 11 -

209817/1557

chlorid), Kation Έ^-δΟ (Alkyldimethylbenzylanimoniumchlorid), Acetamin 24 ^Alkylaminacetatj, Mymeen S-215 (Polyoxyäthylenstearylamin;, lviegamin (Produkt der Meggitü Ltd., Australien, bestimmte Imidazolinverbindung), Kation SA (Octadecylaminacetat), Polyoxyathylenstearylamine u.dgl., anionische oberflächenaktive Mittel, z.B. Natriumlaurylsulfat (SLS), Natriumoleylamidsulfat (SOAS) u.dgl., nicht -ionische oberflächenaktive Mittel, z.B. Tween 60 (Polyoxyäthylensorbitanmonostearat) und Tween 40 (Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat) sowie amphotere oberflächenaktive Mittel, wie oben angegeben.

Die Menge an oberflächenaktivem Mittel, die dem Kulturmedium zugesetzt werden soll, schwankt mehr oder weniger je nach dem speziellen lyp des oberflächenaktiven Mittels, der Zugabezeit und des speziell verwendeten Mikroorganismus. Jedoch werden im allgemeinen Konzentrationen im Bereich von U,01 bis etwa 0,5 Gew.-# bevorzugt.

Das ü'ermentationsmedium umfaßt entweder ein synthetisches .kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium, welches die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismusstammes enthält. Derartige Fermentations-

- 12 -

209817/1557

medien enthalten im allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, wie z.B. Kohlehydrate, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u.dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in spezifischen Mengen verbraucht werden.

Zu den Kohlehydraten gehören z.B. Glukose, Iruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse u.dgl. Geringe Mengen anderer geeigneter Kohlenstoffquellen, wie z.B. Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren u.dgl. können in dem Fermentationsmedium zusammen mit den Kohlehydraten verwendet werden. Die Kohlehydrate können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehr angewendet werden und irgendeine geringe Menge anderer Kohlenstoffquellen kann ebenfalls entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren vorliegen.

Zu den anorganischen Verbindungen gehören Stoffe wie z.B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensuliat oder andere Eisensalze, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid u.dgl. Als ötickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie z.B. Harnstoff oder Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat u.dgl.

- 13 -

109817/1557

oder eine oder mehrere gemischte Aminosäuren in Kombination oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z.B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Peptone, Bouillon, Kaseinhydrolysate, Fischlösliches, Reiskleiextrakt u.dgl. verwendet werden. Diese Stoffe können ebenfalls einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehr angewendet werden. Es kann auch erforderlich sein, gewisse wesentliche Nährstoffe zu dem Kulturmedium zuzufügen, je nach dem speziellen verwendeten Mikroorganismus, wie z.B. Aminosäuren, beispielsweise Asparaginsäure, !Threonin, Methionin Uedgl. und/oder Vitamine, z.B. Biotin, Ihiamin, Kobalamin u.dgl.

Die Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z.B. unter aerobem Schütteln der Kultur oder unter Rühren einer Submerskultur. Eine Inkubierungstemperatur von etwa 20 bis 4O⁰C und ein pH-Wert von etwa 5 bis 9 werden bevorzugt. Andere Temperatur- und pH-Bedingungen können ebenfalls verwendet werden. Es zeigte sich, daß sich beträchtlich große Mengen an Nikotinamidadenindinucleotid in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt hatten.

Nach Beendigung der Fermentierung kann das Nikotinamid-

-H-

209817/1557

adenindinucleotid aus der KuIturflüssigkeic durch übliche Mittel, wie z.B. Ionenaustauschharzbehandlung, Ausfällung mit Metallsalzen, Extraktionsmethoden, übliche Adsorptionsmethoden, Chromatographie u.ufcl. abgetrennt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu begrenzen. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben in der Beschreibung und den Beispielen auf das Gewicht·

Beispiel 1

Als Impfbacterium wird Corynebacterium sp. Hr. 34Ö5 ATGC 21084 verwendet. Es wird Dei 30 C während 24 Stunden in einem .kulturmedium mit folgender Zusammensetzung kultiviert: 2$ Glukose, 1% Pepton, 1$ Hefeextrakt, 0,3$ HaCl und 30/ug/l Biotin. Die Impfkultur wird dann in einem verhältnis von 10 Volum-$ zu einem Permentationskulturmedium der folgenden Zusammensetzung (pro Liter Wasser) gegeben:

100 g Glukose
6 g Harnstoff

1,036 ₂₄

,0# MgSO₄'7H₂O

- 15 -

209817/1557

Bouillon
30 /Ug Biotin.

Der Harnstoff wurde getrennt als eine 12^-ige Lösung sterilisiert. 19 nil-Anteile einer wäßrigen Lösung, welche die anderen Fermentationsmediumskomponenten enthielt, wurden einzeln in Kolben gegossen. Diese Kolben wurden in einem Autoklaven während 10 Minuten bei 1kg/cm sterilisiert. Dann wurde 1 ml der sterilisierten Harnstofflösung zu jedem Kolben vor der i'ransplantation der Impfkultür gegeben.

Die Kombination von Impf- und Fermentationsmedien wurde in 20 ml-Anteilen in konische Kolben mit einem jeweiligen Inhalt von 250 ml gegossen.

Die Kultivierung wird dann unter aerobem Schütteln bei 30°C ausgeführt, llach 24-stündiger Kultivierung wurde ein kationisches oberflächenaktives Mittel, Nymeen S-215 (Polyoxyäthylenalkylamin) zu dem Fermentationsmedium in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben. Adenin bzw. ITikotinamid wurden zu dem Medium in einer Konzentration von 2 mg/ml zugesetzt. Die Kultivierung wurde dann anschließend während weiterer 96 Stunden durchgeführt. Es

- 16 -

209817/1557

erwies sich, daß 5,30 mg/ml Nikotinamidadenindinucleotid erzeugt worden waren und sich in der Kulturflüssigkeit angesammelt hatten.

Ein Vergleichsversuch wurde mit den gleichen Medien und unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Nymeen S-215 nicht zu dem Medium zugesetzt wurde. Die erzeugte Menge an Nikotinamidadenindinucleotid betrug 0,8 mg/ml.

Das Nikotinamidadenindinucleotid wurde durch eine Ionenaustauschbehanalung gewonnen.

Beispiel 2

Die Kultivierung wurde mit dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Brevibacterium ammoniagenes ATCO 6872 als Impfmikrοorgansimus und Megamin (eine Imidazolinverbindung) als oberflächenaktives Zusatzmittel verwendet wurde. Die Menge an Nikotinamidadenindinucleotid, die nach diesem Verfahren erzeugt wurde, betrug 5»20 mg/miL.

Die Menge an Nikotinamidadenindinucleotid, bei in einem

- 17 -

2098t7>1557 '

Kulturmedium in einem mit dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen mit der Ausnahme, daß Megamin nicht zu dem Medium zugesetzt wurde, durchgeführten Vergleichsversuch "betrug 0,7 mg/ml.

Beispiel 3

Das gleiche Kulturverfahren, wie in Beispiel 1 beschrieoen, wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Arthrobacter sp. ar. 3486 ATGC 21085 als Mikroorgansimus verwendet wurde und Cetyltrimethylammoniumbromid als oberflächenaktives Zusatzmittel in einer Konzentration von 1 mg/ml angewendet wurde. Die Menge des in der Kulturflüssigkeit erzeugten Nikotinamidadenindinucleotid betrug 4,7 mg/ml.

Eine Vergleichskultur wurde unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne die Zugabe von oetyltrimethylammoniumbromid durchgeführt. Die Menge an erhaltenem Nikotinamidadenindinucleotid betrug dabei lediglich nur 0,7 mg/ml.

- 18 -

209817/1557

Claims

Patentanmeldung P 16 95 327.8-44 Kyowa Hakko Kogyo Company, Ltd. Unser Zeichen; K 753

München, den

Patentansprüche

1· Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinucleotid durch Kultivierung eines zur Herstellung von Mkotinamidadenindinucleotid fähigen Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet _t daß zu dem Nährmedium wenigstens ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel zu dem Medium bei Beginn der Kultivierung zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel dem iMährmedium nach Einleitung der Kultivierung zugesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- 19 -

209817/1557

das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von etwa 0,01 bis 0,
5 Gew.-fä angewendet wirdo

5ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktives Mittel Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylaminsalze mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, Polyoxyäthylenalkylamine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkyltrimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylbenzyldimethy!ammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylpyridiniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylbetaine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, höhere Fettsäureester oder höhere Pettsäureamide verwendet werden.
6. Verfahren zur Herstellung von Nikotinamidadenindinucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Erzeugung von Nikotinamidadenindinucleotid fähigen Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit wenigstens eines oberflächenaktiven Mittels kultiviert und das Nikotinamidadenindinucleoxid aus der

- 20 -

209817/1557

erhaltenen Kulturflüssigkeit sammelt und gewinnt.
7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktives Mittel Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylaminsalze mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, Polyoxyäthylenalkylamine mi u 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkyltrimethy!ammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylpyridiniumhalogunide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylbetaine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, höhere Fettsäureester oder höhere Fettsäureamide verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 4-0⁰C und bei einem PH-wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt wird.
9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von etwa

- 21 -

209817/1557

0,01 t)is 0,5 Gew.-^ angewendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzachnet,
daß man als MikrοOrganismus eine Hefe verwendet, die zum ü-enus Saccharomyces, Candida, Torula, Schizosaccharomyces, oder Zygosaccharomyces gehört.
11. verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus ein bacterium verwendet, das zum Genus Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Lactobacillus oder Streptococcus gehört»
12. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Nikotinamidadenindinucleotid aus der Kulturflüssigkeit durchweine Ionenaustauschharzbehandlung gewonnen wird.

209817/1557