DE1517836C - Verfahren zur Herstellung von 5' Punnnucleotiden - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden, wie 5'-Inosinsäure, Adenosin-5'-triphosphat und 5'-Guanylsäure, durch aerobes Züchten einer 5'-Purinnucleotide produzierenden Mikroorganismus in einem hierfiir üblichen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37° C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 8,0. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium mindestens ein oberflächenaktives Mittel zusetzt. Nichtionische, kationische, anionische und amphotere oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyäthylensorbit-Derivate, Polyoxyäthylenalkylamine, Polyoxyäthylenalkyläther und Polyoxyäthylenalkylallyläther, können verwendet werden.

Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation, wobei Mikroorganismen in Gegenwart von Purinbasen oder Purinnucleosiden gezüchtet werden, sind bekannt (vgl. die japanischen Patentanmeldungen 12136/1963, 17 615/1963, 28 753/ 1963, 47 841/1963, 57 520/1963, 63 229/1963, 3 377/ und 3 798/1965).

Aufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines in industriellem Maßstab auf wirksame und einfache Weise durchführbaren Verfahrens zur biotechnischen Herstellung von 5'-Purinnucleotiden, welches bei niedrigen Kosten mit hoher Produktausbeute abläuft und damit gegenüber den bisherigen Verfahren mit unbefriedigend niedriger Ausbeute verbessert ist.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß sie 5'-Purinnucleotide in erheblichen Mengen und beschleunigt mittels eines Fermentationsverfahrens herstellen lassen, wenn dem Züchtungsmedium, welches die 5'-Purinnucleotid-produzierenden Mikroorganismen enthält, oberflächenaktive Mittel zugesetzt werden.

Ein Vergleich mit bekannten Fermentationsverfahren zeigt, daß sich erfindungsgemäß größere Ausbeuten an 5'-Inosinsäure (belgische Patentschrift 646 342, französische Patentschrift 1 395 940), 5'-Guanylsäure und 5'-Adenylsäure (belgische Patentschrift 646 342), Adenosin-5'-triphosphat und Guanosin-5'-triphosphat (belgische Patentschrift 655 014 und französische Patentschrift 1 372 054) und Adenosin-5'-diphosphat (belgische Patentschrift 655 014 und französische Patentschrift 1 372054) erzielen lassen.

Anwendbare oberflächenaktive Mittel sind alle bekannte nichtionische, kationische, anionische oder amphotere oberflächenaktive Mittel. Besonders wirksam sind die Polyoxyäthylensorbitfettsäureester (C₁₂-C₁₈), Alkylaminsalze (Cj₈-C₁₈), die Polyoxyäthylenalkylamine (C₁₂-C₁₈), die Polyoxyäthylenalkyläther (C₁₂-C₁₈), die Polyoxyäthylenalkylallyläther (C₈-C₁₈), die Alkyltrimethylammoniumhalogenide (C₁₂-C₁₈), die Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenide (C₁₂-C₁₈), die Alkylpyridiniumhalogenide (C₁₂-C₁₈), die Alkylbetaine (C₁₂-C₁₈) u. ä.

Der Zeitpunkt, zu welchem das oberflächenaktive Mittel dem Nährmedium zugesetzt wird, variiert in Abhängigkeit von dem speziellen angewendeten oberflächenaktiven Mittel. Der größte Effekt wird jedoch festgestellt, wenn das oberflächenaktive Mittel gleichzeitig mit dem Einimpfen des Mikroorganismus in das Nährmedium oder während des Anfangsstadiums der Züchtung zugegeben wird. Es versteht sich, daß eine Mischung zweier oder mehrerer oberflächenaktiver Mittel zum Nährmedium gegeben werden kann, wenn dies erwünscht ist.

Die günstigerweise zuzusetzende Menge des oberflächenaktiven Mittels kann innerhalb weiter Grenzen variiert werden, darf aber natürlich das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus nicht behindern. Die Menge hängt von dem besonderen Typ des oberflächenaktiven Mittels und des zur Fermentation verwendeten Mirkoorganismus ab. Die optimale Menge liegt bei 50 bis 2000 μg auf 1 ml Kulturlösung.

Alle Mikroorganismen, die imstande sind, 5'-Purinnucleotide zu produzieren, können erfindungsgemäß verwendet werden. Entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium ist dafür geeignet, solange es nur die für das Wachstum des angewendeten Mikroorganismenstammes notwendigen Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquelle dienen einzeln oder in Kombination Kohlenhydrate, wie Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse usw., oder andere Quellen, wie Glycerin, Mannit, Sorbit usw. Als Stickstoffquelle dienen einzeln oder in Kombination verschiedene anorganische oder organische Verbindungen wie Harnstoff oder Ammoniumsalze (Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw.) oder Aminosäuren oder stickstoffhaltige natürliche Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton. Fischmehl, Caseinhydrolysate, Casaminosäure,

Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakte usw. Als anorganische Salze dienen einzeln oder in Kombination Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid usw. Alle speziellen, zum Wachstum des bestimmten Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe sollten dem Nährmedium ebenfalls in geeigneten Mengen zugesetzt werden.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie aerobes Schütteln der Kultur, oder durch aerobes Rühren einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37⁰C und einem pH von etwa 5,5 bis 8,0. Nach etwa 3 bis 7 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden im Züchtungsmedium bemerkenswert große Mengen an 5'-Purinnucleotiden gefunden. .

Nach beendeter Züchtung können die 5'-Purinnucleotide vom Fermentationsfiltrat mit den üblichen Mitteln abgetrennt werden, beispielsweise also durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, durch Extraktion mit Lösungsmitteln, durch Ausfällung mit Metallsalzen, durch Chormatographie oder ähnliche Methoden.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Wenn nicht anders vermerkt, sind die angegebenen Prozentgehalte Gewichtsprozente.

Beispiel 1

40 ml-Teile dieses Fermentationsmediums werden in einzelne Sagakuchi-Kolben gegossen. Nach ihrer Sterilisation durch Hitze werden 4 ml-Teile der obenerwähnten Einsaatkultur in die Sagakuchi-Kolben mit den Fermentationsmedien gegeben, unter gleichzeitiger Zugabe verschiedener Konzentrationen an Polyoxyätyhlensorbitfettsäureestern (Tween) mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen als oberflächenaktiven Mitteln. Die oberflächenaktiven Mittel werden vor der Zugabe zu dem Züchtungsmedium getrennt sterilisiert. Das bestimmte verschiedenen Kolben zugesetzte oberflächenaktive Mittel und die angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure, die nach 7 Tage langer Züchtung unter aeroben Bedingungen bei 31° C in der Kulturflüssigkeit gefunden wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 19 183 wird als Einsaatstamm verwendet. 20 ml-Teile eines Eihsaatzüchtungsmediums, bestehend aus 3,3% Glukose, 1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,25% NaCl und 0,2% Harnstoff, werden in konische 250-ml-Flaschen gegossen. Nach Sterilisation der Flaschen mit dem Einsaatzüchtungsmedium wird der Einsaatstamm unter aerobem Schütteln 24 Stunden lang bei 28° C gezüchtet.

Ein Fermentationsmedium ,folgender Zusammen-Setzung wird hergestellt:

12% Glukose,

1% K₂HPO₄,

1% KH₂PO₄,

■ - 1% Bouillon,

1% MgSO₄-7H₂O,

0,01% CaCl₂-2H₂O,

1 mg ZnSO₄ · 7H₂O, pro Liter,
20 mg FeSO₄ · 7 H₂O pro Liter, 20 mg L-Cystin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,
15 mg /S-Alanin pro Liter,

0,5 mg Thiamin-hydrochlorid pro Liter, 50 mg Adenin pro Liter, 50 mg Guanin pro Liter,

0,7% Harnstoff.

Zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel	Menge an ■produzierter 5'-Inosinsäure
	(μδ/πιΐ)	(mg/ml)
Tween 20	• 500 1000 1500 2000	• 17,1 17,9 19,5 20,0
Tween 40	1000 1500 2000 -	18,5 19,8 20,5
Tween 60	1000 1500 2000	19,8 25,1 24,5
Tween 80	500 1000 1500	20,1 ■ ' 21,3 - 21,2
Tween 85 *	1000 1500 2000	20,0 20,1 21,3
Kein Zusatz (Kontrolle)	— .	15,5'

Beispiel 2

Die Züchtung wird mit demselben Mikroorganismus und unter den gleichen Bedingungen und Verfahren wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die nach 7 Tage langem Züchten in der Fermentationsflüssigkeit angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure bei Zugabe von Stearylaminacetat und Alkalaminsalz in verschiedenen Konzentrationen und zu verschiedenen Zeiten der Zugabe sind in Tabelle 2 aufgeführt.

	Tabelle 2	Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel teg/ml)	Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml)
Zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Zeitpunkt des Zusatzes (nach Züchtungsstunden)	100 200	20,0 24,1
Stearylaminacetat	0

. Fortsetzung

Zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Zeitpunkt des Zusatzes (nach Züchtungsstunden)	Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel	Menge an produzierter 5'-Inosinsäure
		((ig/ml)	(mg/ml)
Stearylaminacetat		500	25,0
	24	250	18,2
		500	20,3
		1000	24,0
Acetamine 86 (Alkylaminsalz)	O	100	20,5
		200	24,4
		500	24,9
C17H33CON(CH3)C2H4SO3Na	O	100	20,2
		150	24,6
		200	22,3
	24 -	250	18,5
		500 .	19,0
		1000	22,1
Kein Zusatz (Kontrolle)		—	• ' 16,0

Beispiel 3

Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 14 305 wird als Einsaatstamm in die Kolben eingeimpt. Die Züchtung Einsaatstamm verwendet. Ein Einsaatzüchtungsme- 30 wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei dium aus 2% Glukose, 1% Pepton und 0,8% Hefeextrakt wird in 300-ml'·Anteilen in konische 2-1-Kolben
gegossen. Nach deren Sterilisation mit Hitze wird der

28° C durchgeführt. 31 eines Fermentationsmediums mit den folgenden Bestandteilen werden in ein 5-1-Fermentationsgefäß gefüllt:

10% Glukose,
0,6% K₂HPO₄,
0,6% KH₂PO₄,

0,2% MgSO₄-7H₂O, 0,004% MnSO₄-4H₂O, 1 % Natrium-Citrat, 0,1% Harnstoff,
100 (xg Biotin pro Liter,
100 μg Adenin pro Liter.

Nach Sterilisation des Fermentationsmediums durch Hitze werden 300 ml des obigen Einsaatzüchtungsmediums in den Fermenter eingeimpft. Die Züchtung wird 3 Tage lang bei 32° C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Der pH-Wert des Züchtungsmediums wird während der Züchtung mit Ammoniaklösung auf 6,8 gehalten.

Oberflächenaktive Mittel werden dem Züchtungsmedium in verschiedenen Konzentrationen nach 24stündiger Züchtung zugesetzt. Die nach beendeter Züchtung angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 3 aufgeführt. .

	Tabelle 3	Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml)
Zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel ^g/ml)	7,0 7,7 7,1 7,3 8,0 7,0
Tween 60 Tween 80	1000 1500 2000 1000 1500 2000

Zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel ^g/ml)	Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml)
Stearylaminacetat Kein Zusatz (Kontrolle)	100 300 500	7,1 " 7'8 „ 8,2 5,2

Beispiel 4

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Man bereitet eine Einsaatkultur, indem man diesen Stamm 24 Stunden lang bei 30⁰C in einem wäßrigen Nährmedium aus 3% Glukose, 1% Bouillon, 1% Pepton und 0,25% NaCl züchtet.

Die Fermentation wird in der gleichen Weise, wie im Beispiel 3 beschrieben, in dem Züchtungsmedium mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:

10% Glukose,

1,0% KH₂PO₄,
1,0% K₂HPO₄,
1,0% MgSO₄ -7H₂O,

ιοί/ ö:>o

10 mg ZnSO₄ · 7H₂O pro Liter,

0,01% CaCl₂-2H₂O, .

0,001% FeSO₄-7H₂O,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg jS-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,

0,5 mg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter,

0,2% Harnstoff.

Die Züchtung wird 1 Tag lang unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Dann werden 3 mg Adenin pro Milliliter und verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel, wie in Tabelle 4 angegeben, zugefügt und die Züchtung über weitere 2 Tage durchgeführt. Die als Ergebnis dieses Verfahrens angereicherten Mengen Adenosin-5'-triphosphat sind in Tabelle 4 gezeigt. .

Tabelle 4

	Menge an	Menge an
Zugesetztes	zugesetztem	produziertem
oberflächenaktives	oberflächenaktivem	Adenosin-
Mittel	Mittel	5'-triphosphat
	(μ&ΊηΙ)	(mg/ml)
Tween	500	9,5
	1000	10,6
	1500	9,9
Tween 40	500	9,8
	1000	10,1
	1500	10,3
Acetamine 86	100	9,5
(Alkylaminsalz)	300	9,7 .
	500	10,6
Kein Zusatz	—	6,2
(Kontrolle)

Beispiel 5

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Dieses Bacterium wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 30° C in einem Züchtungsmedium aus 3% Glukose, 0,5% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% MgSO₄-7H₂O, 0,01 % CaCl₂ · 7H₂O, 0,001 % FeSO₄ · 7H₂O, 0,001 % ZnSO₄-7H₂O, 20 mg L-Cystin pro Liter, 15 mg /3-Alanin pro Liter, 50 mg Natriumglutamat pro Liter, 30 μg Biotin. pro Liter, 0,5 mg Thiaminhydrochlorid pro Liter, 0,0002% MnSO₄-4H₂O und 0,2% Harnstoffgezüchtet. :

Die Fermentation wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 3 beschrieben ausgeführt. Das verwendete Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung:

10,0% Glukose, ..".■■.,

0,4% Bouillon,

.1,4% KH₂PO₄^ ■

- 1,4% K₂HPO₄,-

1,4% MgSO₄-7H₂O, ■

' 0,01% CaCIi-2H₂O,

0,005% ZnSO₄-7H₂O,

0,002% FeSO₄ ■ 7H₂O,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg ^-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,

0,5 mg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter,

0,2% Harnstoff.

Nach 24 Stunden der Züchtung unter aeroben Bedingungen werden dem Züchtungsmedium verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel zugesetzt. Nach 48 Stunden weiterer Züchtung werden 4 mg Guanin pro Milliliter zugesetzt. Die nach weiteren 6 Stunden der Züchtung (nach Zugabe des Guanins) angereicherten Mengen 5'-Guanylsäure sind in Tabelle 5 angegeben. ' "

. · .Tabelle5 ^: ■"; ^:

	-:■'."	Menge an	Menge an
	Zugesetztes	zugesetztem	produzierter
15	oberflächenaktives Mittel	oberflächenaktivem Mittel	5'-Guanylsäure
		(μΕ/πιΙ)	(mg/ml)
	Tween 60 .	500 ■'	6,4.
	*	1000	7,1
20		. 1500	6,8
	Tween 85	500	6,3
		"lOÖO	7,0
25		1500	• 6,7
	Stearylaminacetat	. 100	6,9 -
		300	7,0
		500	7,5. ■■;
30	Kein Zusatz	—	3,8
	(Kontrolle)

Beispiel 6

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872, derselbe Mikroorganismus wie im Beispiel 5, wird als Einsaatstamm verwendet. Eine Einsaatkultur davon erhält man auf die gleiche Weise und in demselben Medium, wie im Beispiel 5 beschrieben.

Die Züchtung wird entsprechend dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren in folgendem Fermentationsmedium durchgeführt:

15% Glukose, " . .·■ -

0,4% Bouillon,

1,0% KH₂PO₄, ■

1,0% K₂HPO₄,

1,0% MgSO₄-7H₂O, ' . ■■_.
- 0,01% CaCl₂-2H₂O, . · y

20 mg FeSO₄ · 7H₂O pro Liter,
10 mg ZnSO₄ · 7H₂O pro Liter,
40 μg MnSO₄.· 4H₂O pro Liter,
15 mg /S-Alanin pro Liter, .
20 mg L-Cystin pro Liter,

30 μg Biotin pro Liter, :.

5 μg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter,
0,2% Harnstoff. ■

Nach 24 Stunden Züchtung werden dem Züchtungsmedium verschiedene oberflächenaktive Mittel in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, wie in Tabelle 6 angegeben. 30 Stunden nach Beginn der Züchtung werden dem Züchtungsmedium 6 mg Hypoxanthin pro Milliliter zugesetzt. Die nach 3 Tagen langer Züchtung unter aeroben Bedingungen angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 6 verzeichnet.

309 628/177

	1	-	517	836	10
9				Tabelle 8
Tabelle 6

Zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Menge an zugesetztem oberflächen aktivem Mittel ^g/ml)	Menge an produzierter S'-Inosin säure (mg/ml)
Tween 60 Stearylaminacetat Kein Zusatz (Kontrolle)	500 1000 1500 100 300 500	19,8 . 21,6 20,9 19,8 _ 20,6 21,7 17,0

Beispiel 7

Die Fermentation wird mit demselben Stamm, Züchtungsmedium und Verfahren wie im Beispiel ί durchgeführt, außer der Zugabe von 40 mg MnSO₄ · 4H₂O pro Liter. Nach 3 Tagen langer Züchtung werden dem Züchtungsmedium verschiedene oberflächenaktive Mittel der Nymeen-Reihe, in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Die nach 7 Tage langer Züchtung in der . Kulturflüssigkeit angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 7 aufgezeigt.

Tabelle 7

Zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Menge an zugesetztem oberflächen aktivem Mittel ^g/ml)	Menge an produzierter 5'-Inosinsäure (mg/ml)
Nymeen S-204 (PoIy- oxyäthylenstearylamin- äthylenoxid, 4 Mol) Nymeen S-210 (PoIy- oxyä thylensteary lamin- äthylenoxid, 4MoI) Nymeen S-215 (PoIy- oxyäthylenstearylamin- äthylenoxid, 4 Mol) Kein Zusatz (Kontrolle)	250 500 750 250 500 1000 250 500 1000	23,8 ■ 26,7 27,1 23,4 28,6 29,2 24,7 28,6 ■ 30,2 15,2

Beispiel 8

Die Fermentation wird mit demselben Stamm und Züchtungsmedium und unter den gleichen Bedingungen und dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 durchgeführt. Nach 24 Stunden langer Züchtung werden dem Züchtungsmedium verschiedene Konzentrationen ' der oberflächenaktiven Mittel Polyoxyäthylenoleyläther, Polyoxyäthylencetyläther, PoIyoxyäthylenoctylallyläther und Polyoxyäthylennonylallyläther zugesetzt. Die nach 7tägiger Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereicherten Mengen 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 8 angegeben.

Zugesetztes

oberflächenaktives

Mittel.

IO _K Nissan nonion E-208
(Polyoxyä thylenoleyläther)

Nissan nonion P-208
(Polyoxyäthylencetyläther)

Nissan nonion HS-204,5
(Polyoxyä thylenoctylallyläther) ·

Nissan nonion HS-206
(Polyoxyäthylenoctylallyläther)

Nissan nonion NS-210
(Polyoxyä thylennonylallyläther)

Nissan nonion NS-212
(Polyoxyä thylennonyl)-allyläther)

Kein Zusatz (Kontrolle)

Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel

500 1000

500 1000

1000 1500

1000 1500

1000 1500

1000 1500

Menge an

produzierter

5'-Inosinsäure

(mg/ml)

19,5 18,9

19,4 16,2

19,7 18,6

19,1 19,0

21,3 20,0

17,6 .19,8

14,9

Beispiel 9

Die Fermentation wird mit demselben Stamm, Züchtungsmedium und Verfahren wie im Beispiel 1 durchgeführt. Nach 3 Tage langem Züchten werden dem Züchtungsmedium verschiedene Konzentrationen verschiedener oberflächenaktiver Mittel der Alkyltrimethylammoniumhalogenid-, Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenid-, Alkylpyridiniumhalogenid- und Alkylbetainreihe zugesetzt. Die nach 7 Tage langer Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereicherten Mengen an 5'-Inosinsäure sind in Tabelle 9 verzeichnet.

Tabelle 9

Zugesetztes 5° oberflächenaktives Mittel	Menge an zugesetztem oberflächen aktivem Mittel	- 5'-Inosinsäure ,(mg/ml)
Stearyltrimethylammo- 55 niumchlorid Myristyldimethyl- benzylammoniumchlorid 60 Cetylpyridiniumchlorid Alkylbetain Kein Zusatz	250 500 750 ' 250 500 ' 750 250 500 . 750 750 1000 1500	17,8 22,1 19,6 18,6 23,4. 20,1 20,4 22,8 17,8 15,9 18,4 20,1 13,8

Beispiel 10

ΙΟΙ/ÖJO

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstämm verwendet. Eine Einsaatkultur erhält man, indem man diesen Stamm 24 Stunden lang bei 30⁰C in einem wäßrigen Nährmedium aus 3% Glukose, 1% Bouillon, 1% Pepton und 0,25% NaCl züchtet.

Die Fermentation wird nach der im Beispiel 3 beschriebenen Weise in folgendem Züchtungsmedium durchgeführt:

10% Glukose,

1,0% KH₂PO₄,

1,0% K₂HPO₄,

1,0% MgSO₄ -7H₂O,
10 mg ZnSO₄ ■ 7H₂O pro Liter, 0,01% CaCl₂-2H₂O,

0,001%

FeSO₄-7H₂O,

20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg /S-Alanin pro Liter,
30 μg Biotin pro Liter,

0,5 mg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter, 0,2% Harnstoff.

1 Tag lang wird unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Dann werden 3 mg Adenin pro Milliliter und verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel, wie in Tabelle 10 angegeben, dem Züchtungsmedium zugesetzt, und die Züchtung weitere 2 Tage durchgeführt. Die als Ergebnis dieses Verfahrens erhaltenen Mengen angereicherten Adenosin-5'-triphosphats sind in Tabelle 10 verzeichnet.

Tabelle 10

Die Fermentation wird in derselben Weise, wie im Beispiel 3 beschrieben, ausgeführt. Das hierfür verwendete Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung:
5

10,0% Glukose,
0,4% Bouillon,
1,4% KH₂PO₄,
1,4% K₂HPO₄,

ίο 1,4% MgSO₄ · 7H₂O,

0,01% CaCl₂-2H₂O,
0,005% ZnSO₄-7H₂O,
0,002% FeSO₂ ■ 7H₂O,
20 mg L-Cystin pro Liter,
15 mg/S-Alanin pro Liter,

30 μg Biotin pro Liter,
0,5 mg Thiamin-Hydrochlorid pro Liter, 0,2% Harnstoff.

Nach 24 Stunden der Züchtung unter aeroben Bedingungen werden dem Züchtungsmedium verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel zugesetzt. Nach weiteren 48 Stunden wird eine Menge von 4 mg Guanidin pro Milliliter zugesetzt. Die nach

-weiteren 6 Stunden langer Züchtung" (nach Zugabe des Guanidins) angereicherten Mengen 5'-Guanylsäure sind in Tabelle 11 angegeben.

Zugesetztes oberflächenak ti ves Mittel	Menge an zugesetztem oberflächen aktivem Mittel ^g/ml)	Adenosin- 5'-triphosphat (mg/ml)
Nymeen S-215 (PoIy- oxyäthylenstearylamin- äthylenoxid, 4 Mol) Myristyldimethyl- benzylammoniumchlorid Cetylpyridiniumchlorid Kein Zusatz	250 500 1000 250 500 750 250 500 750	6,0 6,4 6,8 6,2 7,8 7,2 6,8 7,7 6,9 5,6

Tabelle!!

Zugesetztes

oberflächenaktives

Mittel

Nymeen S-215 (PoIyoxyä thylenstearylaminäthylenoxid, 4 Mol)

Lauryltrimethylammohiumchlorid

Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid

Cetylpyridiniumchlorid

Kein Zusatz

Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel

250

500

1000

250 500 750

250 500 750

250 500 750

5'-Guanylsäure

(mg/ml)

5,4 6,8 6,2

6,1 6,9 6,7

6,0

7,4 6,4

6,2 7,1 6,6

4,0

Beispiel 12 Beispielll

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Dieses Bacterium wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 30⁰C in einem Züchtungsmedium aus 3% Glukose, 0,5% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7H₂0,0,01 % CaCl₂ · 7H₂0,0,001 % FeSO₄· 7H₂O, 0,001% ZnSO₄-7H₂O, 20 mg L-Cystin pro Liter, 15 mg /J-Alanin pro Liter, 50 mg Natriumglutamat pro Liter, 30 \xg Biotin pro Liter, 0,5 mg Thiaminhydrochlorid pro Liter, 0,0002% MnSO₄-4H₂O und 0,2% Harnstoff gezüchtet.

Die Fermentation wurde in dem gleichen Medium und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 183, Micrococcus glutamicus ATCC 14 305 und Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 als Stämme eingesetzt wurden.

Nach 20 Stunden vom Beginn der Fermentation an wurden Lecithin und S-Dodecyl-isothioharnstoffhydrochlorid zugegeben. Die in der Fermentationsflüssigkeit angesammelten Mengen an 5'-Inosinsäure, 5'-Guanylsäure und Adenosin-5'-triphosphat sind in Tabelle 12 zusammengefaßt.

13

Tabelle 12

14

	Lecithin	Menge	ATCC 19183	5'-Inosin säure	ATCC 6872	5'-Guanylsäure	Adenosin-
5'-Purinnucleotid		(y/ml)	(mg/ml)	ATCC 14305	(mg/ml) ■	ATCC 6872	5'-triphosphat
Zugegebenes oberflächenaktives	S-Dodecylisothioharnstoff-	500	19,6	(mg/ml)	22,6	(mg/ml)	ATCC 6872
Mittel	hydrochlorid	1000	23,4	■ 7,1	27,0	5,7	(mg/ml)
Kein Zusatz	500	21,6	8,4	24,7 .	6,8	6,8
	1000	25,0	7,7	26,5	7,0	7,7
	—	15,2	8,3	13,4 ,	6,7	7,4
		5,5		4,2	- 7,2
		5,2

"Beispiel 13·.

Die Fermentation wurde in dem gleichen Medium gesetzt wurden. 10 Stunden nach Beginn der Fermen-

und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 tation wurden verschiedene oberflächenaktive Mittel

durchgeführt, wobei Escherichia coli ATCC 14 621, 20 in verschiedenen Konzentrationen zugefügt. Die in

Bacillus subtilis ATCC 14 617, Flavobaceterium harri- den Fermentationsflüssigkeiten angesammelten Men-

sonii ATCC 14 589, Bacillus cereus ATCC 14 603 gen an 5'-Inosinsäure, 5'-Guanylsäure und Adenosin-

und Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 ein- 5'-triphosphat sind in Tabelle 13 zusammengefaßt.

TabelleB

5'-Purinnucleotid zugesetztes oberflächenaktives Mittel	Menge (v/ml)	5'-Ino ATCC 14621 (mg/ml)	>insäure ATCC 14617 (mg/ml)	5'-Guan ATCC 14589 (mg/ml)	ylsäure ATCC 14603 (mg/ml)	Adenosin- 5'-triphosphat ATCC 6871 (mg/ml)
Tween 60 (Polyoxyäthylensorbitfett- säureester)	1000 500	3,1 3,9	7,2 8,0	7,8 9,2	1,1 2,4	3,7 4,2
Nymeen S-215 (Polyoxyäthylenstearyl- aminäthylenoxid, 4 Mol)	100 250	2,6 4,4	6,3 '8,6	6,5 9,0	0,8 1>9	3,2 5,0
Cetylpyridiniumchlo'rid	100 250	3,0 4,2	6,0 7,5	7,5 10,3	1,2 2,0	3,5 4,8
Nissen nonion NS-210 (Polyoxyäthylen- nonylallyläther)	500 1000	2,8 3>9	7,0 9,3	8,6 10,1	1,1 1,9	3,6 -. 5,1
C17H33CON(CH3)C2H4SO3Na	100 250	3,2 4,6	6,5 8,2	9,2 11,4	1,3 1,8	2,8 5,8
Lecithin	500 1000	2,4 3,5	6,4 7,8	8,5 10,4	. 1,0 2,1	3,4 6,1
S-Docecylisothioharnstoff-hydrochlorid	500 1000	2,7 3,6	7,1 8,8	8,8 11,2	0,9.: 1,7	2,9 ' 5,7 y ,
Kein Zusatz	—	1,8	4,5	' 5,7 ,	0,5	2,0

Beispiel 14

Die Fermentation wurde in dem gleichen Medium ' Beginn der Fermentation wurden verschiedene ober

und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 flächenaktive Mittel in verschiedenen Konzentrationer

durchgeführt, wobei Micrococcus glutamicus ATCC 55 zugefügt. Die in den Fermentationsflüssigkeiten ange·

14 620, Bacillus subtilis ATCC 14 618, Streptomyces sammelten Mengen an 5'-Adenylsäure, Adenosin

sp ATCC 15 131 und Brevibacterium ammoniagenes 5'-diphosphat und Guanosin-5'-triphosphat sind ir

ATCC 6872 zum Einsatz kamen. 10 Stunden nach Tabelle 14 zusammengefaßt.

Tabelle 14	5'-Purinnucleotid zugegebenes oberflächenaktives Mittel	Menge (v/ml)	5'-Aden ATCC 14620 (mg/ml)	ylsäure ATCC 14618 (mg/ml)	Adenosin- 5'-diphosphat ATCC 15131 (mg/ml)	Guariosin- 5'-triphosphat ATCC 6872 (mg/ml)
Tween 60 (Polyoxyäthylensorbitfettsäureester)	1000 1500	1,6 2,8	1,8. ■ 3,1	1,4 2,1	3,2 4,5

1 Öl Y bot)

Fortsetzung

5'-Purinnucleotid zugegebenes oberflächenaktives Mittel	• Menge	•5'-Aden ATCC 14620	ölsäure ATCC 14618	Adenosin- 5'-diphosphat ATCC 15131	Guanosin- 5'-triphosphat ATCC 6872
	(y/ml)	(mg/ml)	(mg/ml)	(mg/ml)	(mg/ml)
Nymeen S-215 (Polyoxyäthylenstearylamin- äthylenoxid, 4 Mol)	100 . 250	1,8 2,5	2,4 3,6	1,4 2,9	3,0 4,2
Cetylpyridiniumchlorid	100 250	2,3 4,0	1,9 3,7	' 1,8 2,5	3,7 4,8
Nissan nonion NS-210 (Polyoxyäthylennonyl- allyläther)	500 1000	1,9 3,7	2,4 4,0	1,4 3,1	2,8 3,9
C17H33CON(CH3)C2H4SO3Na	100 250	2,2 3,5	2,1 3,3	1,5 •,2,7	' .3,2 5,4
Lecithin	500 . 1000	1,7 ■ - 4,0	2,5 3,7	1,4 3,0	3,1 4,7
S-Docecyl-isothioharnstoff-hydrochlorid	500 1000	^2,3 4,1	2,4 4,3	1,8 3,1	4,0 4,9
Kein Zusatz	—	1,0	1,0	0,8	2,0

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch aerobes Züchten eines 5'-Purinnucleotide produzierenden Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 8,0, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium mindestens ein oberflächenaktives Mittel zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel dem Nährmedium zu Beginn der Züchtung zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von 50 bis 2000 μg pro Milliliter Nährlösung anwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktives Mittel einen Polyoxyäthylensorbitfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Alkylaminsalz mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Polyoxyäthylenalkylamin mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, einen Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einen Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet; daß man als Alkylaminsalz mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen Alkyltrimethylammoniumhalogenid mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenid mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylpyridiniumhalogenid mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen oder Alkylbetain mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen verwendet.