DE1517836A1

DE1517836A1 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnukleotiden

Info

Publication number: DE1517836A1
Application number: DE19661517836
Authority: DE
Inventors: Yukou Arai; Yoshinobu Miyamura; Takeshi Saito
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-12-10
Filing date: 1966-12-09
Publication date: 1970-09-24
Also published as: GB1145310A; JPS4928996B1

Description

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Am*«rte-Viktori«-Stra8· « Dr.-lng.HAN5 KUOLnM: Pl.n2«iau.r Strak 2

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Potteofeekkonto: PATENTANWÄLTE Pwtodwokkonto: BliWM74M

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K 706 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von !j'-Purinnukleotiden

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von 5'-Purinnukleotiden, wie 5'-Inosinsäure, AdenoBin~5'-triphosphat und 5'-Guanylsäure. Insbesondere wurde gefunden, daß große Mengen an 5'-Purinnukleotiden angereichert werden, wenn Mikroorganismen, die imstande sind, diese Stoffe zu produzieren, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet werden, welches mindestens ein oberflächenaktives Mittel enthält. Nichtionieche, kationisohe, anionische und amphotere oberflächenaktive Mittel, wie die Polyoxyäthylensorbit- Berivate. Polyoxyäthylenalkylamlne, Polyoxyäthylenalkyläther und Polyoxyäthylenalkylallyläther können vorteilhaft verwendet werden. Grundlagen der Erfindung

Die Erfindung bezieht eioh auf eine Fermentation, ge-

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nauer, auf ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnukleotiden durch Fermentation im industriellen Maßstäbe.

Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnukleotiden durch Fermentation, wobei Mikroorganismen in Gegenwart von Purinbasen oder Purinnukleotiden gezüchtet werden, sind bekannt, Beispiele dafür sind die Verfahren, die in den japanischen Patentanmeldungen 12136/1963, 17615/1963,

41
28753/1963, 47844/1963, 57520/1963, 63229/1963, 3377/1965

und 3798/1965 beschrieben sind«

Ausgedehnte Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung ergaben, daß sowohl ein merklicher Anstieg als auch eine Beschleunigung bei der Produktion von 5'-Purinnukleotiden durch Fermentation gefunden wurde. Entsprechend ist eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnukleotiden, welches die Nachteile und Mangel der bisher bekannten Verfahren überwindet.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein im industriellen Maßstab anwendbares Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnukleotiden durch Fermentation, welches auf wirksame und einfache Weise ausgeführt werden kann.

Kin weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnukleotiden durch Fermentation, welches vorteilhaft im industriellen Maßstab bei niedrigen Kosten und gleichzeitiger hoher Auebeute des Erzeugnisses anwendbar ist,

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Diese und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann durch die folgende Beschreibung und die Ansprüche deutlich,

Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß bemerkenswerte Mengen und eine beschleunigte Produktion von 5'-Purinnukleotiden bei einem Fermentationsverfahren erzielt werden, wenn dem Züchtungsmedium, das die 5'-Purinnukleotid produzierenden Mikroorganismen enthält, oberflächenaktive Mittel zugesetzt werden. Die Tatsache, daß ein Zusatz oberflächenaktiver Mittel zu einem Züchtungsmedium die Produktion und Anreicherung von 5'-Purinnukleotiden beträchtlich fördert, ist nicht nur vom industriellen Standpunkt sondern auch vom theoretischen biochemischen Standpunkt aus äußerst fortschrittlich·

Oberflächenaktive Mittel, die erfindungsgemäß angewendet werden können, sind alle geeigneten, in der Technik bekannten, nichtionischen, kationischen, anionischen oder amphoteren oberflächenaktiven Mittel. Besonders wirksam sind die Polyoxyäthylensorbitfensäureester (C-j2"*^18 ^J Tween-Reihe), und ihre Alkylaminsalze (^C8~°18) ' ^die Polyoxyäthylenalkylamine (C-j2""^G18 * Nymeen-Reihe), die Polyoxyäthylenalkyläther (C₁₂-C₁₈), die Polyoxyäthylenalkylallyläther (Cg-C₁₈) ' ^d^^{e A}lkyltrimethylammoniumhalogenide (C₁₂-C₁₈K
halogenide (C₁₂-C₁₈),
(C₁₂-C₁₈), die Alkylbetaine (C₁₂ ^-0IB^ ^{tmd ännllcne}·

009839/0169

Der Zeitpunkt, zu welchem das oberflächenaktive Mittel dem Nährmedium zugesetzt wird, variiert in Abhängigkeit von dem speziellen Typ des angewendeten oberflächenaktiven Mittels. Der größte Effekt wird jedoch festgestellt, wenn das oberflächenaktive Mittel gleichzeitig mit dem Einimpfen des Mikroorganismus in das Nährmedium oder während dee Anfangsstadiums der Züchtung zugegeben wird· Es versteht sich, daß eine Mischung zweier oder mehrerer oberflächenaktiver Mittel zum Nähraedium gegeben werden kann, wenn dies erwünscht ist.

Die günstigerweise zuzusetzende Menge oberflächenaktives Mittel kann innerhalb weiter Grenzen variiert werden, darf aber natürlich das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus nicht behindern· Die Schwankung in der Menge hängt von dem besonderen Typ des oberflächenaktiven Mittels und des zur Fermentation verwendeten Mikroorganismus ab. Die optimale Menge liegt bei 50 - 2000 yug auf 1 ml Kulturlösung.

Alle Mikroorganismen, die imstande sind, 5'-Purinnukleotide zu produzieren, können erfindungsgemäfi verwendet werden. Entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium ist dafür geeignet, solange es nur die für das Wachstum des angewendeten Mikroorganiemenstammes notwendigen Nährstoffe enthält· Diese Nährstoffe ein* in der Mikrobiologie wohlbekannt und schliefen Stoffe wie eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Stoffe und

BAD CRiOlNAL

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ähnliche in geeigneten Mengen ein, welche von dem verwendeten Mikroorganismus gebraucht werden. So müssen beispielsweise als Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate wie Glukose, Fruktose, Maltose, Sukrose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse usw. oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle wie Glycerin, Mannitit, Sorbit usw. erwähnt werden. Diese Stoffe können entweder einzeln oder als Mischung von zweien oder mehreren verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze verwendet werden, wie Harnstoff oder Ammoniumsalze (Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphoephat usw.), oder eine Aminosäure oder mehrere Amino säuren im Gemisch, oder Stickstoff enthaltende natürliche Substrate wie Maisquellewaeser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Kaseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischprei3säfte, Beiskleiieextrakt usw., Biese Stoffe können ebenfalls entweder einzeln oder im Gemisch zweier oder mehrerer verwendet werden« Anorganische Verbindungen, d* de« Züohtungernedium »ugesetst werden kennte» eohlieflen ein Hs44esium»ulfÄt, lat riua j&ospJut, 1*1iuad!hydrogenphosphat, Kaliumaonohydrofenpnosphat, iiseneulfat oder ander« Biβensalse, üanganohlorid, Caloiumohlorid usw,· All· Speeiellen . mm Wftohstum des bestimmten Mikroorfsnisjiu· erforderlichen Mhrstoff· sollten dem lährmedium ebenfallβ in geeigneten Kent·» cugesetst werden. '; . Dl· f«m*a-tation wird unter Mrobta Bedingungen duroh-

BAD

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geführt, wie aerobes Schütteln der Kultur, oder durch Rühren einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 25-37⁰C und einem pH von etwa 5,5 - 8,0. Nach etwa drei bis sieben Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen werden im Ztichtungsmedium bemerkenswert große Mengen an 5'-Purinnukleotiden gefunden.

Nach beendeter Züchtung können die 5'~Purinnukleotidprodukte vom Fermentationsfiltrat mit den üblichen Mitteln getrennt werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung mit Metallsalzen, Chromatographie oder ähnliches·

Beispiele der Erfindung;

Die folgenden Beispiele sollen lediglich «ur Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen, sie jedoch nicht begrenzen. Wenn nicht anders vermerkt, sind die angegebenen Frozentgehalte Gewichtsprozente.

Beispiel 1

Breribaoterium aamoniagenes ATOC Ir, 19183 wir« als SinsaitstMUB verwendet· 20 ml-Teile eine· EineaateOchtungsmediums, bestehend aus 3,3 ^ Glukose, 1 ^ Heftextrakt, 1 % Pepton, 0,25 ^ HaCl und 0,2 % Harnstoff werden Ia konieohe 250 ml-?lasohen gegossen. laoh Sterilisation der flaschen mit dem Einsaat«üohtungernedium wird der Einsaatetamrn unter aerobe» Schütteln 24 Stunden lang bei 28⁰C gezüohtet.

Sin Fermentatlonsaedium folgender Zusammenset«UAg wird

009839/0169 bad or;g:nal

hergestellt:

12 % Glukose

1 £ K₂HPO₄

1 i> KH₂PO₄

1 Ίο Bouillon

1 $ MgS0₄-7H₂0

0,01 * CaCI₂·2H₂O

1 ag/1 ZnSO₄*7H₂O

20 Mg/1 PeSO₄-7H₂O

20 »g/1 L-Cyetin

30 /Ug/1 Biotin

15 Mg/1 ß-Alanin

0,5 »g/1 Thiaain-hydrochlorid

50 mg/1 Adenin

50 »g/l Guanin

0,7 % Harnetoff

al-Teile diese« PementationeeediuMe werden in eineeine Sagakuchi-Kolben gegossen. lach ihrer Sterilisation durch Hitze werden 4 »1-Teile der oben erwähnten Einsaatkultur in die Sagakucni-Kolfcen Mit den FerMentationeaedien angeiapft, unter gleichseitiger Zugabe rerachiedener Konsentra tionen der Tween-Reihe oberflächenaktirer Mittel· Die ober flÄohenaktiren Mittel werden Tor der Zugabe su de» ZÜohtungsaediUM getrennt sterilisiert·

Bas bestiaate rersohiedenen Kolben isugesetste oberfläohenaktire Mittel und die angereicherten Mengen 5'-Inoeineäure, die nach 7 Tage langer Züchtung unter aeroben Be

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dingungen bei 31⁰C in der Kulturflüesigkeit gefunden wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Zugesetztes ober flächenaktives Mittel	Menge an zugesetz tem oberflächen aktivem Mittel	Menge an produ zierter 5^f-Inosin- eäure
	(yug/ml)	(«g/ml)
Tween 20	500	17,1
	1000	17,9
	1500	19,5
	2000	20,0
TweeJi 40	1000	18,5
	1500	19,8
	2000	20,5
Tween 60	1000	19,8
	1500	25,1
	2000	24,5
Tween 80	500	20,1
	1000	21,3
	1500	21,2
Tween 85	1000	20,0
	1500	20,1
	2000 .	21,3
kein Zuaatz (Kontrolle)	-	15,5

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Beispiel 2

Die Züchtung wird mit desselben Mikroorganismus und unter den gleichen Bedingungen und Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt« Sie nach 7 Tage langem Züchten in der Eermentationsfltissigkeit angereicher· ten Mengen 5^f-Inosinsäure bei Zugabe von Cation SA (Stearylaeinaoetat) und Acetamine 86 (Alkylaminsalz) in verschiedenen Konzentrationen und zu verschiedenen Zeiten der Zugabe sind in Tabelle 2 aufgeführt.

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	Tabelle 2	Menge an zuge setztem ober flächenaktivem Mittel (yug/ml)	Menge an pro duzierter 5^f-Inosin- säure (mg/ml)
		100	20,0
Zugesetztes oberflächen aktives Mittel	Zeitpunkt des Zusatzes (nach Züch tungsstunden)	200	24,1
Cation SA	0	500	25,0
		250	18,2
		500	20,3
	24	1000	24,0
		100	20,5
		200	24,4
Acetamine 86	0	500	24,9
		100	20,2
		150	24,6
Diapon T	0	200	22,3
		250	18,5
		500	19,0
	24	1000	22,1
			16,0 :

kein Zusatz (Kontroll·)

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Beispiel 3

Microeoccus glutamicus Ir. 534-348 ATCC Hr. 14305 wird als Einsaatst taut verwendet. Ein Einsaatztiohtungamedium aus 2 j6 Glukose, 1 % Pepton, und 0,8 # Hefeextrakt wird in 300 ml-Anteilen in konische 2 Liter-Kolben gegossen« Nach ihrer Sterilisation mit Hitze wird der Einsaatstamm in die Kolben eingeimpft· Die Züchtung wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 28⁰C durchgeführt. Drei Liter eines Fermentatlonsmediums ait den folgenden Bestandteilen werden in ein 5 Liter-Peraentationsgefäß (jar-Fermenter) gefüllt:

10 $> Glucose

0,6 j6 K₂HPO₄

0,6 i> KH₂PO₄

0,2 f MgSO₄»7H₂O

0,004 + MnSO₄*4H₂O

1 i> latriua-Citrat

0,1 i» Harnstoff

100 /ug/l Biotin

100/Ug/1 Adenin

lach Sterilisation des Permentationemediume durch Hitze werden 300 »1 des obigen EinsaatzüohtungemediuMS in den Fermenter eingeimpft« Die Züchtung wird drei Tage lang bei 32⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Der pH-Wert des ZüchtungBmediOms wird während der Züchtung mit Ammoniaklösung auf 6,8 gehalten«

009839/0169 bad gr;c;nal

Oberflächenaktive Mittel werden dem Ztichtungsmedium in verschiedenen Konzentrationen nach 24stündiger Züchtung zugesetzt. Die nach beendeter Züchtung angereicherten Mengen 5^f-Ino8insäure aind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Zugesetztes oberflächen aktives Mittel	Menge an zuge setztem ober flächenaktive» Mittel *(yug/ml)*	Menge an produ zierter 5'-Inosin- säure (mg/mi)
Tween 60	1000	7,0
	1500	7,7
	2000	7,1
Tveen 80	1000	7,3
	1500	8,0
	2000	7,0
Cation SA	100	7,1
	300	7,8
	500	8,2
kein Zusatz (Kontrolle)	-	5,2

Beispiel 4

Breribacterium ammoniagenes ATCC Ir. 6872 vlrd als Einsaat stamm verwendet. Man bereitet eine Einsaatkultür, indes nan diesen Stamm 24 Stunden lang bei 30⁰C in einen wässrigen

Pepton und

Nährmedium aus 3 # Glukose, 1 i» Bouillon, 1

0 0 9 8 3 9/0169

0,25 # NaCl züchtet.

bad

Die Fermentation wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 beschrieben in folgendem Züchtungsmedium durchgeführt :

10 i> Glukose 1,0 # KH₂PO₄ 1,0 ?6 K₂HPO₄ 1,0 $ MgSO₄*7H₂O 10 mg/1 ZnSO^·7H₂O 0,01 # CaCl₂*2H₂O 0,001 $ PeSO₄*7H₂O 20 mg/1 L-Cystin 15 mg/1 B-Alanine 30/ug/l Biotin

0,5 mg/1 Thiamin-HydroChlorid 0,2 96 Harnstoff

Die Züchtung wird «inen Tag lang unter aeroben Bedingungen durchgeführt· Dann werden 3 mg/ml Adenin und verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel, wie in Tabelle 4 angegeben,zugefügt und die Züchtung über weitere Tage durchgeführt· Die als Ergebnis dieses Verfahrens angereicherten Mengen Adenoein-5'-triphosphat sind in Tabelle 4 gezeigt.

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	Tabelle 4	Menge an produzier tem Adenosine-5¹- triphosphat (mg/ml)
		9,5
zugesetztes oberflächen aktives Mittel		10,6
Tween		9,9
		9,8
		10,1
Tween 40		10,3 ':
		9,5
		9,7
Acetamine 86		10,6
		6,2
	Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel (yug/ml)
kein Zusatz (Kontrolle)	500
Beispiel 5	1000
1500
500
1000
1500
100
300
! 500

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatatamm verwendet« Dieses Bacterium wird 24 Stunden lang unter aeroben Schütteln bei 3O⁰C in einem Züchtungsmedium aus 3 $> Glukose, 0,5 $> Pepton, 0,1 56 K₂HPO₄, 0,1 $> MgS0₄»7H₂0, 0,01 i> CaCl₂«7H₂0, 0,001 # FeSO₄^H₃O, 0,001 j, ZnSO₄.7H₂O, 20 mg/1 L-Cystin, 15 mg/1 ß-Alanin, 50 mg/1 Natriumglutamat, 30 /Ug/1 Biotin, 0,5 mg/1 Thiaminhydrochlorid, 0,0002 $> MnSO₄·4H₂O und 0,2 i> Harnstoff gezüchtet.

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Die Fermentation wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 beschrieben ausgeführt. Das verwendete Züchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung:

10,0 % Glucose

0,4 f> Bouillon

1,4 # KH₂PO₄

1,4 1> K₂HPO₄

1,4 + MgSO₄-7H₂O

0,01 i» CaCl₂*2H₂O

0,005 # ZnSO₄*7H₂O

0,002 + PeSO₄·7H₂O

20 »g/1 L-Cystin

15 mg/1 Ö-Alanin

30 /Ug/1 Biotin 0,5 Mg/1 Thiamin-Hydrochlorid 0,2 i, Harnstoff

lach 24 Stunden der Züchtung unter aeroben Bedingungen werden den Züchtungsmediu« verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel zugesetzt« lach 48 Stunden weiterer Züchtung werden 4 Mg/al Guanin zugesetzt· Sie nach weiteren Stunden ier Züchtung (nach Zugabe des Guanine) angereicherten Mengen 5'-Guanyleäure sind in Tabelle 5 angegeben«

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	Tabelle 5	Menge an produ zierter 5^f-Guanyl- säure (g/l)	Beispiel 6
		6,4
zugesetztes oberflächen- ₀ aktives Mitte/	Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel (yug/ml)	7,1
Tween 60	500	6,8 I
	1000	6,3
	1500	7,0
Tweem 85	500	6,7
	1000	6,9
	1500	7,0
Cation SA	100	7,5
	300	3,8
	500
kein Zusatz (Kontrolle)	-

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Hr. 6872, derselbe Mikroorganismus wie in Beispiel 5, wird als Einsaatβtarne verwendet. Eine Einsaatkultur davon erhält man «uf die gleiche Weise und in demselben Medium wie in Beispiel 5 beschrieben.

Sie Zücatung wird entsprechend den in Beispiel 3 be schriebenen Verfahren in folgendes Feraentatlonsaedlum durchgeführt t

BAD

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-ΠΙ 5 Ί» Glucose 0,4 ^ Bouillon 1,0 J* KH₂PO₄ 1,0 56 K₂HPO. 1,0 96 MgSO₄-7H₂O 0,01 # CaCl₂.2H₂O 20 mg/1 PeSO₄.7H₂O 10 mg/1 ZnSO₄·7H₂O 40 /Ug/1 MnSO₄*4H₂O 15 »g/1 ß-Alanin 20 iig/1 l-Cystin 30 /ug/l Biotin 5 /Ug/1 Thiaain-Hydroohlorid 0,2 # Harnstoff

Haoh 24 Stunden Züchtung werden dem Züchtungamedium verschiedene oberflächenaktive Mittel in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt, wie in Tabelle 6 angegeben« Stunden nach Beginn der Züchtung werden den Züohtungs- »edium 6 Bg/ml Hypoxanthin zugesetzt· Die nach 3 Tage langer Züchtung unter aeroben Bedingungen angereicherten Mengen 5'-Ino»ineäure sind in Tabelle 6 verzeichnet.

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_BAD

-18-Tabelle 6

zugesetztes oberflächenaktives Mittel

Menge an zugesetz- Menge an produ-

tem oberflächen- , zierter

aktivem Mittel 5^f-Inosinsäure (/Ug/ml) (mg/ml)

Tween 60

Cation SA

kein Zusatz (Kontrolle)

500

1000

1500

100

300

500

19,8 21,6

20,9 19,8 20,6 21,7

17,0

Beispiel 7

Sie Fermentation wird mit demselben Stamm, Züchtungsmedium und Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer der Zugabe von 40 ml/1 MnSO.-4H₂O . Nach 3 Tage langer Züchtung werden dem Züchtungsmedium verschiedene oberflächenaktive Mittel der Nymetn-Reihe in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Die nach 7 Tage langer Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereicherten Mengen 5'-Inosinaäure einet in Tabelle 7 aufgezeigt.

BAD ORlCVWAL

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Tabelle 7

zugesetztes
oberflächenaktives Mittel

Menge an zugesetztem oberflächenaktivem Mittel

Menge an produzierter 5'-Iaosinsäure (mg/ml)

Hymeen S-204

(Polyoxyäthylen-

stearylamin-

äthylenoxyd

4 Mol)

Hymeen S-210 (Polyoxyäthylenstearylaainäthylenoxyd 4 Mol)

Hymeen S-215

(Polyoxyäthylen-

stearylaein-

äthylenoxyd

4 Mol)

kein Zusatz (Kontrolle)

250 500 750

250

500

1000

250

500

1000

23,8 26,7 27,1

23,4 28,6 29,2

24,7 28,6 30,2

15,2

Beispiel 8

Die Fermentation wir* Bit demselben Stamm und Züohtungsmedium und unter den gleichen Bedingungen und dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt· lach 24 Stunden langer Züchtung werden dem Züchtungsmedium yersohiedene Konzentrationen der oberflächenaktiven Mittel liesan nonion £ (Polyoxyäthylenoleyläther), lissan nonion P (Polyoxyäthylencetyläther), Hissan nonion HS (Polyoxyäthylenootylallyläther^

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BAD

und Nissan nonion NS (Polyoxyäthylennonylallyläther)
zugesetzt. Die nach 7 Tage langer Züchtung in der Kulturflüssigkeit angereicherten Mengen 5^f-Inosinsäure sind in Tabelle 8 angegeben·

Tabelle 8

zugesetztes oberflächen aktives Mittel	Menge an zugesetz tem oberflächen aktivem Mittel (^ug/ml)	Menge an pro duzierter S'-Inosinsäure (mg/ml)
Nissan nonion E-208	500	19,5
	1000	18,9
Nissan nonion P-208	500	19,4
	1000	16,2
Nissan nonion HS-204,5	1000	19,7
	1500	18,6
Nissan nonion HS-206	1000	19,1
	1500	19,0
Nissan nonion NS-210	1000	21,3
	1500	20,0
Nissan Nonion NS-212	1000	17,6
	1500	19,8
kein Zusatz (Kontrolle) i		14,9

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Beispiel 9

Die Fermentation wird mit demselben Stamm, Ztichtungsmedium und Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach 3 Tage langem Züchten werden dem Züchtungsmedium verschiede· ne Konzentrationen verschiedener oberflächenaktiver Mittel der Alkyltrimethylammoniumhalogenid-, Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenid-, Alkylpyridiniumhalogenid- und Alkylbetain-Reihe zugesetzt. Die nach 7 Tage langer Züchtung in der Kulturflüesigkeit angereicherten Mengen an 5^f-Inosinsäure sind in Tabelle 9 verzeichnet.

Tabelle 9

zugesetztes oberflächen aktives Mittel	Menge an zugesetz- . tem oberflächen- ■ aktivem Mittel ; (yug/ml)	5'-Ino einsäure (mg/ml)
Cation AB (St earyltrimethvl- ammoniumchlorid)	I 250 500 750	17,8 22,1 19,6
Cation M₂-IOO	250	18,6
(Myrietyldimethyl- benzylauwBoniua- ohlorid)	500 750	23,4 20,1
CPC (Cetylpyridiniua- ohlorid)	250 500	20,4 22,8
	750	17,8
Anone BF (Alkylbttain)	750 1000	15,9 18,4
	1500	20,1
kein Zuiatz	-	13,8

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Beispiel 10

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr, 6872 wird als Einsaatstamm verwendet» Eine Einsaatkultur erhält man, indem man diesen Stamm 24 Stunden lang bei 30⁰C in einem wässrigen Nährmedium aus 3 % Glukose 1 fi Bouillom, 1 # Pepton und 0,25 # NaCl züchtet.

Die Fermentation wird nach der in Beispiel 3 beschriebenen Weise in folgendem Züchtungsmedium durchgeführt:

10 fi Glucose 1,0 Ji KH₂PO₄ 1,0 # K₂HPO₄ 1,0 # MgSO₄-7H₂O 10 mg/1 ZnSO₄·7H₂O 0,01 96 CaCl₂-2H₂O 0,001 # PeS0₄·7H₂O 20 mg/1 Ii-Cystin 15 mg/1 ß-Alanin 30 /Ug/1 Biotin 0,5 mg/1 Thiamin-HydroChlorid 0,2 $ Harnstoff

Einen Tag lang wird unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Sann werden 3 mg/ml Adenin und verschiedene Konzentrationen oberflächenaktiver Mittel, wie in Tabelle 10 angegeben, dem Zuohtungernedium zugesetzt und die Züohtung weitere 2 Tage durchgeführt« Die als Ergebnis dieses Verfahrens erhaltenen Mengen angereicherten Adenoein-5'-triphoeph»t*e sind in

Tabelle 10 verzeichnet.

009839/0169 bad original

Γ	zugesetzte· oberflächen aktives Mittel	Cabeilβ 10	AdenoBin-5'- triphosphat (mg/ml)	Beispiel 11
	Nymeen S-215		6,0
	Menge an zugesetz tem oberflächen aktivem Mittel (/ug/ml)	6,4
	250	6,8
Cation M₂-IOO	500	6,2
	1000	7,8
	250	7,2
CPC	500	6,8
	750	7,7
	250	6,9
kein Zusatz	500	5,6
750
-

Breribaoteriu* ammoniagenee ATCC Nr. 6872 wird als Einsaatstamm verwendet. Dieses Bacterium wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 30⁰C in einem Züchtungsmedium aus 3 i> Glukose, 0,5 % P ep ton, 0,1 % K₂HFO^ , 0,1 i» KH₂K)₄, 0,1 i> MgSO₊ -7H₂O, 0,01 + CaCl₂«7H₂0, 0,001 # FeS0₄«7H₂0, 0,001 f> ZnSO. ·7H₂O, 20 mg/1 L-Cystin, 15 mg/1 ß-Alanin, 50 mg/1 Katriumglutamat, 30/Ug/l Biotin, 0,5 ng/1 Thiaminhydroohlorid, 0,0002 + MnSO^·4Η₂0 und 0,2 f> Harnstoff gezüchtet.

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Diβ Fermentation wird in derselben Weise wie in Beispiel 3 beschrieben ausgeführt« Das hierfür verwendete Zuchtungsmedium hat folgende Zusammensetzung:

10,0 i» Glucose

0,4 ?6 Bouillon

1,4 + KH₂PO₄

1,4 + K₂HPO₄

1,4 # MgSO₄*7H₂O

0,01 i» CaCl₂·2H₂O

0,005 $ ZnSO₄-7H₂O

0,002 io PeSO₂-7H₂O

20 mg/1 I-Cystin

15 mg/1 ß-Alanin

30/Ug/1 Biotin

0,5 mg/1 Thiamia-HjdroChlorid

0,2 * Harnstoff

Nach 24 Stunden der Züchtung unter aeroben Bedingungen werden dem Züchtungsmedium verschiedene Konsentrationen oberflächenaktiver Mittel zugesetEt· Nach weiteren 48 Stunden wird eine Menge von 4 mg/ml Guanidin sugesetet· Sie nach weiteren 6 Stunden langer Züchtung (nach Zugabe des Guanidine) angereicherten Mengen 5'-Guanyl»äure sind in Tabelle angegeben·

BAD

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Tabelle	zugesetztes oberflächen aktives Mittel	ι	11	5'-Guanylsäure (mg/ml)
	Nymeen S-215			5,4
		Menge an zugesetz tem oberflächen aktive» Mittel (/ug/ml)	6,8
	1 Cation ϊ"₂-50 (Lauryldimethyl- benzylanMonium- chlorid)	250	6,2
	CPC	500	6,1 6,9
		1000	6,7
Cation BB (Lauryltrinethy1- aauaonium Chlorid)		250 500	6,0 7,4 6,4
kein Zusatz	750	6,2
250 500 750 j	7,1
250 ;	6,6
500	4,0
750
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E* soll betont worden, daß andere oberflächenaktive Mittel al· die hier la besonderen aufgeführten innerhalb d·· Anwendung«bertich·· dor vorliegenden Erfindung verwendet werden kennen, solange sie nicht für da· Wachetu» dos bo-•timton verwendeten Mikroorganlaaue, der das 5'-Purin-Auklootid produziert, sonädlioh sind. Unter oberfläohen-

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BAD OF.:C!KAL

aktiven Mitteln versteht man im allgemeinen synthetische organische Verbindungen, die Oberflächenaktivität aufweisen,, Diese schließen Netzmittel, Detergentien, Durchdringungsmittel (penetrante), Verteilungsmittel (spreader), Dispergiermittel, Schaummittel usw« ein. Alle diese Stoffe sollen in den Bereich des Begriffes "oberflächenaktive Mittel" der vorliegenden Patentanmeldung fallen.

Nach dieser Beschreibung der Erfindung ist es offensichtlich, daß sie auf vielfältige Weise abgewandelt werden kann· Diese Abänderungen werden nicht als Abweichung von Idee und Anwendungsbereich der Erfindung betrachtet. Alle solche Modifikationen sollen in den Bereich der folgenden Patentansprüche eingeschlossen sein·

- Patentansprüche -

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Claims

-27- ί 51783 S κ 70b Patentanspruches

1. Verfahren «ur Herstellung von 5*-iPurinnukleotiden, wobei ein Mikroorganismus, der imstande ist, 5'-Purinnukleotide zu produzieren, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium mindestens ein oberflächenaktives Mittel zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel dem Nährmedium zu Beginn der Züchtung zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel in einer Menge von 50 - 2000 /mg pro ml Nährlösung anwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel ein Polyoxyäthylensorbitfensäureester alt 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Alkylaminsalz mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein PοIyoxyäthylenalkylaain ait 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein PoIyoxyäthylenalkylather Mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen sein kann, wobei das Alkyltrimethylammoniumhalogenid 12 bis 18 Kohlenstoff atome, das Alkylbenzyldiaethylamaoniuahalogenid 12 bis 18 Kohlenstoff atome, das Alkylpyridini-

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umhalogenid 12 bis 18 Kohlenstoffatome und das Alkylbetain 12 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen.

5. Verfahren zur Herstellung von 5*-Purinnukleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, der imstande ist, 5^f-Purinnukleotide zu produzieren, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart mindestens eines oberflächenaktiven Mittels gezüchtet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel ein Polyoxyäthylensorbitfettsäureester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Alkylaminsalz mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Polyoxyäthylenalkylamin mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, ein Polyoxyäthylenalkyläther mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen ist, wobei das Alkyltrimethylammoniumhalogenid 12 bis 18, das Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenid 12 bis 18, das Alkylpyridiniumhalogenid 12 bis 18 und das Alkylbetain 12 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 25 - 37⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5 - 8,0 durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel in einer

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Menge von 50 - 2000 zug pro ml Nährlösung anwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Brevibacterium ammoniagenes oder Micrococcus glutamious verwendet werden.

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