DE1967074A1 - Verfahren zur herstellung von alpha-aminobenzylpenicillin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von alpha-aminobenzylpenicillinInfo
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Description
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Augueto-Viktorla-StraBo 86 n D, ιΟλ,μι/γ· ο DADTMCD Pienzenaueistfaße 2
^•trgiroilnP„aRuechke Dr. RUSCHKE & PARTNER p
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D^tkaa 196/0/4
Quadratur Berlin Quadratur München
TELEX: Τ837ββ TELEX: 522767
Kyowa Ha%ko Kogyo Co., Ltd. Tokyo / Japan
Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin '
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin
durch Umsetzung einer Penicillinverbindung mit einem Derivat der α-Aminopheny!essigsäure in Gegenwart eines
Enzyms, das durch Züchten eines Mikroorganismus in einem wässrigen
Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet worden ist.
a-Aminobenzylpenicillin stellt eine therapeutisch wertvolle
Substanz dar und man ist seit langem bestrebt, diese Substanz auf möglichst einfache und möglichst wirtschaftliche Weise herzustellen.
Es wurde nun gefunden, daß dieses Ziel erfindüngsgemäß dadurch
erreicht wird, daß man 6-Aminobenzylpenicillin auf enzymatischem
Wege herstellt, wobei man von einer Penicillinverbindung ausgeht
609884/1091
.und diese mit einem Derivat der α-Aminophenylessigsäure in
Gegenwart eines von bestimmten Mikroorganismen gebildeten Enzyms umsetzt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von oc-Aminobenzylpenicillin durch Umsetzung einer Penicillinverbindung
mit einem Derivat der α-Aminophenylessigsäure in Gegenwart eines Enzyms, das durch Züchten eines Mikroorganismus
in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gebildet worden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
als Penicillinverbindung Penicillin G, Penicillin V oder ein Natrium- oder Kaliumsalz davon und als Mikroorganismus Pseudomonas
sp, ATCC 21284, Kluyvera citrophila ATCC 21285, Streptomyces
phaeochromogenes ATCC 21289, Nocardia globerula ATCC 21292, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Arthrobacter simplex
ATCC 15799 oder Corynebacterium fascians ATCC 12975 verwendet werden. >
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es.möglich, ct-Aminobenzyl·
penicillin auf technisch einfache und wirksame Weise in großtechnischem Maßstabe unter Erzielung hoher Ausbeuten herzustellen.
Der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch'die nachfolgend angegebenen Reaktionen schematisch dargestellt werden.
609884/ 1031
BAD ORIGINAL
1367074
Wird Penicillin G als Substrat verwendet, dann verläuft die
Reaktion nach folgendem Reaktionsmechanismus:
AiTjüiophonylace tat
-CH0COOH +
EH,
E | ir |
b
/ \ |
\
G |
[■■■■ | |||
C - | C | ||
I | I | ||
C — | |||
II
- CÜOH
Penicillin G
-C
-c
I I
C -
'OIL
ο -. 00ΌΗ
II ■ "
Zur Züchtung der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismenstämme
kann sowohl ein künstliches als auch _e4rr natürliches
Nährmedium verwendet werden, vorausgesetzt jedoch, daß es die
für das Wachstum der Mikroorganismenstämme erforderlichen Nährstoffe
enthält. Die dafür erforderlichen Nährstoffe sind bekannt, Es handelt sich dabei in erster Linie um eine Kohlenstoffquelle,
609884/ 1 09 1
1957074
-A-
eine Stickstoffquelie,anorganische Verbindungen und übliche
Zusätze. Diese Materialien werden von den erfindungsjpmäß verwendeten Mikroorganismen in entsprechenden Mengen verbraucht.
Als KohJenstoffquelIe kommen beispielsweise Kohlehydrate, wie
Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, Sorbit oder dgl., in Frage. Man kann auch organische Säuren verwenden, wie z. Ii. Essigsäure, Milchsäure oder
dgl. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Form von
Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden. Bei Verwendung .von Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismen können Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine, Erdöl-
r
bestandteile, Kerosin, Leichtöle, Schweröle oder dergleichen$
in dem Nährmedium als einzige Kohlenstoffquelle oder als Hauptkohlenstoffquelle verwendet werden.
Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen in Frage. Erwähnt selen beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder
Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammonium-' sulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat', Ammoniumphosphat oder
dgl. Ferner kommen natürliche Substanzen in Frage, die Stickstoff enthalten, wie beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt,
609884/1091 BAD ORIGINAL
Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate,
Kasaminosäure, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt
oder dgl. Diese Substanzen können ebenfalls entweder
für sich allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden.
Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat
, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliümmonohydrogenphosphat,
Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat oder dgl.
Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise
durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Rühren
und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur
von beispielsweise ungefähr 20 bis 50 C und bei einem
pH-Wert von beispielsweise 5,0 bis 9,0. Das Züchten wird im
allgemeinen während einer Zeitspanne von etwa 1 bis 7 Tagen
durchgeführt.
Die Enzyme, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Reaktionen
erforderlich sind;, werden in den Mikroorganismenzellen
sowie in der Kulturbrühe selbst Synthetisierte. Das-Enzym kann
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,SAD
367074
-β-άβη
Ausgangsmaterialien entweder in Form der Kulturbrühe selbst, der Mikroorganismenzellen, der Kulturbrühe,, die nach
der Entfernung der Mikroorganismenzellen anfällt, oder in
Form einer Enzymlösung, die durch Reinigen dieser Substanzen nach bekamiLen Methoden erhalten worden ist, beispielsweise
durch Aussalzen mittels Ammoniumsulfat, durch eine Dialyse, durch Ausfällen durch Aceton oder Äthanol, durch Säulenchromatographie
oder dgl.j zugesetzt werden. Wenn Mikroorganismenzellen
eingesetzt werden, werden sie als solche, in Form von Subspensionen oder in Form getrockneter Zellen verwendet (das Trocknen kann unter Verwendung von Aceton durchgeführt
werden). Wird eine Kulturbrühe selbst verwendet, dann wird das Substrat-Penicillin der Kulturbrühe als solches zugesetzt.
Die Reaktion wird durchgeführt, nachdem der pH-Wert
auf beispielsweise 6-, 5 bis 7,0 eingestellt worden ist.
Wie vorstehend erwähnt, werden die Penicilline Penicillin G,
Penicillin V oder ihre Na- oder K-Salze als Substrat verwendet.
Im allgemeinen wird die Reaktion in einer Reaktionslösung
durchgeführt j die durch Zugabe der zwei Substrate sowie ent= =
sprechender Mengen der Enzymmaterialien zu einer Pufferlösung mit einem definierten pH-Wert hergestellt worden ist. AuBerdem
kann die Reaktion in einer Gämmgsf lü'sslgkeit, wie sie.
609884/ 1 0.9 1. BAD ORIGINAL
vorstehend erwähnt wurde, durchgeführt werden. Dieser Gärungsflüssigkeit werden die zwei Substrate zugesetzt. Die Reaktion
kann innerhalb eines breiten pH-BereJdies durchgeführt werden,
beispielsweise innerhalb eines pil-.üereiches von 3 bis 8, Ein
optimaler pH-Bereich zur Durchführung der erfindungsgemäßen
Reaktion liegt zwischen 5/5 und 7,5 und vorzugsweise zwischen
G,5 und 7,3.. Die Reaktion wird bei 25 bis 5O°C und vorzugsweise
bei einem Wert zwischen 35 und 38°G während einer Zeitspanne
von 1 bis 24 Stunden durchgeführt. '
Das nach Beendigung der Reaktion erhaltene a-Aininobenzylpenicillin
läßt sich in einfacher Weise nach üblichen Methoden abtrennen. In vorteilhafter Weise werden diese Verbindungen
■ ■" ' , ■·■-"·'■ ;t ■ ■■···:.'
in der Weise gewonnen, daß eine Überführungsextraktion oder eine Ausfällung mittels organischer Lösungsmittel mit einer
Ausfällung am isoelektrischen Punkt, einer lonenaustauscher-Harzbehandlung,
einer Säulenchromatögraphie oder dgl. kombiniert
wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie darauf
zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben/ beziehen
sich die Prozentnn^nbcn nut das Gewicht pro Liter Wasser.
60 98 8Ul1091
BAD
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- 8 Beispiel 1
Als Impfrnikroorganismus wird Kluyvera citrophila ATGC 21285
verwendet. Eine Platinöse des Impfmikroorganismus wird in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 20 ml Impfkul-Lur
enthält, die besteht aus 1 % Pepton, 1 % Fleischextrakt, 0,5 % Ilefeextrakt und 0,3 % Natriumchlorid. Die Kultivierung
wird unter aerobem Schütteln bei 30 C während einer Zeitspanne
von 24 Stunden durchgeführt. 2 ml der dabei erhaltenen Impfkulturbrühe werden in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft,
der 20 ml eines Fermentationsmediums der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung enthält:
0,5 % Pepton
0,5% Hefeextrakt -'
2,5 % Maisquellwasser
0,3 % Natriumchlorid
0,5 % Natrium-L-glutamat
0,2 % Ammoniumphenylacetat ; -
Der pH-Wert des Fermentationsmediums vor der Sterilisation beträgt
7,3. Der pH-Wert wird mit 5nNa0H eingestellt.
609884/1091 " ■
1367074
Nach 48-stündiger Kultivierung unter aerobem Schütteln bei
30 C werden die dabei erhaltenen Mikroorganismenzellen durch Zentrifugenabscheidung von der Fermentationsbrühe abgetrennt
und danach zweimal mit einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung
gewaschen'.· Anschließend werden die Zellen in einem 1/30 M
Phosphatpuffer mit einempH-Wert von 6,8 in einer Menge von
10 mg/mlj bezogen auf die getrockneten Zellen^suspendiert.
Es werden das Kaliumsalz von Penicillin G und a-Aminophenylacetatamid
in Mengen von 3 mg/ml bzw. 10 mg/ml zugegeben. Anschließend läßt man die Reaktionslösung 5 Stunden lang bei
37 C reagieren.
Die Menge an in der Reaktionslösung gebildetem a-Aminobenzylpenicillin
beträgt 2,52 mg/ml.
Als Impfmikroorganismen werden Streptomyces phäeochromogenes
ATCC 21289 und Nocardia globerula ATCC 21 292 verwendet.
Außerdem wird ein Fermentationsmedium der nachfolgend angegebenen
Zusammensetzung verwendet?
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3 % lösliche Stärke
2 % Sojabohnenpulver
0,2% Natriumchlorid
0,5% Hefeextrakt
0,5% Pepton
2 % Sojabohnenpulver
0,2% Natriumchlorid
0,5% Hefeextrakt
0,5% Pepton
Das Ferrrientationsmediurn hat vor der Sterilisierung einen pH-Wert
von 7,3. Die übrigen Kultivierungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1.
Nach 4-tägiger Kultivierung erhält man bei Verwendung von
Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289 2,5 mg/ml Penicillin
V und bei Verwendung von Nocardia globerula ATCC 21292 2,5 mg/~
ml Penicillin G5jeweils zusammen mit 10 mg/ml des der Fermentationsbrühe
zugesetzten a-Aminophenylacetatmethylesters.
-= Der pH-Wert der Fermentationsbrühe wird auf 6,8 eingestellt,
anschließend wird die Kultivierung fortgesetzt. Während der Kultivierung wird der pH-Wert der Fermentationsbrühe unter
Verwendung von Chlorwasserstoffsäure oder Natriumhydroxid
alle 30 Minuten auf 6,8 eingestellt. Die Menge des 6 Stunden
nach der Zugabe des Substrats zu Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289 in der Fermentationsflüssigkeit angereicherten a-Aminobenzylpenicillins
beträgt 1,27 mg/ml„ Bei Verwendung von
Nocardia globerula ATCC 21 292 erhält man 2,04 mg/ml
6 0 9 8 8 4/1091
- ιϊ - ■....■"■'
α-Aminobenzylpenicillin in der Fermentationsbrühe.
Beispiel 3
Als Impfmikroorganismus verwendet man Corynebacterium fascians
ATCC 12975. Das Impfkulturmedium enthält 1 % Pepton,
1 %Fleischextrakt, 0,5 % Hefeextrakt und 0,25 % Natriumchlorid. "■■■■■ "β
Eine Platinöse des Impfmikroorganismus wird in einen 250 ml
Erlenmeyer-Kolben überimpft der 20 ml des Impfmediums enthält, und die Kultivierung wird 24 Stunden lang unter aerobem Schütteln bei 30 C durchgeführt.
2 ml der dabei erhaltenen Impfkulturbrühe werden in einen 250
ml Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 20 ml eines Fermentations- *
mediums der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung enthält:
5 % n-Paraffin-Mischung (eine Mischung aus äquivalenten Mengen
von C,,-C 4~n-Paraffinen)
0,3 % Phenylacetat
2 % (NH4)2S04
0,15 % KU2PO4
0,05 % MgSO447H2O
0,001 % MnSO4-AH2O 6O9884nO91
0,01 % FeSO4.7H2O
0,5 % Hefeextrakt :
0,2 % Maisquellwasser
2 % CaCO3
0,5 % Hefeextrakt :
0,2 % Maisquellwasser
2 % CaCO3
Der pH-Wert des Fermentationsmediums vor der Sterilisierung
beträgt 7,3.
Nach 72-stündiger Kultivierung bei 30 C unter aerobem Schütteln der Kultur werden die Mikroorganismenzellen durch Zentrifugieren von der Fermentationsbrühe abgetrennt, zweimal mit einer
0,9%igen Natriumchloridlösung gewaschen und dann in einem 1/30
M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,9 in einer Menge 8 mgA
ml (bezogen auf die getrockneten Zellen) suspendiert. Danach werden 3 mg/ml des Käliümsalzes von Penicillin G und 10 mg/ml
a-Aminophenylacetatmethylester zu der Lösung zugegeben. Die
Lösung läßt man 5 Stunden lang bei 37 C reagieren.
Die Menge des danach in der Reaktionslösung erhaltenen a-Amiriobenzylpenicillins
beträgt 1,86 mg/ml.
Als Impfmikroorganismen werden Pseudomonas sp. ATCC 21284,
609884/ 1091
Arthrobacter simplex ATCC 15799 und Pseudomonas aeruginosa
ATCC 15246 verwendet. Die Irnpfkultur, die daraus resultierende
Hauptkultur, die Abtrennung der Mikroorganismen von der Fermentationsbrühe
und das Suspendieren derselben in einem Puffer
werden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt,
jedoch mit dem Unterschied, daß in der Hauptkultur das Fermentationsmedium
kein Ammoniumphenylacetat enthält.
Es werden das Kaliurnsalz von Penicillin G und Methyl-a-aminophenylacetat
in Mengen von 3 mg/ml bzw. 10 mg/ml zugegeben. Danach läßt man die Reaktionslösung 5 Stunden lang bei 37 C
reagieren. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle angegeben.
verwendeter Mikroorganismenstamm Menge des gebildeten cx-Ami-ATCC Nr.
_____»__^__ - - nobenzy lpenicil lins (mg/ml) (j
21284 · 1,56
15799 1,72
15246 1,63
Patentanspruchi
609884/ 1 091
Claims (1)
- PatentanspruchVerfahren.zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin durch Umsetzung einer Penicillinverbindung mit einem Derivat der a-Aminphenylessigsäure in Gegenwart eines Enzyms, das durch Züchten eines Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß als- Penicillinverbindung Penicillin G, Penicillin V oder ein Natrium-oder ein Kaliumsalz davon und als Mikroorganismus Pseudomonas sp. ATCC 21284, Kluyvera citrophiLa ATCC 21285, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Nocardiagloberula ATCC 21292, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Arthrobacter simplex ATCC 15799 oder W Corynebacterium fascians ATCC 12975 verwendet werden.609884/109 1
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