DE1945607A1

DE1945607A1 - Verfahren zur Herstellung von Penicillin-Derivaten

Info

Publication number: DE1945607A1
Application number: DE19691945607
Authority: DE
Inventors: Masanaru Misawa; Takashi Nara; Ryo Okachi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-09-18
Filing date: 1969-09-09
Publication date: 1970-08-13
Also published as: US3682777A; DE1966521B2; FR2018337A1; DE1967074B2; DE1967074A1; GB1288791A; DE1967074C3; DE1945607B2; DE1945607C3; DE1966521A1

Description

-9. Sep. 1969

Patentanwälte Dr.-lng. HANS RUSCHKE

DipJ.-lng. HEINZ AGULAR 8 München 80, Pienzenauefstr. 2

Sch/01 Σ 928

Kyowa Hafcko Kogyo Go,, Ltd., Tokio / Japan Verfahren our Heretellung von Penicillin-Derivaten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Heretellung von Penicillin-Derivaten. Insbesondere besieht eioh. die Erfindung auf ein Verfahren zur Heretellung von α-AminobeneylpenioÜLlin oder p-Aninobeneylpenioillin. Insbesondere befasst sick die Erfindung mit einem Verfahren but Herstellung von a-Aminobeneylpenioillin oder p-Aminobensy!penicillin duroh eine eneymatisohe Beaktion·

Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen, und awar a-AMinobeniylpenioillin und p-Aminobeneylpenioillln» sind Ver-

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_ßAD OBlGiNAl.

"" 2 ■»·

bindungen» die eich in der Medizin verwenden lassen.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von cc-Aminobenzylpenicillin und p-Aminobenzylpenicillin zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren lässt sich in einfacher und wirksamer Weise durchfuhren. Die Herstellung erfolgt durch eine enzymatisehe Reaktion, die gegebenenfalls in technischem Maßstäbe durchgeführt werden kann, wobei das jeweils gewünschte Produkt in hohen Ausbeuten erhalten wird.

Erfindungsgemäss wird u-Aminobenzylpenioillin durch Verwendung von Kulturbrühen bestimmter Mikroorganismen, davon abgetrennter Zellen oder enzymatischer Lösungen, die aus diesen Kulturbrüllen extrahiert werden, hergestellt, wobei 6~Aminopenicillansäure (nachstehend als 6AFA abgekürzt) oder ein Penicillin-Derivat und cc-Aminophenylace tat oder ein Derivat davon verwendet wird. In entsprechender Weise wird p-Amino-. benzylpenicillin aus 6APA oder einem Penioillin-Derivat und p-Aminophenylacetat. oder einem Derivat davon hergestellt.

Die Herstellung von a-Aminobenzylpenioillin und p-Aminobenzylpenicillin aus 6APA oder einem anderen Penicillin-Derivat und α- oder p-Aminpphenylaoetat wird erfindungsgemäss unter Verwendung von KulturbrUhexi, Zellen oder enzymatischen Lösungen, die von einem Mikroorganismus erhalten werden, der BU dem Öenus Pseudomonas, Arthrobaoter, Oorynebacterium, Brevibaoterium, Miorocoooue, Myoobaoterium, No oardia, Kluyvera, Bhodopseudomonas, Streptomyoes oder dergleichen gehört, durchgeführt. Spezifisiohe Bakterien, die zu den vorstehend erwähnten Genera gehören, aelohnen sich daduroh aus, dasd sie eine bemerkenswert starke enaymatische Aktivität zur Herstellung von a-Amlnobensylpenioiliin oder p-Aminobensylpenloillin aus 6APA (oder einem Penicillin) und a-Aminophenyl-

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BAD ORIGINAL

ace tat bzw. p-Aainoplienylace tat besitzen.

Me Wirkung der erfindungsgeaäseen Enzyme gekt aus folgenden Beaktionesenesata

1, Herstellung von a-AmlnobeiizylpeiilcilliB, falls 6APA als

Substrat verwendet wird:

H HS

m +

-o-o

ö - M

—COQH

a-iaiiiiopheiiylacetat

H₂O

6—Aoinopeniolllansäure (6APA)

CH t

- COSH-

O t

O - M -

C - COOH H

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Wird Penicillin G als Substrat verwendet, dann verläuft die Reaktion nach folgendem Beaktionemeehanisiimö s

H H S

- OOOH +

GH₂OOM

O -

a~Aminop3aenylaoe tat

OH₂COOH

0 H

OH₅ OOOH

Penioillin ß

OHOONH

H ι

-C-O

o:

-

OH,

- OOOH H

Pheny lace tat

. a-Aminobenzylpenioillin

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BAD ORJGiNAL

2. Herstellung van p-Aminobensylpenieillin, fälle 6APA als Substrat verwendet wird:

I₂OOOH + HH₂- H ι

H S OH*

- σ

- η

CH₃

σ - σοοΗ

p-Amiiiophenylacetat

G-AminopenloillaHBäure (6APA)

OHgCONH

HtT Jl *

-0-0

Q-S

A/

0 - OOOH H

p-Aminobenaylpeiiioillin

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Wird Penicillin G als Substrat verwendet, dann läuft die Reaktion nach folgendem Reaktionaraechanismus abi

HH,

H₂COOH +

	H	H	S	\	C	/
		V	j
		- σ	I	\
HoCONH	- C		- C	CH₃
2		»■	H	- COOH
	•	- H
	C

p-Aminophenylace tat Penicillin

/r-OH₂COOH + HH,

H₂COHH

H H

ι t

- Λ Λ

β· I^ ■■· ^j

ι ι

.C-H

CH,

σ - cooH

Phenylacetat p-Aminoljenzylpenicillin

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Andere bevorzugte M.ilsxoorgajQismen_s die ebenfalls erfindungßgemäss eingesetzt -werden können, sind Kohlemiaeserstoff-assimilierende Mikroorganismen _f zu den Genera Pseudomonas, Arthrobaeter, Gorynebacterium» Brevibacteriuäi_? Kioroößceus, Mycobacterium, Nocardia, Kluyvera, Bhodopseudom&B. Streptomyces oder dergleichen gehörend. Mutanteiistränane, welche die enzymatische Aktivität besitzen, die zur Bevirkozig des erfindungsgemässen Verfahrens erforderlich ist, können ebenfalls verwendet werden. Mutanten mit einer derartig starken enaymatischen Wirkung werden in der Weise erhalten, dass eine genetische Mutation durchgeführt wird, wobei man sich beispielsweise einer Behandlung mittels ultravioletter Strahlen, einer Bestrahlung mittels Röntgenstrahlen, chemischer Mutationsraittel oder dergleichen bedient.

Entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Hährmedium eignen sich zur Züchtung der erfindungsgemäss eingesetzten Stämme, sofern das jeweilige Medium die sum Wachstum der verwendeten Stämme wesentlichen Nährmittel enthält. Derartige Nährmittel sind bekannt. Es handelt sich beispielsweise um eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen oder dergleichen. Biese Materialien werden von der» eingesetzten Mikroorganismus in den entsprechenden Mengen verbraucht. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Saccharinmaterialien, wie z.B. Glukose, Fruktoee, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate» Melassen,. Sorbit oder dergleichen in Frage. Ausserdem kann man beispielsweise organische Säuren einsetzen, z.B. Essigsäure, Milchsäure oder dergleichen. Biese Substanzen können entweder einzeln oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden. Bei der Verwendung von Kohlenwasserstoff-assimilierenden Mikroorganismen können Kohlenwasserstoffe, beispielsweise n-faraffine, rohe Erdöl-

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bestandteile, Kerosin, leichtöl®, Schweröle oder dergleichen in dem Nährmedium als einsige Kohlenstoff quelle oder als Hauptkohlezüstoffquslle verwendet werden.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten anorganische oder organischer Salze oder Verbindungen in Präge, Erwähnt seien beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie- beispielsweise Ammoniumchlorid, Amnioniumeulfat, Ammoniumnitrat; Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat oder dergleichen. Ferner kommen natürliche Substanzen in Frage, die Stickstoff enthalten« wie beispielsweise Maiöflüsdigkeit, Hefeextrakt, !fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, Easamindsäure, lösliclie Fischbeetandteile, Reiskleieextrakt oder dergleichen. Diese Substanzen können ebenfalls entweder für sich allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden*

Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Batriumphosphat* Kaliumdihydrogenphosphat, Ealiummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat oder dergleichen.

Bas Züchten wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch RUhren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer temperatur von beispielsweise ungefähr 20 - 50^eC sowie bei einem pH von beispielsweise 5,0 - 9,0« Das 2üchten wird im allgemeinen während einer Zeitspanne von etwa 1-7 Sagen durchgeführt. Die Enzyme, die zur Durchführung der erfindungsgemässen Reaktionen erforderlich sind, werden in den Mikroorganismenzelle» sowie in der Kulturbrühe selbst synthetisiert.

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„ O ~„

Das Enzym kann den Ausgangsmaterialien entweder in Form der Kulturbrühe selbst» der Mikroorganismensellen» der Kulturbrühe, die nach der. Entfernung der Mikroorganismenzellen anfällt, oder In Form einer Enzymlösung, die durch Reinigen dieser Substanzen nach bekannten Methoden erhalten worden ist, beispielsweise durch Aussalzen mittels Ammoniumsulfat, durch eine Dialyse, durch Ausfällen durch Azeton oder Äthanol, durch Säulenchromatographie oder dergleichen, zugesetzt werden. Palls Mikroorganismenzellen eingesetzt werden, werden sie ale solche» in Form von Suspensionen oder in Form getrockneter Zellen verwendet (das Trocknen kann unter Verwendung von Azeton durchgeführt werden). Wird eine Kulturbrühe selbst verwendet, dann wird das Substrat Penicillin der KuI tür brühe als solches zugesetzt. Die Reaktion wird durchgeführt, nachdem der pH-Wert auf beispielsweise 6,5 - 7»O eingestellt worden ist.

Wie vorstehend erwähnt» werden 6APA oder Penicilline, wie beispielsweise Penicillin (J, Penicillin. V oder dergleichen, als Substrat verwendet. Biese Verbindungen werden gewöhnlich in form ihrer Kalium- oder Katriuaealse eingesetzt· Als andere Sutoe trataußgangematerialien werden die Kalium- oder Natriumaalae von a-Aminophenylacetat bzw. p-Aminophenylaoetat verwendet. Derivate dieser Verbindungen, wie beispielsweise das Amid, der Methylepter, der Äthylester, der Thioglykol- Bäureeeter oder das Hydrochlorid, können ebenfalls verwendet werden.

Im allgemeinen wird die Reaktion in einer Reaktionslösung durchgeführt» die durch Zugabe der zwei Substrate sowie entsprechender Mengen der Bnzymmaterlalien zu einer Pufferlösung mit einem definierten pH-Wert hergestellt worden ist, Auseerdem

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die Reaktion in einer Gämngsflüssigkeit, wie sie vorste-=· head ermähnt wurde, durchgeführt werden. Dieser GärungsflÜssigkeit werden die zviel Substrate, zugesetzt« Die Reaktion kann . innerhalb eines breiten pH-Bereiches durchgeführt werden, beispielsweise innerhalb eines pH-Bereiches von 3 ·>* 8. Bin optimaler pH-Bereich zur Durchführung der erfindungsgemaösön Reaktion liegt zwischen 5,5 und 7,5 und vorzugsweise zwischen 6,5 und 7₉3 * Die Reaktion wird bei 25 - 5Ö°C und vorzugsweise bei einem Wert Zwischen 35 und 33⁰C während einer Zeitspanne von 1 - 24 Stunden durchgeführt.

Das nach Beendigung der Reaktion erhaltene cc-Arainobenzy!penicillin öder p-Aminobenjsylpenieillin lässt sich in einfacher Weise nach üblichen Methoden abtrennen. Zn vorteilhafter Weise werden diese Verbindungen in der Weise gewonnen, dass eine Überführungeextraktion oder eine Ausfällung mittels organischer Xiösungsmittel mit einer Ausfällung am isoelektrisohen Punkt, einer Zonenaustauscher-Harasbehandlung, einer Saulenohromatographie oder dergleichen kombiniert wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie au beschränken. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Proeentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Als Impf mikroorganismus wird Pseudomonas sp. AXGO 21264 verwendet. Bine Platinsohleife des Impf mikroorganismus wird auf einen 250 ml-Erlenmeyer-Xolben aufgeimpft, der 20 ml einer Impfkultür enthält. Diese Impfkultur.besteht aus 1 £ Pepton, 1 $ RLeisohextrakt, 0,5 # Hefeextrakt und 0,3 f> Natriumchlorid. Da@ Mohten wird unter aerobem Schütteln bei 30⁰O während einer

24 'Stunden durohgeführt. Zwei ml der erhaltenen

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Impfkulturbrühe werden auf einen 250 ral-Erlenmeyer-Kolben ■ auf geimpft, der 20 ml eines GSrungsmediums enthält» Dieses Crärungsmedium besitzt folgende Zusammensetzung:

0,5 # Pepton

0,5 $» Hefeextrakt

2,5 i> Maieflüssigkeit,

0,3 f> Natriumchlorid

0,5 Ji Hatrium-Ir-glutamat

Der pH des Mediums vor der Sterilisation beträgt 7,3. Der pH wird unter Verwendung von 5 n-NAOH eingestellt.

Nach, der Durchführung des Zttohtens während, einer Zeitspanne von 48 Stunden unter aerobem Schütteln bei 30⁰G werden die erhaltenen Mikroorganismenzellen von der GärungBbrühe ab« geschleudert, worauf ein zweimaliges Waschen mit einer 0,9 #igen Hatriumohloridlösung erfolgt» Anschliessend werden die Zellen in einem 1/30 molaren Phosphatpuff er mit einem pH von 6,8 in einer Menge von 10 mg/ml, bezogen auf die getrockneten Zellen, suspendiert. 6-Aminopenicillansäure und Kialium-a-^aminophenylacetat werden zur Erzeugung von Mengen von 1,5 mg/ml <zw. 10 mg/ml zugesetzt. Anschließsend wird die Reaktionslösung während einer Zeitspanne von 40 Stunden bei 57°C reagieren gelassen.

Die Menge an cc-Aminobenzylpenicillin, die in der Heaktionelöaung erzeugt wird, beträgt 1,53 mg/ml.

Beispiel 2

Huyvera citrophila AfCG 21285 wird als Impfmikroorganiemus verwendet. Die ZttohtungsbeflAngungen eind die gleichen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass 0,2 ^ Ammoniumphenyl-

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ace tat dem Hauptgärungßraedium zugesetzt werden. Die Mikroorganismenzellen, die naoh 48-stündiger Züchtung erhalten werden, werden in der gleichen Weise wie in Beispiel ΐ umgesetzt, mit der Ausnahme, dass weitere 0,6 mg/ml 6-Amlnopenicillansäure der Reakt ions lösung 3 Stunden naoh Beginn der Reaktion zugesetzt werden. Die Reaktion wird nach Zugabe der 6APA während einer Zeitspanne von 1 Stunde fortgesetzt. Die Menge des in der erhaltenen Reaktionslösung erzeugten cc-Amis©benzylpenicillin beträgt 2,38 mg/ml.

Beispiel 3

Es wird der gleiche Impfmikroorganismus wie in Beispiel 2 verwendet. Ausserdem werden die dort beschriebenen ZÜchtungsbedingungen eingehalten. Allerdings werden 3 mg/ml des Kaliumsalzes von Penicillin G der Beaktionslösung gemäes Beispiel 1 anstelle von 6-Aminopenicillansäure zugesetzt, ferner werden 10 mg/ml a-Aminophenylaoetatamid der Beaktionslösung anstelle von Kalium~a-aminophenylacetat zugegeben^ Im übrigen sind die Reaktionsbedingungen. die gleichen wie in Beispiel 1. Naoh 5-stQndiger Reaktion beträgt die Menge des in der Reaktionslösung erzeugten α-Aminobenzy!penicillins 2,52 mg/ml.

Beispiel 4

Rhodopseudomonas shperoides ASCO 21286 und Miorococcus ureae ATCO 21288 werden als Impf mikroorganismen verwendet. Die Züohtungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1. Naoh 48-stündigem Züchten werden 6-Aminopenioillaneäure und a-Aminophenylaoetatäthylester der Gärungsbrühe selbst in Mengen von 1i5 mg/s£L bzw.. 10 mg/ml zugesetzt, ohne dass dabei die Mikroorganismensellen abgetrennt werden. Der pH der Gärungsflüesigkeit wird auf 7»1 eingestellt« Dann wird das Züchten fortgesetzt.

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Während des Züchten? wird der pH der Gärungsflüösigkeit unter Verwendung von Chlorwasserstoff säure oder Ifatriumhydroxyd, und zwar je nach Erfordernis, alle 30 Minuten auf 7t 1 eingestellt. Die Menge des aioh in der erhaltenen GSrungsflussigkeit anreichernden a-Aininobenaylpenicillins beträgt nach 5-sttindiger Reaktion mit den Substraten 1,20 mg/ml im falle von ßhqdopseudomonas spheroides und 1,08 mg/idl im !Falle von Miorococoufl ureae.

Beispiel 5

Streptomyaes phaeoohromogenes ASOC 21289 und Nöoardia glo- berula ATOO 21292 werden als Impfetäane verwendet. Ss wird . ein OSrungsmedlua eingesetzt, das folgende Zusammensetzung besitzt:

JMb Mtdium beeitit vor der Sterllieierung einen pH von 7,3. Die anderen ZOohtungebedlngungen sind die gleichen wie in Beispiel 1.

4-tigigee EUohten werden 25 «g/ml Peniolllin V im 7alle von Strepto^foes phaeoohroaogenes und 25 ug/al Penicillin S im Tall· von looardia globerula susastten alt 10 mg/ml a-A»inophenylaoetatB»thyleiter der OärungsfUtseigkeit atuge-••tit. Der pH der Oärungsflüesigkeit wird auf 6,8 einge stellt, worauf das Züchten fortgesetzt wird. Wahrend des Züohtens wird der pH der OärungsflUflsiglctit unter Verwendung von Ohlorwasserstoffsttur· oder Hatriuohydroxyd Alle 30 Minuten

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auf 6,8 eingestellt. Me Menge des in der ßärungBflüssigkeit angereicherten a~Aminobenaylpenicillins beträgt 6 Stunden nach der Zugabe des Substrats au Streptomyoes phaeochromogenes 1,27 mg/ml. Im Falle von Nooarida globerula werden 2,04 mg/ml a~Aminobensylpenioillin in der eärungsflttseigkeit angereichert·

Beispiel 6 ·

Pseudomonss aeniginosa. ATCO 15246 wird als Irapftaikroorganiemus verwendet. Das Impf kulturmedium enthält 1 $> Pepton, 1 f Fleischextrakt, 0,5 # Hefeextrakt und 0,25 f> HatriumehlQrid. Sine Platinsohleife des Impfmikroorganismue wird auf einen 250 ml-Erlenmeyer-Eolt»en auXgeii^ft, der 20 ml des Impfmediume enthält· Das ZÜohten wird unter aerobem Schütteln bei 30°0 während einer Zeitspanne von 24 Stunden durchgeführt. 2 mi der erhaltenen Impflculturflüeaiglcei-fc werden auf «Ines 250 ml-Erlenmeyer-Kolben aufgeimpft, der 20 al eines Qirungemtdiuma enthält, das folgende ZusammensetBung aufweist: ·

5 $ n-Paraffinmiechuag (eine Mieohung aus äqulTalenten

Mengen an O₁ ^O^-n-Paraffinen)

0,5 i» Phenylaoetat

0,15 Ji KH₂PO₄

0,05 i

0,001

0,01 $ yeS0₄.7H₂0

0,5 £ Hefeextrakt

0,2 * Maiaflüflaigkeit

2 i

Der pH des Mediums beträgt yor der Sterilisierung 7t 3,

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nachdem das Züchten während einer Zeitspanne von 72 Stunden bei 3O°C unter aerobem Schütteln der Kultur durchgeführt worden ist» werden die Mücroorganismenzellen von der Öärungsflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt, zweimal mit einer 0,9 $igen Hatriumohloridlusung gewaschen und anschliessend in einem 1/30 molaren Hiosphatpuffer mit einem pH von 6,9 in einer Menge von 8 mg/ml (beisogen auf die trockenen Zellen) suspendiert. Anschliessend werden 25 mg/ml 6-Aminopenicillansäure und 10 mg/ml a-Aminophenyläoetatmethylester der Lösung zugesetzt. Sie Reaktion wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 5 Stunden fortschreiten gelassen-. Sie Menge des in der erhaltenen Reaktionslösung erzeugten a-AminobenBylpenicillins beträgt 3₍O5 mg/ml. <

Beispiel 7

Brevibaoterlum cerinus ASCC 15112 wird als Impf mikroorganismus verwendet. Sie ZUchtungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 6. Ser Reaktionslösung werden 10 mg/ml p-Aminophenylaoetatmid anstelle des a-Aminophenylacetatmethylesters zugesetzt. Sie anderen Beaktionsbedingungen sind jedoch die gleichen wie in Beispiel 6. Nach 4-BtUndiger Reaktion beträgt die Menge des in der Reaktionslösung erzeugten p-Aminobenzy!penicillins 3,82 mg/m. ~

Beispiel 8

Arthrobacter Simplex ATOO 15799 wird als Impfmikroorganlsmus verwendet. Es wird das gleiche Gärungsmedium wie in Beispiel 6 eingesetzt, mit der Ausnahme, dass 7 i» Kerosin anstelle der n-Saraffinmischung eingesetzt werden. Ausserdem wird das Phenylacetat weggelassen. Die anderen Zttohtungsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 6. Nach 72-stUndigem Züchten

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r ·

werden jedoch 2 mg/ml 6»Arainopenieillanaäure und 10 mg/ml α-Aaiasophenylaeetataiaid der Gärungsflüsßigkeit selbst ohne Abtrennung der Zellen zugesetzt« Der pH der Öärungsfltissiglceit wird auf 6,5 eingestellt» vorauf das. Züchten fortgesetzt wird» Während des ZUchtens wird der pH der Gfärungsflüeeigkeit imtea? Verwendung von Chlorwasserstoff säure oder iiatriumhydroxyd alle 50 Minuten eingestellt. Seche Stunden nach Zugabe der Substrate haben sich 2,75 mg/ml ct-Aminobenzylpenicillin in der öänmgeflüseigkeit angereichert.

Coryseb&eieritun faeoians ASCC 12975 wird als Impf stamm verwendet* Me Ztichtungsbedinguiigen sind die gleichen wie in Beispiel 6* Eine Beaktionsl8sung wird durch Zugabe von 3 mg/ml Penicillin C! (iJallumsalz) anstelle der 6~AminopQnio±llansäure ssu der Heaktlonslb'sung gemäss Beispiel 1 hergestellt. Dl© anderen Eeaktionsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 6, Nachdem die Reaktion 5 Stunden fortgeschritten ist, werden 1,86 mg/ml a-Aminohenzy!penicillin in der Reaktionslöeung gefunden.

Beispiel^iO

IJrei verschiedene Stamm _t und zwar Mlcrococcus ureae AXCC 21283» Xfycobacteriuraamegiaatis ASCC 21293 und Nöoardla glo~ bernla ATGG 21022 werden als Impf mikroorganismen verwendet* "Das verwendete Hauptgörungsmeaium entspricht dem gemjäss Beispiel 6 eingesetzten Medium, wobei jedoch das Phenylaoetat weggelassen ist, DiB anderen Zttohtusgebedlngungen sind die gleichen wie in Beispiel 6· fiaoh 72-a titndigam Zuchten werden jedoch das Kaliums&lz von Penioillin Q sowie p~&alnophenylaoetotäthyleüter der eärungsflüsslgkelt selbst Ic Mengen von. 4 mg/ml bzw. 15 lag/ffll zugesetst, ohse dass dabei, die Hikro-

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ρ ·, ■ 8AD ORIGINAL

organismensellen von der Flüssigkeit abgetrennt werden. Der pH der Garungsflüssigkeit wird auf 5»8 eingestellt» worauf das Züchten fortgesetzt wird. Während des Züehtens wird äex pH der Gärungefl flüsigkeit unter Verwendung von Chlorwasserstoffsäure oder Uatriumhydroxyd auf 5,8 eingestellt. lter pH vrird, nachdem das Züchten während einer Zeitspanne von 3 Stunden nach Zugabe der Substrate fortgesetzt worden ist, auf 7,2 eingestellt. Dann wird das Züchten fortgesetzt, wobei der pH alle 30 Hinuten auf 7*2 eingestellt wird. Sie Mengen an p-Aminobensylpenioillin, welche sich in der erhaltenen Heafctionslösung angereichert haben, sind in der Tabelle I zusammengefasst:

!Tabelle I

Menge an erzeugtem

p-Aminobengylpeni-

Mikroorganlsmenstämme clllin (mg/ml)

Microcoocus ureae Hycobacterium smegmatia Nooardia globerula

ATGO	21288	2	,57
AIOC	21293	3	,09
AO)CO	21022	2	»75

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Claims

- 18 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von cc-Aminobengylpenieillin oder p-AmiMobensiylpenioillin, dadurch gekennzeichnet, dass 6-Aminöpeniöillansäure oder ein Penicillin mit a-Aminobenssylaoetat im Balle des a-Aminohenaylpenicillins oder p-Aminobensylacetat im falle des p-Aminobenaylpenicillins in Gegenwart eines Enzym» zur Umsetzung gebracht wird, das durch Züchten eines Mikroorganismus erhalten wird, der au einem Genue gehört, welcher aus Bseudomonas, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Mieroeoccus, Myoobaeterium, No cardia, Eluyvera, Bhodopaeudomonas und Streptomyces ausgewählt wird, wobei das Züchten unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Hährmedium durchgeführt wird und das a-Aminobenzylpenicillin oder das p-Aminobenzylpenicillin von der erhaltenen Reaktionslösung abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennaeiohnet, dass der verwendete Mikroorganismus Kohlenwasserstoff-assimilierend ist und das verwendete Nährmedium wenigstens einen Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquelle enthält.

3· Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einem pH von ungefähr 3-8 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3_t dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer Temperatur von ungefähr 25 - 50⁰C durchgeführt wird.

5. Verfahre» nach Anspruch 1« dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einem pH von 5$$ ~ 7»5 durchgeführt wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer ^temperatur von 35 - 38 °C durchgeführt wird₀

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

der verwendete Penieillinreaktant aus Penicillin Gr, Penicillin V oder den natrium- oder Kaliumsalzen davon besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der a-Aminobenaylaeetatreaktant aus dem Amid, dem Methylester, dem Äthyleeter, dem l'hloglykolsäureester, dem Hydroehlorid, dem Kaliumsals oder dem Natriumsalz davon besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 1y dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete p-Aminobenzylacetatreaktant aus dem Amid, dem Methylester, dem Äthyl eater, dem üDhioglykolöäureester, dem Hydroohlorid, dem Kaliumsais oder dem Natriumsalz dieser Verbindung besteht.

10. Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin oder p-Aminobenzylpenicillin, dadurch gekennzeichnet, dass 6-Aminopenicillansäure oder ein Penicillin mit a-Aminobenissylaeetat im Falle des a-Arainobeneylpenioillins oder p-Aminobenzylaoetat im Falle des p-Aminobenzylp^Moillins bei einer Temperatur von ungefähr 25 - 5O°C sowie bei einem pH von ungefähr 3 - 8 in Gegenwart eines Enzyms zur Umsetzung gebracht wird, das durch ZUohten eines Mikroorganismus erhalten wird, der zu einem Genus gehört, welcher aus Pseudomonas, Arthrobacter, Gorynebacterlutt, Brevibaoterium, Microcoocub, Mycobaoterium, Hocardia, Uuyvera, Hhodopsetidomonas und Streptomyoes ausgewählt wird, wobei das Zttchten unter aeroben Bedingungen in einen wässrigen Jtäbxmedium bei einer Temperatur von ungefähr 20 - 50°0 and bei einem pH von ungefähr 5»0 - 9,0 durchgeführt wird, und das a-AminobenBylpenicillln oder das p-Aminobeneylpenicillin aus der erhaltenen Reaktionslöeung abgetrennt wird.

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11. Verfahren nach Anspruch 2* dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Kohlenwaeseratoff-aBBimiliG-rend lot, während das eingesetzte HMhrmediumwenigetens einen Kohlenwasserstoff ale Kohlenstoffquelle enthält.

12. Verfahren naoh Anapruoh 10, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Paeudoraonae ep* AIOÖ 21284 beeteht.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekenneeiohnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus ELuyvera oltrophila A(DOC 21285 besteht.

14« Verfahren nach Anepruoh 10, dadurch gekennzeichnet, daea der verwendete MikroorganiemuB aus Rhodopseudoioonee epheroidee ATOO 21286 besteht.

15. Verfahren naoh Anapruch 10, dadurch gekennieionnet, daea der verwendete MikroorganiBmue aus Microcooouß uxeae AfOO 21288 !»steht.

16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekenneeichnet, dass der verwendete Mikroorganierauß aus Streptosgroei phaeochromogenee A3Ö0 21289 hesteht.

17. Verfahren nach Anapruch 10» dadurch gekenneeiohnet, dass der verwendete Mikroorganiamuß aus Hooardia gloljerula ATOO 21292 besteht*

18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenneeiohnet, dass dir verwendete Mlkroorganieaua aus Peeudoaonaa aeruginoea ASSKi 15246 besteht.

19. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenneeiohnet. dass

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der verwendete Mikroorganismus aus Brevibaeterium oerinue ATOO 15112 bestellt.

20» Verfahren naoh Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Arthrobaeter simplex AfCO 15799 besteht.

21. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Corynebacterium fasoians AOXJC 12975 besteht.

22. Verfahren nach Anspruch 11, daduroh gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Rycobaoterium smegmatis ASOC 21293 besteht.

23. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet» dass der verwendete Mikroorganismus aus Nbcardia globerula AXCC 21022 besteht.

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