DE3212380C2 - Verfahren zur fermentativen Gewinnung von Purinen - Google Patents

Verfahren zur fermentativen Gewinnung von Purinen

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DE3212380C2 DE19823212380 DE3212380A DE3212380C2 DE 3212380 C2 DE3212380 C2 DE 3212380C2 DE 19823212380 DE19823212380 DE 19823212380 DE 3212380 A DE3212380 A DE 3212380A DE 3212380 C2 DE3212380 C2 DE 3212380C2
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Gewinnung von Purinen mittels Mutanten der Mikroorganismen Streptomyces coelicolor A3 (2), deponiert am 1.4.1982 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung m.b.H., Griesebachstraße 8, 4300 Göttingen, unter der Nr. DSM 2336 und DSM 2348, welche bisher noch nicht als Erzeuger von derartigen Verbindungen bekannt waren. Die oben erwähnten Mutanten Streptomyces coelicolor A3 (2) wurden submers kultiviert und schieden in das Substrat Xanthin, Hypoxanthin, Adenin und Harnsäure aus. Xanthin, Hypoxanthin und Adenin sind Purinbasen, die beim biosynthetischen Weg von Purinnukleotiden anfallen, welche ihrerseits Derivate für Nukleinsäuren sind, während die Purinharnsäure beim weiteren Metabolismus von Xanthin durch das Enzym Xanthin-Oxydase auftritt.

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch ausgegebene Verfahren. Dieses Verfahren arbeitet mittels Mutanten der Mikroorganismen Streptomyces coelicolor A3(2), deponiert am 1.4.1982 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung m.b.H., Grisebachstraße 8, 4300 Göttingen, für die guaninabhängige Mutante unter der NR. DSM 2348, für die adeninabhängige Mutante am gleichen Tag an der gleichen Hinterlegungsstelle unter der Nr. DSM 2336, welche bisher noch nicht als Erzeuger von derartigen Verbindungen bekannt waren. Diese beiden Stämme jo werden submers kultiviert und scheiden in das Substrat Xanthin, Hypoxanthin, Adenin und Harnsäure aus. Xanthin, Hypocanthin und Adenin sind Purinbasen, die beim biosynthetischen Weg von Purinnukleotiden anfallen, welche ihrerseits Derivate für Nukleinsäuren sind, während die Purinharnsäure beim weiteren Metabolismus von Xanthin durch das Enzym Xanthin-Oxydase auftritt.
Ihre gemeinsame Verwendung auf dem Gebiet der Medizin ist vielseitig. Man kann generell sagen, daß die angeführten Purine sowie deren Derivate zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen des Herzens, der Blutgefäße, von Thrombosen, als wichtiger Faktor der Erythrozyten-Erhaltung bei der Blutkonservierung, ferner bei der Behandlung von gewissen Lebererkrankungen, der hereditären Distrophie sowie von zahlreichen anderen Krankheiten dienen. Die Applikation sowie die Art der Gewinnung einiger der erwähnten Purine ist im folgenden dargestellt.
Es ist bekannt, daß Xanthin und seine Derivate bei der Tonussenkung der Koronarblutgefäße wirksam sind (Bunzhaburr, Nuki, Soko Ikagu 14, 1957, 1056) und daß sie die Vorkammern des Herzens durch geringes stimulatives Wirken zusammenziehen und zum Stillstand bringen (Michio.T., Nippon Yakarigaku Zasshi 55, 1959,430).
Aus den Untersuchungen über die Herzreizbarkeit des Frosches während der Verabreichung von Xanthin und seinen Derivaten (Marchett, G.. Nava, S., Arch. Sei. Farmacol., 10, 1060, 208) sowie von Hypoxanthin wi (Chapman, R. Α., Hiller, D. ]., J. Physiol., 242, 1974, 615) geht hervor, daß bei kleinen Dosen die Reizbarkeit des Myokards verringert, bei großen Dosen dagegen gesteigert wird. Xanthin spielt bei der Behandlung von Patienten mit koronarpathologischen Zuständen eine f> bedeutende Rolle (Perrotla, P., Minerva Med. 54, 1962, 1165).
Eine der Verwendungen von Xanthin sowie von Adenin, Hypoxanthin und Harnsäure (neben den bereits bekannten Antioxydanten at-Tokoferol, Butylhydroxyanisol u. a.) beruht auf seiner antioxydativen Wirkung auf ungesättigte Fettsäuren (wie z. B. das Verhindern der Oxidation der Linolensäure an der Luft) (Setsuro, M, Fumio, L Alkiji, A, Arch. Bioch. Biophys. 102, 1963, 446). Es wurde festgestellt, daß durch die Zugabe von Xanthin in die Infusionslösung das posttransfusionale Überleben der Erythrozyten erhöht und die Nukleosidtriphosphatregenerierung beim Schutz von Erythrozyten verbessert wurden (Popovic, D, Med. Pregl. 27, 1974, 439). Xanthinderivate und deren Salze wurden in Kombination mit Corticosteroiden lokal zur Behandlung von Ekzemen, Insektenstichen, Sonnenbrand usw. verwendet In solchen Fällen wird durch Xanthin die Wirkung der Corticosteroide um das zwei- bis dreifache erhöht (DE-OS 26 52 867). Durch orale Einnahme der Xanthinderivate werden' gastrointestinale Störungen beseitigt (US-PS 41 89 469).
Eine der Verwendungen des Xanthins zu medizinischen Zwecken beruht auf seiner Fähigkeit, die Beweglichkeit der polymorphonuklearen Leukozyten in vitro ebenso wirksam wie Harnsäure und Theobromin zu stimulieren (Zse, R. L, Phelps, P, Urban, D, J. Lab. Clin. Med. 80,1972,264). Unter anderem hat sich, neben Hypoxanthin und Harnsäure, ein Zusatz von Xanthin zur Verbesserung der Hundenahrung als sehr nützlich erwiesen (FR-OS 20 04 476).
Verschiedene organisch-chemische Synthesen, deren Verfahren auch patentiert sind, können als die ersten Methoden zur Herstellung von Xanthin und seinen Derivaten erwähnt werden (US-PS 25 17 410, DE-PS 8 64 869, DE-PS 8 64 870).
Es werden mehrere Verfahren zur Herstellung von Xanthin aus Hypoxanthin und Harnsäure durch das aus Milch isolierte Enzym Xanthin-Oxydase beschrieben (J. Bact. 63, 1952, 163; Biochem. J. 51, 1952, 557). Da gefunden wurde, daß das Exkret der Galleria mellonella-Larven größerere Mengen gewisser Purine, darunter auch Xanthin, enthält, wurde es auch zu dessen Gewinnung verwendet (J. Insect. Physiol. 9,1963,195).
Die bekannten Verfahren zur Herstellung von Xanthin sind wegen geringer Xanthinausbeuten und großer Mengen von Ausgangsrohstoff unwirtschaftlich. Die Verfahren zur Herstellung von Xanthin durch Fermentierung mittels verschiedener Mikroorganismen haben sich gegenüber den erwähnten Verfahren als überlegen erwiesen. Arima und seine Mitarbeiter (Arima, K., Fukami, T., Fujuwara, M., Nippon Nogei Kogaku Kaishi, 37,453,1963) haben bei der Prüfung von 447 verschiedenen Mikroorganismen feststellen können, daß gewisse Hefearten und einige der 38 untersuchten Streptomycetes-Stämme in das Substrat zwischen 100 und 150 μΐ/ml Hypoxanthin, lnosin, Adenin und Xanthin ausscheiden.
Durch Züchten des Mikroorganismus Aerobacter aerogenes auf komplexen Substraten können nach 96stündigem Züchten und Reinigung der Fermentationsbrühe über Kolonnen 1,9 mg/ml Xanthin erhalten werden (JP-PS 3 830/67). Der Mikroorganismus Arthrobacter ureofaciens lieferte bei der Fermentation im Substrat 0,53 mg/ml Xanthin, während durch Escherichia coli ATCC 1798 und Brevibacterium ammoniagenes Xanthin in Spuren erhalten wurde (FR-PS 14 67 667). Außerdem wurde festgestellt, daß durch auxotrope Mutanten von Neurospora crassa unter Zusatz von Adenin Xanthin und Harnsäure in das Substrat ausgeschieden wurden (Hanks, R. S., Mogile, A.
R, Mol. Gen. Genau 173,1979,31).
Hypoxanthin dient in der Medizin als Standardsubstanz beim Diagnostizieren einiger Erkrankungen. So wird z. B. bei Lebererkrankungen der Hypoxanthin-, Adenin-, Xanthin- und Harnsäurespiegel im Harn stark erhöht (Heixwegh, K. P„ Ramber, Q, De Groote, J. Amer. Med. 42, 1967, 913). Der durch bestimmte Stoffwechselstörungen verursachten Fettleber kann man durch eine Therapie mit Adenin und Hypoxanthin vorbeugen (lipotroper Effekt) (Kiyoshi, F, Kazuhiki, O, Tadao, T„ Asian Med. J. 15 (8), 1972, 535). Bei mongoloiden Patienten sind Hypoxaathin-, Xanthin- und Harnsäurespiegel im Plasma wesentlich erhöht (Appleton, M. D, Haab, V, Amer. J. Ment Defic, 74 (2), 1969,196).
Die Herstellung von Hypoxanthin und seinen Derivaten begann mit organisch-chemischen Synthesen, ausgehend von 5-Amino-4-carbamoylimidazol oder seinen substituierten Derivaten und Alkylalkanoaten oder -carbonaten in Anwesenheit von Na-AIkoxyd (GB-PS 10 75 008). Ferner wurde die Herstellung von Hypoxanthin durch Umsetzung von Acetoamidocyanoacetat mit Formamidin beschrieben (JP-PS 17 756/ 67). Einen der teuren Wege zur Gewinnung von Hypoxanthin neben Xanthin und Harnsäure stellt die Extraktion aus dem Exkret der Dermestes maculates-Larven dar (Hoyt, C. P„ Osborne, G. O, Ann. Entomol. Soc. Amer, 63,1970,1198).
Bei der fermentativen Gewinnung von Hypoxanthin hat sich die Verwendung von verschiedenen Mikroorganismen als nützlich erwiesen. So können mittels Mutanten von Saccharomyces cerevisiae, die gegen 6-Mercapto-9-/?-D-ribofürano-sylpiirin-5'-phosphat resistent sind, durch Züchten im Substrat 0,7 mg/ml Hypoxanthin erhalten werden (JP-PS 515/67). Durch aerobes Züchten von adeninabhängigen Mutanten der Bakterien Xantomonas pruni, Xantomonas oryzae, Xantomonas campestris wurden innerhalb von 4 Tagen im Substrat 0,4 mg/ml Hypoxanthin neben 2 mg/ml Inosin erhalten. Mittels der triptophanabhängigen Mutante des Achromobacter butyri können durch Fermentation im Nährsubstrat 1,2 mg/ml Hypoxanthin erhalten werden (JP-PS 20 718/68). Die adenin-, biotin- oder aminosäurenabhängigen Mutanten der Stämme Microbacterium flavum var. glutamicus, M. ammoniafirm scheiden bei einer 72stündigen Züchtung im Substrat bei 30° C 0,299 mg/ml Hypoxanthin in das Substrat aus. Durch die Züchtung verschiedener Mikroorganismen, wie Saccharomyces oviformis, Rhodotorula rubra, R. glutinis, Torulopsis globrata und 5» Streptomyces olivoverticillatus, die gegen Purin-Antimetabolite resistent sind, wurden innerhalb von 12 Tagen im Substrat 0,146 mg/ml Hypoxanthin, 0,127 mg/ml Inosin und 0,55 mg/ml Adenin erhalten (JP-PS 21 794/74).
Auch die Purinbase Adenin spielt eine vielseitige Rolle im Stoffwechsel. So ist Adenin ein besonders guter Stabilisator für Erythrozyten, da es zusammen mit Säure-Citrat-Glucose die Stabilität der Erythrozyten bis auf 5 Wochen erhöht (Seidl, S., Bibl. Haematol. Nr. 38/Pt. 2/1971,190). Außerdem wurde durch Untersuchungen ermittelt, daß die Funktion des Hämoglobins im Blut während der Blutlagerung im flüssigen Zustand durch Adenin aufrechterhallen werden kann (Dawson, R. B., Loken, M. R., Crater, D. H., Transfusion, 12, 1972, 46). Durch einen Zusatz von Adenin zu den bereits bekannten Stabilisatoren (Glucose-Natriumcitrat-Zitronensäure) wird das Überleben von Erythrozyten bei sechswöchiger Lagerung bei 4° C um 35 bis 78% erhöht (Straus, D, Raderecht, H., Folia Haematol, 101, 1974, 232), ebenso wie die Fähigkeit, die natürliche Menge des ATP im Blut 35 Tage aufrechtzuerhalten (Dawson, R. B, ElHs1T. Y, Transfusion, 16,1976,79).
In vitro-Untersuchungen einer Sarkomart (Yosliida sarcoma) haben ergeben, daß durch Purinderivate, darunter auch durch Adenin, das Wachstum des Sarkoms beträchtlich gehemmt wird (Ito, Homu, Ikui, S, Masekiko, Y, Takeda Kenkyusko Ho, 30 (2), 1972, 296). Adenin und seine Derivate sowie Hypoxanthin haben sich bei der Behandlung verschiedener Hautentzündungsvorgänge als wirksam erwiesen (Wojnar, R. J, Losle, K. A, Brittain, R. J, Agents Actions, 5,1975,145). Adenin sowie bestimmte andere Purine und Nukleoside dienen zur Blutdrucksenkung (Jasunori. J, Osaka, D, Igaku Zasshi, 13, 196!, 127). Als ein weiteres Beispiel kann auch die Rolle des Adenins als Konservierungsmittel für Obst, welches dadurch seine frische grüne Farbe für längere Zeit behält, erwähnt werden (US-PS 30 13 885).
Ursprünglich wurde Adenin durch organisch-chemische Synthesen aus HCN oder anderen Cyaniden und NH3 oder Ammoniumsalzen bei hohen Temperaturen und Drücken gewonnen (JP-PS 10113/66, JP-PS 10 114/66). Die Gewinnung von Adenin durch Fermentation mittels Mikroorganismen hat sich, verglichen mit den erwähnten Verfahren, als vorteilhaft erwiesen. Bereits im Jahre 1959 wurde die Gewinnung von Adenin mittels Bacillus subtilis beschrieben (JP-PS 299/64). Durch 96stündiges Züchten vom Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum bei 30° C wurden im Substrat 2,3 mg/ml Adenin und 0,2 mg/ml Adenosin erhalten (JP-PS 28 690/73). Die gegen 2-Fluor-adenin resistente Mutante des Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21 709 produzierte nach 96 Stunden bei 30°C im Substrat 0,6 mg/ml Adenin und 0,12 mg/ml Adenosin (JP-PS 33 092/73). Das gegen Adeninanaloge resistente B. ammoniagenes produzierte ebenfalls 0,6 mg/ml Adenin (JP-PS 94 191/75).
Die Bakterie Microbacterium alkaliscens K. 38, die auf einem Nährisubstrat unter Zusatz von Inosin (4 bis 8 g/l) und Hypoxanthin (2 bis 4 g/l) gezüchtet wurde, produzierte nach 3 Tagen Züchtung bei 30° C, 3,5 g Adenin.
Die Feststellung erhöhter Mengen von Harnsäure im Blut oder Harn ist ein wichtiger Indikator von pathologischen Zuständen im Organismus. Außerdem wurde festgestellt, daß eine erhöhte Menge von Harnsäure im Blut auf myeloide Metaplasie (myeloide Leukämie) schließen läßt (Hickling, R. A., Lancet, I, 1958, 175). Die Feststellung erhöhter Mengen von Harnsäure im Serum tritt bei Patienten mit kongenitalen Herz- und Lungenkrankheiten (Lewis, J. G., Gardner, J. E., J. Clin. Path. 13, 1960, 502) sowie bei Patienten, die an Diabetes erkrankt sind, auf (De Coek, N. M, Australasian Ann., Med., 14, 1965," 205). Eine Erhöhung des Harnsäurespiegels im Blut wurde auch bei Patienten, die an Psoriasis und anderen Dermatosen erkrankt sind, festgestellt (Block, W. D, Hayde, J., J. Invest. Dermatol., 37,1961,125). Ein erhöhter Uratspiegel im Serum weist auch auf Lungentuberkulose, Lungenkrebs und Hepatitis hin. Bei Herzfehlern wird er mäßig erhöht, während sein schneller Anstieg beim Herzinfarkt sehr wichtig ist und in diesem Falle als ein wichtiger Indikator bei einer derartigen Diagnose dient (Toshio,M.,Wakayama Igaku 19(2), 1968,91).
Die Harnsäure kann aus Guano durch Extraktion
gewonnen werden und kann weiter zur Synthese von Coffein ais einem der medizinischen Präparate verwendet werden (Cancino, J. M., Actas y trabayos Congr. peruano. guinx, 1953,228).
Bedeutendere Mengen Harnsäure wurden im Extrakt der Schnecke Helix pomatia gefunden; daraus kann sie isoliert werden (Jezeska, B, Gosskonski, J, Acta Biochim. Polon. 10, 1963, 55). Ein Weg zur Gewinnung von Harnsäure in 80 bis 90%iger Reinheit ist die Extraktk/if von Hühnerkot mit 2,5%igem KOH; dieses Verfahren ist patentiert (US-PS 40 0/ 186). Es wurde festgestellt, daß der wilde Typ und die weißen Mutanten der Taufliege Dtosophila melanogaster Harnsäure ausscheiden, während die rosa Mutanten Xanthin und Hypoxanthin ausscheiden (Kuersteiner, R., ]. Insect. Physiol, 7, 1961, 5). Die Harnsäure kann durch Transformation einer organischen Verbindung (Purinbasen) mittels gewisser Bakterien, wie Serratia, Flavobacterium oder Achromobacter, erhalten werden (Akio, M. Tooru, A, Hakko Kogaku Zasshi, 47, 1969, 268).
Die Harnsäure kann durch Züchtung der Bakterie Streptomyces sp. auf einem Substrat mit Pepton und Glukose unter Zusatz von Hypoxanthin, welches durch die Bakterie zu Harnsäure transformiert wird, erhalten werden (Jasuto, W, Tatsuhiko, O., Agr. Biol. Chem., 36, 1972,785).
Aufgabe der Erfindung war es, für die fermentative Herstellung bestimmter Purine und deren Isolierung Mikroorganismen zu finden, die diese Purine in vorteilhafter Weise zu bilden vermögen. Diese Aufgabe wird mit dem vorstehend formulierten Anspruch gelöst.
Es wurde also nun gefunden, daß die dort genannten Mutanten der Bakterie Streptomyces coelicolor A3(2), welche auf flüssigen Nährmedien kultiviert wurden, in erheblichen Mengen Xanthin, Hypoxanthin, Adenin und Harnsäure, die chromatographisch bestimmt werden, ausscheiden. Die Mutanten, die unter der Nr. 2336 und 2348 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH., Grisebachstraße 8, 4300 Göttingen, am 1.4.1982 deponiert worden sind, wurden durch die Behandlung der Bakterie Streptomyces coelicolor A3(2) mit mutagenen Mitteln, wie z. B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosiguanidin oder UV-Strahlung, gewonnen. Für das vorliegende Verfahren wurden die guanin- bzw. adeninabhängigen Mutanten S. coelicolor DSM 2336 bzw. DSM 2348 gewählt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird derart ausgeführt, daß die angeführten Mutanten auf Nährmedien, die übliche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wachstumsfaktoren enthalten, gezüchtet werden. Als Kohlenstoffquelle dienten Kartoffelstärke, Glucose, Sorbit, Maltose und Ribose. Als Stickstoffquelle dienten Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Bactopepton, Bactokasiton. Als Mineralsalze dienten KNO3, (NH4J2SO4, NaCl, KH2PO4, MgSO4, CaCO3, FeSO4. Wachstumsfaktoren waren Biothin, Thiamin, Nicotinamid und Benzoesäure. Auch der Zusatz von Antibiotika sowie von Purin-Antimetaboliten stimulierte die Purin-Ausscheidung.
Die verwendeten Mutanten des Mikroorganismus Streptomyces coelicolor A3(2) sind adeninabhängiges S. coelicolor Nr. 2336 und guaninabhängiges S. coelicolor Nr. 2348. Bei submerser Schüttelkultivierung unter aeroben Bedingungen scheiden sie Purine in Nährsubstrate aus. Die optimale Temperatur beträgt 28 bis 32°C, der DH-Wert 6.2 bis 8.2 und die Reaktionszeit 4 bis 8 Tage. Adenin, Xanthin, Hypoxanlhin und Harnsäure werden chromatographisch und spektrophotometrisch bei einer bestimmten Wellenlänge bestimmt (Thomson, P. Y., 1960, Purines and Pyrimidines and their Derivatives, in: Chromatography and Electrophoretic Technique, 2nd Ed. 1; J. Smith (EcL), London).
Es ist zweckmäßig, im Nährmedium als Kohlenstoffquellen 17 bis 30 g/l Kohleristoffstärke, 15 bis 25 g/l Sorbit und 0,1 bis 0,5 g/l Ribose, die gleichzeitig als Stickstoffquelle dient, sowie etwa 20 g Glucose einzusetzen. Im Nährsubstrat sollte als Quelle von organisch gebundenem Stickstoff 10 bis 15 g/l Bactopepton und 5 bis 10 g/l Hefeextrakt verwendet werden.
Es ist ferner zweckmäßig, daß das Züchtungssubstrat ,5 den anorganischen Stickstoff in Form von etwa 1 g/l Ammoniumsalz und etwa 5 g/l Nitrate enthält.
Es wird ferner bevorzugt, daß die Substrate etwa 0,1 g/l Magnesiumsalze, etwa 2 g/l Natriumsalze, etwa 1 g/l Calciumsalze, etwa 10 μg/mI Eisensalze, etwa 3 g/l KH2PO4 enthalten. Ferner sollten die Züchtungssubstrate auch 100 bis 200μ§/1 Wachstumsfaktoren, etwa 50 mg/1 2,6-Diaminopurin und etwa 5 mg/i Antibiotika enthalten.
Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele erläutert werden.
Beispiel 1
Mit einer Sporensuspension von guaninabhängigem
Streptomyces coelicolor Nr. 2348 aus einer Agar-Schrägkultur wird ein Vorfermentorsubstrat, welches als Inoculum dient geimpft. Das Substrat weist die folgende Zusammensetzung auf:
Glucose 20 g/l
Pepton 5 g/l
Fleischextrakt 5 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
Bactokasitcn 3 g/l
NaCl 5 g/l
Leitungswasser 1000 ml
pH-Wert des Substrats: 6,8
Sterilisierung: 15 Minuten bei 1200C.
Glucose wird separat sterilisiert und zum sterilisierten Substrat gegeben. Die Kultivierung wird 24 Stunden bei 28° C auf einer Rotationsschüttelapparatur bei 200 U/min durchgeführt. Für die Inokulierung des Fermentorsubstrats werden 5% des Impfstoffes verwendet.
Die Fermentierung wird in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml eines Substrats der folgenden Zusammensetzung ausgeführt:
Kartoffelstärke 17 g/l
Bactopepton 15 g/l
2,6-Diamino-purin 50 mg/1
KNO3 5 g/l
(NH4J2SO4 lg/l
NaCl 2 g/l
KH2PO4 3 g/l
MgSO4 0,1 g/l
CaCO3 lg/1
FeSO4 IOμg/ml
b5 Der pH-Wert vor der Fermentation beträgt 7,0. Im Laufe von 96 bis 120 Stunden der Fermentierung auf einer Rotationsschüttelapparatur bei 200 U/min bei 300C werden 1.5 me Xanthin/ml im Fermentationssub-
strat gewonnen.
Beispiel 2
Das Substrat wird mit 5% des Inoculums der auxotrophen Mutante, wie im Beispiel 1 angeführt, geimpft und weist die folgende Zusammensetzung auf:
2 g/l
3 g/l 0,1 g/l lg/1
Kartoffelstärke
Bactopepton
Hefeextrakt
KNO3
(NH4J2SO4
NaCI
KH2PO4
MgSO4
CaCO3
FeSO4
Nicotinamid
p-Amino-benzoesäure
30 g/l 10 g/l
5 g/l
5 g/l
lg/1
2 g/l
3 g/l 0,1 g/I lg/1
10 mg/ml 100μg/l 100μg/l.
NaCl
KH2PO4
MgSO4
CaCO3
FeSO4
Nach 144 Stunden der Fermentierung auf einer Rotationsschüttelapparatur bei 300C scheidet die Mutante 0,4 mg Adenin/ml in das Substrat aus.
Beispiel 5
Die auxotrophe adeninabhängige Mutante S. coelicolor DSM 2336 diente als Kultur zur Impfung des Vorfermentorsubstrats wie im Beispiel 1.
Das Fermentationssubstrat, welches mit 5% des Inoculums geimpft wird, weist die folgende Zusammensetzung auf:
Die Kultivierung wird wie im Beispiel 1 ausgeführt. Nach 120 Stunden der Fermentierung auf einer Rotationsschüttelapparatur bei 300C werden im Substrat 0,8 mg Xanthin/ml und 0,3 mg Harnsäure/ml gefunden.
Beispiel 3
Dieses Beispiel illustriert den Einfluß der Zugabe von Streptomycin in das Fermentationssubstrat zur Purinsynthese. Das Inoculum wird wie im Beispiel 1 vorbereitet und mit 5% des Impfstoffes der auxotrophen guanidinabhängigen Mutante wird ein Substrat der folgenden Zusammensetzung inokuliert:
Sorbit
Ribose
Glutaminsäure
Hefeextrakt
KNO3
(NH4J2SO4
NaCl
KH2PO4
MgSO4
CaCO3
FeSO4
Streptomycin
Thiamin-HCl
Biotin
15 g/l
0,1 g/l
lg/1 10 g/l
5 g/l
lg/1
2 g/l
3 g/I 0,1 g/I lg/1
10μg/ml 5 mg/1 200μg/l 100μg/l.
Kartoffelstärke
Bactopepton
Streptomycin
KNO3
(NH4J2SO4
NaCl
KH2PO4
MgSO4
CaCO3
FeSO4
17 g/l 15 g/l
5 mg/1
5 g/i
lg/1
2 g/l
3 g/l 0,1 g/l lg/1
10μg/ml Nach 120 Stunden der Fermentierung auf einer Rotationsschüttelapparatur bei 300C und einem pH-Wert von 7,0 scheidet die adeninabhängige Mutante 0,36 mg Hypoxanthin/ml und 0,20 mg Xanthin/ml in das Substrat aus.
Beispiel 6
Die auxotrophe Mutante des Beispiels 5 wird im Inoculum, welches im Beispiel 1 beschrieben wurde, gezüchtet. Mit 5% des Inoculums wird ein Substrat der folgenden Zusammensetzung geimpft:
Nach 96 Stunden der Kultivierung auf einer Rotationsschüttelapparatur unter den im Beispiel 1 bzw. angegebenen Bedingungen werden im Fermentationsansatz 1.0 mg Xanthin/ml und 0,45 mg Harnsäure/ml bestimmt.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird als Kohlenstoff quelle Sorbit verwendet. Das Inoculum wird wie im Beispiel 1 vorbereitet und dient als Impfstoff für das Fermentationssubstrat mit folgender Zusammensetzung:
Glucose
Hefeextrakt
Glutaminsäure
KNO3
(NH4J2SO4
NaCi
KH2PO4
MgSO4
CaCO
FeSO4
Thiamin-HCl
Biotin
Sorbit
Ribose
Glutaminsäure
Hefeextrakt
KNO3
(NH4J2SO4
25 g/l 0,5 g/l lg/1
lOg/1 5 g/l lg/1 20 g/l 10 g/l
lg/1
lg/1
lg/1
2 g/i
3 g/l 0,1 g/l lg/1
10μg/ml 200 μg/l 100μg/l
Nach 120 Stunden der Fermentierung auf einer Rotationsschüttelapparatur bei 300C' und einem pH-Wert von 7,0 verwenden im Fermentationsansatz 0,42 mg Hypoxanthin/ml bestimmt

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur fermentativen Gewinnung der Purine Xanthin, Adenin, Hypoxanthin und/oder Harnsäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in flüssigen Nährsubstraten, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralsalze, Wachstumsfaktoren, Purin-Antimetaboliten und gegebenenfalls Antibiotika enthalten, und Gewinnen derselben aus dem Nährsubstrat, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Streptomyces coelicolor DSM 2336 oder DSM 2358 züchtet
    15
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