DE2220508C3

DE2220508C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung cyclischer Adenosin-3'3'monophosphorsäure

Info

Publication number: DE2220508C3
Application number: DE2220508A
Authority: DE
Inventors: Akira Kawasaki Furuya; Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Masayo Tokio Ukita
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1971-05-07
Filing date: 1972-04-26
Publication date: 1979-09-13
Also published as: FR2137511A1; DE2220508A1; FR2137511B1; GB1366451A; US3816251A; DE2220508B2

Description

Die biotechnische Herstellung von cyclischer Adcnosin-3',5'-monophosphorsäure der Formel

NIl,

N N
ClI-

OO OH P

HO

nachstehend als cAMP bezeichnet, ist z..l). aus der ₄-, FR-PS 20 15 396 bekannt. Gemäß dieser Patentschrift werden die Mikroorganismen-Stämme Corynebacterium murisepiicum AFCC 21 374 Arthrobacter ATCC 21 37^r) oder Microbacierium AICC 21 37b in Gegenwart von Adenin. Adenosin. llypoxanthin. Inosin, ,< ■vAmino-4-imida/olcarboxamid, 5-Amino-4-imida/.olcarbo >,,imidnbosid. Succinyladeniri oder Siiccinyladenosin gezi'vhlet. In der Kullurbriihe werden durch Zusatz, von 1 bis j mg/ml eines der vorgenannten Vorläufer zum Kulturmedium während der Züchtung 1 bis -,· i mg<ml cAMP.inget' ·ι heil.

Aufgabe der I rfu .iung war es, ein neues Verfahren zur Herstellung des als wichtiges Arzneimittel dienenden 1ΛΜΙ' /nt Verfügung zu stellen, das sich im ühI'isu i'Jicn Miilhliib mit erhöhten Ausbeuten durch- _hl innren i.1 ii:

' κ t'ei'surid del I rfmdimg ist somit ein Verfahren zur ¹ -ι. ■ ■. huivi Ik'h Herstellung csclischer Adenosin- Ϊ.V-■·■ ■ 1 ■ . ·|)ί'ιΜ·,ρΊιιι·'.,ιιιι e ι Inn Ii /ι κ'ht iing von (or γ nc bade ■ ¹Ii- r: ■ ·. ι τ "-1'JiUi-IIi]I -\|(( 21 174. Aithroh, icier sp. , \ i < < _'i .' Ί i'vl·.¹' ΜκγίΙι.η leniini sp. YK C 21 !7h in

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10, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Züchtung in Gegenwart eines Fluorids durchführt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt es, cAMP auf einfache Weise in industriellem Maßstab mit hoher Ausbeute herzustellen.

Zahlreiche Untersuchungen bezüglich der Anreicherung von cAMP bei drr Züchtung von Mikroorganismen ergaben, daß beträchtliche cAMP-Mengen angereichert werden, wenn einer der genannten Bakterienstämme in einem ein Fluorid, wie Natrium- oder Kaliumfluorid, enthaltenden Nährmedium gezüchtet wird, wobei kein Adenin, Adenosin, Hypoxanthin, Inosin, S-Amino^-imidazoIcarboxamid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribosid, Succinyladenin oder Succinyladenosin zugesetzt werden muß. Die vorgenannten Verbindungen sind Vorstufen bei der Biosynthese von Purinnucleotiden und bei der Bildung von ς-^MP in lebenden Organismen (W. W. Umbreit, Metabolie Map, Bd. Il [1060], Seite 201, Burgess Publishing Co., Minnesota, V. St. A.). Bei gleichzeitiger Anwesenheit eines Fiuorids und eines Vorläufers von cAMP im Nährmedium während des Züchtens werden erhöhte cAMP-Mengen angereichert.

Fluoride, wie Natrium- und Kaliumfluorid, werden im allgemeinen als Enzyminhibitoren (R. M. Höchster und J. H. Quast el, Metabolie Inhibitor, Bd. I und II [1963], Academic Press, New York, V. St. A.) verwendet.

Aus Biochem. ]., Bd 120, (1970), S. 6P, geht zwar hervor, daß Adenylcyclase aus Corpus Luteum von Ratten durch Zusatz von Nutriumfluorid aktiviert wird. In I. Biol. Chem.. Bd. 244 (1969), S. 3468, wird beschrieben, daß die Aktivität der Adenylcyclase in Rattenfettzellen durch Zusatz von Fluoridionen gesteigert wird.

Andererseits ist jedoch bekann', daß Natriumfluorid Adenylcyclase mikrowellen Ursprungs aus Escherichia coli hemmt (M. T a ο und RLipman, Proc. Natl. Acad. Sei., Bd 63 [1969], S. 86). Es war daher anzunehmen, daß die Bildung und Anreicherung von cAMP in Mikroorganismen durch die Zugabe eines Fluorids gehemmt würde. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß im Falle der beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Mikroorganismen bei Zugabe eines Fluorids zum Nährmedium erhöhte cAMP-Mengen angereichert werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl synthetische als auch natürliche Nährmedien verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß sie geeignete Mengen einer Kohlenstoffquelle, einer organischen oder anorganischen Stickstoffquelle, anorganische Salze und. falls notwendig, spezifische Nährstoffe enthalten. Als KohlenstoTqucllen können /.. B. Kohlenhydrate, wie Glucose. Fructose, Saccharose, Maltose, Mannit. Galactose. Ribosc. Stärke, Stärkchydrolysat-Lösung und Melasse, organischen Säuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure und Essigsäure, Alkohole wie Glycerin, Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffinc und Kerosin, und Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure. Alanin, Glutamin und Asparagin, eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen können z. B. Ammoniak, anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniiimchlorid, Ammonium phosphat. Ammoniumsulfat. Ammoniumnitrat. Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat. Harnstoff, stickstoffhaltige organische Malenalien, wie l'epton, Caseinhydrolysat, Fleischextrakt, llefeevtrakl. Maisquellwasser. Fischmehl oder abgebautes Fischmehl, und Aminosäuren, wie Glycin. (ί in i.tniinsäin e und Αί,ιιιιΐι. Lin^cset/t werden. Als

anorganische Salze können z, B, Kalmmdibydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Calciumcarbonat eingesetzt werden.

Das Fluorid wird dem Nährmedium in Mengen von 1 bis 2000 mg/Liter zugesetzt. Es kann dem Nährmedium bei dessen Herstellung, nach dem Beimpfen mit dem Mikroorganismus oder während des Züchtens zugesetzt werden. Spezielle Beispiele von im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbarer Fluoride sind Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Calciumfluorid, Magnesiumfluorid, Lithiumfluorid, Bariumfluorid, Ammoniumfluorid und Zinkfluorid.

Der Mikroorganismus wird vorzugsweise vor dem Animpfen des Kulturmediums in einem Anzuchtmedium gezüchtet. Das Züchten der Anzuchtkultur wird unter günstigen Wachstumsbedingungen so lange durchgeführt, bis eine geeignete Population gewachsen ist, wozu im Normalfall 12 bis 24 Stunden erforderlich sind. Die Anzuchtkultur wird dann in das Kulturmedium eingeimpft.

Nach einer weiteren Ausführungsforrri des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Kulturmedium zusätzlich mit mindestens einem Vorläuger von cAMP. wie Adenin, Adenosin, Adenylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Inosinsäure, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribosid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribotid, Succinyladenin oder Succinyladenosin, versetzt. Der Vorläufer wird dem Kulturmedium in geeigneten Mengen, vorzugsweise in Mengen von I bis 20 g/Liter, beim Einimpfen des Mikroorganismus oder während des Zu htens zugesetzt.

Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen, z. B. in Schüttelkultur oder in belüfteter und gerührter Submerskultur durchgeführt.

Die Züchtungszeit beträgt gewöhnlich 10 bis 120 Stunden, wobei eine beträchtliche cAMP-Mengc in der Kulturbrühe angereichert wird. Nach beendeter Züchtung wird das cAMP aus der Kulturbrühe mittels eines Ionenaustauschers, wie im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Das cAMP kann auch durch Adsorption, Ausfällung und Extraktion isoliert werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Durch etwa I2stündiges Züchten von Mikrobacterium sp. ATCC 21 376 in einem 1 Prozent Glucose, 1 Prozent Pepton.-l Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenden Anzuchtmedium bei 30⁰C wird eine Anzuchtkullur hergestellt. Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, I Prozent Kaliumdihyurogenphosphat, I Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 1 Prozent Magnesiumsulfat, 10 mg/Liter Kobalt(ll)-chlorid, 30ng/Liter Biotin, 100 mg/Liter Natriumfluorid, 0,5 Prozent Peplon und 1 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7,6 eingestellt wird. 30 ml des Kulturmediums werckn in einem 250 ml fassenden konischen Kolben 10 Minuten bei 120"C sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wird dann mit der Anzuchtkullur im Verhältnis von 10 Volumprozent beimpft. Nach 72stündigem Züchten bei JO''C" in Schüttclkultur enthält die Kulturbrühe j.i mg/ml cAMP.

I Liter Kulturfiltrat, das durch Abfiltrieren der Zellen und der Niederschlag'.· aus tier Kulliirhriihe erhalten wird, wird mit Sal/saur·· ;r ι if pll !,() eingestellt und mit Aktivkohle versetzt. 1-. .-s Gemisch wird gründlich L'crührt. wubei das cAMP an der Aktivkohle adsorbiert wird. Die Aktivkohle wird abfiltriert, und das adsorbierte cAMP wird mit einem Ammoniak-Äthanol-Gemisch eluiert Das Eluat wird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird über einen Ionenaustauscher (Dowex 1 χ 2 in der Chloridform) gegeben. Der Austauscher wird mit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Salzsäure eluierL Die cAMP enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat

to wird mit Äthanol versetzt, wobei 1,8 g Rohprodukt in kristalliner Form erhalten wird. Das Rohprodukt wird umkristallisiert. Sämtliche bei der Elemantaranalyse erhaltenen Werte, die Bestimmung des Basen-, Zuckerund Phosphorsäuregehaltes, das UV- und das IR-Ab- sorpti-jnsspektrum und die bei der Papierchromatographie erhaltenen Rf-Werte zeigen, daß es sich bei der erhaltenen Verbindung um cAM P handelt

Beispiel 2

:o Es wird eine Anzuchtkultur von Corynebacterium mnriscptic'jm ATCC 2! 374 hergestellt. Ein 5 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat, 0,3 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1 Prozent Magnesiumsulfat, 1 Prozent Maisquellwasser, 0,3 Prozent

j-, säurehydrolysiertes Casein, 200 mg/Liter Kaliumfluorid und 1,5 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium, dessen pH-Wert vor dem oterilisieren auf 7,5 eingestellt wird, wird mit dieser Anzuchtkultur beimpft. Das Züchten wird 60 Stunden bei 30⁰C in Schüttelkultur

jo genvß Beispiel I durchgeführt. Nach dieser Zeit enthält die I ulurbrühe 2,3 mg/ml cAMP. Eine ohne Kaliumfluorid-Zusalz gezüchtete Vergleichskultur enthält lediglich 0,2 mg/ml cAMP.

Beispiel 3

Es wird eine Anzuchtkultur von Arthrobacter sp. ATCC 21 375 hergestellt. Das Züchten erfolgt gemäß Beispiel 1 in einem Kulturmedium mit der in Beispiel I angegebenen Zusammensetzung mit de Ausnahme,

.in daß das Kulturmedium 24 Stunden nach Beginn des Züchtens mit 100 mg/Liter Natriumfhiorid versetzt wird. Das Züchten wird % Stunden bei 32''C durchgeführt. Nach dieser Zeit enthält die Kulturbrühe 2,1 mg/ml cAMP. In einer ohne Natriumfluorid-Zusatz

i-> gezüchteten Vergleichskultur ist fast kein cAMP enthalten.

Beispiel 4

Das Züchten wird unter Verwendung des in Beispiel 1 -,(i angegebenen Stammes 72 Stunden gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Natriumfluorid 100 mg/Liter Magnesiumfluorid eingesetzt werden. Die Kulturbrühe enthält dann 3,0 mg/ml cAMP. In einer ohne Magncsiumfluorid-Zusatz gezüch-Vi teten Vergleichskultur ist fast kein cAM P enthalten.

Beispiel 5

Das Züchten wird unter Verwendung des in Beispiel 2 angegebenen Stammes 60 Stunden gemäß Beispiel 2 mi durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Kaliumfluorid 200 mg/Liter I.ithiumfiuond eingesetzt werden. Die Kulturbrühc enthält dann 2.1 mg/ml cAMP. In einer ohne Lithiumfluorid-Zusatz gezüchteten Ver gleichskultur ist fast kein cAMP enthalten.

H e i s ρ ι e I b

Durch ein etwa 12stündijzes Züchten von Microhm, te üiim sp. A"ICC 2! 576 in einem 1 Prozent r.lnrosr I

Prozent Pepton, I Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenenen Anzuchtmedium bei 30⁰C wird eine Anzuchtkultur hergestellt Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat, 1 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 1 Prozent Magnesiumsulfat, 10 mg/Liter Kobalt((!)-chlorid, 30μg/Liter Biotin, 100 mg/Liter Natriumfluorid, 0,5 Prozent Pepton und 1 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen pH-Wert auf 7,6 eingestellt wird. 30 ml des Kalturmediums werden in einem 250 ml fassenden konischen Kolben 10 Minuten bei 120⁰C sterilisiert Das sterilisierte Kulturmedium wird dann mit der Anzuchtkultur in einem Verhältnis von 10 Volumprozent beimpft. Das Züchten wird 72 Stunden bei 30⁰C in Schüttelkultur durchgeführt. 20 und 40 Stunden nach Beginn des Züchtens wird das Kulturmedium mit Adenin versetzt, so daß dessen Konzentration jeweils 2 mg/ml beträgt. Nach beendetem Züchten enthält das Kulturmedium 9.7 mg/ml cAMP. Eine ohne Natriumfluorid-Zusatz gezüchtete Vergleichsl.ultur enthält lediglich 2.1 mg/ml cAMP.

Beispiel 7

Es wird eine Anzuchtkultur von Microbacterium sp. ATCC 21 376 hergestellt. Das Züchten erfolgt gemäß Beispiel 6 in einem Kulturmedium mit der in Beispiel 6 angegebenen Zusammensetzung. Zum Vergleich wird eine Kultur ohne Natriumfluorid-Zusatz gezüchtet. In der Tabelle I sind die zugesetzten Vorläufer, deren Mengen, die Zugabezeiten und die nach 72stünd ger Züchtung bei 30⁰C in der Kulturbrühe enthaltenen cAMP-Mengen zusammengestellt. Die Abkürzungen AICA und AICAR in Tabelle I bedeuten 5-Ainino-4-imida;:olcarboxamid bzw. 5-Amino-4-imidazolcarboxarnidribosid.

Tabelle !

Vorläufer

Zugesetzte
Menge, mg/ml

OStd.

20Std.

L-AMP

mit
NaF-/usiit/.
mg/ml

ohne
NaF-/usat/,
mg/ml

Adenosin

llypoxanthin

Inosin

AICA

AICAK

4
0
5

0
4

Beispiel 8

4.7
7,1
5.8
6,4
5.1

2.3
2.4
2.2
1.8
?A

Es wird eine Anzuchtkultur von Arthrobacter sp. ATCC 21 375 hergestellt. Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 0.1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat, 0.3 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 0.1 Prozent Magnesiumsulfat, I Prozent Maisquellwasscr, 0,5 Prozent säurehydrolysiertcs Casein und 1.5 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen kein pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7.5 eingestellt wird. Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium beim Beimpfen mit der An/.uchtkultur mit 200 mg/1,iter KaliiimfliKVid versetzt wird. Als Vergleich wird eine Kultur ohne kaliumfluorid /iisat/ ge/uchtct.

In der Tabelle Il sind die zugesetzten Vorläufer, deren Mengen, die Zugabezeiten und die nach öOstündiger Züchtung bei 30⁰C in der Kulturbrühe enthaltenen cAMP-Mengen zusammengestellt.

Tabelle II	lü	Zugesetzte Menge, mg/ml	20 Std.	cAMP	ohne KF- Zusatz, mg/ml
Vorläufer	15 Hypoxanthin Adenosin Succinyladenin Succinyl- udenosin	OStd.	3 4 2 2	mit KF- Zusatz, mg/ml	1,8 1,6 2,2 1,7
	3 0 2 2		5,2 4,8 5,7 4,3

Beispiel y

Es wird eine Anzuchtkultur von Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374 hergestellt. Da:, Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daij das Kulturmedium 20 Stunden nach Beginn des Züchtens zusammen mit den in der Tabelle Hl aufgeführten Vorläufern mit 100 mg/Liter Nairiumfluorid versetzt wird. Nach Wstündiger Züchtung bei 30'" C enthalten die Kulturbrühen die in der Tabelle III angegebenen cAMP-Mengen.

Tabelle III

Vorlauter

Zugesetzte
Menge, mg/ml

cAMP

mit NaF-Zusat?. mg/ml

ohne NaF-/usatz. mg/ml

Adenin

Adenosin

Hypoxanthin

Inosin

AICA

5.3 4,7 5,5 ',3 4,3

2,2 2,1 1,8 2,1 1.9

Beispiel 10

Es wird eine Anzuchtkultur von Microbacterium sp. ATCC 21 376 hergestellt. Das Züchten wird gemäß Beispiel b durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium 20 Stunden nach Beginn des Züchtens •-,it den in der Tabelle IV aufgeführten Vorläufern versetzt wird. Nach 72s;ündiger Züchtung bei 30"C enthalten die Kulturbrühcn die in der Tabelle IV angegebenen cAMP-Mengen. Die Abkürzung AICARP bedeutet 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribotid.

Tabelle IV	ι-A MP	ohne	NaF'-
Vorläufer	mit NaF-/.usat/.	/usill	./. mg/ml
	mg/ nl	0.4
	τ ^	0.6
5'-lnosinsiiure	l.S	0 ^ς
V-Adenvlsiture	1."
Λ Κ ARI¹

7 8

lic ι spic I 12

^IJ(?lsP^lcl " Die Züchtung wird 72 Stunden gemäß Beispiel 6

Das Züchten wird gemäß Beispiel b durchgeführt, mit durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von

der Ausnahme, dal.) anstelle von Natriumfluorid 100 mg Natriiimfluorid 100 mg/Liter l.ithiumfhiorid eingesetzt

pro Liter MagncsiumNuorid eingesetzt werden. Nach , werden. Nach beendeter Züchtung enthält die Kultur-

beendeter Züchtung enthält die KulHirbrühc 9.5 mg/ml brühe 9,3 mg/ml cAMP. Kine ohne I.ithiumfluorid-Zu-

cAMP. Rine ohne Magnesiumfluorid-Zusat/ge/üchiete sat/ gezüchtete Vergleichskiiltur enthält lediglich

Vergleichskultur enthält letliglich 2,4 mg/ml cAMP. 2.2 mg/ml cAMP.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung cyclischer Adenosin-3',5'-monophosphorsäure durch Züchtung von Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374, Arthrobacter sp. ATCC 21 375 oder Mikrobacterium sp. ATCC 21 376 in einem Nährmedium üblicher Zusammensetzung bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und pH-Werten von 4 bis 10, in dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart mindestens eines Fluorids durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Nährmedi- um durchführt, das zusätzlich mindestens einen Vorläufer der cyclischen Adenosin-3',5'-monophosphorsäure enthälL