DE2220508A1

DE2220508A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung zyklischer AdenosinS^-monophosphorsäure

Info

Publication number: DE2220508A1
Application number: DE19722220508
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara; Furuya Akira Kawasaki; Kanagawa; Ukita Masayo Tokio; Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1971-05-07
Filing date: 1972-04-26
Publication date: 1972-11-16
Also published as: GB1366451A; US3816251A; FR2137511B1; DE2220508C3; DE2220508B2; FR2137511A1

Description

DIPL-CH-EM. DR. ELISABETH JUNG OiPL-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUS DIPL-PHYS. DH. JÜRGEN SCHIRDEWAHN PATENTANWÄLTE

u.Z.: G 932 C (Bz/Vo/be) Cäse 92 - 4

MÜNCHEN 23, *■"' ^

CLEMENSSTRASSE 30 TELhFON 34 5067

TELEGRAMM-ADRESSE: INVENT/MÜNCHEN TELEX 5-29686

EYOwA HAKKO ICOGYO CO., LTD., Tokyo, Japan

"'/erfahren zur biotechnischen Herstellung zyklischer Adenosin-3^! ? 5' -Lionophosphorr.äure"

Priorität: 7. Kai 1971, Japan, ITr. 29 803/71 und

lir. 29 804/71

Die biotechnische Herstellung von zyklischer Adenosin~3'»5^fi monophosphorBäure der Formel

OH

nachstehend als cAl'JP bezeichnet, ist ζ „Β. aus der PR-Po 2 015 .3 S)o bekannte Gemäß dieser Patentschrift wird ein zur Gattung
Arthrobacter, Corynebacterium oder I.iicrobacterium gehörender' und zur Bildung und Anreicherung von cAMP aus Adenin, Adenosin, Hypoxanthin, Inosin, 5-A-^rn.no-4"imidazolcarboxariiid, 5~Ami.no-4~iinida2olcarbo;-:ainidribor> id, Succinyladenin oder Succinyladcnosin befähigter IJikroorganismus gezüchtet. In der Kulturbrüho v/erden durch den Zusatz von 1 bis 3 mg/ml eines der vorgenannten Vorläufer zum Kulturmedium während der Züchtung 1 bis 3 mg/ml ©ΛΙ.ΓΡ angereichert,.

Aufgabe der Erfindung war es, ein neues Verfahren zur Herstellung den als wichtiges Arzneimittel dienenden cAIvlP zur Verfügung zu stellen, das sich im industriellen Maßstab mit erhöhten, Ausbeuten durchführen läßt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung zyklischer Adenosin~3^!,5'-monophpsphorsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur
Produktion zyklischer Adonosin-3¹,5^f-monophc3phorcäure befähigten Mikroorganismus in einem mindestens ein Pluorid enthaltenden Hährmedium züchtet, die Zellen abtrennt und die zyklische Adenosir-3',5'-monophosphorsäure aus dem Kulturfiltrat isoliert«

lach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt es, οΛΊί? auf
einfache V/ciae in industriellem Llaßütab mit hoher Ausbeute
herausteilen.

BADORtGINAL r

rt /

Zahlreiche Untersuchungen bezüglich der Anreicherung vpn cAI.IP 1;·', i de-r Züchtung von /vlihroorganisracn ergaben, daß beträchtliche c AIaP-.long en angereichert werden, wenn ein zur Produktion von cAJ.iP befähigtes Baktcrium in einen ein Pluorid,wie J-T atriumfluorid oder iialiurnfluorid, enthaltenden liährmedium ge~ »'lichtet wird, wobei kein -A.den.in, Adenosin, Hyporxanthin, Xnorjin, 5~Ami;?.o--4~iniidazölearboxarnid _t 5--Amino-4"iinidazol·- carboxamdribosid, S ucc iny ladenin oder Succinyladenosin auge setzt werden nuß» Die vorgenannten Vorläufer sind zur Biosynthese von Fu.rinnu.cleotiden und zur Bildung von cArIP in lobenden Organismen unbedingt erforderlich (W,Y/. Umbreit,

Seite 201, Metabolie I-.iap_t 33and IT (19&Ό), üurgess Publishing Co», Minnesota, 'V"»St_eA,)» Fluorides wie Hatriiunfluorid und Kaliunifluorid, sind dagegen anorganische Verbindungen und werden im allgemeinen als Enzyminhibitoren (Rc M. Höchster und J. II, QuaBtcl;.. I.lGtnbolic Inhibitor, Band I und II (1963), Academic Press, Hew York, V,St,A.) verwendet, Bs ist somit ersichtlich, daß die Zugabe.von z,B, Adenin und die Zugabe eines Pluorids völlig verschiedene physiologische Wirkungen auf den Stoffwechsel eines IJikrοOrganismus haben. Es wurde fer ner berichtet, daß ITatriumfluorid das riinzym Adenylcyclase hfnjA-jt, dan an der Biosynthese von cA".Q? aus Adenosintriphosphoreäure in MilLroorganisrne-n (;.-I. Tao -und P, Lipman, ProcITatl, y,c.'id. bei«, Band 63 (1969), Seite 86) beteiligt ist. Es war cliöcr a/iaunehmon, daß die Bildung und Anreicherung von cA'.IP. ί^: ι'.Ir¹OjJ c'.-l.c /..-'HrAiC oibucs Pluorids gcheuL/r!. würde. Überraschenderv.":.:.i.::e wuruo ;joooch ;;cfii.vi.don,. daß bei; Zugabe eines Pluorids öl·;·)'-: %n.:.i;r iA\ ··.';: '/orl ·'■ υ Γ"-·. Tr, cr]iüiitu οΑ.-.ϊΡ-.Υια irmi angereiclicrt.

SAD ORIGINAt 2 0 9 8 A 7 / 1 1 8 A ^ίίε

werden» Bei gleichzeitiger Anwesenheit eines Fluoride und eines Vorläufers von oAMP im Nährmedium während des Züchtens Ί

werden ebenfalls erhöhte cAMP-Uengen angereichert, . '

Im erfindungßgemäßen Verfahren kann Jeder zur Produktion von cAI.tP befähigte Mikroorganismus und daraus hergestellte Mutanten eingesetzt werden. Die Bestimmung, ob ein Mikroorganismus ■ zur Produktion von οΑΙ,ΊΡ befähigt ist, kann nach jeder Standard-Screeningmethode erfolgen. Bin zu untersuchender Mikroorganismus wird in ein steriles Nährmedium eingeimpft und bei einer geeigneten (Temperatur inkubiert. Beim Einimpfen des MicroOrganismus oder während des Züchtens wird das lährmedium mit einem Vorlaufer, wie Adenin oder Adenosin, und/oder einem Pluorid in Mengen von 1 bis 20 g Vorlaufer/Liter und/oder 1 bis 2000 mg Fluorid/Liter versetzt» Nach beendeter Züchtung wird die so erhaltene Kultur mit einer ohne einen solchen Zusatz gezüchteten Kontrollkultur verglichen. Die Anwesenheit von cAMP in den jeweiligen Kulturbrühen wird in üblicher Weise> z.B. papierchromatographisch oder mittels der UV-Absorption, bestimmt» Bei erfolgversprechenden Mikroorganismen wird dex' cAHP-Gehalt quantitativ bestimmt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise die Stämme Corynebacterium murisepticum AIOC 21374» Arthrobacter sp, ATCC 21375 und IJicrobacterium sp, AICC 21376 eingesetzt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl synthetische als auch natürliche Uährmedien verwendet werden, unter der Voraus- !

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■ - 5 ~

Setzung^ daß sie geeignete Mengen einer Kohlenstoff quelle, einer organischen oder anorganischen Stickstoffquelle» anorganische Salze und, falls riotwendig, spezifische Nährstoffe enthalten. Es können sämtliche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt werden, die von den gezüchteten S.tämmen verwertet werden können. Als "Kohlenstoffquellen können z.B. Kohlenhydrate, wie Glucose,. Fructose, Saccharose, Maltose, Mannit, Galactose, Ribose, Stärke, Stärkehydrolysat-Lösung · und Melasse, organische Säuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure und Essigsäure, Alkohole wie Glycerin, Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine und Kerosin,.und Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Alanin, Glutamin und Asparagin, eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen können z.B. Ammoniak, anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumohlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff, stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, Caseinhydrolysat, fleischextrakt _t Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fischmehl oder abgebautes Fischmehl, und Aminosäuren, wie Glycin^ Glutaminsäure und Alanin, eingesetzt werden. Als anorganische Salze können z.B. Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Calciumcarbonat, eingesetzt werden. Falls ein Mikroorganismus zusätzlich spezifische Nährstoffe benötigt, müssen diese dem Nährmedium natürlich ebenfalls zugesetzt werden.

Das Fluorid wird dem Nährmedium in Mengen von 1 bis 2000 rag/Liter zugesetzt. Das Fluorid kann dem Nährmedium bei dessen

Herstellung einverleibt werden.Das Hährmedium kann auch nach dem Beimpfen mit dom Mikroorganismus oder während- des Zuchtens mit einer Fluoridlösung versetzt werden. Spezielle Beispielevon im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbarer Fluoride sind Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Calciuaifluorid, Magnesiumfluoride Lithiumfluorid, Bariumfluorid, Amraoniumfluorid und Zinkfluorid.

Der Mikroorganismus wird vorzugsweise vor dem Animpfen des Kulturmediums in einem Anzuchtmedium gezüchtet. Das Züchten der Anzuphtkultur wird unter günstigen Wachstirnsbedingungcn solange durchgeführt, bis eine geeignete Population gewachsen ist, wozu im Normalfall 12 bis 24 Stunden erforderlich sind. Die Anzuchtkultür wird dann in das Kulturmedium eingeimpft.

Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Kulturmedium zusätzlich mit mindestens einem Vorläufer von cAMP, wie Adenin, Adenosin, Adenylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Inosinsäure, ^"Ariar-o^-imidazolcarboxamid, 5-Amino-4-imidaz öle arb oxamidribosid, 5-Amino--4-imidazöle arb oxamidribotid, Succinyladenin oder Succinyladenosin, versetzt. Der Vorläufer wird dem Kulturmedium in geeigneten Mengen, vorzugsweise in Mengen von 1 bis 20 g/Liter, beim Einimpfen des Mikroorganismus oder während des Zuchtens zugesetzt.

Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen, z.B. in Schüttelkultur oder in belüfteter und gerührter Submerckultur, bei Temperaturen von vorzugsv/eise 20 bis 4O⁰C und bei pH-Y/erten des Kulturmediums von vorzugsweise 4 bin 10 durchgeführt.

A Λ I

Die*Ziichtungsaeit beträgt gewöhnlich 10 bis 120 Stunden, wobei eine beträchtliche cAMP-Menge in der Kulturbrühe angereichert wird. Each beendeter Züchtung wird das cAIviP. aus der Kulturbrühe mittels eines Ionenaustauschers, wie im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Das cAMP kann auch mittels anderer Ionenaustauscher und durch Adsorption,· Ausfällung und Extraktion isoliert werden,

cAMP ist ein physiologisch wichtiges llucleotid, das zahlreiche Hormonwirkungen in höheren tierischen Organismen steuert. cAMP ist daher ein wertvolles Arzneimittel.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Durch etwa 12stündiges Züchten von Mikrobacterium sp, ATCC 21376 in einem 1 Prozent Glucose, 1 Prozent Pepton, 1 Prozent 'Fleischextrakt,» 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenden Anzuchtmedium bei 3O⁰C wird eine Anzuchtkultur hergestellt, Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 1 Prozent Kalinmdihydrogenphosphat, 1 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 1 Prozent,Magnesiumsulfat, 10 mg/liter Kobalt-(Il)-chlorid, 30 /fg/Liter Biotin, 100 mg/Liter latriumfluorid, 0,5 Prozent Pepton und 1 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7,6 eingestellt wird. 30 ml des Kulturmediums werden in einem 2Ί5Ο ml fassenden konischen Kolben 10 Minuten

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h»ei 120⁰C sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wird .dann mit der Anzuchtkultur im Verhältnis von 10 Volumprozent beimpft. Nach 72stündigem Züchten bei 3O⁰C in Schüttelkultur enthält die Kulturbrühe 3,3 mg/ml'cAMP.

1 Liter Kulturfiltrat, das durch Abfiltrieren der Zellen und der niederschlage aus der Kulturbrühe erhalten wird, v/ird mit Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt und mit Aktivkohle versetzt. Dieses Gemisch wird gründlich gerührt, wobei das cAMP an der Aktivkohle adsorbiert wird. Die Aktivkohle wird abfiltriert, und das adsorbierte cAMP wird mit einem Ammo- . niak-Äthanol-Gemisch eluiert. Das Eluat v/ird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird über einen Ionenaustauscher (Dowex 1 χ 2 in der Chloridform) gegeben. Der Austauscher wird mit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Salzsäure eluiert. Die cAMP enthaltenden ■ Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird mit Äthanol versetzt, wobei 1,8 g Rohprodukt in kristalliner Form erhalten wird» Das Rohprodukt v/ird umkristallisiert. Sämtliche bei der Elementaranalyse erhaltenen Werte, die Bestimmung des Baaen-, Zuckerund Phosphorsäuregehaltes, das UV- und das IR-Absorptionsspektrum und die bei der Papierchromatographie erhaltenen. R_f-W er te zeigen, daß es sich bei der erhaltenen Verbindung um cAM? handelt«

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■ Beispiel -2 .

Es wird eineAnzuchtkultur von Corynebacteriura murisepticum ATCC 21374 hergestellt. Ein 5 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat, 0,3 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1 Prozent Magnesiumsulfat, 1 Prozent Maisquellwasser, 0,3 Prozent säurehydrolysiertes Casein, 200 mg/Liter Kalium-

und. ;'-·■...
fluorid / 1,5 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium, dessen pH-Y/ert vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt wird, wird mit dieser Anzuchtkultur'beimpft. Das Züchten wird 60 Stunden bei 30⁰C in Schüttelkultur gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Nach dieser Zeit enthält die Kulturbrühe 2,3 mg/ml cAMP. Eine ohne Kaliumfluorid-Zusatz gezüchtete Eontrollkultur enthält lediglich 0,2 mg/ml cAMP.

Beispiel 3'

Es wird eine Anzuchtkultur von Arthrobacter sp. ATCC 21375 hergestellt. Das Züchten erfolgt gemäß Beispiel 1 in einem Kulturmedium mit der in Beispiel 1 angegebenen Zusammen-Setzung mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium 24 Stunden - nach Beginn des Züchtens mit 100 rag/Liter ITatriumfluorid versetzt wird,, Das Züchten wird 96 Stunden bei 32⁰Cdurchgeführt. ITach dieser Zeit enthält die Kulturbrühe .2,1 mg/ml cAMP. In einer ohne IJatriumfluorid-Zusatz gezüchteten Kon- trollkultur ist fast kein cAMP enthalten.

Das Züchten wird unter Verwendung des in Beispiel 1 angege-

ΘΟΡΥ ^v

ÖRKSJNAHNSPECTEP ^: , ; ._;

""benen Stammes 72 Stunden gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mii; der Ausnahme j daf3 anstelle von Hatriurnfluorid 100 mg/Liter Magnesiumfluorid eingesetzt werden. Die Kulturbrühe enthält dann 3»0 mg/ral cALIP. In einer ohne Magnesiumfluorid-Zusatz gezüchteten Kontrollkultur ist fast kein cAMP enthalten. -

Beispiel 5

Das Züchten wird unter Verwendung des in Beispiel 2 angegebenen Stammes 60 Stunden gemäß Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Kalrumfluorid 200 mg/Liter Lithiurnfluorid eingesetzt werden. Die Kulturbrühe enthält dann 2,1 mg/ml cAMP. In einer ohne Lithiumfluorid-Zusatz gezüchteten Kontrollkultur ist fast kein cAMP enthalten.

Beispiel 6

Durch etwa 12stündiges Züchten von Microbacterium sp_o ATCC 21376 in einem 1 Prozent Glucose, 1 Prozent Pepton, 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenen Anzuchtmedium bei 3O⁰C wird eine Anzuchtkultur hergestellt, Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 1 Prozent Kaliumdlhydrogenphosphat, 1 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 1 Prozent Magnesiumsulfat, 10 mg/Liter Kobalt(II)-Chlorid, 30//g/Liter Biotin, 100 mg/Liter IJatriumfluorid, 0,5 Prozent Pepton und 1 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen pH-Y/ert auf 7,6 eingestellt wird, 30 ml des Kulturmediums v/erden in einem 250 ml fassenden konischen Kolben 10 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Das

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VfcQrilisierte Kulturmedium wird dann mit der Anzuchtkultur in einem Verhältnis von 10 Volumprozent beimpft. Das Züchten wird 72 Stunden bei 3O°C in Schüttelkultur durchgeführt«, 20 und 40 Stunden nach Beginn des Zucht ens wird das Kulturmedium mit Adenin versetzt, sodaß dessen Konzentration jeweils 2 mg/ml beträgt. IJach beendetem Züchten enthält das Kulturmedium 9,7 mg/ml cAMP. Eine ohne Hatriumfluorid-Zusatz gezüchtete Kontrollkultur enthält lediglich 2,1 mg/ml cAMP.

Beispiel 7

Es wird eine Anzuchtkultur von Microbacterium sp· ATOC 21376 hergestellt» Das Züchten erfolgt gemäß Beispiel 6 in einem Kulturmedium mit der in Beispiel 6 angegebenen Zusammensetzung. Zur Kontrolle wird eine Kultur ohne latriumfluorid-Zusatz' gezüchtet. In der Tabelle I sind die zugesetzten Vorläufer, deren Mengen, die Zugabezeiten und die nach 72stün4iger Züchtung bei 30⁰O in der Kulturbrühe enthaltenen eAMP-Mengen zusammengestellt.

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Tabelle I

Vorläufer	zugesetzte Menge, mg/ml	20 Stunden	CAMP	ohne NaF- Zusata, mg/ml
Adenosin Hypoxanthin Inosin AICA⁺ AICAR⁺*	O Stunden	4 0 5 O 4	mit KaB¹- Zusatz, mg/ml	2,3 2,4 2,2 1,8 2,4
O 3 O 3 O	4,7 7,1 5,8 6,4 5,1

5-Amino-4-imidazolcarbos:amid
5-Amino~4-imidazoloarboxamidribosid

Beispiel

Es wird eine Anzuchtkultür von Arthrobacter sp. ATCC 21375 hergestellt. Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Kaliuindihydrogenpliospliat, 0,3 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1 Prozent LIagnesiumsulfat, 1 Prozent Maisquellwasser, 0,5 Prozent saurehydrolysiertes Casein und 1,5 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen pH-Y/ert vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt wird. Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahmej daß das Kulturmedium beim Beimpfen mit der Anzuchtkultür mit 200 mg/Liter Kaliumfluorid versetzt wird. Als Kontrolle wird eine Kultur .ohne Kaliumfluorid-Zusatz gezüchtet.

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In der Tabelle II sind die zugesetzten Vorläufer, deren . Mengen, die Zugabezeiten und die nach 60stündiger Züchtung bei 3O⁰C in der Kulturbrühe enthaltenen cAMP-Mengen. zusammengestellt.

Tabelle

II

	zugesetzte Menge, mg/ml	_	cAICP	ohne KP-
Vorläufer		20.Stunden		Zusatz ■
			mit KP-	mg/ml
	C St^-UxIu-CIj.	3	Zusatz,	1,8
		4 ·	mg/ml	1,6
Hypoxanthin	3	2	5,2	2,2
Adenosin	0	,2	4,8	1,7
Succinyl- adenin	2	5,7
Succinyl- adenosin	2	4,3

Beispiel9

Es v/ird eine Anzuchtkultür von Corynebacterium murisepticum ATCC /21374 hergestellt. Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß de.3 Kulturmedium 20 Stunden nach Beginn des Züchtens zusammen mit den in der Tabelle III aufgeführten. Vorläufern mit 100 mg/Liter Natriumfluorid versetzt wi£d. Nach 90stlindiger Züchtimg bei 30⁰C enthalten die KulturbrUhen die in der Tabelle III angegebenen cAMP-'Mengen.

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- 14 Tabelle III

Vorläufer	zugesetzte Menge, mg/ml	• cAl	.P
Adenin	.3	mit ITaI'¹- Zusata, mg/ml	ohne ITaU- Zusatz, ■ mg/ml
Adenosin	.4	5,3	2,2
Hypoxanthin	3	4,7	2,1
Inosin	4	5,5	1,8
AICA	3	4,3	2,1
4,3	1,9

Beispiel

10

Es wird eine Anzuchtkultur von Lücrobacterium sp. ATCC 21376 hergestellt. Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das - Kulturmedium 20 Stunden nach Beginn des Züchtens mit den in der Tabelle IV aufgeführten Vorläufern versetzt wird. Nach 72stündiger Züchtung bei 3O⁰C enthalten die Kulturbrühen die in der Tabelle IV angegebenen cAMP-Mengen.

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Tabelle IV

Vorläufer	CAMP . ·	ohne itfaF-Zusatz. mg/ml
5'-Inosinsäure 5'-Adenylsäure AICARP⁺	mit IaF-Zusatζ, mg/ml	0,4 0,6 0,5
2,3 1,8 1,7

⁺ 5-Amino-4-imidazolcarl3Oxamidribotid

Beispiel 11

Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Aus- . nähme, daß anstelle von Hatriurnfluorid 100 mg pro Liter Magnesiumfluorid eingesetzt werden. Hach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe 9,5 mg/ml cAMP. Eine ohne Magnesiuinfluorid-Zusatz gezüchtete Kontrollkultur enthält lediglich 2,4 mg/ml cAMP. ·

B e i s ρ i e 1 12

Die Züchtung wird 72 Stunden gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von latriumfluorid 100 mg/Liter Lithiumfluorid eingesetzt werden, Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe 9,3 mg/ml cAMP* Eine ohne Lithiuwifluorid-Zusatz gezüchtete Kontrollkultur enthält lediglich 2,2 mg/ml c AMP.

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Claims

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P a t ent a η s ρ r ü c h e

Verfahren zur biotechnischen Herstellung zyklischer Adeno- · sin-3^f,5'~monophosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Produktion zyklischer Adenosin-3% 5'-monophosphorsäure befähigten LlikrοOrganismus in einem mindestens ein Pluorid enthaltenden liährmedium züchtet, die Zellen abtrennt und die zyklische Adenosin-3',5^f-inonophosphorsäure aus dem Kulturfiltrat isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fluorid ITatriumfluorid, Kaliumfluorid, Calciumfluorid, Magnesiumfluorid, Lithiumfluorid, Bariumfluorid, Ammoniumfluorid oder Zinkfluorid einsetzt,
3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium murisepticum AT¹CC 21374, Arthrobacter sp. ATCC 21375 oder Microbacterium sp. ATCC 21376 einsetzt.
4· Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Hährmedium durchführt, das · zusätzlich mindestens einen Vorläufer der zyklischen Adenosin-3',5'-monophosphorsäure enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vorläufer Adenin, Adenosin, Adenylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Inosinsäure, 5-Ainino-4-imidazolcarboxainid, 5-Arnino-4-imidazolcarbo3camidribosid, 5-Amino~4-imidazolcarboxa;::id~ ribotid, Succinyladenin oder Succinyladenosin einsetzt,

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6*· Verfahren zur biotechnischen Herstellung zyklischer Adenosin-3's5'~monophosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, 'daß man Corynebacterium murisepticuw ATCG 21374» Arthrobacter sp. ATCC 21375 oder Ilicrobacterium sp. ATCC- 21376 in. einem mindestens eines der fluoride· Hatriumfluorid, Kaliitmfluorid, Calciumfluorid, Iilagnesiumfluorid, Lithiumfluorid, Bariumfluorid, Ammoniumfluorid und Zinkfluorid in !,!engen von 1 bis 2000 mg/Liter und mindestens einen der Vorläufer Adenin, Adenosin, Adenylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Inosin~ säure, 5~Amino-4-imidazolcarboxamid, 5-Ami:io--i-imidazolcarbosamidribotid, 5-Amino-4-iniidazolcarbozainidribosiaj Succinyladeniri oder Succinyladenosin in Mengen von 1 bis 20 g/Liter enthaltenden liährmedium züchtet, die Zellen abtrennt und die zyklische Adenosin~3^!j5'~monophosphorsäure aus dem I^ilturfiltrat isoliert.

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