DE2427484C3

DE2427484C3 - Verfahren zur Herstellung von zyklischer -3'3'-Cytidylsäure durch Fermentierung

Info

Publication number: DE2427484C3
Application number: DE2427484A
Authority: DE
Inventors: Jiro Noda Ishiyama; Tamotsu Nagareyama Yokotsuka
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1973-06-08
Filing date: 1974-06-07
Publication date: 1978-08-03
Also published as: US3926725A; JPS5325039B2; DE2427484A1; DE2427484B2; JPS5013587A

Description

H H C-H

O O H C-C

O OH

HO

Zur chemischen Synthese von CCMP nach derzeit bekannten Verfahren sind viele und komplexe Verfahrensstufen erforderlich. Diese Stufen sind beispielsweise:

Cytosin ^Stufe ' , Benzylcytosin ^{Stufe 2} , Ben-

zylcytidin

Benzylcytidin-S'-monophoszyklische 3',5'-Benzylcytidilsäure

^Stufe5 > zyklische 3',5'-Cytidylsäurc.

(G.M.Blackburn, J.S.Cohen imdA.T.Todd, Tetrahedron Letters 39, 2873 [1964]; R. K. Borden und M. S m i t h, J. Org. ehem. 31,3241,1966 [1964]; G. J. Drummond.M. W.Gilgan, E. J. Reimer und M. Smith, J. Amer. Chem. Soc, 86, 1626 [1964]; G. J. Smith, G. J. Drummond und H. G. K h ο r a η a, j. Amer. Chem. Soc, 83, 698 [1968]; G. M. T e η e ζ, H. G. Khorana, R. Markham und E. H. P ο I e, J. Amer. Chem. Soc., 80,6223 [1958]).

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein neues Verfahren zur Herstellung von CCMP durch Fermentierung unter Verwendung eines Mikroorganismus zu schaffen, das darüber hinaus billig im industriellen Maßstab durchführbar ist.

Die Erfindung wird in den Patentansprüchen definiert.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind Corynebakterium murisepticum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P Nr. 206) und Corvnebakterium Nr.

MT-11 (ATCC 31019, FERM-P Nr. 2384) als Mikroorganismen, die zu der Gattung Corynebakterium gehören, Arthrobacter 11 (ATCC 21375, Ferm-P Nr. 207) und Arthrobacter Nr. MT-12 (ATCC 31020, Ferm-P Nr. 2482) als Mikroorganismen, die zu der Gattung Arthrobacter gehörig sind, und Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106), Microbakterium Nr. 205-CM7 (ATCC 21979, Ferm-P Nr. 1557) und Microbakterium Nr. MT-3 (ATCC 21981, FERM-P Nr. 787) als Mikroorganismen, die zu der Gattung Microbakterium gehörig sind.

Die mykologischen Eigenschaften von Corynebakterium muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter 11 und Microbakterium Nr. 205 sind im Detail, beispielsweise in der US-PS 36 30 842, beschrieben.

Microbakterium Nr. 205-CM7 stellt einen Mikroorganismus dar, der dadurch erhalten wurde, daß man Microbakterium Nr. 205 als Mutterstamm einer derartigen üblichen künstlichen Mutation, wie sie nachstehend erwähnt wird, unterwirft.

Das heißt, 10 ml einer Suspension von Sporen von Microbakterium Nr. 205 (Zahl der Sporen: 2 bis 5 · lOVml) wurden η 0,1 ml Diäthylsulfat eingebracht und hiermit bei 3O⁰C während 60 Minuten unter Schüttelung in Berührung gehalten, auf ein Agarplattenmedium (Anmerkung 1) geschmiert und bei 30⁰C während 48 bis 100 Stunden zur Entwicklung einer Kolonie kultiviert, wonach dann der resultierende Mutant aus der Kolonie durch Sieben gewonnen wurde.

(Anmerkung 1):

Das Medium wies eine Zusammensetzung von 1 % Glucose, 0,5% (NH₄J₂SO₄, 0,5% Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 03% Casaminosäure, jOy/1 Biotin, 1% MgSO₄ und 2% Agar (pH 7,0), welches während 10 Minuten unter einem Dampdnr k von 6,8 kg/ 6,45 cm² (15 Ibs/inch²) sterilisiert worden war, auf. (Das vorstehend angeführte y/l bedeutet Gewicht in einem Liter des Mediums und % bedeutet einen Gewichtsprozentsatz in 100 ml des Mediums; das gleiche soll nachstehend gelten.)

Die Eigenschaften des Vitamin- und Aminosäurebedürfnisses des vorstehend erwähnten Mutanten sind die gleichen wie jene des Mutterstammes (d. h. der Mutant benötigt Biotin als Vitamin und erfordert nicht speziell Aminosäuren, wächst jedoch gut in Gegenwart von Asparagin, Asparaginsäure und Arginin).

Ein Mutant der andere Nährerforderniseigenschaften als jene des Mutterstammes aufweist, kann natürlich in dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch wirksam angewandt werden, daß man den Grad seines Nährmittelbedürfnisses geeignet befriedigt, wenn der Mutant eine Fähigkeit zur Erzeugung von CCMP aufweist.

Darüber hinaus werden die angeführten Corynebakterium muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter Il und Microbakterium Nr. 205 individuell einer solchen nachstehend erwähnten Diäthylsulfatbehandlung unter Erhalt von jeweils Mn + +-Ionen-permablen Mutanten Corynebakterium Nr. MT-Il, Arthrobacter Nr. MT-12 und Microbakterium Nr. MT-3 unterworfen.

Das heißt, 10 ml einer Suspension von Sporen von jeweils Corynebakterium muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter 11 und Microbakterium Nr. 205 (Zahl der Sporen: 2 bis 5 · 10⁹/ml) werden in 0,1 ml Diäthylsulfat eingebracht und unter Schüttelung bei 30°C während 16 Stunden in Berührung gehalten, 300 ml eines Mediums (Anmerkung 2) hinzugefügt und einer Schüttelkultur bei 30" C während weiteren 16 Stunden unterworfen, Nachfolgend werden die Zellen gewonnen, mit Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und auf das gleiche Medium geschmiert, wie es in der vorstehenden

-, Anmerkung 1 definiert wurde, jedoch mit der Ausnahme, daß in das Medium zusätzlich 500 mg/1 MnCIi · 4 HjO eingebracht worden waren, und bei 30⁰C während 72 Stunden zur Entwicklung von Kolonien kultiviert. Die derart entwickelten Kolonien

κι wurden willkürlich auf dem gleichen Medium, wie es in der vorstehenden Anmerkung 1 definiert ist, jedoch mit der Ausnahme, daß in das Medium 500 mg/l MnCIi · 4 HiO eingefügt worden waren, und auf dem gleichen Medium, wie es in der vorstehenden Anmer-ι kup.g 1 definiert ist, jedoch mit der Ausnahme, daß in das Medium 1 mg/I MnCl₂ · 4 H₂O eingefügt worden waren, gesammelt und bei 30⁰C während 48 Stunden kultiviert und Rassen, die in dem zuerstgenannten Medium, jedoch nicht in dem zuletztgenanriten Medium

:<> gewachsen waren, isoliert. Eine der somit isolierten Stämme ist jeweils das angeführte Corynebakterium Nr. MT-Il, Arihrobacter Nr. MT-12 und fvlicrobakierium Nr. MT-3.

(Anmerkung 2):

Das Medium besaß eine Zusammensetzung von 1 % Rindfleischextrakt, 1 % Polypepton, 0.5% Hefeextrakt und 03% Natriumchlorid (pH 7,0) welches während 15 Minuten unter einem Dampfdruck von 6,8 kg/6,45 cm² (15 Ibs/inch²) sterilisiert worden war.

Die Kolonien von Corynebakterium Nr. MT-Il, Arthrobacter Nr. MT-12 und Microbakterium Nr. MT-3 sind weiß gefärbt und die Rassen weisen die Eigenschaft,

Γ) daß sie Biotin als Nährmittel erfordern, wie die Mutterrassen auf.

Die vorstehend erwähnten Corynebakterium Nr. MT-11, Arthrobacter Nr. MT-12 und Microbakterium Nr. MT-3 stellen Stämme dar, die die Fähigkeit zur

κι Erzeugung von CCMP selbst dann aufweisen, wenn sie in einem Medium kultiviert werden, in das 0,02 bis 500 mg/1 Mn⁺+-Ionen in Form von MnCI₂ ■ H₂O und/oder 10 bis 1000 mg/1 Fe⁺+-Ionen im Form von FeCI₂ · 7 H₂O und/oder 10 bis 1000 mg/1 Fe⁺ + +-Ionen

r> in Form von FeCb ■ 7 H₂O eingebracht wurden, und stellen somit Stämme dar, die gegenüber Mn + + -, Fe + + und Fe+ + +-Ionen resistent sind (die Bezeichnung »resistent« bedeutet, daß die Stämme durch die Metallionen nicht in ihrem Wachstumszustand jedoch in

Vi ihrer CCMP-Produktivität ungestört gelassen sind). Wenn die angeführten Stämme angewandt werden, kann CCMP ohne Verringerung der Erzeugung an CCMP selbst in einem Medium gewonnen werden, das natürliche Substanzen umfaßt und relativ große

ν, Mengen an Mn++-, Fe++- und Fe++ +-Ionen enthält, z. B. einem Medium, das Leitungswasser und hohe Konzentrationen an Fleischextrakt, Proteinhydrolysatlösung, Maisstärkesaft, Reiskleie, Melassen, Fischlauge (fish solubles), Destillationsschlämpe (distillers solubles)

wi etc. umfaßt und ein oder mehrere Mn++-, Fe⁺ + - und Fe⁺+ +-Ionen enthält, die größer als jene, die vorstehend erwähnt wurden, sind.

Darüber hinaus können Stämme, die gegenüber Chemikalien, wie beispielsweise 5-Fluorouracil und

h-, 6-Azauracil resistent sind, ebenfalls wirksam in dem erfindungsgemäßen Verfahren dann angewandt werden, wenn sie die Fähigkeit zur Erzeugung von CCMP aufweisen.

Ein Teil der mycologischen Eigenschaften der vorstehend erwähnten Mutanten, d, h, Corynebakterium Nr. MT-U, Arthrobacter Nr. MT-12, Microbakterium Nr. 205-CM7 und Microbakterium Nr. MT-3, wie sie vorstehend erwähnt wurden, und weitere mykologische Eigenschaften der Mutanten sind mit jenen ihrer Mutterstämme, d. h, Corynebakterium muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter 11 und Microbakterium Nr. 205 identisch.

Zur Herstellung von CCMP nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden beliebige der vorstehend angeführten Stämme in ein Medium, das natürliche Substanzen umfaßt, oder in ein synthetisches Medium inokuliert, welches durch geeignete Vermischung von kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Nährstoffen, die durch die Stämme genutzt werden können, und, sofern erforderlich, anderen anorganischen Salzen und Komponenten als jenen hergestellt worden ist, und bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C während eines Zeitraumes bis die Erzeugung an CCMP ein Maximum wird, z. B. während 10 bis 160 Stunden, kuLvviert.

Die Erzeugung an CCMP wird dann weiter erhöht, wenn in das Medium zumindest eine Verbindung eingefügt wird, die aus der aus Cytosin, Uracil, Orotsäure, Ribosiden auf Grundlage dieser Verbindungen (d. h. Cytidin, Uridin und Orotidin), und ihren Ribotiden [z. B.

2'- (oder 3'- oder 5'-)Cytidylsäure,
Cytidin-2'- (oder 3'- oder 5'-)diphosphat,
Cytidin-2'- (oder 3'- oder 5'-)triphosphat,
2'- (oder 3'- oder 5'-)Uridylsäure,
Uridin-2'- (oder 3'- oder 5'-)diphosphat,
Uridin-2'- (oder 3'- oder 5'-)triphosphat,
Orotidin-2'- (oder 3'- oder 5'-)monophosphat,
Orotidin-2'- (oder 3'- oder 5'-)diphosphat und
Orotidin-2'- (oder 3'- oder 5'-)triphosphat]

nachstehend werden diese als »Cytosin und ähnliche Substan..3n« bezeichnet) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Im Fall, daß es gewünscht ist, die Kultivierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in Gegenwart des vorstehend erwähnten Cytosins und ähnlicher Substanzen durchzuführen, wird der in der Erfindung verwendbare Mikroorganismus in beispielsweise ein übliches Medium, wie es vorstehend erwähnt wurde, inokuliert und bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C während eines geeigneten Zeitraums, z. B. 6 bis 20 Stunden (diese Stufe wird als »Vorkultur« bezeichnet) kultiviert. Nachfolgend wird in die Kulturflüssigkeit zumindest eine Verbindung eingebracht, die aus der aus Cytosin und ähnlichen Substanzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist und die Kultivierung wird weiter bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C während eines Zeitraums fortgesetzt, bis die Menge an erzeugte/n CCMP ein Maximum wird, z. B. 4 bis 140 Stunden (diese Stufe wird als »Nachkultur« bezeichnet). In alternativer Weise wird der Mikroorganismus in das übliche Medium inokuliert, in welches zuvor zumindest eine Verbindung, die aus der aus Cytosin und ähnlichen Substanzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder ein Material, das beliebige von Cytosin und ähnlichen Substanzen enthält, oder eine Fermentationsflüssigkeit hiervon zuvor eingebracht worden ist, und sodann bii einem pH-Wert von ?. bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 4O⁰C während eines Zeitraumes, bis die Menge an CCMP ein Maximum wird, z. B, etwa 10 bis 160 Stunden, kultiviert. Die Menge an Cytosin und ähnlichen Substanzen, die dem Medium hinzugefügt werden soll, ist nicht in besonderer Weise beschränkt, wobei jedoch eine Konzentration von 0,05 bis 2% (GewVV) im allgemeinen bevorzugt ist.

Beispiele an bevorzugten Kohlenstoffquellen, die in dem vorstehend erwähnten Medium verwendet werden, umfassen verschiedene Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Galactose, Ribose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen; verschiedene organische Säuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure und Essigsäure; Alkohole, wie Glyzerin, Sorbit, Inosit und Mannit; und Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffin und Kerosin.

Beispiele für bevorzugte Stickstoffquellen schließen verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze neben Ammoniak, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat und AmnKviumacetat; stickstoffhaltige organische Verbindungen, w^:-e Harnstoff, Pepton, Kaseinhydrolysat, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisstärkesaft, Fischmehl und deren Derivate (digestives); und Aminosäuren, wie Alginin bzw. Alginsäure, Asparaginsäure, Asparagin, Histidin, Glutamin, Tyrosin, Tryptophan, Cycstein und Glycin ein.

Beispiele für anorganische Nährstoffe schließen anorganische Phosphate, wie Monokalium- und Mononatriumphosphate, Dikalium- und Dinatriumphosphate und Ammoniumphosphat ein. Beispiele für anorganische Salze außer anorganischen Phosphaten, die hinzugefügt werden, wie es die Gelegenheit erfordert, schließen verschiedene Metallsalze, wie Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisensulfat, Eisenchlorid, Zinksulfat, Kobaltsulfat und Mangansulfat; verschiedene Fluoride, wie Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Kalziumfluorid, Bariumfluorid, Ammoniumfluorid und Zinkfluorid; und Borsäure und deren Salze, wie Amnoniumborat, Kaliumborat, Natriumborat und Lithiumborat ein.

Wenn der in der Erfindung verwendbare Mikroorganismus in einem Medium in Gegenwart von zumindest einer Verbindung kultiviert wird, die aus der aus den vorstehend erwähnten Fluoriden, Borsäure und Boraten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wird die Erzeugung an CCMP weiter erhöht, in diesem Fall beträgt die Menge an Fluoriden, Borsäuren, Boraten, die zu dem Medium hinzugesetzt werden soll, vorzugsweise 0,1 bis 500 mg/1. Die Fluoride, Borsäure und Borate können dem Medium zuvor oder innerhalb etwa 30 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung hinzugefügt werden.

Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Nährstoffen werden Vitamine, wie Biotin, Vitamin Bi und B2 und Pantothensäure oder hiervon abgeleitete Verbindungen wirksam als geringfügigere Komponenten hinzugegeben. Pantothensäure stellt eine Verbindung aus der wasserlöslichen Vitam-B-Gruppe dar und ihre physiologischen Aktivitäten fallen mit jenen von Coenzym A (CoA) zusammen, welches im allgemeinen aus Pantothensäure bios/nthetisiert wird. Somit können solche Verbindungen, die im Verlauf der Coenzymbiosynthese gebildet werden, wie Pantothensäure, ^-Alanin, Pantothin, Pantosäure, Asparaginsäure, Valin, Dimethylbrenztraubensäure, Λ-Ketopantosäure, Pantothenylcystein, D( + )-4-Phosphopantothin, Diphosphocoenzym A und Coenzym A angewandt werden. In alternativer Weise können Derivate der Verbindungen (z. B. j3-Alanin enthaltendes Carnosin und Anserin) und natürliche Substanzen, die diese Verbindungen enthal-

ten (ζ. B. Hefeextrakt, Maisstärkesaft, Fischlauge, Fleischextrakt, Reiskleie, Melassen, Leberpulver, Pepton, NZ-Amin und Destillatschlempen) angewandt werden. Anstelle von Vitamin Bi können Thiamin verwandte Verbindungen, wie 4-Amino-5-aminomethyl-2-methyl-pyrimidin und 4-Methyl-5-/?-hydroxy-äthylthiazol angewandt werden. Die Verwendung natürlicher Substanzen, die diese Verbindungen enthalten, ist natürlich möglich.

Die Produktivität an CCMP erhöht sich, wenn Coffein, Theophylin, Theobromin oder dergleichen, Methylxanthin oder 2,3-, 2,4- oder 2,5-Pyridindicarbonsäure, Dipicolinsäure, 8-Hydroxychinolin, Polyphosphorsäure oder Pyrophosphorsäure, welche ein Wachstumsinhibitor für zyklische 3',5'-Nukleotidphosphordiesterase darstellt, zuvor in das Medium eingebracht oder im Verlauf der Kultivierung bis zu einer r»cr!zcn;ra;icri von Si™ mg/1 cin

wcrucn.

Die Kultivierung kann durch ein geeignetes Kultivierungsverfahren, wie eine Schüttelkultur, Rührkultur oder aerobe Kultur, durchgeführt werden.

Während der Kultivierung wird die Kulturflüssigkeit vorzugsweise gerührt und belüftet, so daß in dem Wachstumsstadium der Druck des in der Kulturflüssigkeit vorliegenden Sauerstoffes niedriger und jener von Kohlendioxid höher wird, während die Drücke dieser Gase in dem Stadium der CCMP-Produktion umgekehrt werden. Konkret ausgedrückt werden die Rührung und Belüftung vorzugsweise derart durchgeführt, daß man die Sauerstofftransfergeschwindigkeit bzw. -rate (Kd) und die Sauerstoffzuführungsgeschwindigkeit bzw. -rate (KGa) des Kultivierungstankes derart einstellt, daß beim Wachstumsstadium (6 bis 16 Stunden nach Initiierung der Kultivierung) der Druck des vorliegenden Sauerstoffes in der Kulturflüssigkeit auf 0,1 bis 0,6 Atmosphären und jener des hierin vorliegenden Kohlendioxides auf weniger als 0,08 Atmosphären geregelt wird, während der Druck in dem CCMP-Produktionsstadium (16 bis 60 Stunden nach Initiierung der Kultivierung) an Sauerstoff auf 0,2 bis 0,8 Atmosphären und jener von Kohlendioxid auf weniger als 0,05 Atmosphären geregelt wird.

Wenn die Menge an erzeugtem CCMP das Maximum erreicht hat, wird die Kultivierung unterbrochen und das CCMP, sofern erforderlich, aus der Kultur gewonnen und. sofern erforderlich, gereinigt. Die Gewinnung an CCMP kann beliebig nach der Adsorptionsmethodik und der Ausfällungsmethodik erfolgen, die entweder einzeln oder in Kombination angewandt werden können. Die hier angeführte Adsorptionsmethodik stellt eine Methodik dar, worin die Kulturflüssigkeit von den Zellen befreit wird und mit einem Adsorptionsmittel, wie einem Anionenaustauscherharz, Kationenaustauscherharz, Aktivkohle oder Aluminiumoxid, zur Adsorbierung des gewünschten CCMP auf dem Adsorbens in Berührung gebracht wird, wodurch das CCMP aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt wird. Die Ausfällungsmethodik stellt eine Methodik dar, worin die von den Zellen befreite Kulturflüssigkeit mit einem Nichtlösungsmittel für CCMP, wie einem niedrigen Alkohol oder Aceton, versetzt wird, wodurch das CCMP aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt und gewonnen wird. Wenn die Betriebsbedingungen der vorstehend erwähnten Methodiken in geeigneter Weise gewählt und zusammen kombiniert werden, kann CCMP gereinigt werden. Die vorstehend angeführten Betriebsbedingungen bedeuten die Art des Adsorbens, die Zusammensetzung und Konzentration des Eluates, etc im Fall der

Adsorptionsmethodik und bedeuten die Art und Menge des Nichtlösungsmittels für CCMP, die Behandlungstemperatur etc. im Fall der Ausfällungsmethodik.

Zur Veranschaulichung werden nachstehend verschiedene Methodiken zur Abtrennung und Gewinnung von CCMP aus der Kulturflüssigkeit angegeben.

(1) Das in der von Zellen durch Zentrifugieren oder Filtration befreiten Kulturflüssigkeit befindliche CCMP wird auf Aktivkohle adsorbiert und sodann mit einer wäßrigen ammoniakalischen Alkohol- oder Acetonlösung eluiert. Das Eluat wird durch Konzentrierung unter verringertem Druck vom überschüssigen Ammoniak befreit und sodann mit einem Anionenaustauscherharz (z. B. Dowex 1, Chloridtypus, oder Dowex 1, Formattypus) zur Adsorption von CCMP auf dem Harz in Berührung gebracht. Nachfolgend wird das CCMP mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. verdünnter Salzsäure öder Sifici'n Käi/.iuiiK.n!uriu-veruüiiiiit:-Sai/-säure-Lösungsmittel im Fall von Dowex 1, Chloridtypus, und verdünnter Ameisensäure oder einem Verdünnte-Ameisensäure-Natriumformiat-Lösungsmittel im Fall von Dowex 1, Formiattypus) eluiert. Das resultierende Eluat wird weiter mit Aktivkohle zur Adsorption von CCMP hierauf in Berührung gebracht, welches sodann mit einer wäßrigen ammoniakalischen Alkohol- oder Acetonlösung eluiert wird. Das hierdurch erhaltene Eluat wird von überschüssigem Ammoniak durch Konzentration unter verringertem Druck befreit, sofern erforderlich, auf einen pH-Wert von 5 bis 10 durch Zugabe einer 1- bis 50%igen Natriumhydroxidlösung oder 1- bis 50%igen Kaliumhydroxidiösung eingestellt, durch eine Aluminiumoxidsäule geführt und sodann mit einem Kationenaustauscherharz zur Adsorption des CCM P auf dem Harz in Berührung gebracht und soaann mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das hierdurch erhaltene Eluat wird unter verringertem Druck konzentriert und sodann in einem kalten Raum stehengelassen oder mit einem Nichtlösungsmittel für CCMP, wie Alkohol oder Aceton, versetzt, wodurch CCMP-Kristalle erhalten werden können.

(2) CCMP wird in der von Zellen durch Zentrifugieren oder Filtration befreiten Kulturflüssigkeit auf einem Adsorbens, wie Aktivkohle, adsorbiert und sodann mit einer wäßrigen ammoniakalischen Alkohol- oder Acetonlösung eluiert. Das Eluat wird von überschüssigem Ammoniak durch Konzentration unter verringertem Druck befreit, mir Chlorwasserstoffsäure angesäuert, mit einem organischen Lösungsmittel, wie Alkohol oder Aceton, versetzt und sodann in einem kalten Raum, beispielsweise stehengelassen, wodurcn rohe CCMP-Kristalle erhalten werden können. Die hierdurchb erhaltenen rohen Kristalle können unter Verwendung solcher Anionen- oder Kationenaustauscherharze, wie sie vorstehend erwähnt wurden, oder mit Aluminiumoxid gereinigt werden. Γη alternativer Weise werden die rohen Kristalle in Wasser aufgelöst, mit Chlorwasserstoff- oder Schwefelsäure angesäuert, mit einem Entfärbungsharz entfärbt, mit einem Nichtlösungsmittel für CCMP, wie Alkohol oder Aceton, versetzt und sodann in beispielsweise einem kalten Raum stehengelassen, wodurch Kristalle an CCMP erhalten werden können.

(3) CCNfP wird in der von Zellen durch Zentrifugieren oder Filtration befreiten Kulturflüssigkeit direkt auf einem Anionen- oder Kationenaustauscherharz adsorbiert und sodann mit einem Lösungsmittel eluiert Das resultierende Eluat wird einer Behandlung mit Aluminiumoxid, einer Behandlung mit Aktivkohle und einer

Reinigung mit einem Entfärbungsharz unterworfen und sodann in beispielsweise einem kalten Raum stehengelassen, wodurch Kristalle von CCMP erhalten werden können.

In dem Fall, iaß die Kühlflüssigkeit 3',5'-zyklische Adenylsäure, 2'-Nukleotid, 3'-Nukleotid und 5'-Nukleotid enthält, wird die Kulturflüssigkeit im Verlauf der Reinigung einer Adsorptionsbehandlung unter Verwendung von beispielsweise einem lonenaustauscherharz unterworfen und sodann der Elutionsvorgang durch geeignete Wahl der Art des Elutionsmittels, der Salzkonzentration, der Säurekonzentration etc. bewirkt, wodurch CCMP von der genannten Säure und den Nukleotiden entfernt werden kann.

In dem Fall, wo die Kulturflüssigkeit 2'-Nukleotid, 3'-Nukleotid und 5'-Nukleotid enthält, wird die Kulturflüssigkeit auf einen pH von 5 bis 10 eingestellt und sodann durch eine Aluminiumoxidsäule geführt, wodurch die Nukleotide entfernt werden können (Aluminiumoxid adsorbiert solche zyklische 3'.5'-Nukleotide. wie 3',5'-zyklische Adenylsäure und CCMP nicht, abdorbiert jedoch 2'-Nukleotid, 3'-Nukleotid und 5'-Nukleotid).

In dem Fall, wo die CCMP-enthaltende Flüssigkeit einer Konzentration unter verringertem Druck unterworfen wird, ist es bevorzugt, daß die Flüssigkeit konzentriert wird, nachdem das freie CCMP in Form eines Salzes, wie als Natriumsalz oder Kalziumsalz umgewandelt ist.

Das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in vorstehender Weise erhaltene CCMP stimmt bezüglich der Elementaranalyse, der Ribosebestimmung, der Phosphorbestimmung, des UV-Absorptionsspektrums und des Infrarotabsorptionsspektrums mit handelsüblichem, autentischem CCMP überein, das durch chemische Synthese gewonnen ist.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann CCMP, welches bisher lediglich durch ein Syntheseverfahren erzeugt worden ist, welches viele und komplexe Schritte erfordert, durch Fermentierung in einer Stufe und in einem kürzeren Zeitraum, wie vorstehend erwähnt, erhalten werden. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren als Verfahren zur Herstellung von CCMP äußerst vorteilhaft.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele, die keine Einschränkung darstellen, weiter veranschaulicht.

In jedem der Beispiele wurde die Menge an erzeugtem CCMP gemäß der lonenaustauschchromatografie (R. Berk ν ist: Acta. Chem. Scan. 10, 1303 [1956]) oder durch zweidimensionale Papierchromatografie

(primäres Lösungsmittel = Isobutyrsäure : I n-Essigsiiure : 1 n-Ammoniak = IO : 1 :5 [in Volumen]; sekundäres Lösungsmittel = gesättigte Ammoniumsulfatlösung: 1 m-Natriumacetatlösung : Isopropylalkohol =

80:20:2 [in Volumina)),

Beispiel 1

Jede der in Tabelle I angegebenen Stämme wurde in einem Schrägmedium, das eine Zusammensetzung von 0,5% (NH₄J₂SO₄. 0.5% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 1% Kasaminosäure, 0,3% Hefeextrakt, 1% Glucose und 2% Agar aufwies, zur Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde ein Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 0,5% Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 1% Asparagin, 0,5% MgSO₄ · 7 H₂O, 200 γ/\ Biotin, 0,02% Kalziumpantothenat, 0,002% Thiaminhydrochlorid, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O und 0,00005% Fe₂(SO₄)) ■ 7 H₂O (pH 8,0, eingestellt durch Zugabe von 3 n-KOH) aufwies, in einen 5-Liter-Schüttelkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115°C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in dem Schüuelkolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 70 Stunden unter Schüttelungbei 180 U/min unterworfen.

Die Menge an CCMP, die in jeder Kulturflüssigkeit in diesem Stadium erzeugt ist, ist in Tabelle 1 wiedergegeben.

Sodann wurde jede Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und das Oberstehende auf pH 4,0 durch Zugabe von 3 n-HCl eingestellt und sodann durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule zur Adsorption von CCMP auf Aktivkohle geführt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit 50%igem Äthanol, welcher 1,4% Ammoniak enthielt, zur Elution von CCMP behandelt Das Eluat wurde unter verringertem Druck bei 50⁰C zur Entfernung von überschüssigem Ammoniak konzentriert, auf pH 8,0 unter Verwendung von 3 n-NH₄OH eingestellt und sodann durch eine mit Kunstharz-Ionenaustauscher gefüllte Säule des Ameisensäuretypus zur Adsorption des CCMP auf dem Harz geführt Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, mit 0,02 n-Ameisensäurelösung voreluiert (CCMP und 3',5'-zyklische Adenylsäure wurden nicht eluiert), und weiter mit einer 0,10 n-Ameisensäurelösung (3',5'-zyklische

ji Adenylsäure wurde nicht eluiert und lediglich CCMP wurde eluiert) unter Erhalt einer CCMP-Fraktion eluiert. Diese CCMP-Fraktion wurde auf pH 7.0 mit 3 n-KOH eingestellt und sodann durch eine mit neutralem Aluminiumoxid gefüllte Säule geführt. Das resultierende ausströmende Material, welches lediglich CCMP enthielt, wurde auf pH 2,0 mit 50%iger HCI eingestellt und sodann durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule zur Adsorption von CCMP auf Aktivkohle geführt Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und

4> sodann mit einer 50%igen Äthanollösung, die 1,4% Ammoniak enthielt, behandelt. Das Eluat wurde unter verringertem Druck zur Entfernung des überschüssigen Ammoniaks konzentriert, durch eine mit Kunstharz-Ionenaustauscher gefüllte Säule in der Η-Form zur

">o Entfernung von Ammoniak geführt, weiter unter verringertem Druck konzentriert, mit Aceton versetzt und sodann bei 0°C während 20 Stunden unter Bildung \on CCMP-Kristallen stehengelassen. Die Kristalle wurden durch Filtration gewonnen und im Vakuum unter Erhalt von CCMP-Kristallen getrocknet

Die Menge des auf vorstehende Weise aus 10 Litern Kulturflüssigkeit jeder Rasse erhaltenen CCMP ist in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

Stamm

Menge an CCMP erzeugt gewonnen

(mg/1) (mg)

Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC
21374, FERM-P Nr. 206)

21

Fortsetzung

S bi mm	Menge an	CCMI'
	erzeugt	gewonnen
	(mg/l)	(mg)
Arthrobacter 11 (ATCC	5	26
Nr. 21375, FERM-f'Nr. 207)
Microbakterium Nr. 205	8	34
(ATCC 21376, FERM-P
Nr. 106)

Beispiel 2

Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) wurde bei 28°C während 16 Stunden in einem Medium, das eine Zusammensetzung von 2% Glucose, 1% Polypepton, 0,7% Hefeextrakt und 0,2% Natriumchlorid (pH 7.0) aufwies, kultiviert. Andererseits wurde 1 Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 1% Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 2% Histidin, 0,2% MgSO₄ · 7 H₂O. 200 y/l Biotin, 0,02% Kalzium-, pantothenat, 0,001% Folsäure, 0,0005% CoSO₄ ■ 7 H₂O, 0,000005% FeSO₄ · 7 H₂O und 3 g/l von jeweils den in Tabelle 2 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115°C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erhaltene Kultur wurde in dem Medium in dem Kolben in einer Menge von 10% inokuliert und bei 30°C während 80 Stunden mit 180 U/min geschüttelt.

Die Menge an CCMP, die in jeder Kulturflüssigkeit in dieser Stufe erzeugt wurde, ist in Tabelle 2 wiedergegeben.

Sodann wurde jede Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach die gleiche Behandlung wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die Menge der aus 10 Litern jeder Kulturflüssigkeit gewonnenen CCMP ist in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Verbindung

Cytosin

Cytidin

5'-Cytidylsiiure

2'-CytidyIsäure

3'-Cytidylsäure

Cytidin-5'-diphosphat

Cytidin-5'-triphoshat

Keines

Beispiel 3

Jeweils Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-Nr. 206), Arthrobacter II (ATCC 21375, FERM-P 207) und Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106) wurden in einem Schrägmedium, das eine Zusammensetzung von 0,5% (NH₄J₂SO₄,

Menge an	CCMP
erzeugt	gewonnen
(mg/1)	(mg)
98	382
99	333
115	415
30	107
45	118
83	321
79	245
6	12

0,5% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 1% Kasaminosäure, 0,5% Hefeextrakt, 1% Glucose und 2% Agar aufwies, tor Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurden 40 ml eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose. 0.5% Harnstoff, 0,5% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 3 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 500-ml-Schüttelkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115° C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Kultur wurde in das Medium in dem Schüttelkolben inokuliert und bei 3O⁰C während 70 Stunden mit 140 U/min geschüttelt.

Die Menge an in jeder Kulturflüssigkeil in diesem Stadium erzeugten CCMP ist in Tabelle 3 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde jeweils die Kulturflüssigkeit /.ur Entfernung der Zellen zentrifugiert und die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

DieCCMP-Menge, die aus 10 Litern jeder Kulturflüssigkeit gewonnen wurde, ist in Tabelle 3 wiedergegeben.

Tabelle 3

Rasse Verbindung

Cytosin
Cytidin
keine

Menge an	CCMP
er/eugt	gewonnen
(mg/1)	(mg)
63	223
78	256
4	10
118	327
105	336
5	12
110	320
104	285
6	12

C: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC Nr. 21374, FERM-P Nr. 206).

A: Arthrobacter 11 (ATCC 21375. IERM-P Nr. 207).
M: Microbakterium Nr. 205 (ATCC Nr. 21.176. FERM-PNr. 106).

Beispiel 4

Microbakterium Nr. MT-3 (ATCC Nr. 21 981, FERM-P Nr. 787) wurde einer Schüttelkultur bei 28° C während 16 Stunden in einem Medium, das eine Zusammensetzung von 4% Abfallmelasse, 1% Fleichextrakt, 0,5% Maisstärkesaft und 0,1% Natriumchlorid (pH 7,0) aufwies, zur Erzeugung einer Samenkultur unterworfen. Andererseits wurde 1 1 eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 1 % Harnstoff, 0,5% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 1% Fleischextrakt, 0,5% Maisstärkesaft, 1,0% MgSOWH₂O, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,02% FeCl₂ · 7 H₂O, 3 g/l jeweils der in Tabelle 4 angegebenen Verbindungen und Leitungswasser (pH 7,5, eingestellt mit 3 n-KOH) aufwies, in einen 5-Liter-ErlenmeyerkoIben eingegeben und in einem Autoklav bei 115°C während 10 Minuten sterilisiert (Das Medium enthielt 1,02 mg/I Mn⁺⁺ in Form von MnCi₂ · 4 H₂O, i 12 mg/1 Fe+ + in Form von FeCl₂^H₂O und 88 mg/1 Fe+ + + in Form von

FeCl) · 7 H2O.) Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10% inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die Menge an CCMP, die in jeder Kultur zu diesem Stadium erzeugt war, ist in Tabelle 4 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde jede Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 10 Litern jeweils der Kulturflüssigkeit erhaltene CCM P-Menge ist in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Verbindung

Menge an CCMP

erzeugt gewonnen

(mg/1) (mg)

Cytosin

Cytidin

S'-Cytidylsiiurc

.V-Cytidylsüure

Keine

190
200
181

170

800 791 534 532 28

Beispiel 5

Jede der in Tabelle 5 angegebenen Rassen wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 unter Herstellung einer -> Samenkultur kultiviert. Andererseits wurco 1 Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 7,5% Glucose, 1% Harnstoff, 1% KH₂PO₄,1% K₂HPO₄,0,5% Hefeextrakt, 1% Polypepton, 1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,02% ZnSO₄ · 7 H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 5 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei I I5°C während 12 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10% inokuliert und sodann einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die CCMP-Menge, die in der Kulturflüssigkeit jeweils in dieser Stufe erzeugt wurde, ist in Tabelle 5 wiedergegeben.

j> Die Menge an CCMP, die aus IO Litern der Kulturflüssigkeit jeweils gewonnen wurde, ist in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Verbindung

Rasse C	CCMP	Rasse M	CCMP
Menge an	gewonnen	Menge an	gewonnen
erzeugt	(mg)	erzeugt	(mg)
(mg/1)	334	(mg/1)	256
110	95	120	100
34	90	45	112
35	287	48	278
107	280	HO	256
108	13	98	15
7	8

5'-Cytidylsäure

3 -Cytidylsäurc

2'-Cytidylsäure

Cytidin-5'-diphosphat

Cy tidin-5'-tri phosphat

Keine

C: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC Nr. 21 374, FERM-P Nr. 206). M: Microbakterium Nr. 205(ATCC Nr. 21 375. FERM-PNr. 106).

Beispiel 6

Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 zur Erzeugung einer Samenkultur kultiviert Andererseits wurde 1 Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 7,5% Glucose, 1% Harnstoff, 0,5% KH₂₁PO₄I 0,5% K₂HPO₄, 0,5% Glycin, 03% Hefeextrakt, 1% MgSO₄ · 7 H₂0,0,02% ZnSO₄ ■ 7 H₂O und 3 g/I jeweils der in Tabelle 6 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 7^, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115° C während 12 Minuten sterilisiert Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10% inokuliert und sodann einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 20 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen. Nachfolgend wurde eine l%ige Lösung des Fluorides, von Borsäure oder des Borates, die in Tabelle 6 angegeben sind (die zuvor in einem Autoklav bei 110⁰C während 10 Minuten sterilisiert worden war), zu dem Medium in einer in Tabelle 6 angegebenen Konzentration hinzugegeben und die Schüttelkultur bei 30⁰C während 60 Stunden unter Schüttelung bei 180 U/min weiter fortgesetzt

Die Menge an CCMP, die in diesem Stadium in jeweils der Kulturflüssigkeit erzeugt wurde, ist in Tabelle 6 angegeben.

Nachfolgend wurde jeweils die Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 10 Litern jeweils der Kulturflüssigkeit gewonnene Menge an CCMP ist in Tabelle 6 angegeben.

	Tabelle 6	24 27	Zusatz	484	-	-	16	CCMP
15	Verbindung		Fluorid, Borsäure		100	200		gewonnen
		oder Borat		5	10	Menge an ι
			-	erzeugt	(mg)
	Borsäure	Konzen	100		611
Cytosin	Zinkfluorid	tration	50	(mg/1)	638
	keiner	(mg/1)	-	186	290
	Borsäure	40	100	194	680
Cytidin	Zinkfluorid	50	100	104	622
	keiner	-	-	184	257
	Natriumborat	40	eingegeben und *19 N^tniltpn ct#ri**	187	685
5'-Cytidylsäure	Kobaltfluorid	50		84	635
	keiner	-	197	276
	Natriumborat	100	184	125
3'-Cytidylsäure	Kobaltlluc.id	5	94	219
	keiner	53	96
	Kaliumborat	74	139
2'-Cytidylsäure	Kaliumfluorid	34	205
	keiner	50	80
	Zinkborat	64	649
Cytidin-5'-diphosphat	Natriumfluorid	28	610
	keiner	188	287
	Ammoniumborat	184	640
Cytidin-S'-triphosphat	Eisen(III)-fluorid	95	637
	keiner	181	297
		188	in einem Autoklav bei 115° C w
Beispiel 7	90

Jeweils Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) und Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2 unter Erzeugung einer Samenkultur kultiviert Andererseits wurde 1 1 eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 1% Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 1% K₂HPO₄, 0,5% Hefeextrakt, 1% Polypepton, 1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,02% ZnSO₄ · 7 H₂O und 3 g/l jeweils der in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Verbindungen aufwies und jeweils die in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Fluoride, Borsäure und Borate in den in den Tabellen angegebenen Konzentrationen enthielt (pH 7,5, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben

das Medium in einer Menge von 10% inokuliert und sodann einer Schüttelkultur bei 30° C während 8G Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die in der Kulturflüssigkeit in diesem Stadium jeweils erzeugte CCMP-Menge ist in den Tabellen 7 und 8 angegegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit jeweils zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel I unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die Menge an CCMP, die aus 10 Litern dei Kulturflüssigkeit jeweils erhalten wurde, ist in der Tabellen 7 und 8 angegeben.

Tabelle 7 Rasse: Arthrobacter Il (ATCC 21 375, FERM-P Nr. 207)

Verbindung	Zusatz	Konzen	Menge an	CCMP	809 631/163
	Fluorid, Borsäure	tration	erzeugt	gewönnen
	oder Borat	(mg/1)
		30	(mg/1)	(mg)
Cytosin	Nütriumfluorid	20	165	518
	Borsäure	-	134	386
	keiner		94	274

	Fortsetzung	24 27 484	Zusatz	Konzen	5	-	Konzen	18	CCMP	CCMP I
17	Verbindung		Fluorid, Borsäure	tration	100	100	tralion		gewonnen	gewonnen f
		oder Borat	(mg/I)	-	50	(mg/1)	Menge an
		10	100	"	100	erzeugt	(mg)	(mg) I
	Kaliumfluorid	40	2		100		489	325 Ϊ
Cytidin	Natriumborat	-	muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 376,	-	(mg/1)	350	427 I
	keiner	100	Zusatz	50	168	251	97 f
	Zinkfluorid	40	Fluorid, Borsäure	100	128	478	286 )
5'-Cytidylsäure	Natriumborat	-	oder Borat	-	88	412	385 I
	keiner	100		30	158	267	94 *
	Zinkfluorid	100	Ammoniumlluorid	20	140	197	271 ;
3'-Cytidylsäure	Kaliumborat	-	Zinkborat	-	87	116	416
	keiner	keiner	50	60	79	98
	Kobaltfluorid	Natriumfluorid	20	42	178	117
2'-Cytidyl säure	Kaliumborat	Zinkborat	-	38	107	118
	keiner	keiner	50	51	58	74
	Ammoniumfluorid	Kaliumfluorid	30	40	405 I	98
Cytidin-5'-diphosphat	Kobaltborat	Kobaltborat	-	24	370 §	120
	keiner	keiner		158	217 j	70
	Ammoniumfluorid	Zinkfluorid	135	478 I
Cytidin-S'-triphosphat	Zinkborat	Kobaltborat	74	381 I
	keiner	keiner	161	235
		Zinkfluorid	129
Tabelle 8		Borsäure	88	FERM-P Nr. 206) \|
Rasse: Corynebakterium		keiner		Menge an
Verbindung				erzeugt

		(mg/1)
	98
Cytosin	134
	36
	87
Cytidin	128
	35
	86
5'-Cytidylsiiure	138
	37
	34
3'-C'ytidylsiiure	42
	25
	30
2'-Cytidylsiiure	38
	24

Fortsetzung Verbindung

Zusatz

Fluorid, Borsäure oder Borat Konzentration

Menge an CCMP erzeugt gewonnen

(mg/1)

(mg)

Cytidin-5'-diphosphat Cytidin-5'-triphosphat

Kobaltfluorid Kaliumborat keiner

Kobaltfluorid Natriumborat keiner

Beispiel 8

Unter Verwendung von Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106) wurden CCMP-Kristalle in gleicher Weise wie in Beispiel 6 erzeugt, jedoch mit der Ausnahme, daß nicht die in Tabelle 6 angegebenen Verbindungen verwendet wurden, sondem die in Tabelle 6 angegebenen Fluoride, Borsäure und Borate durch jene, die in Tabelle 9 angegeben sind in den in der Tabelle 9 angegebenen Konzentrationen verwendet wurden.

Die CCMP-Menge,die in der Kulturflüssigkeit jeweils erzeugt wurde und die Menge an CCMP-Kristallen, die aus 10 Litern der Milturflüssigkeit jeweils gewonnen wurde, ist in Tabelle 9 angegeben.

Tabelle 9

Fluorid, Borsäure
oder Borat

Konzentration

(mg/1)

Menge an CCMP erzeugt gewonnen (mg/1) (mg)

Borsäure

Natriumborat Kaliumborat

Zinkborat

Ammoniumborat Zinkfluorid Kobaltfluorid Kaliumfluorid Natriumfluorid Eisen(HI)-riuorid

Keiner

40
100
200·
100
100

50
5

50
100

36 28 27 28 21 30 28 33 36 28 10

97 70 68 65 57 94 80 96 88 77 25

Beispiel 9

10 100

135

128

287

420

86

258 382 106

aus 10 Litern jeweils der Kulturflüssigkeit gewonnen wurde, ist in den Tabellen 10 und 11 wiedergegeben.

Tabelle IU

Rasse: Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207)

Fluorid, Borsäure oder Borat

Konzen- '. iation

(mg/1)

Menge an CCMP

rzeugt gewonnen (mg/!) (mg)

Natriumfluorid 30 28 87 Kaliumfluorid 10 25 65 Zinkfluorid 100 33 96 H Kobaltriuorid 5 27 71 Ammoniumfluorid 100 30 81

Borsäure 20 27 74

Natriumborat 40 25 74 Kaliumborat 100 20 81 Kobaltborat 2 25 74

Zinkborat 50 26 71

Keine - 6 18

^4> Tabelle

Rasse: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC

21 374, FERM-P Nr. 206)

55

Bei Verwendung von Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P Nr. 207) und Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206) wurden CCMP-Kristalle in gleicher Weise wie in Beispiel 7 erhalten, jedoch mit der Ausnahme, daß die in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Verbindungen nicht angewandt wurden, sondern die in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Fluoride, Borsäure und Borate durch jene in den Konzentrationen ersetzt wurden, die in den Tabellen 10 h5 und 11 angegeben sind.

Die CCMP-Menge, die in der Kulturflüssigkeit jeweils erzeugt wurde und die Menge der CCMP-Kristalle, die

Fluorid, Borsäure	Konzen	Menge an	CCMP
oder Borat	tration	erzeugt	gewonnen
	(mg/1)	(mg/1)	(mg)
Ammoniumfluorid	100	18	58
Natriumfluorid	50	15	47
Kaliumfluorid	30	17	48
Zinkfluorid	50	18	52
Kobaltfluoricl	!0	15	45
Zinkborat	100	28	84
Kobaltborat	20	21	67
Borsäure	30	18	51
Kaliumborat	100	18	45
Natriumborat	100	20	57
Keine	_	7	20

2!

Beispiel 10

Jede der in Tabelle 12 angegebenen Rassen wurde bei 28°C während 16 Stunden in einem Medium kultiviert, das eine Zusammensetzung von 2% Glucose, 1% Polypepton, 0,7% Hefeextrakt und 0,2% Natriumchlorid (pH 7,0) aufwies, um eine Samenkultur zu erzeugen. Andererseits wurde 1 i eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 1% Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,2% MgSO₄ · 7 H₂0,0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O und 3 g/I jeweils der in Tabelle 12 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115° C während 10 Minuten sterilisiert Die vorstehend erwähnte Sarnenkultur wurde in das Medium inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30°C während 20 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die CCMP-Menge, die in der Kühlflüssigkeit in diesem Stadium jeweils erzeugt wurde, ist in Tabelle 12 angegeben.

Nachfolgend wurde jeweils 1 Liter der iCulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und das Überstehende auf pH 4,0 unter Verwendung von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure eingestellt, und sodann auf Aktivkohle adsorbiert. Die Aktivkohle wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit einer 50%igen wäßrigen Äthanollösung, die 1,4% Ammoniak enthielt, zur Elution von CCMP behandelt. Das Eluat wurde unter verringertem Druck auf 100 ml konzen- jo triert und das resultierende Konzentrat auf pH 8,0 unter Verwendung von konzentriertem NH₄OH eingestellt und sodann durch eine Säule (3 cm χ 50 cm), die mit Ionenaustauschharz des Ameisensäurentypus gefüllt war, zur Adsorption von CCMP auf der Harzsäule geführt. Nachfolgend wurde die Säule mit Wasser gewaschen, mit einer 0,02 n-Ameisensäurelösung voreluiert und sodann mit einer 0,1 n-Ameisensäurelösung zur Elution von CCMP behandelt, wobei das Eluat in Fraktionen von jeweils 50 ml Volumen aufgeteilt wurde (3',5'-zyklische Adenylsäure wurde nicht eluiert). Unter diesen Fraktionen wurden jene, die Absorptionen bei 280μ aufwiesen, der Indolreaktion (Ceriotti, G. J, Biol. Chem. 198, 297 [1952] und 214, 59 [1955]) und der Orcinolreaktion auf Ribose (Brown, A. H, Arch. Biochem. 11, 269 [1946]) unterworfen und Fraktionen, die gegenüber der erstgenannten Reaktion negativ und gegenüber der letzteren Reaktion positiv reagierten, wurden unter Erhalt einer Fraktion, die lediglich CCMP enthielt, gesammelt.

Die CCMP-Fraktion wurde auf pH 7,0 mit 3 n-KOH eingestellt und durch eine Aluminiumoxid-Säule geführt, die mit neutralem Aluminiumoxid gefüllt war. Der ausfließende Strom wurde auf p}' 2,0 mit 50%iger HCI eingestellt und durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule zur Adsorption von CCMP auf Aktivkohle geführt Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit einer 50%igen Äthanollösung, die 1,4% Ammoniak enthielt, zur Elution vom CCMP behandelt. Das Eluat wurde sodann unter verringertem Druck zur Entfernung des überschüssigen Ammoniaks konzentriert, durch eine mit Ionenaustauscherharz, H+ -Form, gefüllte Säule zur Entfernung von Ammoniak geführt, weiter unter verringertem Druck konzentriert und sodann unter Erhalt von CCMP-Kristallen in einer Menge, wie es in Tabelle 12 gezeigt ist, gefriergetrocknet

Tabelle 12	Rasse C	gewonnen	Rasse M	gewonnen
Verbindung	erzeugt	(g)	erzeugt	(g)
	(g/l)	0,72	(g/l)	1,21
	2,34	0,84	3,46	1,12
Uracil	2,54	0,82	3,34	1,09
LIridin	2,67	0,79	3,38	0,42
5'-Uridy!säure	0,98	0,12	1,24	0,32
3'-Uridylsäure	0,34	0,83	1,10	1,00
2'-Uridylsaure	2,84	0,84	3,28	1,14
Uridin-5' diphosphat	2,87	0,42	3,45	0,51
Uridin-5'-triphosphat	1,22	0,33	1,54	0,53
Orotsäure	1,12	0,32	1,64	0,65
Orotidin	1,41	0,003	1,82	0,006
Ototidin-5'-monophosphat	0,01		0,03
Keine

C: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-Γ Nr. 206). M: Microbakterium Nr. 2O5-CM7 (ATCC 21 979, FERM-P Nr. 15.77).

Beispiel 11

Jede der im Tabelle 13 angegebenen Rassen wurde in einem Schrägmedium, das eine Zusammensetzung von 0,5% (NH₄)JSO₄, 0,5% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 0,05% _b5 MgSO₄ · 7 H₂0,1% Kasaminosäure, 0,5% Hefeextra'ct, 1% Glucose und 2'b Agar aufwies, unter Erzeugung einer Samenltultur kultiviert. Andererseits wurden 40 ml eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 0,5% Harnstoff, 0,5% KH₂PO₄,0,5% K₂HPO₄, 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,1% ZnSO₄ · 7 H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle Ii angegebenen Komponenten aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 500-ml-Schüttelkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115°C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend

erwähnte Samenkultur wurde in das Medium inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 70 Stunden unter Schüttelung mit 140 U/min unterworfen.

Die jweils in diesem Stadium in der Kulturflüssigkeit erzeugte Menge an CCM P ist in Tabelle 13 angegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit jeweils zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 10 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 1 Liter jeweils der Kulturflüssigkeit gewonnene Menge an CCMP ist in Tabelle 13 wiedergegeben.

Tabelle	13	Menge an	CCMP
Rasse	Verbindung	er/eugt	gewonnen
		(u/l)	(?)
		2.27	0,73
C	Draal	2,54	0,81
	Dridin	0,01	0,002
	keine	1.14	0,28
Λ	IJracil	1,32	0,42
	Dridin	0,006	0,001
	keine	2.47	0,85
M	D rad I	2.68	0,94
	Dridin	0.03	0,01
	keine

C: Cnrynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCX" 21374.

1-"ERM-I¹ Nr. 20dl.

Λ: Arthrobacter 11 (ATCC Nr. 21375. FERM-P Nr. 207). M:

Beispiel 12

Die in Tabelle 14 angegebenen Rassen wurden jeweils einer Schüttelkultur bei 28°C während 16 Stunden in einem Medium, das eine Zusammensetzung von 4% Abfallmelassen, 1% Fleischextrakt, 0,5% Maisstärkesaft, und 0,1% Natriumchlorid (pH 0,7) aufwies, unter Erzeugung einer Samenkultur unterworfen. Andererseits wurde 1 Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 1% Harnstoff. 0,5% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄. 1% Fleischextrakt, 0,5% Maisstärkesaft. 1,0% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O. 0,02% FxCl₂ · 7 H₂O, 3 g/l jeweils der in Tabelle 14 angegebenen Verbindungen und Leitungswasser aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115"C während 10 Minuten sterilisiert. (Das Medium enthielt i,ö2mg/i fvin· · in Form von MnCI₂ · 4 H₂O, 112 mg/1 Fe' * in Form von FeCI₂ · 7 H₂O und 86 mg/1 Fe' * ♦ in Form von FeClj · 7 H₂O.) Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10% inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 80 Stunden unter Schüttelung bei 180 D/min unterworfen.

Die in der Kulturflüssigkeit jeweils in diesem Stadium erzeugte CCMP-Menge ist in Tabelle 14 angegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen jeweils zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 10 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit jeweils gewonnene CCMP-Menge ist in Tabelle 14 wiedergege-

Microbakicrium Nr. 205 (ATCC"	Tabelle 14	21376, I ERM-P Nr.	))	Menge an CCMP	gewonnen	ben.	CCMP	Rasse A	CCMP
106).	Verbindung			erzeugt	(g)		gewonnen	Menge an	gewonnen
			(g/l)	0,82		(g)	erzeugt	(g)
	Rasse M	2,84	0,63	Rasse C	1.22	(g/l)	0.83
	2,76	0.81	Menge an	1.26	2.43	0.77
Dracil	2,86	0,45	erzeugt	1.12	2,35	0.82
Dridin	1,22	0,24	(g/l)	0.54	2,44	0,40
5'-Dridylsäure	0,78	0,28	3,24	0.32	1,35	0.25
3'-Dridylsäure	0,87	0,002	3,33	0,38	0,85	0.23
Orotsäure	0,01	3,21	0,003	0,68	0,003
Orotidin	1,58		0,02
Keine	0.98
1.13
0,02

M: Microbakterium Nr. MT-3 (ATCC 21981, FERM-P Nr. 787).

C: Corynebakterium Nr. MT-Il (ATCC 31019, FERM-PNr. 2384).

A: Arthrobacter Nr. MT-12 (ATCC 31020, FERM-P Nr. 2482).

Beispiel 13

Die in Tabelle 15 jeweils angegebenen Rassen wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 10 unter Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 I eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5% Glucose. 1% Harnstoff. 1% KH₂PO₄. 1% K₂HPO₄, 0,5% Hefeextrakt, 1% Polypepton, 1% MgSO₄ · 7 H₂0,0,03% ZnSO₄ - 7 H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 15 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115° C während 12 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10% inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die in der Kulturflüssigkeit jeweils in diesem Stadium erzeugte CCMP-Menge ist in Tabelle 15 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde die Kühlflüssigkeit jeweils zur Entfernung von Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel IO

unter Erhalt von CCMP-Kristallcn durchgeführt.

Die aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit jeweils erhaltene Menge an CCMP ist in Tabelle 15 wiedergegeben.

Tabelle 15

Verbindung

5'-Uridylsiiure
V-Uridylsiiure
2'-Uridylsüure
U ridin-5'-di phosphat

l'riuiri-5'-lfipnüSpnäi

Orotsäure

Orotidin

Orotidin-2'-monophosphat

C)rotidin-3'-monophosphat

Orotidin-5'-monophosphat

Orotidin-5'-di phosphat

ürotidin-5'-triphosphat

Keine

Λ: Arthrobacter 11 (ATCC 21 375. FERM-P Nr. 207).

M: Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106).

Rasse A	MP	CCMP
Menge an ('(	gewonnen	gewonnen
erzeugt	(g) (	(gl
(g/l)	0,92	0.93
2.77	0,32 (	0,23
0,98	0,28 (	0.24
0,97	0,73	0.72
2,54	η co U, UO i	l\ Oi- L/,O"
T Λ1	0,28 (	0.35
1,17	0,43 (	0.29
1.22	0,32	0.45
1,23	0,45	0.43
1,44	0,48	0.44
1,47	0,67	0.45
1,74	0,81	0,34
1.77	0,002 (	0,003
0,05	Kasse M
	Menge an
erzeugt
g/l)
?,84
),77
),84
».23

),97
),96
,24
,32
,22
,34
,22
),01

Beispiel 14

Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 10 unter Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 I eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 7.5% Glucose, 1% Harnstoff, 0.5% KH₂PO₄, 0.5% K. HPO₄. 0,5% Glyzin, 0,5% Hefeextrakt. 1% MgSO₄ ■ 7 H₂0.0,02% ZnSO₄ · 7 H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 16 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3 n-KOH), in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115⁰C während 12 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10% inokuliert und einer Schüttelkultur bei 28°C während 24 Stunden unter Schüttelung mit 190 U/min unterworfen. Nachfolend wurde eine l%ige Lösung des Fluorides, der Borsäure oder des Borates, die in Tabelle 16 angegeben sind (die vorstehend in einem Autoklav bei 110⁰C während 10 Minuten sterilisiert worden war), dem Medium in einer in Tabelle 16 angegebenen Konzentration hinzugegeben und die Schüttelkultur weiter bei 28°C während 70 Stunden unter Schüttelung mit 190 U/min fortgesetzt.

Die in der Kulturflüssigkeit in diesem Stadium jeweils erzeugte CCMP-Menge ist in Tabelle 16 wiedergegeben.

Die aus I Liter der Kulturflüssigkeit jeweils gewonnene Menge an CCMP-Kristallen ist in Tabelle 16 angegeben.

Tabelle 16	Zusatz	Konzen	Menge an	CCPM
Verbindung	Fluorid, Borsäure	tration	erzeugt	gewonnen
	oder Borat	(mg/1)
		50	(g/I)	(g)
	Natriumfluorid	60	3,43	1,12
Uracil	Natriumborai	-	3,66	1,23
	keiner	50	2,45	0,82
	Natriumfluorid	60	3.76	1,23
Uridin	Natriumborat	—	3,87	1,28
	keiner		2,44	0,89

	Fortsetzung	24 27	/ U SiIt/	484	5	5	5	28	C(¹I¹M
21	Verhiniluni!		I luoriil. Borsäure		100	100	100		gewonnen
		oder Bonit		-	-	-	Menge an
			70	erzeugt	(g)
	Niitriumliuorid	Konzen	100		1,33
5'-Uridylsiiure	Natriumborat	tration	-	<i'-/l>
	keiner	I mg/1)	70	3.67	0,81
	Natriumlluorid	50	100	3,46	1.23
.V-Uridylsiiure	Natriumborat	m	-	2,56	1.33
	keiner	-		3.67	0.34
	Natriumtluorid	50	3.88	0.84
2'-Uridyls;iure	iiaii luuiuuiiii	60	0,<M	i;.n ι
	keiner	-	2.47	0.32
	Natriumlluorid	50		1.24
Uridin-5'-di phosphat	Natriumborat		0,97	1.23
	keiner	-	3.45	0.84
	Nutriumfluorid	50	3.37	1.25
Uridin-5'-tri phosphat	Borsiiurc	40	2.67	1.42
	keiner		3.89	0.75
	Zinkfluorid	50	3.81	0.84
Orotsäure	Ammoniumborat	40	2.53	0.70
	keiner	-	2.45	0.35
	Zinkfluorid	KH)	2.31	0.72
Orotidin	Ammoniumborat	200	1.12	0.86
	keiner	-	2.22	0.34
	Kobaltfluorid	100	2.53	0.72
Orotidin-2'-monophosphat	Zinkborat	200	1.12	0.58
	keiner	-	2.05	0.24
	Kobaltfluorid	1.97	0.72
Orotidin-3'-monopf(Osphat	Zinkborat	0.84	0.83
	keiner	2.34	0.23
	Kobaltfluorid	2.50	0.83
Orotidin-5'-monophosphat	Zinkborat	0.77	0.89
	keiner	2.57	0.31
	Kaliumfluorid	2.67	1,23
Orotidin-5'-di phosphat	Zinkborat	0.72	1,33
	keiner	3.77	0,94
	Kaliumfluorid	3,65	1,22
Orotidin-5'-triphosphat	Zinkborat	2,70	1,32
	keiner	3,77	0,87
	3,82
2,74

Beispiel 15

Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) und Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr 206) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 10 unter Erzeugung einer Samenktiitur vorkultiviert. Andererseits wurde 1 I eines Mediums, das

eine Zusammensetzung von 5% Glucose, 1 % Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 1% K^HPO₄. 0,5% Hefeextrakt, 1% Polypepton, 1% MgSO₄ · 7 H₂0,0,02% ZnSO₄ ■ 7 H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabellen 17 und 18 angegebenen Verbindungen aufwies und jeweils die in den Tabellen 17 und 18 angegebenen Fluoride, die Borsäure und Borate in den in den Tabellen angegebenen Konzer.tra-

lionen enthielt (pH 7,5, eingestellt mit 3 n-KOH), ^:n einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklav bei 115°C während 1.2 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 1% inokuliert und einer Schiiittelkultur bei 30"C während 80 Stunden unter Schütteluing mit 180 U/min unterworfen.
Die in der Kulturflüssigkeit in diesem Stadium

erzeugte CCMP-Menge ist in den Tabellen 17 und 18 angegeben.

Die aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit jeweils erhaltene CCMP-Menge ist in den Tabellen 17 und 18 angegeben.

Tabelle 17

Rasse: Arthrobactcr 11 (ATCC 21 375, I ERM-P Nr.

207).

Verbindung	/usat/	Konzen	6	-	6	-	Menge an	CXMI'
	lluorid. Borsäure	tration	5	40	er/cugt	gewonnen
	oder Borat	In·.,./I I	-
		50	40	I../Il • C" · ·	"C"
Uracil	Zinkfluorid	100	30	3.74	1,25
	Zinkborat	-	-	3,72	1,32
	keiner	50	40	2,63	0,82
Uridin	Zinkfiuorid	-	-	3,77	1,23
	keiner	30	40	2,38	0,82
5'-Uridylsa'ure	Natriumfluorid	100	30	3,88	1,32
	Zinkborat	-	-	3,73	1,28
	keiner	30	40	2.84	0,95
3'-Uridylsäure	Natriunifluorid	100	30	2.37	0,71
	Natriumborat	-	-	2,68	0,93
	keiner	30	40	1,24	0,39
2'-Uridylsäure	Natriumfluorid	-	-	2,82	0,98
	keiner	40	0,93	0,32
Uridin-5'-diphosphat	Kaliumfluorid		3,-"M	1,24
	keiner	2.27	0.73
Uridin-5'-triphosphat	Kaliumfluorid	3,66	1,24
	Kobaltborat	3.27	1.23
	keiner	2,46	0,79
Orotsäure	Ammoniumfluorid	2,33	0,72
	keiner	1,22	0,45
Orotidin	Ammoniumfluorid	2,22	0,72
	Borsäure	2,43	0,82
	keiner	1,23	0,43
Orotidin-2'-monophosphat	Ammoniumfluorid	1,84	0,60
	keiner	0,95	0,32
Orotidin-3'-monophosphat	Ammoniumfluorid	1,76	0,53
	Borsäure	1,88	0,66
	keiner	0,86	0,25
Orotidin-5'-monophosphat	Ammoniumfluorid	1,97	0,66
	Borsäure	1,97	0,73
	keiner	0,65	0,22
Orotidin-5'-diphosphat	Ammoniumfluorid	1,85	0,66
	keiner	0,77	0,24
Orotidin-5'-triphosphat	Ammoniumfluorid	1,98	0,73
	keiner	0.76	0.24

	Tabelle 18	24 27	Zusatz	484	-	-	32	CCMi
31		Fluorid, Borsäure		50	30		gew
	oder Borat		-	-
Rasse: Corynebaktenum muriseptikurn Nr. 7		(ATCC 21 374,	50	30		(g)
Verbindung	Kaliumfluorid		-	100		1,10
	Borsäure	Konzen	Ammoniumfluorid 100	-	FERM-P Nr. 206)	1,23
	keiner	tration	keiner	100	Menge an	0,84
	Kaliumfluorid	(mg/1)	Natriumfluorid	-	erzeugt	1,21
Uracil	Kobaltborat	20	keiner	30		1,23
	keiner	20	Natriumfluorid	-	(g/l)	0,83
	Kaliumfluorid	-	Kaliumborat	30	3,37	1,24
Uridin	Kobaltborat	20	keiner	100	3,67	1,22
	keiner	30	Kaliumborat	-	■ 2,67	0,88
	-	keiner	60	3,68	0,75
5'-Uridylsäure	20	Natriumfluorid	-	3,55	0,34
	30	keiner	60	2,67	0,83
	-	Natriumfluorid	100	3,77	0,43
3-Uridylsäure	Ammoniumfluorid 100	Kaliumborat		3,86	1,25
	keiner	keiner		2,45	0,87
2'-Uridylsäure	Natriumborat	Zinkfluorid	2,45	1,22
	keiner	keiner	1,56	0,83
Uridin-5'-diphosphat	Natriumborat	Zinkfluorid	2,45	0,72
	keiner	Kaliumborat	1,22	0,33
Uridin-5'-triphosphat	keiner	3,78	0,7S
	2,65	0,84
Orotsäure	3,88	0,34
	2,44	0,8S
Orotidin	2,56	0,2i
	1,12	0,81
	2,88	0,2f
Orotidin-2'-monophosphat	2,78	0,8i
	1,13	i,i:
Orotidin-3'-monophosphat	2,87	0,7'
	0,98	u:
Orotidin-5'-monophosphat	2,65	0,7<
	1,12	1,2'
	2,89	l.H
Orotidin-5'-diphosphat	3,34	0,7:
	2,23
Orotidin-5'-triphosphat	3,34
	2,23
	3,47
3,23
2,44

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung zyklischer 3',5'-Cytidylsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Erzeugung zyklischer 3',5'-Cytidylsäure aufweist, Corynebakterium muriseptikum ATCC 21 374, Corynebakterium ATCC 31 019, Arthrobacter ATCC 21 375, Arthrobacter ATCC 31 020, Microbakterium ATCC 21 376, Microbakterium ATCC 21 979 oder Microbalkterium ATCC 21 981, in einem Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Nährstoffe aufweist, unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 5—9 bei einer Temperatur von 20—40⁰C während eines Zeitraums bis zyklische 3',5'-Cytidylsäure erzeugt, und in dem Medium angesammelt wird, kultiviert, und daß man die zyklische 3',5'-Cytidylsäure aus der Kulturflüssigkeit gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine Verbindung in das Medium eingebracht wird, die aus der aus Cytosin, Uracil und Orotsäure sowie den entsprechenden Ribosiden und den entsprechenden Ribotiden dieser Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in das Medium zumindest eine Verbindung eingebracht ist, die aus der aus Fluoriden, Borsäure und Boraten bestehenden Gruppe ausgewählt ist

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in das Medium außerdem noch zumindest eine Verbindung eingebracht wird, die aus der aus Fluoriden, Borsäure und Boraten bestehenden Gruppe ausgewählt ist

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der Verbindung in dem Medium 0,05 bis 2% (GewVv) beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Fluorides, der Borsäure oder des Borates in dem Medium 0,1 bis 500 mg/1 beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Fluorides, der Borsäure oder des Borates in dem Medium 0,1 bis 500 mg/1 beträgt.

8. Verfahren zur Herstellung zyklischer 3',5'-Cytidylsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der in Anspruch 1 angegebenen Mikroorganismen in einem Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Nährstoffe enthält, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C aerob vorkultiviert und in die resultierende Samenkultur zumindest eine Verbindung einbringt, die aus der aus Cytosin, Uracil und Orotsäure sowie den entsprechenden Ribosiden und den entsprechenden Ribotiden dieser Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und daß man sodann eine Nachkultur durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorkultur 6 bis 20 Stunden lang und die Nachkultur 4 bis 14Ö Stunden lang durchführt.

10. Verfahren nach Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß in das Medium Vitamine eingebracht werden.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von zyklischer 3',5'-Cytidylsäure durch Fermentierung. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von zyklischer 3\5'-Cytidylsäure durch Kultivierung bestimmter Mikroorganismen, die zu der Gattung Corynebakterium, Arthrobacter oder Microbakterium gehören.

Zyklische 3',5'Cytidylsäure (nachstehend als »CCMP« bezeichnet) stellt eine Substanz dar, die die nachstehend aufgeführte Strukturformel besitzt deren Bedeutung kürzlich auf dem Gebiet der Biochemie erkannt worden ist CCMP wird als Reagens für Hormonvermittler und dergleichen angewandt und ist ziemlich teuer.

Strukturformel von CCMP: