DE2427484A1 - Verfahren zur herstellung von zyklischer -3',5'-cytidylsaeure durch fermentierung - Google Patents

Description

2'5 16^· n/wa

KIKKOMAN SHOYU CO., LTD., NODA-SHI/JAPAN

Verfahren zur Herstellung von zyklischer -3',5'-Cytidylsäure durch Fermentierung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von zyklischer-3',5'-Cytidylsäure durch Fermentierung. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von zyklischer 3',5'-Cytidylsäure durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der zu der Gattung

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ORIGINAL INSPECTED

Corynebakterium, Arthrobacter oder Microbakterium gehörig ist.

Zyklische-3¹,5'-Cytidylsäure (nachstehend als "CCMP" bezeichnet) stellt eine Substanz dar, die die nachstehend aufgeführte Strukturformel besitzt deren Bedeutung kürzlich auf dem Gebiet der Biochemie erkannt worden ist. pCMP wird als Reagens für Hormonvermittler und dergleichen angewandt und ist ziemlich teuer.

Strukturformel von CCMP:

- H

Zur chemischen Synthese von CCMP nach derzeit bekannten Verfahren sind viele und komplexe Verfahrensstufen erforderlich. Diese Stufen sind beispielsweise:

Cytosin ^{Stufe 1}) Benzylcytosin Benzylcytidin Benzylcytidin-5'-monophospaht zyklische 3 ' , 5'-Benzylcytidi!säure zyklische 3·,5'-Cytidy!säure.

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/~G.M. Blackburn, J.S. Cohen und A.T. Todd, Tetrahedron Letters 3_9,2873 (1964); R.K. Borden und M. Smith, J. Org. Chem., 3J_, 3241 , 1966 (1964); G.J. Drummond, M.W. Gilgan, E.J. Reimer und M. Smith, J. Amer. Chem. Soc, £$j>, 1626 (19-64); G.J. Smith, G.J. Drummond und H.G. Khorana, J. Amer. Chem. Soc, 82, 698 (1968); G.M. Tenez, H.G. Khorana, R. Markham und E.H. Pole, J. Amer. Chem. Soc, 80,6223 (1958)_7·

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein neues Verfahren zur Herstellung von CCMP durch Fermentierung unter Verwendung eines Mikroorganismus zu schaffen, das darüber hinaus billig im industriellen Masstab durchführbar ist.

Gemäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung von CCMP durch Fermentierung geschaffen, welches, dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus, der zu der Gattung Corynebakter ium, Arthrobacter oder Mikrobakterium gehörig ist und die Fähigkeit zur Erzeugung von CCMP aufweist, in einem Medium kultiviert, wodurch CCMP in der Kultur erzeugt und angehäuft wird, und sodann das CCMP aus der Kultur gewinnt.

Derartige Verfahren zur Herstellung von CCMP unter Verwendung eines Mikroorganismus sind zuerst gemäss der Erfindung durchgeführt worden.

Als in dem erfindungsgemässen Verfahren zu verwendende · Mikroorganismen können alle Mikroorganismen wirksam verwendet werden, wenn sie zu der Gattung Corynebakterium,

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Arthrobacter oder Mikrobakterium gehörig sind und die Fähigkeit zur Erzeugung· von CCMP aufweisen.

Konkrete Beispiele für diese Mikroorganismen sind Corynebakterium murisepticum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P Nr. 206) und Corynebakter ium Nr. MT-11 (ATCC 31019, FERM-P Nr. 2384) als Mikroorganismen, die zu der Gattung Corynebakterium gehören, Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) und Arthrobacter Nr. MT-12 (ATCC 31O7O_f FERM-P Nr. 2482) als Mikroorganismen, die zu der Gattung Arthrobacter gehörig sind, und Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106), Microbakter ium Nr. 2O5-CM7 (ATCC 21979, FERM-P Nr. 1557) und Mierobakterium Nr. MT-3 (ATCC 21981, FERM-P Nr. 787) als Mikroorganismen, die zu der Gattung Microbakter ium gehörig sind.

Die mykologischen Eigenschaften von Corynebakterium muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter 11 und Microbakterium Nr. sind im Detail, beispielsweise in der US-PS 3 630 842 beschrieben.

Microbakter ium Nr. 2O5-CM7 stellt einen Mikroorganismus dar, der dadurch erhalten wurde, dass man Microbakterium Nr. 205 als Mutterstamm einer derartigen üblichen künstlichen Mutation, wie sie nachstehend erwähnt wird, unterwirft.

Das heisst, 10 ml einer Suspension von Sporen von Micro-

bakterium Nr. 205 (Zahl der Sporen: 2 bis 5 χ IO /ml) wurden in 0,1 ml Diäthylsulfat eingebracht und hiermit bei 30°C während 60 Minuten unter Schüttelung in Berührung gehalten, auf ein Agarplattenmedium (Anmerkung 1) geschmiert

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und bei 30° C während 48 bis 100 Stunden zur Entwicklung einer Kolonie kultiviert, wonach dann der resultierende Mutant aus der Kolonie durch Sieben gewonnen wurde.

(Anmerkung 1): Das Medium,wies eine Zusammensetzung von 1 % Glucose, 0,5 % (NH₄J₂SO₄, 0,5 % Harnstoff, 1 % KH₃PO₄, 0,3 % Casaminosäure, 30 t/l Biotin, 1 % MgSO₄ und 2 % Agar (pH

7,0), welches während 10 Minuten unter einem

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Dampfdruck von 6,8 kg/6,45cm (15 lbs/inch )

sterilisiert worden waj|auf(Das vorstehend angeführte γ/1 bedeutet Gewicht in einem Liter des Mediums und % bedeutet einen Gewichtsprozentsatz in 100 ml des Mediums; das gleiche soll nachstehend gelten).

Die Eigenschaften des Vitamin- und Aminos-äurebedürfnisses des vorstehend erwähnten Mutanten sind die gleichen wie jene des MutterStammes (d.h. der Mutant benötigt Biotin als Vitamin und erfordert nicht speziell Aminosäuren, wächst jedoch gut in Gegenwart von Asparagin, Asparaginsäure und Arginin).

Ein Mutant der andere Nährerforderniseigenschaften als jene des MutterStammes aufweist, kann natürlich in dem erfindungsgemässen Verfahren dadurch wirksam angewandt werden, dass man den Grad seines Nährmittelbedürfnisses geeignet befriedigt, wenn der Mutant eine Fähigkeit zur Erzeugung von CCMP aufweist.

Darüber hinaus werden die angeführten Corynebakterium

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muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter 11 und Microbakterium Nr. 205 individuell einer solchen nachstehend erwähnten Diäthylsulfatbehandlung unter Erhalt von jeweils Mn ⁺- Ionen-permeablen Mutanten Corynebakterium Nr. MT-11, Arthrobacter Nr. MT-12 und Microbakterium Nr. MT-3 unterworfen.

Das heisst, 10 ml einer Suspension von Sporen von jeweils Corynebakterium muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter 11 und

9 Microbakterium Nr. 205 (Zahl der Sporen: 2 bis 5 χ 10 /ml) werden in 0,1 ml Diäthylsulfat eingebracht und unter Schüttelung bei 30⁰C während 16 Stunden in Berührung gehalten, 300 ml eines Mediums (Anmerkung 2) hinzugefügt und einer Schüttelkultur bei 30°C während weiteren 16 Stunden unterworfen. Nachfolgend werden die Zellen gewonnen, mit Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und auf das gleiche Medium geschmiert, wie es in der vorstehenden Anmerkung 1 definiert wurde, jedoch mit der Ausnahme, dass in das Medium zusätzlich 5OO mg/1 MnCl₂.4H₂O eingebracht worden waren, und bei 30°C während 72 Stunden zur Entwicklung von Kolonien kultiviert. Die derart entwickelten Kolonien wurden willkürlich auf dem gleichen Medium, wie es in der vorstehenden Anmerkung 1 definiert ist, jedoch mit der Ausnahme, dass in das Medium 500 mg/1 MnCl₃.4H₂O eingefügt worden waren, und auf dem gleichen Medium, wie es in der vorstehenden Anmerkung 1 definiert ist, jedoch mit der Ausnahme, dass in das Medium 1 mg/1 MnCl₃.4H₂O eingefügt worden waren, gesammelt und bei 30°C während 48 Stunden kultiviert und Rassen, die in dem zuerstgenannten Medium, jedoch nicht in dem zuletztgenannten Medium gewachsen waren, isoliert. Eine der somit isolierten Rassen ist jeweils das angeführte Corynebakterium Nr. MT-11, Arthrobacter Nr. MT-12 und Microbakterium Nr. MT-3

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(Anmerkung 2): Das Medium besass eine Zusammensetzung von

1 % Rindfleischextrakt, 1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt und 0,3 % Natriumchlorid (pH 7,0), welches während 15 Minuten unter einem Dampfdruck von 6,8 kg/6, sterilisiert worden war.

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Dampfdruck von 6,8 kg/6,45 cm. (15 lbs/inch )

Die Kolonien von Corynebakterium Nr. MT-11, Arthrobacter Nr. MT-12 und Microbakterium Nr. MT-3 sind weiss gefärbt und die Rassen weisen die Eigenschaft, dass sie Biotin als Nährmittel erfordern, wie die Mutterrassen auf.

Die vorstehend erwähnten Corynebakter ium Nr. MT-11, Arthrobacter Nr. MT-12 und Microbakterium Nr. MT-3 stellen Rassen dar, die die Fähigkeit zur Erzeugung von CCMP selbst dann aufweisen, wenn sie in einem Medium kultiviert werden, in das 0,02 bis 500 mg/1 Mn -Ionen in Form von MnCl₀.4H₀O

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und/oder TO bis 1000 mg/1 Fe -Ionen in Form von FeCl₀.7H₀O

+++
und/oder 10 bis 1000 mg/1 Fe -Ionen in Form von FeCl.,. 7H₀O eingebracht wurden, und stellen somit Rassen dar, die gegenüber Mn -,Fe - und Fe -Ionen resistent sind (die Bezeichnung "resistent" bedeutet", dass die Rassen durch die Metallionen nicht in ihrem Wachstumszustand jedoch in ihrer CCMP-Produktivität ungestört gelassen sind). Wenn die angeführten Rassen angewandt werden, kann CCMP ohne Verringerung der Erzeugung an CCMP selbst in einem Medium gewonnen werden, das natürliche Substanzen umfasst und relativ grosse Mengen an Mn -,Fe - und Fe -Ionen enthält, z.B. einem Medium, das Leitungswasser und hohe Konzentrationen an Fleischextrakt, Proteinhydrolysatlösung, Maisstärkesaft, Reiskleie, Melassen,

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Fischlauge (fish solubles), Destillationsschlämpe (distillers' solubles) etc. umfasst und ein oder mehrere Mn - _t Fe -, und Fe -Ionen enthält, die grosser als jene die vorstehend erwähnt wurden, sind.

Darüber hinaus können Rassen, die gegenüber Chemikalien, wie beispielsweiseS-Fluorouracil und 6-Azauracil resistent sind, ebenfalls wirksam in dem erfindungsgemässen Verfahren dann angewandt werden, wenn sie die Fähigkeit zur Erzeugung von CCMP aufweisen.

Ein Teil der mycologischen Eigenschaften der vorstehend erwähnten Mutanten, d.h. Corynebakterium Nr. MT-11, Arthrobacter Nr. MT-12, Microbakterium Nr. 2O5-CM7 und Microbakterium Nr. MT-3, wie sie vorstehend erwähnt wurden, und weitere mykologische Eigenschaften der Mutanten sind mit jenen ihrer Mutterrassen, d.h. Corynebakterium muriseptikum Nr. 7, Arthrobacter 11 und Microbakterium Nr. 205 identisch.

Zur Herstellung von CCMP nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden beliebige der vorstehend angeführten Rassen, die in dem erfindungsgemässen Verfahren anwendbar sind, in ein Medium, das natürliche Substanzen umfasst, oder in ein synthetisches Medium inokuliert, welches durch geeignete Vermischung von Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Nährstoffen, die durch die Rasse genutzt werden können, und, sofern erforderlich, anderen anorganischen Salzen und Komponenten als jenen hergestellt worden ist, und bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40 C während eines Zeitraumes bis die

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Erzeugung an CCMP ein Maximum wird, z.B. während 10 bis 160 Stunden, kultiviert.

Die Erzeugung an CCMP wird dann weiter erhöht, wenn in das Medium zumindest eine Verbindung eingefügt wird, die aus der aus Cytosin, Uracil, Orotsäure, Ribosiden auf Grundlage dieser Verbindungen (d.h. Cytidin, Uridin und Orotidin) , und ihren Ribotiden /""z.B. 2¹ (oder 3¹ oder 5')-Cytidylsäure, Cytidin-2'(oder 3· oder 5')-diphosphat, Cytidin-2'(oder 3' oder 5¹)-triphosphat, 2' (oder 3¹ oder 5')-Uridylsäure, Uridin-2¹ (oder 3' oder 5')-diphosphat, Uridin-2· (oder 3¹ oder 5')-triphosphat, Orotidin-2' (oder 3¹ oder 5¹) -monophosphat, Orot-idin-2¹ (oder 3' oder 5 ') -diphosphat und Orotidin-2'(oder 3¹ oder 5·)-triphosphat_/ (nachstehend werden diese als "Cytosin und ähnliche Substanzen" bezeichnet) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

Im Fall, dass es gewünscht ist, die Kultivierung nach dem erfindungsgemässen Verfahren in Gegenwart des vorstehend erwähnten Cytosins und ähnlicher Substanzen durchzuführen, wird der in der Erfindung verwendbare Mikroorganismus in beispielsweise ein übliches Medium, wie es vorstehend erwähnt wurde, inokuliert und bei einem pH-Wert von 5 bis bei einer Temperatur von 20 bis 40°C während eines geeigneten Zeitraums, z.B. 6 bis 20 Stunden (diese Stufe wird als "Vorkultur" bezeichnet) kultiviert. Nachfolgend wird in die Kulturflüssigkeit zumindest eine Verbindung eingebracht, die aus der aus Cytosin und ähnlichen Substanzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist und die Kultivierung wird weiter bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40°C während eines Zeitraums fortgesetzt, bis die Menge an erzeugtem

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CCMP ein Maximum wird, z.B. 4 bis 140 Stunden (diese Stufe wird als "Nachkultur" bezeichnet). In alternativer Weise wird der Mikroorganismus in das übliche Medium inokuliert, in welches zuvor zumindest eine Verbindung, die aus der aus Cytosin und ähnlichen Substanzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder ein Material, das beliebige von Cytosin und ähnlichen Substanzen enthält, oder eine Fermentationsflüssigkeit hiervon zuvor eingebracht worden ist, und sodann bei einem pH-Wert von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40 C während eines Zeitraumes, bis die Menge an CCMP ein Maximum wird, z.B. etwa 10 bis 160 Stunden, kultiviert. Die Menge an Cytosin und ähnlichen Substanzen, die dem Medium hinzugefügt werden soll, ist nicht in besonderer Weise beschränkt, wobei jedoch eine Konzentration von 0,05 bis 2 % (Gew./V) im allgemeinen bevorzugt ist.

Beispiele an bevorzugten Kohlenstoffquellen, die in dem vorstehend erwähnten Medium verwendet werden, umfassen verschiedene Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose,. Galactose, Ribose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melassen; verschiedene organische Säuren, wie Gluconsäure,Brenztraubensäure, Milchsäure und Essigsäure; Alkohole, wie Glyzerin, Sorbit, Inosit und Mannit;und Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffin und Kerosin.

Beispiele für bevorzugte Stickstoffquellen schliessen verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze neben Ammoniak, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat;

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stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Harnstoff, Pepton, Kaseinhydrolysat, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisstärkesaft, Fischmehl und deren Derivate (digestives); und Aminosäuren, wie Alginin bzw. Alginsäure, Asparaginsäure, Asparagin, Histidin, Glutamin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein und Glycin ein.

Beispiele für anorganische Nährstoffe schliessen anorganische Phosphate, wie Monokalium- und Mononatriumphosphate, Dikalium- und Dinatriumphosphate und Ammoniumphosphat ein. Beispiele für anorganische Salze ausser anorganischen Phosphaten, die hinzugefügt werden, wie es die Gelegenheit erfordert, schliessen verschiedene Metallsalze, wie Magneisumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisensulfat, Eisenchlorid, Zinksulfat, Kobaltsul'fat und Mangansulfat; verschiedene Fluoride, wie Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Kalciumfluorid, Bariumfluorid, Atnmoniumfluorid und Zinkfluorid; und Borsäure und deren Salze, wie Ammoniumborat, Kaliumborat, Natriumborat und Lithiumborat ein.

Wenn der in der Erfindung verwendbare Mikroorganismus in einem Medium in Gegenwart von zumindest einer Verbindung kultiviert wird, die aus der aus den vorstehend erwähnten Fluoriden, Borsäure und Boraten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wird die Erzeugung an CCMP weiter erhöht. In diesem Fall beträgt die Menge an Fluoriden, Borsäuren, Boraten, die zu dem Medium hinzugesetzt werden soll, vorzugsweise 0,1 bis 500 mg/1. Die Fluoride, Borsäure und Borate können dem Medium zuvor oder innerhalb etwa 30 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung hinzugegefügt werden.

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Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Nährstoffen werden Vitamine, wie Biotin, Vitamin B.. und B„ und Pantothensäure oder hiervon abgeleitete Verbindungen wirksam als geringfügigere Komponenten hinzugegeben. Pantothensäure stellt eine Verbindung aus der wasserlöslichen Vitam-B-Gruppe dar und ihre physiologischen Aktivitäten fallen mit jenen von Coenzym A (CoA) zusammen, welches im allgemeinen aus Pantothensäure biosynthetisiert wird. Somit können solche Verbindungen, die im Verlauf der Coenzymbiosynthese gebildet werden, wie Pantothensäure, ß-Alanin, Pantothin, Pantosäure, Asparaginsäure, Valin, Dimethyl-brenztraubensäure,^-Ketopantosäure, Pantothenylcystein, D(+)-4-Phosphopantothin, Diphosphocoenzym A und Coenzym A angewandt werden. In alternativer Weise können Derivate der Verbindungen (z.B. ß-Alaninenthaltendes Carnosin und Anserin) und natürliche Substanzen, die diese Verbindungen enthalten (z.B. Hefeextrakt, Maisstärkesaft, Fischlauge, Fleischextrakt, Reiskleie, Melassen, Leberpulver, Pepton, NZ-Amin und Destillatschlempen) angewandt werden. Anstelle von Vitamin B₁ können Thiaminverwandte Verbindungen, wie ^Amino-S-aminomethyl^-methylpyrimidin und 4-Methyl-5-ß-hydroxy-äthyl-thiazol angewandt werden. Die Verwendung natürlicher Substanzen, die diese Verbindungen enthalten, ist natürlich möglich.

Die Produktivität an CCMP erhöht sich, wenn Coffein, Theophylin, Theobromin oder dergleichen, Methylxanthin oder 2,3-2,4- oder 2,5-Pyridindicarbonsäure, Dipicolinsäure, 8-Hydroxychinolin, Polyphosphorsäure oder Pyrophosphorsäure, welche ein Wachsturnsinhibitor für zyklische-3',5'-Nukleotidphosphordiesterase darstellt, zuvor in das Medium

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eingebracht oder im Verlauf der Kultivierung bis zu einer Konzentration von 500 mg/1 eingebracht werden.

Die Kultivierung kann durch ein geeignetes Kultivierungs verfahren, wie eine Schüttelkultur, Rührkultur oder aerobe Kultur durchgeführt werden.

Während der Kuktivierung wird die Kulturflüssigkeit vorzugsweise gerührt und belüftet, so dass in dem Wachstumsstadium der Druck des in der Kulturflüssigkeit vorliegenden Sauerstoffes niedriger und jener von Kohlendioxid höher wird, während die Drucke dieser Gase in dem Stadium der CCMP-Produktion umgekehrt werden. Konkret ausgedrückt werden die Rührung und Belüftung vorzugsweise derart durchgeführt, dass man die Sauerstofftransfergeschwindigkeit bzw. -rate (Kd) und die SauerstoffZuführungsgeschwindigkeit bzw. -rate (KGa) des Kultivierungstankes derart einstellt, dass beim WachsturnsStadium ( 6 bis 16 Stunden nach Initiierung der Kultivierung) der Druck des vorliegenden Sauerstoffes in der Kulturflüssigkeit auf 0,1 bis 0,6 Atmosphären und jener des hierin vorliegenden Kohlendioxides auf weniger als 0,08 Atmosphären geregelt wird, während der Druck in dem CCMP-Produktions Stadium (16 bis 60 Stunden nach Iniidierung der Kultivierung)an Sauerstoff auf 0,2 bis 0,8 Atmosphären und jener von Kohlendioxid auf weniger als 0,05 Atmosphären geregelt wird.

Wenn die Menge an erzeugt em CCMP das Maximum erreicht hat, wird die Kultivierung unterbrochen und das CCMP, sofern erforderlich, aus der Kultur gewonnen und, sofern erforderlich, gereinigt. Die Gewinnung an CCMP kann beliebig

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nach der Adsorptionsmethodik und der Ausfällungsmethodik erfolgen, die entweder einzeln oder in Kombination angewandt werden können. Die hier angeführte Adsorptionsmethodik stellt eine Methodik dar, worin die Kulturflüssigkeit von den Zellen befreit wird und mit einem Adsorptionsmittel, wie einem Anionenaustauscherharz,·Kationenaustauscherharz, Aktivkohle oder Aluminiumoxid, zur Adsorbierung des gewünschten CCMP auf dem Adsorbens in Berührung gebracht wird, wodurch das CCMP aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt wird. Die Ausfällungsmethodik stellt eine Methodik dar, worin die von den Zellen befreite Kulturflüssigkeit mit einem Nichtlösungsmittel für CCMP, wie einem niedrigen Alkohol oder Aceton versetzt wird, wodurch das CCMP aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt und gewonnen wird. Wenn die Betriebsbedingungen der vorstehend erwähnten Methodiken in geeigneter Weise gewählt und zusammen kombiniert werden, kann CCMP gereinigt werden. Die vorstehend angeführten Betriebsbedingungen bedeuten die Art des Adsorbens, die Zusammensetzung und Konzentration des Eluates, etc. im Fall der Adsorptionsmethodik und bedeuten die Art und Menge des Nichtlösungsmittels für CCMP, die Behandlungstemperatur etc. im Fall der Ausfällungsmethodik.

Zur Veranschaulichung werden nachstehend verschiedene Methodiken zur Abtrennung und Gewinnung von CCMP aus der Kulturflüssigkeit angegeben.

(1) Das in der von Zellen durch Zentrifugieren oder Filtration befreiten Kulturflüssigkeit befindliche CCMP wird auf Aktivkohle adsorbiert und sodann mit einer wässrigen^ ammoniakalischen Alkohol- oder Acetonlösung eluiert. Das Eluat wird durch Konzentrierung unter verringertem Druck

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vom überschüssigen Ammoniak befreit und sodann mit einem Anionenaustauscherharz (z.B. Dowex 1, Chloridtypus, oder Dowex 1 , Formiattypus) zur Adsorption von CCMP auf dem Harz in Berührung gebracht. Nachfolgend wird das CCMP mit einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. verdünnter Salzsäure oder einem Kalciumchlorid-verdünnte-Salzsäure-Lösungsmittel im Fall von Dowex 1, Chloridtypus/und verdünnter Ameisensäure oder einem verdünnte-Ameisensäure-Natriumformiat-Lösungsmittel im Fall von Dowex 1, Formiattypus) eluiert. Das resultierende Eluat wird weiter mit Aktivkohle zur Adsorption von CCMP hierauf in Berührung gebracht, welches sodann mit einer wässrigen ammoniakalisehen Alkohol- oder Acetonlösung eluiert wird. Das hierdurch erhaltene Eluat wird von überschüssigem Ammoniak durch Konzentration unter verringertem Druck befreit, sofern erforderlieh,auf einen pH-Wert von 5 bis 10 durch Zugabe einer 1 bis 50 %igen Natriumhydroxidlösung oder 1 bis 50 %igen Kaliumhydroxidlösung eingestellt, durch eine Aluminiumoxidsäule geführt und sodann mit einem Kationenaustauscherharz (z.B. Dowex 50, Wasserstofftypus; Amberlite IR 170, Wasserstoff- oder Natriumtypus;· oder Amber lite IRC-50, Wasserstoff- oder Natriumtypus) zur Adsorption des CCMP auf dem Harz in Berührung gebracht und sodann mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das hierdurch erhaltene Eluat wird unter verringertem Druck konzentriert und sodann in einem kalten Raum stehen gelassen oder mit einem Nichtlösungsmittel für CCMP, wie Alkohol oder Aceton versetzt, wodurch CCMP-Kristalle erhalten werden können.

(2) CCMP wird in der von Zellen durch Zentrifugieren oder Filtration befreitenKulturflüssigkeit auf einem Adsorbens

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wie Aktivkohle, adsorbiert und sodann mit einer wässrigen ammoniakalisehen Alkohol-.oder Acetonlösung eluiert. Das Eluat wird von überschüssigem Ammoniak durch Konzentration unter verringertem Druck befreit, mit Chlorwasserstoffsäure angesäuert, mit einem organischen Lösungsmittel, wie Alkohol oder Aceton, versetzt und sodann in einem kalten Raum, beispielsweise stehen gelassen, wodurch rohe CCMP-Kristalle erhalten werden können. Die hierdurch erhaltenen rohen Kristalle können unter Verwendung solcher Anionen- oder Kationenaustauscherharze, wie sie vorstehend erwähnt wurden, oder mit Aluminiumoxid gereinigt werden. In alternativer Weise werden die rohen Kristalle in Wasser aufgelöst, mit Chlorwasserstoffoder Schwefelsäure angesäuert, mit einem Entfärbungsharz (z.B. DuoliteS-30 oder Duolite S-10) entfärbt, mit einem Nxchtlosungsmxttel für CCMP, wie Alkohol oder Aceton, versetzt und sodann in beispielsweise einem kalten Raum stehen gelassen, wodurch Kristalle an CCMP erhalten werden können.

(3) CCMP wird in der von Zellen durch Zentrifugieren oder Filtration befreiten Kulturflüssigkeit direkt auf einem Anionen- oder Kationenaustauscherharz adsorbiert und sodann mit einem Lösungsmittel eluiert. Das resultierende Eluat wird einer Behandlung mit Aluminiumoxid, einer Behandlung mit Aktivkohle und einer Reinigung mit einem Entfärbungsharz unterworfen und sodann in beispielsweise einem kalten Raum stehen gelassen, wodurch Kristalle von CCMP erhalten werden können.

In dem Fall, dass die Kulturflüssigkeit 3',5'-zyklische Adenylsäure, 2'-Nukleotid, 3'-Nukleotid und 5'-Nukleotid enthält, wird die Kulturflüssigkeit im Verlauf der Reinigung

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einer Adsorptionsbehandlung unter Verwendung von beispielsweise einem Ionenaustauscherharz, unterworfen und sodann der Elutionsvorgang durch geeignete Wahl der Art des EIutionsmittels, der Salzkonzentration, der Säurekonzentration etc. bewirkt, wodurch CCMP von der genannten Säure und den Nukleotiden entfernt werden kann.

Irr dem Fall, wo die Kulturflüssigkeit 2'-Nukleotid, 3'-Nukleotid und 5'-Nukleotid enthält, wird die Kulturflüssigkeit auf einen pH von 5 bis 10 eingestellt und sodann durch eine Aluminiumoxidsäule geführt, wodurch die Nukleotide entfernt werden können (Aluminiumoxid adsorbiert solche zyklische-3',5'-Nukleotide, wie 3',5'-zyklische Adenylsäure und CCMP nicht, adsorbiert jedoch 2'-Nukleotid, 3'-Nukleotid und 5'-Nukleotid).

In dem Fall, wo die CCMP-enthaltende Flüssigkeit einer Konzentration unter verringertem Druck unterworfen wird, ist. es bevorzugt, dass die Flüssigkeit konzentriert wird, nachdem das freie CCMP in Form eines Salzes, wie als Natriumsalz oder Kalciumsalz umgewandelt ist.

Das gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren in vorstehender Weise erhaltene CCMP stimmt bezüglich der Elementaranalyse, der Ribosebestimmung, der Phosphorbestimmung, des UV-Absorptionsspektrums und des Infrarotabsorptionsspektrums mit handelsüblichem, autentischem CCMP überein, das durch chemische Synthese gewonnen ist.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren kann CCMP, welches

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bisher lediglich durch ein Syntheseverfahren erzeugt worden ist, welches viele und komplexe Schritte erfordert, durch Fermentierung in einer Stufe und in einem kürzeren Zeitraum, wie vorstehend erwähnt, erhalten werden. Somit ist das erfindungsgemässe Verfahren als Verfahren zur Herstellung von.CCMP äusserst vorteilhaft.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele, die keine Einschränkung darstellen, weiter veranschaulicht.

In jedem der Beispiele wurde die Menge an erzeugtem CCMP gemäss der Ionenausaüschchromatografie unter Verwendung von Dowex 1 (x4) Harz des Formiattypus/ R. Berkvist: Acta. Chem. Scan. J[O, 1303 (1956)_7 oder durch zweidimensional Papierchromatografie (_ primäres Lösungsmittel = Isobutyrsäure: 1n-Essigsäure:1n-Ammoniak = 10 : 1 : 5 (in Volumen); sekundäres Lösungsmittel = gesättigte Ammoniumsulfatlösung : 1m-Natriumacetatlösung : Isopropy!alkohol =80 : 20 :2 (in Volumina) J/, bestimmt.

Beispiel 1

Jede der in Tabelle 1 angegebenen Rassen wurde in einem Schrägmedium, das eine Zusammensetzung von 0,5 % (NHJ₂SO. 0,5 % KH₀PO., 0,05 % MgSO..7H_OO, 1 % Kasaminosäure, 0,3 %

aufwies Hefeextrakt, 1 % Glucose und 2 % Agar ^ur Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde ein Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 0,5 % Harnstoff, 1 % KH₃PO₄, 1 % Asparagin, 0,5 % MgSO₄^H₀O,

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200 γ/1 Biotin, 0,02 % Kaleiumpantοthenat, 0,002 % Thiaminhydrochlorid, 0,01 % ZnSO₄-TH₃O und 0,00005% Fe₃(SO₄J₃, 7H₂O (pH 8,0, eingestellt durch Zugabe von 3n-K0H) aufwies in einen 5-Liter-Schüttelkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115°C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in dem Schüttelkolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30°C während 70 Stunden unter Schüttelung bei 180 U/min unterworfen.

Die Menge an CCMP, die in jeder Kulturflüssigkeit in diesem Stadium erzeugt ist, ist in Tabelle 1 wiedergegeben.

Sodann wurde jede Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und das Überstehende auf pH 4,0 durch Zugabe von 3n-HCl eingestellt und sodann durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule zur Adsorption von CCMP auf Aktivkohle geführt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit 50 %igem Äthanol, welcher 1,4 % Ammoniak enthielt, zur Elution von CCMP behandelt. Das Eluat wurde unter verringertem Druck bei 50 C zur Entfernung von überschüssigem Ammoniak konzentriert, auf pH 8,0 unter Verwendung von 3n NH₄OH eingestellt und sodann durch eine mit Dowex 1 (x4) gefüllte Säule des Ameisensäuretypus (100 bis 200 mesh) zur Adsorption des CCMP auf dem Harz geführt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, mit 0,02 η Ameisensäurelösung voreluiert (CCMP und 3',5'-zyklische-Adenylsäure wurdennicht eluiert), und weiter mit einer 0,1On Ameisensäurelösung (3',5'-zyklische Adenylsäure wurde nicht eluiert und lediglich CCMP wurde eluiert) unter Erhalt einer CCMP-Fraktion eluiert. Diese CCMP-Fraktion wurde auf pH 7,0 mit 3n-K0H eingestellt und sodann durch

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eine mit neutralem Aluminiumoxid gefüllte Säule geführt. Das resultierende ausströmende Material, welches lediglich CCMP enthielt, wurde auf pH 2,0 mit 50 %iger HCl eingestellt und sodann durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule zur Adsorption von CCMP auf Aktivkohle geführt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit einer 50 %igen Äthanollösung, die 1,4 % Ammoniak enthielt, behandelt. Das Eluat wurde unter verringertem Druck zur Entfernung des überschüssigen Ammoniaks konzentriert, durch eine mit Amberlite IRC-50 gefüllte Säule in der Η-Form zur Entfernung von Ammoniak geführt, weiter unter verringertem Druck konzentriert, mit Aceton versetzt und sodann bei O⁰C während 20 Stunden unter Bildung von CCMP-Kristallen stehengelassen. Die Kristalle wurden durch Filtration gewonnen und im Vakuum unter Erhalt von CCMP-Kristallen getrocknet.

Die Menge des auf vorstehende Weise aus 10 Litern Kulturflüssigkeit jeder Rasse erhaltenen CCMP ist in Tabelle 1 wiedergegeben .

Tabelle 1

Rasse	Menge an CCMP	gewonnen (mg)
	erzeugt(mg/1)	21
Corynebakterium muriseptikum	5
Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P-Nr 206)

21 -

409851 /1055

Fortsetzung Tabelle 1

Rasse ·	Menge an CCMP ;	gewonnen (mg)
Arthrobacter 11	erzeug(mg/1)	26
(ATCC Nr. 21375 FERM-P Nr. 207)	5	34
Microbakterxum Nr. 205	8
(ATCC 21376, FERM-P Nr. 106)

Beispiel 2

Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) wurde bei 28 C während 16 Stunden in einem Medium, das eine Zusammensetzung von 2 % Glucose, 1 % Polypepton, 0,7 % Hefeextrakt und 0,2 % Natriumchlorid (pH 7,0) aufwies , zur Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 1 % KH₂PO₄, 2 % Histidin, 0,2 % MgSO₄^H₃O, 200 'f/1 Biotin, 0,02 % Kalciumpantothenat, 0,001 % Folsäure, 0,0005 % CoS0₄.7H₂0, 0,000005% FeSO₄^H₃O und 3 g/l von jeweils den in Tabelle 2 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115 C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte

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Samenkultur wurde in dem Medium in dem Kolben in einer Menge von 10 % inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die Menge an CCMP, die in jeder Kulturflüssigkeit in dieser Stufe erzeugt wurde, ist in Tabelle. 2 wiedergegeben ·

Sodann wurde jede Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach die gleiche Behandlung wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Krisüallen durchgeführt.

Die Menge der aus 10 Litern jeder Kulturflüssigkeit gewonnenen CCMP ist in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Verbindung	Menge an CCMP	gewonnen(mg)
Cytosin	erzeugt(mg/1)	382
Cytidin	98	333
5'-Cytidylsäure	99	415
115

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- 23 -

Fortsetzung Tabelle 2

Verbindung	Menge an CCMP	gewonnen(mg)
2'-Cytidylsäure	erzeugt(mg/1)	107
3'-Cytidylsäure	30	118
Cytidin-5·-diphosphat	45	321
Cytidin-5'-triphosphat	83	245
keines	79	12
6

Beispiel 3

Jeweils Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P Nr. 20,6) ,Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P 207) und Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 37 6, FERM-P Nr. 106) wurden in einem Schrägmedium, das eine Zusammensetzung von 0,5 % (NH₄)2^SO ₄r 0,5 % KH₃PO₄, 0,5 % K₃HPO₄, 0,05 % MgSO₄. 7H₂O, 1 % Kasaminosäure, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Glucose und 2 % Agar aufwies,zur Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurden 40 ml eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 0,5 % Harnstoff, 0,5 %

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KH₃PO , 0,5 % K₂HPO , 1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % MgSO .7H 0, 0,01 % ZnSO..7H₉O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 3 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 500 ml Schüttelkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115°C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in dem Schüttelkolben inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 70 Stunden unter Schüttelung mit 140 U/min unterworfen.

Die Menge an in jeder Kulturflüssigkeit in diesem Stadium erzeugtem CCMP ist in Tabelle 3 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde jeweils die Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die CCMP-Menge, die aus 10 Litern jeder Kulturflüssigkeit gewonnen wurde, ist in Tabelle 3 wiedergegeben.

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Tabelle 3

Rasse	Verbindung	Menge an CCMP	gewohnen (mg)
C	Cytosin	erzeugt (mg/1)	223
A	Cytidin	63	256
M	keine	78	10
Cytosin	4	327
Cytidin	118	336
keine	105	12
Cytosin	5	320
Cytidin	110	285
keine	104	12
6

C: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC Nr. 21374 FERM-P Nr₄ 206)

A: Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr< 207 M: Microbakterium Nr. 205 (ATCC Nr. 21376, FERM-P Nr. 106)

- 26 -

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Beispiel 4

Microbakterium Nr. MT-3 (ATCC Nr. 21 981, FERM-P Nr. 787) wurde einer Schüttelkultur bei 28°C während 16 Stunden in einem Medium _f das eine Zusammensetzung von
4 % Abfallmelasse, 1 % Fleischextrakt, 0,5 % Maisstärkesaft und 0,1 % Natriumchlorid,(pH 7,0) aufwies, zur Erzeugung einer Samenkultur unterworfen. Andererseits wurde 1 1 eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 0,5 % KH₂PO₄, 0,5 % K₂HPO₄, 1 % Fleischextrakt, 0,5 % Maisstärkesaft, 1,0 % MgSO₄.7HO, 0,01 % ZnSO₄^H₃O, 0,02 % FeCl₂-7H₂O, 3 g/l jeweils der in Tabelle 4 .angegebenen Verbindungen und Leitungswasser (pH 7,5, eingestellt mit
3n-K0H) aufwies, in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaverjbei 115 C während 10 Minuten sterilisiert. (Das Medium enthielt 1,02 mg/1 Mn in Form von MnCl₂.4HO, 112 mg/1 Fe⁺⁺ in Form von FeCl₃.7H₃O und
88 mg/1 Fe⁺⁺ in Form von FeCl₃.7H₂O). Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10 % inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30°C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die Menge an CCMP, die in jeder Kultur zu diesem Stadium., erzeugt war, ist in Tabelle 4 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde jede Kulturflüssigkeit zur Entfernung
der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1, unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 10 Litern jeweils der Kulturflüssigkeit erhaltene CCMP-Menge ist in Tabelle 4 gezeigt.

- 27 -09851/1055

Tabelle 4

Verbindung	Menge an CCMP	gewonnen (mg)
Cytosin	erzeugt (mg/1)	800
Cytidin	190	791
5'-Cytidylsäure	200	534
3'-Cytidylsäure	181	532
keine	170	28
7

Beispiel 5

Jede der in Tabelle 5 angegebenen Rassen wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 unter Herstellung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 Liter eines Mediums,
das eine Zusammensetzung von 7_;5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 1 % KH PO₄, 1 % K₃HPO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 1 % MgSO₄.7H₂O, 0,02 % ZnSO₄.7H₂O und 3 g/l jeweils der
in Tabelle 5 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115°C während 12 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in

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das Medium in einer Menge von 10 % inokuliert und sodann einer Schüttelkultur bei 30⁰C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die CCMP-Menge, die in der Kulturflüssigkeit jeweils in dieser Stufe erzeugt wurde, ist in Tabelle 5 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde jede Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die Menge an CCMP, die aus 10 Litern der Kulturflüssigkeit jeweils gewonnen wurde, ist in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Verbindung	1-Cytidylsäure	C	Rasse	erzeugt	M	gewonnen (mg)
	•-Cytidylsäure			120		256
	1-Cytidylsäure	erzeugt (mg/1)		45	(mg/1)	100
		110		48		112
5	34	Menge an CCMP
3	35	gewonnen (mg)
2	334
	95
	90

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- 29 -

Fortsetzung Tabelle 5

Cytidin-51- diphosphat	107	287	110	278
Cytidin-51-' triphosphat	108	280	98	256
keine	7	13	8	15

C: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC Nr. 21 374 FERM-P Nr. 206)

M: Microbakterium Nr. 205 (ATCC Nr. 21 375, FERM-P Nr. 106)

Beispiel 6

Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 zur Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 7,5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 0,5 % KH₂PO₄, 0,5 % K₂HPO₄, 0,5 % Glycin, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % MgSO₄.7H₂O, 0,02 % ZnSO₄.7H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 6 angegebenen Verbindungen aufwies 4?H. 7,5, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115°C während 12 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10 % inokuliert und sodann einer Schüttelkultur bei 30°C während 20 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen. Nachfolgend wurde eine 1 %ige Lösung des Fluorides, von Borsäure oder des Borates, die in

- 30 -

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Tabelle 6 angegeben sind (die zuvor in einem Autoklaven bei 110°C während 10 Minuten sterilisiert worden war) zu dem Medium in einer in Tabelle 6 angegebenen Konzentration hinzugegeben und die Schüttelkultur bei 30°C während 60 Stunden unter Schüttelung bei 180 U/min weiter fortgesetzt.

Die Menge an CCMP, die in diesem Stadium ±n jeweils der Kulturflüssigkeit erzeugt wurde, ist in Tabelle 6 angegeben.

Nachfolgend wurde jeweils die Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt

Die aus 10 Litern jeweils der Kulturflüssigkeit gewonnene Menge an CCMP ist in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Verbindung	Zusatz	Konzen tration (mg/1)	Menge an CCMP	gewonnen (mg)
Cytosin	Fluorid, Borsäure oder Borat	40	erzeugt (mg/1)	611
Borsäure	50 ■	186	638
Zinkfluor id	-	194	290
keiner	104

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409851/1055

Fortsetzung Tabelle 6

Cytidin	Borsäure	40	-	-	-	-	-	184	680
5'-Cytidyl- säure	Zinkfluorid	50	100	100	200	100	187	622
3'-Cytidy1- säure	keiner	5	5	10	50	84	257
2'-Cytidyl- säure	Hatriumborat	197	685
Cytidin-51- diphosphat	Kobaltfluorid	184	635
keiner	94	276
Natriumborat	53	125
Kobaltfluorid	74	219
keiner	34	96
Kaliumborat	50	139
Kaiiumfluorid	64	2O5
keiner	28	80
Zinkborat	188	649
Natriumfluoric	184	610
keiner	95	287

- 32 -

40 9 851/1055

Fortsetzung Tabelle 6

Cytidin-51- triphosphat	Ammonium borat	100	181	640
Eisen(III)- fluorid	100	188	637
keiner	-	90	297

Beispiel 7

Jeweils Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P Nr. 207) und Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2 unter Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 1 eines Mediums, dagfeine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 1 % KH PO₄, 1 % K₃HPO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 1 % MgSO₄^H₃O, 0,02 % ZnSO₄^H₃O und 3 g/l jeweils der in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Verbindungen aufwies, und jeweils die in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Fluoride, Borsäure und Borate in den in den Tabellen angegebenen Konzentrationen enthielt (pH 7.5, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115 C während 12 Minuten sterilisiert, Die obige Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10 % inokuliert und sodann einer Schüttelkultur bei 30°C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

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_ OO _

Die.in der Kulturflüssigkeit in diesem Stadium jeweils erzeugte CCMP-Menge ist in den Tabellen 7 und 8 angegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit jeweils zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 1 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die Menge an CCMP, die aus 10 Litern der Kulturflüssigkeit jeweils erhalten wurde, ist in den Tabellen 7 und 8 angegeben.

Tabelle 7

Rasse: Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P Nr. 207)

Verbindung	Zusatz	Konzen tration (mg/1)	-	10	-	Menge an CCMP	gewonnen (mg)
Cytosin	Fluorid, Borsäure oder Borat	30	40	erzeugt (mg/1	518
Cytidin	Natriumfluorid	20	165	386
Borsäure	134	274
keiner	94	489
Kaliumfluorid	168	350
N atr iumbor at	128	251
keiner	88

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Fortsetzung Tabelle 7

5'-Cytidyl- säure	Zinkfluorid	100	-	5	-	-	158	478
3'-Cytidyl- säure	Natriumborat	40	100	100	100	140	412
2·-Cytidyl- säure	keiner	100	-	50	- 87	267
Cytidin-5·- diphosphat	Zinkfluorid	-	100	60	197
Cytidin-5'- triphosphat	Kaliumborat	2	42	116
keiner	38	79
Kobaltfluorid	51	178
Kaliumborat	40	107
keiner	24	58
Ammoniumfluorid	158	405
Kobaltborat	135	370
keiner	74	217
Ammoniumfluorid	161	478
Zinkborat	129	381
keiner	88	235

- 35 -

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Tabelle 8

Rasse: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 376 FERM-P Nr. -206)

Verbindung	Zusatz	Konzen tration (mg/1)	50	30	-	50	-	Menge an CCMP	gewonnen (mg)
Cytosin	Fluorid, Borsäure oder Borat	100	100	20	20	erzeugt (mg/1)	325
Cytidin	Ammoniumfluorid	100	-	98	427
5'-Cytidyl- säure	änkborat	-	134	97
3·-Cytidyl- säure	keiner	36	286
Natr iumfluorid	87	385
Zinkborat	128	94
keiner	35	271
Kaliumfluorid	86	416
Kobaltborat	138	98
keiner	37	117
Zinkfluorid	34	118
Kobaltborat	42	74
keiner	25

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Fortsetzung Tabelle 8

2·-Cytidyl- säure	Zinkfluorid	50	-	10	10	30	98
Cytidin-51- diphosphat	Borsäure	30	100	100	38	120
Cytidin-5(- triphosphat	keiner	-	-	24	70
Kobaltfluorid	76	287
Kaliumborat	135	420
keiner	38	86
Kobaltfluorid	80	258
Natriumborat	128	382
keiner	40	106

Beispiel 8

Unter Verwendung von Mierobakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106) wurden CCMP-Kristalle in gleicher Weise wie in Beispiel 6 erzeugt, jedoch mit der Ausnahme, dass nicht die in Tabelle 6 angegebenen Verbindungen verwendet wurden, sondern die in Tabelle 6 angegebenen Fluoride, Borsäure und Borate durch jene, die in Tabelle 9 angegeben sind in den in der Tabelle9angegebenen Konzentrationen verwendet wurden.

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Die-CCMP-Menge, die in der Kulturflüssigkeit jeweils erzeugt wurde und die Menge an CCMP-Kristallen, die aus 10 Litern
der Kulturflüssigkeit jeweils gewönnen wurde, ist in Tabelle 9 angegeben.

Tabelle 9

Fluorid, Borsäure oder Borat	Konzentra tion (mg/1)	Menge an CCMP	gewonnen (mg)
Borsäure	40	erzeugt (mg/1)	97
N atr iumbor at	100	36	70
Kaliumborat	200	28	68
Zinkborat ·	100	27	65
Ammoniumbor at	100	28	57
Zinkfluorid	50	21	94
Kobaltfluorid	5	30	80
Kaliumfluorid	10	28	96
Natriumfluorid	50	33	88
Eisen(III)fluorid	100	36	77
keiner	-	28	25
10

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Beispiel 9

Bei Verwendung von Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P
Nr. 207) und Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206) wurden CCMP-Kristalle in gleicher Weise wie
in Beispiel 7 erhalten, jedoch mit der Ausnahme, dass die
in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Verbindungen nicht angewandt wurden, sondern die in den Tabellen 7 und 8 angegebenen Fluoride, Borsäure und Borate durch jene in den Konzentrationen ersetzt wurden, die in den Tabellen 10 und 11 angegeben sind.

Die CCMP-Menge, die in der Kulturflüssigkeit jeweils erzeugt
wurde und die Menge der CCMP-Kristalle, die aus 10 Litern jeweils der Kulturflüssigkeit gewonnen wurde, ist in den Tabellen 10 und 11 wiedergegeben.

Tabelle 10

Rasse: Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207)

Fluorid, Borsäure oder Borat	Konzentra tion (mg/1)	Menge an CCMP	gewonnen (mg)
iatriumfluorid	30	erzeugt (mg/1)	87
Kaliumfluorid	10	28	65
Zinkfluorid	100	25	96
33

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Fortsetzung Tabelle 10

Kobältfluorid	5	27	71
Aitimoniumfluorid	100	30·	81
Borsäure	20	27	74
Natriumborat	40	25	74
Kaliumborat	100	20	81
Kobaltborat	2	25	74
Zinkborat	50	26	71
keine	-	6	18

Tabelle 11

Rasse: Gorynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206)

Fluorid, Borsäure Borat	Konzen tration (mg/1)	Menge an CCMP	gewonnen (mg)	58
Ammoniumfluorid	100	erzeugt (mg/1)	47
Natriumfluorid	50	18
15

40985-1 / 1055

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Fortsetzung Tabelle 11

Kaliumfluorid	30	17	48
Zinkfluorid	50	18	52
Kobaltfluor id	10	15	45
Zinkborat	100	28	84
Kobaltborat	20	21	67
Borsäure	30	18	51
Kaliumborat	100	18	45
Natriumborat	100	20	57
keine	-	7	20

Beispiel 10

Jede der in Tabelle 12 angegebenen Rassen wurde bei 28 C während 16 Stunden in einem Medium kultiviert, das eine Zusammensetzung von 2 % Glucose, 1 % Polypepton, 0,7 % Hefeextrakt und 0,2 % Natriumchlorid (pH 7,0) aufwies, um eine Samenkultur zu erzeugen. Andererseits wurde 1 1 eines Mediums das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 1 %

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409851/105

, 1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0/2 % MgSO₄. 7H₂O, 0,01 % ZnSO₄.7H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 12 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115 C während 10 Minuter/sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30 C während 20 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die CCMP-Menge, die in der Kulturflüssigkeit in diesem Stadium jeweils erzeugt wurde, ist in Tabelle 12 angegeben .

Nachfolgend wurde jeweils 1 Liter der Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und das überstehende auf pH 4,0 unter Verwendung von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure eingestellt, und sodann auf Aktivkohle adsorbiert. Die Aktivkohle wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit einer 50 %igen wässrigen Äthanollösung, die 1,4 % Ammoniak enthielt, zur Elution von CCMP behandelt. Das Eluat wurde unter verringertem Druck auf 100 ml konzentriert und das resultierende Konzentrat auf pH 8,0 unter Verwendung von konzentriertem NH₄OH eingestellt und sodann durch eine Säule (3 cm χ 50 cm), die mit Dowex 1 (x 4) Harz des Ameisensäurentypus (100-200 mesh) gefüllt war, zur Adsorption von CCMP auf der Harzsäule geführt. Nachfolgend wurde die Säule mit Wasser gewaschen, mit einer 0,02n-Ameisensäurelösung voreluiert und sodann mit einer 0,1n-Ameisensäurelösung zur Elution von CCMP behandelt, wobei das Eluat in Fraktionen von jeweils 50 ml

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4098 51/105

Volumen aufgeteilt wurde (3',5'-zyklische-Adenylsäure wurde nicht eluiert). Unter diesen Fraktionen wurden jene, die Absorptionen bei 28Om ,u aufwiesen, der Indolreaktion / Ceriotti, G.J. Biol. Chem. JJ38, 297 (1952) und 2Jt±, 59 (1955)_7 und der Orcinolreaktion auf Ribose {_ Brown, A.H. Arch. Biochem. 11, 269 (1946)_/ unterworfen und Fraktionen, die gegenüber der erstgenannten Reaktion negativ und gegenüber der letzteren Reaktion positiv reagierten, wurden unter Erhalt einer Fraktion, die lediglich CCMP enthielt, gesammelt.

Die CCMP-Fraktion wurde auf pH 7,0 mit 3n-K0H eingestellt und durch eine Aluminiumoxid-Säule geführt, die mit neutralem Aluminiumoxid gefüllt war. Der ausfliessende Strom wurde auf pH 2,0 mit 50 %iger HCl eingestellt und durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule zur Adsorption von CCMP auf Aktivkohle geführt. Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit einer 50 %igen Äthanollösung,die 1,4 % Ammoniak enthielt, zur Elution von CCMP behandelt. Das Eluat wurde sodann unter verringertem Druck zur Entfernung des überschüssigen Ammoniaks konzentriert, durch eine mit AmberIite IRC-50, H⁺-Form_r gefüllte Säule, zur Entfernung von Ammoniak geführt, weiter unter verringertem Druck konzentriert und sodann unter Erhalt von CCMP-Kristallen in einer Menge, wie es in Tabelle 12 gezeigt ist, gefriergetrocknet.

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09851/1055

- 43 Tabelle 12

Verbindung	Rasse	C	erzeugt (g/i)	gewonnen (g)	M	gewonnen (g)
Uracil	2.34	0.72	erzeugt . (g/l)	1.21
Uridin	2.54	0.84	3.46	1.12
5'-Uridylsäure	2.67	0.82	3.34	1.09
3'-Uridylsäure	0.98	0.79	3.38	0.42
2'-Uridylsäure	0.34	0.12	1 .24	0.32
Uridin-5'-diphosphat	2.84	0.83	1 .10	1 .00
Uridin-5'-triphosphat	2.87	0.84	3.28	1.14
Orotsäure	1 .22	0.42	3.45	0.51
Orotidin	1.12	0.33	1 .54	0.53
.. Or ot id in- 5 ' - monophospha	t 1.41	0.32	1.64	0*65
keine	0.01	0.003	1 .82	0.006
0.03

C: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374,

FERM-P Nr. 206)
M: Microbakterium Nr. 2O5-CM7 (ATCC 21 979, FERM-P Nr. 1557)

- 44 -

409851/1055

Beispiel 11

Jede der in Tabelle 13 angegebenen Rassen wurde in einem Schrägmedium, das eine Zusammensetzung von 0,5 % (NH.)₂SO , 0,5 % KH₂PO₄, 0,5 % K₃HPO₄, 0,05 % MgSO₄.7H₂O, 1 % Kasaminosäure, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Glucose und 2 % Agar aufwies, unter Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurden 40 ml eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 0,5 % Harnstoff, 0,5 % KH₃PO₄, 0,5 % K₂HPO₄, 1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % MgSO₄.7H₂O, 0,1 % ZnSO₄.7HO und 3 g/l jeweils der in Tabelle 13 angegebenen Komponenten aufwies (pH 8,0, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 500 ml-Schüttelkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115 C während 10 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30°C während 70 Stunden unter Schüttelung mit 140 ü/min unterworfen.

Die jeweils in diesem Stadium in der Kulturflüssigkeit erzeugte Menge an CCMP ist in Tabelle 13 angegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit jeweils zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 10 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 1 Liter jeweils der Kulturflüssigkeit gewonnene Menge an CCMP ist in Tabelle 13 wiedergegeben.

- 45 -

0 9 8 5 1/1055

Tabelle 13

Rasse	Verbindung	Menge an CCMP	gewonnen (g)
C	üracil	erzeugt (g/l)	0.73
	Uridin	2.27	0.81
A	keine	2.54	0.002
	üracil	0.01	0.28
M	Uridin	1 .14	0.42
keine	1 .32	0.001
Üracil	0.006	0.85
Uridin	2.47	0.94
keine	2.68	0.01
0.03

C: Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206)

A: Arthrobacter 11 (ATCC Nr. 21 375, FERM-P Nr. 207) M: Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106)

409851/1055

Beispiel 12

Die in Tabelle 14 angegebenen Rassen wurden jeweils einer Schüttelkultur bei 28 C während 16 Stunden in einem Medium das eine Zusammensetzung von. 4 % Abfallmelassen, 1 % Fleischextrakt, 0,5 % Maisstärkesaft, und 0,1 % Natriumchlorid (pH 7,0) aufwies, unter Erzeugung einer Samenkultur unterworfen. Andererseits wurde 1 Liter eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 0,5 % KH PO., 0,5 % K₃HPO₄, 1 % Fleischextrakt, 0,5 % Maisstärkesaft, 1,0 % MgSO₄.7H₂O, 0,01 % ZnSO₄.7H₂O, 0,02 % FeCl₃.7H₃O, 3 g/l jeweils der in Tabelle 14 angegebenen Verbindungen und Leitungswasser aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115°C während 10 Minuten sterilisiert. (Das Medium enthielt 1,02 mg/1 Mn⁺⁺ in Form von MnCl₃^H₃O, 112 mg/1 Fe⁺⁺ in Form von FeCl₃^H₃O und 86 mg/1 Fe⁺ in Form von FeCl., .7H-O) . Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10 % inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30 C während < Schüttelung bei 180 U/min unterworfen.

einer Schüttelkultur bei 30°C während 80 Stunden unter

Die in der Kulturflüssigkeit jeweils in diesem Stadium erzeugte CCMP-Menge ist in Tabelle 14 angegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit zur Entfernung der Zellen jeweils zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 10 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit jeweils gewonnene CCMP-Menge ist in Tabelle 14 wiedergegeben.

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4 09851/1055

Tabelle 14

Verbindung	M	erzeugt (g/i)	Rasse	erzeugt (g/i)	gewonnen (g)	A	erzeugt (g/l)	gewonnen (g)
		2.84		3.24	1 .22		2.43	0.83
	2.76	C	3.33	1 .26	2.35	0.77
	2.86	Menge an CCMP	3.21	1 .12	2.44	0.82
Uracil	1 .22	gewonnen (g)	1 .58	0,54	1 .35	0.40
Uridin	0.78	0.82	0.98	0.32	0.85	0.25
5 '--Ur idyl Säure	0.87	O."63	1 .13	0.38	0.68	0.23
3'-Uridylsäure	0.01	0.81	0.02	0.003	0.02	0.003
Orotsäure	0.45
Orotidin	0.24
keine	0.28
	0.002

M: Microbakterium Nr. MT-3 (ATCC 21 981, FERM-P Nr. 787) C: Corynebakterium Nr. MT-11 (ATCC 31 019, FERM-P Nr. 2384) A: Arthrobacter Nr. MT-12 (ATCC 31 070, FERM-P Nr. 2482)

- 48 -

409 8 B1 / 1055

Beispiel 13

Die in Tabelle 15 jeweils angegebenen Rassen wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 10 unter Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 1 eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 1 % KH PO., 1 % K₂HPO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 1 % MgSO..7H₃O, 0,03 % ZnSO₄.7H₂O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 15 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115 C während 12 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10 % inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30°C während 80 Stunden unter Schüttelung mit 180 U/min unterworfen.

Die in der Kulturflüssigkeit jeweils in diesem Stadium erzeugte CCMP-Menge ist in Tabelle 15 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit jeweils zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 10 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit jeweils erhaltene Menge an CCMP ist in Tabelle 15 wiedergegeben.

- 49 -

409851 / 1055

Tabelle 15

	A	1 .17	Rasse	M	CCMP	gewonnen (g)
Verbindung		1 .22	-"	erzeugt (g/i)	, 0.93
	erzeugt (g/i)	1 .23	Menge an	2.84	0.23
	2.77	1.44	gewonnen (g)	0.77	0.24
5'-Uridylsäure	0.98	1 .47	0.92	0.84	0.72
3'-Uridylsäure	0.97	1 .74	0.32	2.23	0.86
2'-Uridylsäure ·	Uridin-5'-diphosphat 2.54	1 .77	0.28	2.64	0.35
	Uridin-5' -triphosphat 2.47	0.05	0.73	0.97	0.29
Orotsäure	0.68	0.96	0.45
Orotidin	0.28	1.24	0.43
Orotidin-2'- monophosphat	0.43	1 .32	0.44
Orotidin-3'- monophosphat	0.32	1.22	0.45
Orotidin-5'- monophosphat	0.45	1.34 .,	0.34
Orotidin-5'. ~ diphosphat	- 0.48	1.22	0.003
Orotidin-5'- triphosphat	0.67	0.01
keine	0.81
0.002

A: Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P Nr. 207) M: Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376, FERM-P Nr. 106)

409851/1055

Beispiel 14

Microbakterium Nr. 205 (ATCC 21 376 , FERM-P Nr. 106) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 10 unter Erzeugung einer Samenkultur kultiviert. Andererseits wurde 1 1 eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 7,5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 0,5 % KH PO₄, 0,5 % K HPO., 0,5 % Glyzin, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % MgSO₄^H₃O, 0,02 % ZnSO₄^H₃O und 3 g/l jeweils der in Tabelle 16 angegebenen Verbindungen aufwies (pH 7,5, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115 C während Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 10 % inokuliert und einer Schüttelkultur bei 28 C während 24 Stunden unter Schüttelung mit 190 U/min unterworfen. Nachfolgend wurde eine 1 %ige Lösung des Fluorides, der Borsäure oder des Borates, die in Tabelle 16 angegeben sind (die vorstehend in einem Autoklaven bei 110 C während 10 Minuten sterilisiert worden war) dem Medium in einer in Tabelle 16 angegebenen Konzentration hinzugegeben und die Schüttelkultur weiter bei 28 C während 70 Stunden unter Schüttelung mit 190. U/min fortgesetzt.

Die in der Kulturflüssigkeit in diesem Stadium jeweils erzeugte CMP-Menge ist in Tabelle 16 wiedergegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit jeweils zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 10 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit jeweils gewonnene Menge an CCMP-Kristallen ist in Tabelle 16 angegeben.

- 51 -

409851/1055

- 51 Tabelle 16

Verbindung	Zusatz	Konzen tration (mg/1)	Menge an CCPM	gewonnen (g)
Uracil	Fluorid, Borsäure oder Borat	50	erzeugt (g/i)	1.12
Uridin	Natriumfluorid	60	3.43	1 .23
5'-Uridylsäure	Natriumborat	-	3.66	0.82
3'-Uridylsäure	keiner	50	2.45	1 .23
Natriumfluorid	60	3.76	1 .28
Natriumborat	-	3.87	0.89
keiner	50	2.44	1.33
Natriumfluorid	60	3.67	1.19
Natriumborat	-	3.46	0.81
keiner	50	2.56	1 .23
Natriumfluorid	60	3.67	1 .33
Natriumborat	-	3.88	0.34
keiner	0.94

- 52 -

£09851 / 10 5 5

Fortsetzung Tabelle 16

2'-Uridylsäure	Natrxumfluorid	50	2.47	0.84
Uridin-5'- diphosphat	Natriumborat	60	2.49	0.81
Uridin-5·- triphosphat	keiner	-	O.97	0.32
Orotsäure	Natriumfluorid	50	3.45	1 .24
Orotidin	Natriumborat	40	3.37	1 .23
keiner	-	2.67	0.84
Natriumfluorid	-50	3.89	1 .25
Borsäure	40	3.81	1 .42
keiner		2.53	0.75
Zinkfluorid	100	2.45	0.84
Ammoniumborat	200	2,3 1	0.70
keiner	-	1 .12	0.35
Zinkfluorid	100	2.22	0.72
Ammoniumborat	200	2.53	0.86
keiner	- ■	1 .12	0.34

- 53 -

409851/1055

Fortsetzung Tabelle 16

	Kobaltfluorid	5	5	5	2.05	0.72
Orotidin-2'- monophosphat	ZinKborat	100	100	100	1 .97	0.58
	keiner	-	-	-	0.84	0.24
	KobaItfluorid	70	2.34	0.72
Orotidin-31- monopho sp hat	Zinkborat	100	2.50	0.83
	keiner	-	0.77	0.23
	Kobaltfluorid	70	2.57	0.83
Orotidin-51- raonopho sphat	Zinkborat	100	2.67	0.89
	keiner	-	0.72	0.31
	Kaliumfluorid	3.77	1 .23
Orotidin-51- diphosphat	Zinkborat	3.65	1.33
-	keiner	2.70	0.94
	Ka1iumfluorid	3.77	1 .22
Orotidin-51- triphosphat	Zinkborat	3.82	1 .32
	keiner	2.74	0.87

- 54 -

/1055

Beispiel 15

Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P Nr. 207) und Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206) wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 10 unter Erzeugung einer Samenkultur vorkultiviert. Andererseits wurde 1 1 eines Mediums, das eine Zusammensetzung von 5 % Glucose, 1 % Harnstoff, 1 % KH₂PO₄, 1 % K₃HPO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton, 1 % MgSO₄.7H₃O, 0,02 % ZnSO .7H₃O und 3 g/l jeweils der in Tabellen 17 und 18 angegebenen Verbindungen aufwies und jeweils die in den Tabellen 17 und 18 angegebenen Fluoride, die Borsäure und Borate in den in den Tabellen angegebenen Konzentrationen enthielt (pH 7,5, eingestellt mit 3n-K0H) in einen 5-Liter-Erlenmeyerkolben eingegeben und in einem Autoklaven bei 115 C während .12 Minuten sterilisiert. Die vorstehend erwähnte Samenkultur wurde in das Medium in einer Menge von 1 % inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30 C wahrem
180 U/min unterworfen.

kultur bei 30°C während 80 Stunden unter Schüttelung mit

Die in der Kulturflüssigkeit in diesem Stadium erzeugte CCMP-Menge ist in den Tabellen 17 und 18 angegeben.

Nachfolgend wurde die Kulturflüssigkeit jeweils zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und hiernach wurden die gleichen Behandlungen wie in Beispiel 10 unter Erhalt von CCMP-Kristallen durchgeführt.

Die aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit jeweils erhaltene CCMP-Menge ist in den Tabellen 17 und 18 angegeben.

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Λ 0 9 8 51/1055

Tabelle 17
Rasse: Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P Nr. 207)

Verbindung	Zusatz	Konzen tration (mg/1)	Menge an CCMP	gewonnen (g)
	Fluorid, Borsäure oder Borat	50	erzeugt (g/i)	1.25
j Uracil	Zinkfluorid	100	3.74	1 .32
	Zinkborat	-	3.72	0.82
Ur id in	keiner	50	2.63	1 .23
	Zinkfluorid	-	3.77	0.82
5'-Uridylsäure	keiner	30	2.38	1 .32
	Natrxumfluorid	100	3.88	1.28
3'-Uridylsäure	Zinkborat	-	3.73	0.95
keiner	30	2.84	0.71
Natrxumfluorid	100	2.37	0.93
Natrxumborat	-	2.68	0.39
keiner	1 .24

- 56 -

U09851/1055

Fortsetzung Tabelle 17

2'-Uridylsäure	Natriumfluorid	30	6	-	6	-	2.82	0.98
Uridin-51- diphosphat	keiner	-	5	40	0.93	0.32
Uridin-51- triphosphat	Kaiiumfluorid	-	3.24	1.24
Orotsäure	keiner	40	2.27	0.73
Orotidin	Kaliumfluorid	30	3.66	1.24
Orotidin-21- monophosphat	Kobaltborat	-	3.27	1 .23
keiner	40	2.46	0.79
Ainmoniumfluorid	-	2.33	0.72
keiner	1 .22	0.45
Ainmoniumfluorid	2.22	0.72
Borsäure	2.43	0.82
keiner	1 .23	0.43
Ammoniumfluorid	1.84	0.60
keiner	0.95	0.32

- 57 -

409851/1055

Fortsetzung Tabelle 17

Orotidin-3«- monophosphat	Ammoniumfluorid	40	1,76	0.53
	Borsäure	30	1 .88	0.66
Orotidin-5'- monophosphat	keiner	-	0.86	0.25
	Ammoniumfluorid	40	1 .97	0.66
	Borsäure	30	1.97	0.73
Orotidin-5'- diphosphat	keiner	-	0.65	0.22
Orotidin-5'- triphosphat	Ammoniumfluorid	40	1.85	0.66
keiner	-	0.77	0.24
Ammoniumfluorid	40	1 .98	0.73
keiner	-	0.76	0.24

- 58 -

4 0 9 8 5 1/1055

Tabelle.18

Rasse: Gorynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206)

Verbindung	Zusatz	Konzen tration (mg/1)	Menge an CCMP	gewonnen (g)
Uracil	Fluorid, Borsäure oder Borat	20	erzeugt (g/i)	1.10
üridin	Kaliumfluorid	20	3.37	1 .23
5'-Uridylsäure	Borsäure		3.67	0.84
keiner	20	2.67	1 .21
Ka1iumfluor id	30	3.68	1 .23
Kobaltborat	-	3.55	0.83
keiner	20	2.67	1 .24
Kaliumfluorid	30	3,77	1 .22
Kobaltborat	-■	3.86	0.88
keiner	2.45

- 59 -

409851/1055

Fortsetzung Tabelle 18

3·-Uridylsäure	Ammoniumfluorid	100	2.45	0.75
2'-Uridylsaure	keiner	-	1.56	0.34
Uridin-51- diphosphat	Natriumborat	50	2.45	0.83
Uridin-5'- triphosphat	keiner	-	1 .22	0.43
Orotsäure	Natriumborat	50	3.78	1 .25
Orotidin	keiner	-	2.65	0.87
Ammonxumfluorid	100	3.88	1 .22
keiner	-	2.44	0.83
Natr iumfluorid	30	2.56	0.72
keiner	-	1.12	0.33
Natriumfluorid	30	2.88	0.79
Kaliumborat	100	2.78	0.84
keiner	-	1 .13	0.34

- 60 -

Λ0 9 8 51/1055

Fortsetzung Tabelle 18

Orotidin-21- monopho sphat	Kaliumborat	100	2.87	0.89 :
Orotidin-31- monophosphat	keiner	-	0.98	0.28
Orotidin-51- raonophosphat	Natr iumfluorid	30	2.65	0.81
Orotidin-51- diphosphat	keiner	-	1 .12	0.25
Orotidin-5'- triphosphat	Natr iumfluor id	30	2.89	0.87
Kaliumborat	100	3.34	1 .12
keiner	-	2.23	0.74
Zinkfluorid	60	3.34	1 .12
keiner	-	2.23	0.74
Zinkfluorid	60	3.47	1 .24
Kaliumborat	100	3.23	1 .10
keiner	-	2.44	0.77

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Claims (18)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung zyklischer-3',5'-Cytidyl-

säure durch Fermentierung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Microorganismus, der zu der Gattung Corynebakterium, Arthrobacter oder Microbakterium gehört, und die Fähigkeit zur Erzeugung zyklischer 3',5'-Cytidylsäure aufweist, in einem Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Nährstoffe aufweist, unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 5-9 bei einer Temperatur von 20-40 C während eines Zeitraums kultiviert wird, bis zyklische-3',5'-Cytidylsäure erzeugt und in dem Medium angesammelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zyklische-3',5'-Cytidylsäure aus der Kulturflüssigkeit gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass die zyklische-3',5'-Cytidylsäure durch die Adsorptionsmethodik oder die Ausfällungsmethodxk oder eine Kombination der beiden Methodiken gewonnen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus eine Rasse verwendet wird, die zu der Art Corynebakterium muriseptikum, Arthrobacter 11 oder Microbakterium 205 gehörig ist.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine Rasse darstellt, die aus der aus Corynebakterium muriseptikum Nr. 7 (ATCC 21 374, FERM-P Nr. 206), Corynebakterium Nr. MT-11 (ATCC 31 019, FERM-P Nr. 2384), Arthrobacter 11 (ATCC 21 375, FERM-P Nr/ 207), Arthrobacter Nr. MT-12 (ATCC 31 070, FERM-P Nr. 2482), Microbakterium Nr. 205 (ATCC .21 376, FERM-P Nr. 106), Microbakterium Nr. 2O5-CM7 (ATCC 21 979, FERM-P Nr. 1557) und Microbakterium Nr. MT-3 (ATCC 21 981, FERM-P Nr. 787) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Verfahren nach Anspruch1, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Verbindung in das Medium eingebracht wird, die aus der aus Cytosin, Uracil und Orotsäure, Ribosiden, die diese Verbindungen als Grundlagen aufweisen, und Ribotidendieser Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in das Medium zumindest eine Verbindung eingebracht ist, die/aus der aus Fluoriden, Borsäure und Boraten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass, in das Medium zumindest eine Verbindung eingebracht wird, die aus der aus Fluoriden, Borsäure und Boraten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Cytosin, Uracil oder Orotsäure, eines Ribosides, das die Verbindung als Grundlage aufweist, oder eines Ribotides der Verbindung in dem Medium 0,05 bis 2 % (Gew./v) beträgt.

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10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , dass die Menge des Fluorides, der Borsäure oder des Borates in dem Medium 0,1 bis 500 mg/1 beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass die Menge des Fluorides, der Borsäure oder des Borates in dem Medium 0,1 bis 500 mg/1 beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichn e t , dass die Kultivierung unter Schüttelung, Rührung oder Belüftung durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung während 10 bis 160 Stunden durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Microorganismus in einem Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Nährstoffe enthält, bei einem pH Wert von 5-9

bei einer Temperatur von 2O-4O°C vorkultiviert wird und in die resultierende Samenkultur zumindest eine Verbindung eingebracht wird, die aus der aus Cytosin, üracil und Orotsäure, Ribosiden, die diese Verbindungen als Grundlage enthalten, und Ribotiden der Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und sodann einer Nachkultur unterworfen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorkultur während 6 bis 20 Stunden und die Nachkultur während 4 bis 140 Stunden durchgeführt wird.

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16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in das Medium Vitamine eingebracht werden.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennz eichn e t , dass in das Medium ein Wachstumsinhibitor für zyklische-3',5'-Nukleotidphosphordiesterase eingebracht wird.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich-.net, dass die Kultivierung unter solchen Bedingungen bewirkt wird, dass in dem Wachstumsstadium der zyklischen-3',5'-Cytidylsäure der Druck des in der Kulturflüssigkeit vorliegenden Sauerstoffes auf 0,1 bis 0,6 Atmosphären und der Druck des in der Kulturflüssigkeit vorliegenden Kohlendioxides auf weniger als 0,08 Atmosphären geregelt ist, während in dem Stadium der Produktion zyklischer-3',5'-Cytidylsäure der Druck des in der Kulturflüssigkeit vorliegenden Sauerstoffes auf 0,2 bis 0,8 Atmosphären und der Druck des in der Kulturflüssigkeit vorliegenden Kohlendioxides auf weniger als 0,05 Atmosphären geregelt ist.

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