DE2351738C3

DE2351738C3 - Verfahren zur Herstellung von 3', 5'-cyclischer Adenylsäure

Info

Publication number: DE2351738C3
Application number: DE19732351738
Authority: DE
Inventors: Jiro Ishiyama; Motohiko Kato; Tamotso Nagareyama Yokotsuka; Fumihiko Matsudo Yoshida
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1972-10-16
Filing date: 1973-10-15
Publication date: 1979-02-22
Also published as: FR2202938B1; DE2351738A1; FR2202938A1; DE2351738B2; GB1460028A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 3',5'-cyclischer Adenylsäure durch Kultivierung eines Mikroorganismus und Gewinnung der 3',5'-cyclischen Adenylsäure aus dem Medium.

Es ist bekannt, daß 3',5'-cyclische Adenylsäure in verschiedenen biochemischen Reaktionen in vivo teilnimmt und für verschiedene Hormone eine aktive Rolle als Vermittler spielt. Sie stellt daher ein sehr geschätztes biochemisches Reagens dar.

Es sind bereits Verfahren zur Herstellung von 3',5'-cyclischer Adenylsäure (nachstehend als CAMP bezeichnet) bekannt. So kann CAMP z. B. durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium, Arthrobacter oder Microbacterium mit der Fähigkeit zur Erzeugung von CAMP aus einem Vorläufer, wie beispielsweise Adenin, Hypoxanthin, Succinyladenin, 5-Amino-4-imidazol-carboxamid,

7-Amino-pyrazolo-(4,3d)-pyrimidin, Pyrazolo-(4,3d)-pyrimidin, 4-Amino-pyrrolo-(2,3d)-pyrimidin, Pyrrolo-(2,3d)-pyrimidin, ein Ribosid, das eine der Verbindungen als Base enthält, oder ein Mononucleotid

; hiervon [2'(3' oder 5')-Adenylsäure, 2'(3' oder 5')-lnosinsäure, 2'(3' oder 5')-Succinyladenylsäure, 5-Amino-4-imidazolearboxamidribose-2'(3' oder 5')-phosphat, Formycin A-2'(3' oder 5')-monophosphat. Formycin B-2'(3' oder :5')-monophosphat, Tubercidin-2'(3' oder

) 5')-monophosphat, 6-Deaminotubercidin-2'(3' oder 5')-monophosphat oder dergleichen] in einem Medium, das die vorstehend genannten Vorläufer enthält, erzeugt werden.

CAMP kann durch derartige Verfahren, z. B. gemäß US-PS 36 30 842 im Vergleich zu ebenfalls bekannten präparativ-chemischen Verfahren unter geringeren Kosten gewonnen werden. Die bekannten mikrobiologischen Verfahren können jedoch noch nicht immer befriedigen, da es erforderlich ist eine erhebliche Menge der vorstehend angeführten Verbindungen dem Kulturmedium, hinzuzufügen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur einfachen und kostengünstigen Herstellung von CAMP durch Kultivierung eines Mikroorganismus zu schaffen. Hierbei soll insbesondere von Mikroorganismen Gebrauch gemacht werden, die zur Erzeugung von CAMP in einem Medium, das keinen Vorläufer enthält, fähig sind.

Das Verfahren der eingangs angeführten Art ist dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen Corynebacterium murisepticum Nr. 7-10 (ATCC 21977), Arthrobacter 11-211 (ATCC 21978), Microbacterium Nr. 205-CM 7 (ATCC 21979), Microbacterium Nr. 205-CM-XA 3 (ATCC 21980), Microbacterium Nr. MT-3 (ATCC 21981) oder Microbacterium Nr. 205-MP-197 (ATCC 21976) in einem Medium, das Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen und anorganische Nährsubstanzen, jedoch als Vorläufer kein Adenin, Hypoxanthin, Succinyladenin, 5-Amino-4-imidazol-carboxamid, 7-Aminopyrazolo-(4,3d)-pyrimidin, Pyrazolo-(4,3d)-pyrimidin, 4-Aminopyrrolo-(2,3d)-pyrimidin, Pyrrolo-(2,3d)-pyrimidin, ein Ribosid, das eine dieser Verbindungen als Base enthält, oder ein Mononucleotid hiervon aufweist, bei pH 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C kultiviert, bis 3',5'-cyclische Adenylsäure in dem Medium akkumuliert ist.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen 2 bis 4 erläutert.

Die Erfindung wird in der folgenden Beschreibung weiter veranschaulicht.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen stellen künstliche Mutanten von Corynebacterium murisepticum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P Nr. 206) (Corynebacterium murisepticum Nr. 7-10 [ATCC 21977]), von Arthrobacter-11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) (Arthrobacter 11-211 [ATCC 21978]) oder von Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P 106) (wie beispielsweise Microbacterium Nr. 205-CM 7 [ATCC 21979], Microbacterium Nr. 205-CM-XA 3 [ATCC 21980], Microbacterium Nr. MT-3 [ATCC 21981] bzw. Microbacterium Nr. 205-MP-197 [ATCC 21976]) dar.

Zum Erhalt der angeführten künstlichen Mutanten, ausgehend von den vorher erwähnten Mutierrassen, kann eine hierfür übliche Behandlung wirksam angewandt werden. Beispielsweise weiden die Mutterrassen bzw. -stamme Röntgenstrahlung, ultraviolettem Licht oder dergleichen. Behandlung mit mutagen wirkenden

Chemikalien, wie beispielsweise Nitrosoguanidin, Diäthylsulfat, Methyläthylsulfat, NaNO₂, Acridin, Stickstoffmustard oder dergleichen unterworfen. Die derart erhaltenen Mutanten werden in üblicher Weise geprüft bzw. klassiert und sodann die Mutanten, die eine Fähigkeit zur Erzeugung von CAMP ohne Zugabe der vorstehend angeführten Vorläufer aufweisen, isoliert.

Als Beispiel für Mutationsbehandlungen, wodurch ein Mutantenstamm erhältlich ist, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden kann, wird die folgende Methodik angeführt.

Zu 10 ml (Zahl der Zellen: 2 bis 5XlOVmI) Zellsuspension von Corynebacterium murisepticum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P Nr. 206), Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) oder Microbacterium Nr. 205 (AlCC 21376, FERM-P Nr. 106) werden während der logarythmischen Wachstumsphase 0,1 ml Diäthylsulfat hinzugefügt, und das Gemisch wird bei 30° C während ö0 Minuten unter Schüttelung zur guten Berührung bzw. Durchmischung gehalten. Die resultierende Suspension wird auf ein Agar-Plattenmedium (Anmerkung 1) geschmiert und während 48 bis 100 Stunden bei 30° C kultiviert. Die aufgetretenen Kolonien werden willkürlich aufgenommen, in ein Agarschrägmedium inokuliert (Anmerkung 2) und bei 30°C während 48 bis 100 Stunden kultiviert. Hiernach wird der derart kultivierte Mikroorganismus in 3 ml eines flüssigen Kulturmediums (Anmerkung 3) in einem Testrohr (0 2 cm, Länge 15 cm) inokuliert und während 24 Stunden bei 30°C unter Schüttelung mit 289 UpM kultiviert. Das Auftreten bzw. die Zunahme von CAMP in der Kulturlösung wird papierchromatografisch geprüft.

Anmerkung 1:

Ein aus 1% Glucose, 0,5% (NH₄J₂SO₄. 0.5% Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 1% K₂HPO₄, 0,3% Kasaininosäure, 3Oy/! Biotin, 1% MgSO₄ · 7 H₂O, 2% Agar zusammengesetztes Medium von pH 7,0; sterilisiert bei einem Druck von 1,05 kg/cm² während 10 Minuten.

Anmerkung 2:

ic Ein aus 1% Rindfleischextrakt, 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl und 2% Agar zusammengesetztes Medium von pH 7,0; sterilisiert bei einem Druck von 1,05 kg/cm- während 15 Minuten.

j. Anmerkung 3:

Ein aus 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,5% Harnstoff, 0,5% (NH₄)₂SO₄, 1% KH₂PO₄, 1% K₂HPO₄, 0,5% Arginin, 30y/l Biotin, 5% Glucose, 1% MgSO₄ · 7 H₂O, zusammengesetztes Medium, das bei einem Druck von 1,05 kg/cm² während 12 Minuten sterilisiert wurde.

Der Prozentsatz, der die Menge jedes Bestandteils in dem vorstehend erwähnten Medium bezeichnet, ist als eine Zahl angegeben, wobei das Gewicht des Bestandteils durch das Volumen des Mediums dividiert ist, d. h.

der Ausdruck »%« bedeutet Gewicht des Bestandteils in 100 ml des Mediums. Der gleiche Ausdruck wird nachstehend, sofern nicht anders angegeben, verwendet.

In Tabelle 1 Lt die Produktivität an CAMP und der

Nährbedarf des Mutterstammes und einer der somit

iu erhaltenen Mutanten, die die Fähigkeit zur CAMP-Produktion ohne Zugabe der vorstehend angegebenen Vorläufer zu dem Medium aufweisen, verglichen.

Tabelle

Stamm

Produktivität
CAMP*) Vilaininbedarf

Aminosäurenbedarf

Corynebacterium murisepticum Nr.7 keine Biotin Aminosäure ist nicht besonders

erforderlich, wenngleich Asparagin, Asparaginsäure und Arginin das Wachstum der Bakterien fördern

Arthrobacter 11 keine Biotin Aminosäure ist nicht besonders

Biotin Aminosäure ist nicht besonders

*) Die Schültelkullur wurde unter Verwendung eines Mediums (Anmerkung i) bei 30°C während 24 Stunden bei 289 UpM

Microbacterium Nr. 205 keine

Corynebacterium murisepticum Nr. 0,3 mg/ml
7-10

Arthrobacter 11 -211 0,4 mg/ml

Microbacterium Nr. 205-CM7 0,7 mg/ml

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, weisen die Mulanten keinen bestimmten Nährbedarf im Vergleich zu ihren Mutterstämmen auf und sind in der Lage CAMP ohne Zugabe der vorstehend angeführter. Vorläufer zu erzeugen.

Natürlich können Mutanten, die :.i ihrem Nährbedarf gegenüber ihren Mutterstämmen unterschiedlich sind, in dem Verfahren unter Erfüllung ihres Nährbedarfes verwendet werden, wenn sie zur Erzeugung von CAMP ohne Zugabe der Vorläufer fähig sind.

Beispielsweise wurde gemäß der Erfindung der Xanthin erfordernde Mutant Microbacterium Nr. 205-CM-XA 3 (ATCC 21980) dadurch isoliert, daß man Microbacterium Nr. 205-CM 7 (ATCC 21979, FERM-P Nr. 1557) einer im folgenden angegebenen Nitrosoguanidinbehandlung unterworfen hat

Zu einer Zellsuspension von Microbacterium Nr. 205-CM 7 wird in der logarythmischen Wachstumsphase (Zahl der Zellen etwa 10⁹/ml: "ine Phosphatpufferlösung von pH 6,5) Nitrosoguanidin derart zugegeben, daß dessen Endkonzentration 0,1 mg/ml beträgt, und die Zellen werden mit dem chemischen Reagens bei O⁰C während 30 Minuten in Berührung gebracht und durch Zentrifugieren gewonnen. Hiernach werden die gewonnenen Zellen bei 30° C unter Schüttelung während 16 Stunden in einem Medium (Anmerkung 4) kultiviert, wonach die resultierenden Zellen erneut gewonnen werden. Nachdem die gewonnenen Zellen mit einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen worden sind, werden die gewaschenen Zellen in einem Medium (Anmerkung 5) derart suspendiert, daß die Zahl der Zellen 1 bis 5 χ lOVml beträgt, und es wird Penicillin in einer Menge von 2000 Einheiten pro ml hinzugegeben. Hiernach werden die Mikroorganismen beim Stehen während 16 Stunden bei 30° C kultiviert. Sodann werden die Zellen gesammelt und mit einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in das gleiche Medium, wie es in Anmerkung 4 beschrieben ist, mit der Ausnahme geschmiert, daß 2% Agar hinzugefügt werden, und die Kultivierung wird bei 30°C während 72 Stunden durchgeführt. Von den erschienenen Kolonien werden die Stämme, die zum Wachstum in dem gleichen Medium, wie es in Anmerkung 4 beschrieben ist, außer das 2% Agar hinzugefügt sind, fähig sind, jedoch zum Wachstum nicht fähig sind in dem gleichen Medium, wie es in Anmerkung 5 beschrieben wurde, mit der Ausnahme jedoch, daß 2% Agar hinzugefügt sind, nach dem Replic-Verfahren isoliert. Hiernach werden die Stämme in dem gleichen Medium, das in Anmerkung 3 beschrieben wurde, mit der Ausnahme jedoch, daß lOOy/ml Xanthin hinzugefügt wurden, inokuliert und unter Schüttelung während 48 Stunden bei 30°C kultiviert. Hiernach wird die Anhäufung bzw. Zunahme von CAMP geprüft und einer der zur Erzeugung von CAMP fähigen, isolierten Stämme als Microbacterium Nr. 205-CM-XA 3 bezeichnet.

Anmerkung 4:

Ein aus 20 mg/1 Xanthin, 5% Glucose, 0,2% (NH₄J₂SO₄, 0,5% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 0,2% vitaminfreie Kasaminosäure, 30 γΙ\ Biotin, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O zusammengesetztes Medium von pH 7,0 (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung) und sterilisiert bei einem Druck von 1,05 kg/cm^; während 12 Minuten.

Anmerkung 5:

Ein aus 0,5% Glucose, 0,2% (NH_S),SO₄, 0,5% KH₃PO₄, 0,5% K2HPO₄, 0,2% vitaminfreier Kasaminosäire, 3Cy'] Biotin, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O zusammengesetztes Medium von pH 7,0 (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung); sterilisiert bei einem Druck von 1,05 kg/cm² während 12 Minuten.
Bei Kultivierung unter Schüttelung des somit

ίο erhaltenen Microbacterium Nr. 205-CM-XA 3 und seines Mutterstammes Microbacterium Nr. 205-CM 7 während 48 Stunden bei 30⁰C in einem Medium (Anmerkung 6) worin die zugefügte Xanthinmenge, wie in Tabelle 2 gezeigt, eingestellt worden war, erhöhte

;5 sich die CAMP-Produktivität des Microbacteriums Nr. 205-CM-XA 3 in großem Ausmaß im Vergleich zu der des Mutterstammes.

Anmerkung 6:

Gleiches Medium wie in Anmerkung 3 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, daß Xanthin derart hinzugefügt ist. daß dessen Konzentration

beträgt.

Tabelle 2

Stamm bzw. Rasse Produktiv]- Farbe der Nährmitteltä! an CAMP Kolonie bedarf

Microbacterium 0,6 mg/ml gelb*) Biotin
Nr. 205-CM 7

MicroDacterium 1,8 mg/ml weiß Biotin und

Nr. Xanthin

205-CM-XA 3

*) Die Farbe der Kolonie ist gelb, vcränder; '■ich jedoch 4Q durch natürliche Mutation zu weiü. Deren CAMP-Produktiviiä't verändert sich jedoch nicht.

Darüber hinaus kann ein Mutant, der gegenüber

π5 einem chemischen Reagens resistent und zur Produktion von CAMP ohne Zugabe der genannten Vorläufer fähig ist, ebenfalls als Mikroorganismus in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise würde ein Mn⁺+-Ion permeabler Mutant Microbacterium Nr. M-3 (ATCC 21981) dadurch gewonnen, daß man Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106) einer im folgenden angegebenen Diäthylsulfatbehandlung unterwarf. Zu 10 ml einer Zellsuspension (Zahl der Zellen: 2 bis 5xlO⁹/ml) von Microbacterium Nr. 205 werden bei der logarythmischen Wachstumsrate 0,1 ml Diäthylsulfat hinzugefügt und die Zellen mit der Chemikalie unter Schüttelung während 16 Stunden bei 30° C in Berührung gebracht. Die behandelten Zellen werden in 300 ml des gleichen

bo Mediums, das in Anmerkung 2 beschrieben wurde, jedoch mit der Ausnahme, daß kein Agar hinzugefügt und MnCI₂ · 4 H₂O in einer Menge von 500 mg/1 hinzugegeben war, inokuliert und !inter Schüttelung wahrend 16 Stunden bei 30' C kiiltivien. Nach dem

b5 Waschen der gewonnenen Zellen mit einer Phosphatpufferlösung (pH 7.0) werden die gewaschenen Zellen auf das gleiche Medium, das in Anmerkung 1 beschrieben wurde, jedoch mit der Ausnahme, daß

MnCl₂ ■ 4 H2O in einer Menge von 500 mg/1 zugefügt war, geschmiert und während 72 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Die erschienenen Kolonien wurden sodann willkürlich aufgenommen, in dem gleichen Medium, das in Anmerkung 1 beschrieben wurde, jedoch mit der Ausnahme, dnß MnCIi · 4 H₂O in einer Merge von "Ό0 m^/l zugefügt wai und das gleiche Medium, das in Anmerkung 1 beschrieben war, jedoch mit der Ausnahme, daß MnCb · 4 H2O in einer Menge von 1 mg/1 zugefügt war, jeweils inokuliert und während 48 Stunden bei 30^cC kultiviert. Sodann wurden die zum Wachstum in dem erstgenannten Medium fähigen Stamme, die zum Wachstum in dem leizteren Medium jedoch nicht fähig waren, isoliert. Sodann wurden die hierdurch gewonnenen Stämme unter Schüttelung während 48 Stunden bei 30'C in einem Medium (Anmerkung 7) kultiviert und die Zunahme an CAMP papierchromatografisch geprüft. Der eine der somit

gewonnenen Stämme, der -rvr Erzeugung von CAMP fähig ist. wird als Miorobacterium Nr. MT-3 bezeichnet.

Anmerkung 7:

Ein aus 5% Glucose, 0,5% Harnstoff, 0,5% (NH₄J₂SO₄, 1% KH2PO4, 1% K₂HPO₄, 0,3% Fleischextrakt, 0,3% Maissiärkcsait,O,<% lnosin, 1% MgSO. · 7 H₂O, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O, 0,01% FeSO₄ ■ 7 H₂O, 0,0001% MnSO₄ · 5 I I.O bestehendes Medium mit einem pH von 8,0 (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung); sterilisLil LiCi einem Druck von 1,05 kg/cm² während 12 Minc'L-n.

Diese Stämme werden in dem gleichen Medium, das in Anmerkung 3 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß 0,01% FeSO₄ ■ 7 H₂O und 0,00005% MnSO₄ · 5 H2O hinzugefügt sind, während 48 Stunden bei 30°C kuiii viert, wobei die in Tabelle 3 zusammengefaßten Ergebnisse erhalten werden.

Tabelle 3

Stamm

Produktivität an CAMP

Farbe der Kolonien Nährbedarf

Resistenz gegenüber
6-Mercaptopurin

Microbacterium Nr. 205

keine

gelb

Microbacterium Nr. MT-3 0,8 mg/ml weiß

Biotin wächst nicht in einem Medium

das 20OjVmI 6-Mercaptopurin
enthält

Biotin wächst nicht in einem Medium

das 200y/ml 6-Mercaptopurin
enthält

Zu einer Zellsuspension (Zahl der Zellen ca. 10⁹/ml, ein Phosphatpuffer von pH 6,5) von Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106) wird in der logarythmischen Wachstumsphase Nitrosoguanidin derart zugegeben, daß seine Endkonzentration 0,1 mg/ml beträgt, und die Gemische werden während 30 Minuten bei 0°C zur guten Berührung gehalten. Die Zellen werden sodann durch Zentrifugieren gewonnen und die gewonnenen Zellen auf das gleiche Medium, das in Anmerkung 1 beschrieben wurde, jedoch mit der Ausnahme, daß 100 v/ml 6-Mercaptopurin hinzugefügt waren, zur Inkubierung bei 30⁰C während 48 Stunden geschmiert Die erschienenen Kolonien werden auf das gleiche Schrägkulturmedium, das in Anmerkung 2 beschrieben ist jedoch mit der Ausnahme, daß lOOy/ml 6-Mercaptopurin hinzugegeben sind, zur Inkubierung bei 3O⁰C während 40 Stunden gebracht. Eine Schleifenmenge des Wachstums wird jeweils in 3 ml des gleichen flüssigen Mediums, das in Anmerkung 3 beschrieben ist, in einem Testrohr (0 2 cm, Länge 15 cm) inokuliert und bei 30° C während 24 Stunden unter Schüttelung mit einer Geschwindigkeit von 289 UpM kultiviert. Die Zunahme an CAMP in der Kulturlösung wird papierchromatografisch geprüft und eine große Zahl von Stämmen, die eine hohe CAMP-Produktivität aufweisen, gewonnen. Unter diesen Stämmen wird cn Stamm als Microbacterium Nr. 205-MP-197 (ATCC 21976) bezeichnet. In Tabelle 4 sind die Produktivität an CAMP, die Widerstandsfähigkeit gegenüber 6-Mercaptopurin und die Farbe der Kolonie von Mutterstamm und dem hierdurch erhaltenen Mutanten verglichen.

Tabelle 4	Widerstands	CAMP-Pro	Farbe der
Stamm	fähigkeit ge	duktivität*)	Kolonie
	genüber 6-Mer
	captopurin
	(lOOy/ml)
	wächst nicht	keine	gelb
Microbacte
rium Nr. 205	wächst	3 5 mp/ml	u/piß
Microbacte
rium Nr.
205-MP-197

*) Die Schüttelkultur wurde unter Verwendung eines Mediums (Anmerkung 3) bei 30° C während 24 Stunden mit 289 Upm durchgeführt.

Der Vitamin- und Aminosäurebedarf des Mutanten ist der gleiche wie der des Mutterstammes.

Ein Teil der Eigenschaften dieser Mutanten ist genauso wie vorstehend angegeben wurde, wobei der Rest der Eigenschaften von denjenigen der Mutterstämme Corynebacterium murisepticum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P Nr. 206), Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) und Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106) nicht unterschiedlich ist Die Eigenschaften dieser Mutterstämme sind beispielsweise in der US-PS 36 30 842 ausführlich beschrieben.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann CAMP durch Inokulierung des Stammes, der fähig ist, in dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem Medium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die für den

Stamm assimulierbar sind, anorganische Phosphate, anorganische Salze, die keine Phosphate darstellen, sofern erforderlich, und andere Komponenten in geeigneter Menge enthält, angewandt zu werden, und Kultivierung bis die Anhäufung an CAMPdas Maximum ^r> erreicht, erzeugt werden. Et, ist bevorzugt, die Kultivierung bei einem pH von 5 bis 9 während 24 bis 80 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 40"C durchzuführen.

Beispielsweise kann die in dem Medium verwendete Kohlenstoffquelle ein Saccharosematerial, wie beispielsweise Glucose, Stärkehydrolysate, Melassen, Schlempe, Glycerin und dergleichen; einen Alkohol, wie beispielsweise lnosii, Mannit, Sorbit. Ribit und dergleichen; eine anorganische Säure, wie beispielsweise ι. Fumarsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure und dergleichen; Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise n-Paraffin, Kerosin und dergleichen darstellen, und die Stickstoffquelle kann Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff, verschiedene Aminosäuren, Hydrolysate von Aminosäure-hochpolymeren, Fleischextrakt, Maisstärkeflüssigkeit, Reiskleie, organische- Extrakte, wie Fischlösung und Hefeextrakt und dergleichen darstellen. Das anorganische Phosphat kann Kaliumoder Natriumdihydrogenphosphat, Dikalium- oder 2^r> Dinatriumhydrogenphosphat, Ammoniumphosphat und dergleichen sein. Die anorganischen Salze, die keine Phosphate sind, können dem Medium hinzugegeben werden, wobei Beispiele für diese Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(II)- oder Eisen(III)-sulfat, Eisen(II)- oder Eisen(III)-chlorid, Zinksulfat, Kobaltsulfat, BorsäHre, ein Salz hiervon, wie Kaliumborat oder Natriumborat, Fluoride, wie Kaliumfluorid oder Natriumfluorid, Mangansulfat, Manganchlorid und dergleichen sind. Darüber hinaus ist die Zugabe von r> Mikroelementen günstig, wobei hierfür Vitamine, wie beispielsweise Biotin, Vitamin Bi, Vitamin B2, Pantothensäure und verwandte Verbindungen typische Beispiele sind. Allgemein gesprochen kann, da Pantothensäure eines der wasserlöslichen Vitamine der Vitamin B-Gruppe darstellt und seine physiologische Wirkung mit derjenigen von Coenzym A (CoA) verträglich ist, welches aus Pantothensäure biosynthetisiert wird, ein Zwischenprodukt des Biosyntheseweges von Coenzym A angewandt werden, wobei für diese Pantothensäure, /?-Alanin, Pantothein, Pantothin, Asparaginsäure, Valin, Dimethylpyruvat, at-Ketopantothensäure, Pantothenylcystein, D-(+)-4-Phosphopantothein, Dephosphocoenzym A, Coenzym A und dergleichen illustrativ sind. Die Derivate dieser Verbindungen (z. B. Carnosin oder Anserin, die ^-Alanin enthalten) und natürliche Substanzen, die diese Verbindungen enthalten (z. B. Hefeextrakt, Maisstärkeflüssigkeit, Fischlösung, Fleischextrakt, Reiskleie, Melassen, gepulverte Leber, Pepton, NZ-Amin, Schlempe und dergleichen) können ebenfalls Verwendung Finden.

Mit Thiamin verwandte bzw. hiervon abgeleitete Verbindungen, wie 4-Amino-5-aminomethyI-2-methylpyrimidin, 4-Methyl-5-/?-hydroxyäthylthiazoI und dergleichen können ebenfalls als Ersatz für Vitamin Bi verwendet werden. Die natürlichen Substanzen, die diese Verbindungen enthalten, können ebenfalls angewandt werden.

Die Ansammlung von CAMP kann dadurch erhöht werden, daß man im voraus oder im Verlauf der Kultur dem Medium einen Inhibitor von cyclischer 3',5'-Nucleotidphosphodiesterase, wie beispielsweise Methyixanthine wie Koffein, Theophyllin, Theobromin oder dergleichen, 2,3-, 2,4- oder 2,5-Pyridindicarbonsäure, Dipicolinsäure, 8-Hydroxychinolin, Polyphosphorsäure, Pyrophosphorsäure und dergleichen in einer Menge von 0,001 bis 500 mg/Ί hinzufügt.

Die CAMP-Produktion kann weiter durch Zugabe der vorstehend genannten Vorläufer zu dem Medium in einigen Fällen gemäß der Erfindung erhöht werden.

Die Kultivierung kann durch jegliches geeignetes Verfahren, z. B. unter Schüttelung, unter Rührung, unter Belüftung oder dergleichen, durchgeführt werden.

Wenn die Ansammlung an CAMP ihr Maximum erreicht, wird die Kultivierung gestoppt und sodann CAMP isoliert und gereinigt. Bei dessen Isolierung und Reinigung können Behandlungsweisen mit Aktivkohle, Behandlung mit kationischen oder anionischen Austauschharzen, Zugabe von Lösungsmittel, worin CAMP unlöslich ist, in geeigneter Weise in Kombination angewandt werden. Beispielsweise wird nach Entfernung der Pilzkörper aus der Kulturbrühe das hierin enthaltene CAMP auf Aktivkohle adsorbiert und das adsorbierte CAMP mit wäßriger ammoniakalischer Alkohollösung, ammoniakalischer wäßriger Acetonlösung oder dergleichen eluiert. Nach Entfernung des überschüssigen Ammoniaks, wobei das Eluat unter verringertem Druck oder dergleichen konzentriert wird, wird das CAMP an einem anionischen Austauscherharz (z. B. einem stark basischen Anionenaustauscherharz, das aus Polystyrolharzen mit n-(Alkyl)j-Gruppen gebildet ist; Chloridform, Formiatform oder dergleichen) adsorbiert und sodann das adsorbierte CAMP mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder dem Kalziumchlorid + verdünnte Salzsäuresystem für das beispielhaft angeführte Harz [Chloridform] oder mit verdünnter Ameisensäure oder mit dem verdünnten Ameisensäure- + Natriumformat-System [Formiatform]) eluiert. Das CAMP in dem Eluat wird erneut an Aktivkohle adsorbiert und das adsorbierte CAMP mit ammonikalischer wäßriger Alkohollösung, ammoniakalischer wäßriger Acetonlösung oder dergleichen, eluiert. Hiernach wird der wäßrige Ammoniak dadurch entfernt, daß man das Eluat einer Konzentration unter verringertem Druck unterwirft und das CAMP an einem kationischen Austauscherharz (z. B. einem stark sauren Kationenaustauscherharz das aus Polystyrolharz mit SOj-Gruppen gebildet ist [H'-Form]) adsorbiert. Das adsorbierte CAMP wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das CAMP kann in Form von Kristallen dadurch abgeschieden werden, daß man das derart erhaltene Eluat unter verringertem Druck konzentriert und das resultierende Material in einer kalten Kammer stehen läßt oder ein Lösungsmittel, worin CAMP unlöslich ist, wie Alkohol, Aceton oder dergleichen, dem Eluat hinzufügt.

Bei einem anderen Verfahren wird CAMP in der pilzkörperfreien Kulturbrühe an Aktivkohle adsorbiert und das adsorbierte CAMP mit ammoniakalischer wäßriger Alkohollösung, ammoniakalischer wäßriger Acetonlösung oder dergleichen, eluiert. Hiernach wird der überschüssige Ammoniak dadurch entfernt, daß man das Eluat unter verringertem Dn.ick oder dergleichen konzentriert und ein organisches Lösungsmittel dem resultierenden Material unter salzsauren Bedingungen unter Erhalt roher CAMP-Kristalle hinzufügt. Die rohen Kristalle können mit dem vorstehend genannten an ionischen Austauscherharz oder kationischen Austauscherharz gereinigt werden. Das gereinigte kristalline CAMP kann auch dadurch

erhalten werden, daß man die rohen Kristalle in Wasser auflöst, die resultierende Lösung unter Verwendung eines Entfärbungsharzes (z. B. einem porösen harzartigen Adsorbens mit großer aktiver Oberfläche, die aus Polystyrolharz gebildet ist) unter sauren Bedingungen mit Chlorwassersloffsäure oder Schwefelsäure entfärbt und ein Lösungsmittel, worin CAMP unlöslich ist, wie Alkohol, Aceton oder dergleichen, zu der entfärbten Lösung hinzugefügt. Die CAMP-Kristalle können dadurch erhalten werden, daß man CAMP in der von Pilzkörpern befreiten Kulturbrühe direkt an einem anionischen oder kationischen Austauscherharz adsorbiert, das Eluat einer Aktivkohlebehandlung und Reinigung mit einem Entfärbungsharz unterwirft und ein Lösungsmittel, worin CAMP unlöslich ist, dem resultierenden Material hinzufügt.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugte Produkt stimmt mit autenthischem CAMP in Elementaranalyse, Ribose- und Phosphorgehalt, Ultraviolettabsorptions- und Infrarotabsorptionsspektren überein.

Die folgenden Beispiele, die keine Einschränkung darstellen, veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

Microbacterium Nr. 205-CM7 (ATCC 21979) wurde in einem Schrägkulturmedium vorkultiviert, das aus 0,5% (NH₄J₂SO,, n<y% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 1% Kasaminosäure, 0,3% Hefeextrakt, 1% Glucose, 2% Agar bestand und einen pH von 7,0 (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung) aufwies.

Getrennt wurden jeweils 30 ml eines Mediums, das aus 5% Glucose, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂0,0,5% Harnstoff, 0,5% (NH₄)₂SO₄, 1% KH₂PO₄. 1% K₂HPO₄, 0,5% Arginin, 30 γ/\ Biotin, 1% MgSO₄ · 7 H₂O zusammengesetzt war und einen pH von 7,5 aufwies (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung) in einen 500 ml Kolben für die Schüttelkultur gegossen und einer Sterilisierung bei 115°C während 10 Minuten unter Verwendung eines Autoklavs unterworfen. Die erhaltene Samenkultur wurde in das Medium inokuliert und unter Schütteln bei 30⁰C während 48 Stunden kultiviert. Als Ergebnis wurden 1,0 mg/ml CAMP in dem Medium gebildet.

Die Kulturbrühe wurde zur Entfernung der Pilzkörper zentrifugiert, und die überstehende Phase der Brühe, die mit 3 η-wäßriger HCI-Lösung auf pH 4 eingestellt wurde, wurde an Aktivkohle adsorbiert. Das adsorbierte CAMP wurde mit Äthylalkohol, welcher 0,7% Ammoniak enthielt, eluiert und das Eluat unter verringertem Druck zur Entfernung des überschüssigen Ammoniaks konzentriert und sodann mit Ammoniak auf pH 8,0 eingestellt Das resultierende Eluat wurde durch eine Säule, welche mit stark basischem Anionenaustauscherharz das aus Polystyrolharz mit n-(Alkyl)rGruppen gebildet ist, in Formiatform einer Größe von 0,149 bis 0,074 mm gefüllt war, zur Adsorption von CAMP geführt Hiernach wurde die Säule mit 0,02 n-Ameisensäurelösung gewaschen und das adsorbierte CAMP mit 0,15 n-Ameisensäurelösung eluiert Das Eluat wurde erneut an Aktivkohle adsorbiert, und das adsorbierte CAMP wurde mit 0,7% Ammoniak enthaltendem Äthylalkohol eluiert Das Eluat wurde unter verringertem Druck konzentriert und mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 eingestellt Das resultierende Eluat wurde durch eine Säule, die mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz, das aus Polystyrolharz mit SO3-Gruppen gebildet ist, in Wasserstofform einer Größe von 0,149 bis 0,074 mm gefüllt war, zur Adsorption von CAMP geführt und das adsorbierte CAMP mit wäßriger 0,05 n-HCI-Lösung eluiert. Das Eluat wurde erneut unter verringertem Druck konzentriert und in einer kalten Kammer (2° bis 3°C) unter Erhalt von 600 mg CAMP-Kristallen aus 1000 ml der > Kulturbrühe stehengelassen.

Der Mqtterstamm des vorliegenden Mutanten,

Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr.

106) wurde in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben, kultiviert, wobei sich jedoch kaum CAMP

ig in der Kulturbrühe bildete.

Beispiel 2

Corvnebacterium murisepticum Nr. 7-10 (ATCC 21977), wurde in einem Schrägkulturmedium vorkulti-

Ii viert, da- aus 1% Rindfleischextrakt, 1% Poiypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid, 2% Agar zusammengesetzt und auf einen pH von 7,0 mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung eingestellt war.

Es wurden getrennt jeweils 60 ml eines Mediums,

3d welches aus 5% Glucose, 0,5% Harnstoff, 0,5% Ammoniumsulfat, 1% KH₂PO₄, 1% K₂HPO₄, 1% Poiypepton, 0,5% Hefeexlrakt, 1% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O zusammengesetzt und dessen pH auf einen Wert von 7,5 mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung

2> eingestellt war, in einen 500-ml-Kolben für die Schüttelkultur gegossen uid einer Sterilisierung bei 115⁰C während 10 Minuten unter Verwendung eines Autoklavs unterworfen. Die erhaltene Samenkuitur wurde in dem Medium inokuliert und bei 30⁰C während

jo 72 Stunden mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 140 UpM kultiviert. Als Ergebnis bildeten sich 1,2 mg/ml CAMP in dem Medium.

Nachdem die Kultur zur Entfernung der Pilzkörper zentrifugiert worden war, wurde die überstehende

j-, Phase in gleicher Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, unter Erhalt von 610 mg CAMP-Kristallen aus 1000 ml der Kulturbrühe behandelt. Der Mutterstamm des vorliegenden Mutaten, Corynebacterium murisepticum Nr. 7 (ATCC 21374, FERM-P Nr. 206) wurde in der vorstehend beschriebenen Weise kultiviert, wobei jedoch kaum CAMP in der Kulturbrühe gebildet wurde.

Beispiel 3

Arthrobacter 11-211 (ATCC 21978) wurde in dem > gleichen Medium, das in Beispiel 2 verwendet wurde, bei 30⁰C während 24 Stunden vorkultiviert und die erhaltene Samenkultur in jeweils 100 ml eines Mediums in einem 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur inokuliert; das Medium, das aus 5% Glucose. 0,5% Ammoniumsulfat, 1% K₂HPO₄, 0,5% Harnstoff, 0,5% KH₂PO₄, 1% Poiypepton, 1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5% Hefeextrakt, 0,01% ZnSO₄ ■ 7 H₂O, 0,0005% FeSO₄ · 7 H₂O zusammengesetzt und auf pH 7,0 (eingestellt mit wäßriger KOH-Lösung) eingestellt war, wurde in einen 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur in einer Menge von 100 ml pro Kolben jeweils eingegossen und bei 115° C während 10 Minuten unter Verwendung eines Autoklavs sterilisiert. Das inokulierte Medium wurde zur Kultivierung bei 30° C während 48 Stunden unter Schütteln

bo gehalten. Als Ergebnis bildeten sich 13 mg/ml CAMP hierin.

Die Kulturbrühe wurde zur Entfernung der Pilzkörper zentrifugiert und die resultierende überstehende Phase in gleicher Weise wie in Beispiel 1, behandelt, wobei 490 mg CAMP-Kristalle aus 1000 ml Kulturbrühe erhalten wurden. Der Mutterstamm des vorliegenden Mutanten, Arthrobacter 11 (ATCC 21375, FERM-P Nr. 207) wurde in der vorstehend beschriebenen Weise

23 5i 738

kultiviert, wobei je'doch kaum CAMP in der Kuhurbrühe gebildet wurde.

Beispiel 4

Es wurde nach dem Kultivierungsverfahren des Beispiels 2 vorgegangen, wobei jedoch Microbacterium Nr. 2O5-CM7 (ATCC 21979) ansteile von Corynebacterium muriscplicum Nr. 7-10 (ATCC 21977) unter Erhalt von 2,8 mg/n"! CAMP verwendei wurde.

Die Kulturbrühe wurde zur Entfernung der Pibkörper zentrifugiert und die übersiehende Phase in der in Beispiel I beschriebenen Weise unter Erhall von !,3 g CAMP-Kristallcn aus 1000 ml Kulturbrühe behandelt. Der Mutterstamm, Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106) wurde in der vorstehend beschriebenen Weise kultiviert wobei jeoch in dem Kulturmedium kaum CAMP gebildet wurde.

Beispiel 5

Microbacteriiün Nr 205-CM-XA3 (ATCC 21980) wurde in einem Schrägkulturmedium vorkultiviert, das aus 0,5% (NH₄J₂SO₄, 0,5% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, i-to Kasaminosäur·.. 1% Glucose, 0,01% Xanthin, 2% Agar bestand und euien pH von 7,0 aufwies. Die erhaltene Samenkultur wurde in jeweils 30 ml eines Mediums in einem 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur inokuliert; dieses Medium, welches aus 5% Glucose 0,5% (NHi)₂SO₄, 0,5% Harnstoff, 1% KH₂PO₄, 1% K₂HPO₄, 1,5% Polypepton, 1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5% Hefeextrakt, lOOy/ml Xanthin, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O zusammengesetzt war und einen pH von 7,5 (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung) aufwies, wurde in einen 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur in einer Menge von 30 ml pro Kolben jeweils gegossen, bei 115° C während 10 Minuten unter Verwendung eines Autoklavs sterilisiert, und hierzu wurden 2% getrennt sterilisiertes Kalziumcarbonat hinzugegeben. Das inokulierte Medium wurde zur Kultivierung während 70 Stunden bei 30⁰C unter Schüttelung unter Erhalt von 6,7 mg/ml CAMP gehalten.

Die Kulturbrühe wurde zur Entfernung der Pilzkörper zentrifugiert und die überstehende Phase in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt. Als Ergebnis wurden 3,1 g CAMP-Kristalle aus 1000 ml Kulturbrühe erhalten. Der Mutterstamm des vorliegenden Mutanten, Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106) wurde in der gleichen Weise wie es vorstehend beschrieben ist, kultiviert, wobei jedoch kaum CAMP in der Kulturbrühe gebildet wurde.

Beispiel 6

Microbacterium Nr. MT-3 (ATCC 21981) wurde in einem Schrägkulturmedium, das aus 1 % Fleischextrakt, 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid, 0,0005% MnCl₂ ■ 4 H₂O und 2% Agar bestand, bei 30⁰C während 48 Stunden vorkultiviert. Die erhaltene Samenkultur wurde in 40 ml jeweils eines Mediums in einem 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur inokuliert; das Medium, das aus 10% Glucose, 0,5% (NH₄J₂SO₄, 0,5% Harnstoff, 0,5% KH₂PO₄, 0,5% K₂HPO₄, 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Reiskleie, 1% MgSO₄ -7 H₂O, 0,0001% MnCl₂ ■ 4 H₂O, 0,025% FeCI₂ ■ 7 H₂O, 0,025% FeCl₃ · 7 H₂O, 0,01% ZnSO₄ · 7 H₂O, Leitungswasser zusammengesetzt war und einen pH von 7,5 (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung) aufwies, wurde in einen 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur in einer Menge von 40 ml pro Kolben jeweils eingegossen und bei 115°C während 10 Minuten unter Verwendung eines Autoklavs (die Kori7entrationen an Mn*+, Fe⁺+ und Fe ^{++ +} in dem autoklavbuliandelten Medium betrugen 1,5 mg/1 als MnCl₂ · 4 H₂0,200 mg/1 als FeCI₂ 7 H₂O und 330 mg/1

■"' als FeCIi ■ 7 H₂O jeweils) sterilisiert. Das inokulierte Medium würde während 48 Stunden bei 30¹C zur Kultivierung unier Schüttelung gehalten, wobei 2,1 mg/ml CAMP erhalten wurden.

Die Kuhurbrühe wurde zur Entfernung der Püzkör-

H> per zentrifugiert, wobei nach Behandlung des überstehenden, in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise 725 mg CAMP-Kristalle aus 1000 ml Kuiturbrühe erhalten wurden. Der Mutterstamm de* vorliegenden Mutanten, Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr.

106) wurde in der vorstehenden Weise kultiviert, wobei jedoch in der Kultürbrühe kaum CAMP gebildet wurde.

Beispiel 7

Microbacterium Nr. 205-CM7 (ATCC 21979) wurde in

2« einem Schrägkulturmedmm, das aus 0,5% (NH₄J₂SO₄, 0,5% KH_:PO₄, 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O. 1% Kasaminosäure, 0.3% Hefeextrakt, 1% Glucose, 2% Agar zusammengesetzt war, und einen pH von 7,0 aufwies (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung) vorkuUiviert. Die erhaltene Samenkultur wurde in 30 m! jeweils eines Mediums in einen 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur inokuliert. Das Medium, das aus 5% Glucose, 0,01 % ZnSO₄ - 7 H₂O, 0,5% Harnstoff, 0,5% (NH₄J₂SO₄, 1% KH₂PO₄, 1% K₂HPO₄. 0,2% Glycin, 1 mg/1 Biotin, 100 mg/1 Kalziumpantothat, 10 mg/l Thiaminhydrochlorid, 1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,4% eines der in Tabelle 5 angegebenen Vorläufern zusammengesetzt war und einen pH von 7,5 (eingestellt mit wäßriger 3 n-KOH-Lösung) aufwies, wurde in einen 500-ml-Kolben zur Schüttelkultur in einer Menge von 30 ml pro Kolben jeweils gegossen und bei 115°C während 10 Minuten unter Verwendung eines Autoklavs sterilisiert. Die Kultivierung wurde bei 3O⁰C während 48 Stunden unter Schüttelung zur Anreicherung von CAMP durchgeführt.

ίο Die Kulturbrühe wurde zur Entfernung der Pilzkörper zentrifugiert und die überstehende Phase in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise unter Erhalt von CAMP-Kristallen behandelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Zur Kontrolle wurde die Kultivierung in der gleichen Weise wie es vorstehend beschrieben ist. jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß keine Vorläufer dem Kulturmedium zugesetzt wurden.

__ Tabelle 5

Vorläufer	Aneereichertes	CAMP-
	CA^-MP	Kristallc
	(mg/ml)	(g/l)
Adenin	2.5	0,74
Adenosin	4,5	1,34
5'-Adenylsäure	4,8	1,42
3'-Adenylsäure	2,0	0,67
Hypoxanthin	5.0	1,60
Inosin	5.3	1,63
5'-Inosinsäure	5.2	1,60
3'-Inosinsäure	2.1	0,68
5-Amino-4-imidazol-	4,5	1.24
carboxamid
5-Amino-4-imidazol-	4,8	135
carboxamidribosid
Standard (Kontrolle:	1.5	0,60
kein Vorläufer)

Der Mutterstamm des vorliegenden Mutanten, Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, FERM-P Nr. 106) wurde in der gleicher Weise wie es vorstehend beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme kultiviert, daß kein Vorläufer dem Kulturmedium hinzugefügt würde, wobei jedoch kaum CAMP in der Kulturbrühe gebildet wurde.

Beispiel 8

Microbacterium Nr. 205-MP-197 (ATCC 21976) wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise

kultiviert, und es wurden 3,3 mg/ml CAMI Kulturbrühe wurde zur Entfernung d< zentrifugiert. Das überstehende wurde in ι 1 beschriebenen Weise unter Erhalt CAMp-Kristallen aus 1000 ml der Kultui delt. Der Mutterstamm des vorliegend Microbacterium Nr. 205 (ATCC 21376, 106) wurde in der vorstehend beschrie kultiviert, wobei jedoch kaum CAMP in c hegebildet wurde.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 3','. Adenylsäure durch Kultivierung eines" Mikroorganismus und Gewinnung der S'.S'-cyclischen Adenylsäure aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen Corynebacterium murisepticum Nr. 7-10 (ATCC 21977), Arthrobacter 11-211 (ATCC 21978), Microbacterium Nr. 205-CM 7 (ATCC 21979), Microbacterium Nr. 205-CM-XA 3 (ATCC 21980), Microbacterium Nr. MT-3 (ATCC 21981) oder Microbacterium Nr. 205-MP-197 (ATCC 21976) in einem Medium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Nährsubstanzen, jedoch als Vorläufer kein Adenin, Hypoxanthin, Succinyladenin 5-Amino-4-inidazol-carboxamid, 7-Amino-pyrazolo-(4,3d)-pyrimidin, Pyrazolo-(4,3d)-pyrimidin, 4-Aminopyrrolo-(2,3d)-pyrimidin, Pyrrolo-(2,3d)-pyrimidi'n, ein Ribosid, das eine dieser Verbindungen als Base enthält, oder ein Mononucleotid hiervon aufweist, bei pH 5 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C kultiviert, bis 3',5'-cyclische Adenylsäure in dem Medium akkumuliert ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine Vorläufersubstanz enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in Gegenwart einer kleinen Menge von zumindest einem Stoff durchgeführt wird, der unter Biotin, Vitamin B,, Vitamin B2, Pantothensäure und deren abgeleiteten bzw. verwandten Verbindungen ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in Gegenwart eines Stoffes, der unter Koffein, Theophyllin, Theobromin, 2,3-, 2,4- und 2,5-Pyridindicarbonsäure, Dipicolinsäure, 8-Hydroxychinolin, Polyphosphorsäüre und Pyrophosphorsäure ausgewählt ist und in einer Konzentration von 0,001 bis 500 mg/1 dem Medium vor oder während der Kultivierung zugesetzt ist, durchgeführt wird.