DE2428548C2

DE2428548C2 - Fermentative Herstellung von Guanosin

Info

Publication number: DE2428548C2
Application number: DE19742428548
Authority: DE
Inventors: Yasuo Anzai; Hajime Yokohama Kanagawa Eguchi; Hitoshi Zushi Kanagawa Enei; Yoshio Fujisawa Kanagawa Hirose; Katsuaki Kawasaki Kanagawa Sato
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-06-14
Filing date: 1974-06-14
Publication date: 1982-11-18
Also published as: GB1424300A; DE2428548A1; FR2233398A1; IT1015044B; FR2233398B1

Description

10

15

20

25 NH₂-

-SO₂NH—

Erfindüngsgegenstand ist das im Patentanspruch angegebene Verfahren.

Guanosin findet in weitem Maß Anwendung zur Herstellung des Natriumsalzes von Guanosin-5'-monophosphat, das sich als Würze eignet.

Es ist bekannt, daß eine Mutante von Bacillus subtilis, die resistent gegen 8-Azaguanin ist und Adenin zu ihrem Wachstum benötigt, Guanosin in dem Kulturmedium, in welchem sie wächst, bildet (J. Gen. Appl. Microbiol„ 15, 399-411 [1969]).

Es wurde nun gefunden, daß wesentlich höhere Mengen an Guanosin im Vergleich mit der bekannten Methode gebildet werden, wenn in einem Kulturmedium eine Mutante von Bacillus gezüchtet wird, die resistent gegen mindestens eine der folgenden Verbindungen ist: Sulfa-Arzneimittel, Methionin, Methionin-Analoge und Azaserin, und die für ihr Wachstum Adenin benötigt; als Mutante, die diese Bedingungen erfüllt, kommt erfindungsgemäß Bacillus subtilis FERM-P 2313, FERM-P 2314 oder FERM-P 2107 bis FERM-P 2115 oder Bacillus pumilus FERM-P 2116 in Betracht.

Die Mutanten wurden von den Elternstämmen mit Hilfe mutagener Dosen ionisierender Strahlung (Ultraviolett-Licht, Röntgenstrahlung, Gamma-Strahlung) oder mit Hilfe chemischer Mittel (Natriumnitrat, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Diäthylsulfat) und durch Screening der behandelten Elternstämme im Hinblick auf Mutanten, welche die gewünschten Eigenschaften haben, abgeleitet. Adenin erfordernde Mutanten werden mit Hilfe der Replika-Methode isoliert und gegenüber Sulfa-Arzneimitteln, Methionin, Methionin-Analogen, oder Azaserin resistente Mutanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, kräftig auf sonst üblichen Medien zu wachsen, die eine ausreichende Menge der Verbindungen, gegen die sie resistent sein sollen, enthalten, um das Wachstum der Elternstämme zu unterdrücken.

Die Resistenz wird bestimmt, indem das relative Wachstum der Mutante in Gegenwart der Verbindungen mit dem des Elternslammes verglichen wird. Das relative Wachstum ist dabei das Verhältnis des und haben anti-mikrobielle Wirkung, welche mindestens zum Teil durch p-Aminobenzoesäure unterdrückt wird.

Zur Zeit bekannte Sulfa-Arzneimittel mit den vorstehend genannten Eigenschaften sind Sulfapyridin, Sulfathiazol, Sulfadiazin, Sulfaguanidin, Sulfamethazin, Sulfamerazin, Sulfadimethoxin, Sulfamethomidin, Sulfamethoxypyridazin, Sulfisomidin, Sulfisoxazol, Acetosulfamin, Sulfamethizol, Sulfaäthidol, Sulfapyrazin, Irgafen, Irgamid, Sulfanilamid, Suifisomezol und Sulfaphenazol.

Methionin-Analoge sind dem Methionin chemisch analog und sie hemmen das Wachstum zahlreicher Mikroorganismen. Diese Hemmung kann mindestens zum Teil durch Methionin beseitigt werden. Allgemein bekannte Methionin-Analoge sind Methylmethioninsulfoniumchlorid, Methioninsulfoxid und Äthionin.

Es wurde gefunden, daß Mutanten, die Resistenz gegen ein Sulfa-Arzneimittel haben, gewöhnlich auch gegenüber anderen Sulfa-Arzneimitteln resistent sind und daß ein ähnlicher Zusammenhang auch bei Mutanten besteht, die resistent gegen Methionin-Analoge sind.

Eine Mutante, die zusätzlich resistent gegen 8-Azaguanin ist, bildet gewöhnlich eine erhöhte Menge an Guanosin. Eine gegen 8-Azaguanin resistente Mutante ist auch gegen andere Purin-Analoge resistent, wie gegen 8-Azaxanthin, 8-Azaadenin, Thioinosin, 6-Mercaptopurin, 6-Chlorpurin, 6-Aminopurin, 2-Amino-6-mercaptopurin, 4-Hydroxy-thiazolpyrimidin, 6-Mercapto-8-hydroxypurin und e-Methyl^-nitro-S-imidazolthiopurin.

Nachstehend werden die erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten und die zu ihrer Selektion verwendeten Verbindungen, das heißt die Verbindungen, gegenüber die die entsprechende Mutante resistent ist, aufgeführt:

Bacillus subtilis AJ 3617 (FERM-P 2313)

(Sulfaguanidin)

Bari'lus subtilis AJ 3618 (FERM-P 2314)

(8-Azaguanin, Sulfamerazin)

Bacillus subtilis AJ 3473 (FERM-P 2107)

(Methylmethioninsulfoniumchlorid)

Bacillus subtilis AJ 3474 (FERM-P 2108)

(Azaserin)

Bacillus subtilis AJ 3475 (FERM-P 2109)

(Methioninsulfoxid)

Bacillus subtilis AJ 3476(FERM-P 2110)

(Äthionin)

Bacillus subtilis AJ 3477 (FERM-P 2111)

(Methionin)

Bacillus subtilis AJ 3478 (FERM-P 2112)

(8-Azaguanin, Methioninsulfoxid)

Bacillus subtilis AJ 3479(FERM-P 2113)

(8-Azaguanin, Azaserin)

Bacillus subtilis AJ 3480(FERM-P 2114)

(Methionin + Methioninsulfoxid)

Bacillus subtilis AJ 3481 (FERM-P 2115)

(8-Azaguanin, Methionin + Methioninsulfoxid)

Bacillus pumilus AJ 3482 (FERM-P 2116)

(Methioninsulfoxid).

»+« zeigt an, daß die Mutante in einem Medium durch Selektion erhalten wurde, das sowohl Methionin als auch Methioninsulfoxid enthielt

Die Kulturmedien, in denen die erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten Guanosin erzeugen, sind weitgehend konventioneller Zusammensetzung. Sie müssen Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sowie Adenin enthalten und sollten ferner anorganische Ionen und organische Spurennährstoffe enthalten. Geeignete Kohlenstoffquellen können Glucose, Fructose, Saccharose, Stärkehydrolysate und Melassen sein. Stickstoff kann aus Nitraten, Ammoniumsalzen, Ammoniumhydroxid, Harnstoff und ähnlichen anorganischen und organischen Verbindungen erhalten werden.

Aerobe Bedingungen werden durch Belüftung und/ is oder Rühren aufrechterhalten und der pH-Wert wird zum Erzielen guter Ausbeuten zwischen 5 und 9 gehalten Wenn Ammoniak zur pH-Rsgelung verwendet wird, kann es gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen. Die Guanosinkonzentration in der Nährbrühe erreicht ihren Maximalwert innerhalb 2 bis 7 Tagen, wenn die Fermentation bei 24 bis 37° C durchgeführt wird.

Das in der Fermentationsbrühe angereicherte Guanosin kann durch übliche Methoden gewonnen werden, wie Entfernen der Zellen durch Filtration oder durch Zentrifugieren, und Leiten der Brühe über ein Ionenaustauscherharz.

Die durch die FERM-P-Nummern identifizierten erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismen sind frei erhältlich durch das Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science & Technology, Chiba-shi, Chiba-ken, Japan.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher verdeutlicht.

Beispiel 1

35

Die Resistenz jeder Mutante gegen die in den Tabellen aufgeführten Verbindungen wurde in nachstehender Weise geprüft:

Es wurde ein wäßriges Medium hergestellt, das auf 100 ml

0,02 g MgSO₄ · 7 H₂O,

0,05 g Natriumeitrat,

0,1 g L-Glutaminsäure,

2,5 g Glucose, 0,5 g NH₄CI,

0,4 g KH₂PO₄,

1 mg 1 mg

100 μ_δ 10 mg 0,2 g

enthielt und

FeSO₄ · 7 H₂O, MnSO₄ · 4 H₂O, Vitamin Bi, Adenin und Caseinhydrolysat einen pH-Wert

von 7,0 hatte. Dem

wäßrigen Medium wurde außerdem jeweils eine der in den Tabellen 1 bis 9 aufgeführten Verbindungen zugesetzt und es wurde (Gesamtvolumen 3 ml) in Reagenzgläser gegeben. Jedes Reagenzglas wurde nach dem Sterilisieren mit 0,05 ml einer Zellsuspension angeimpft, die 10⁶ Zellen/ml enthielt, und 24 Stunden bei 34°C geschüttelt Das Wachstum wurde durch Messen der Trübung der Kulturbrühe bestimmt Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 9 gezeigt

Tabelle

Sulfaguanidin y/ml

Tabelle

Sulfamerazin y/ml

Relatives Wachstum

AJ 3617

= FERM-P 2313

100

93

86

80

55

32

Relatives Wachstum

AJ 3618

= FERM-P 2314

100

90

85

60

20

Tabelle 3

8-Azaguanin y/ml

Relatives Wachstum

AJ 3481

= FERM-P 2115

AJ 3618

= FERM-P 2314 AJ 3478 = FERM-P 2112

AJ 3479

= FERM-P2113

0	100	100	100	100
50	92	100	90	88
100	85	92	85	60
300	50	40	50	32
500	20	15	22	12
1000	8	0	10	2
2000	0	0	0	0

Tabelle 4	5	24	28 548 Tabelle 5	6	AJ 3482 = FERM-P 2116	Relatives Wachstum AJ 3473 = FERM-P 2107
Azaserin y/ml	Relatives Wachstum AJ 3474 = FERM-P 2108	AJ 3479 = FERM-P 2113	Methylmethioninsulfoniumchlorid y/ml 5		100 89 60 43 15 2
O 50 100 300 500 1000	100 86 55 15 0 0 Tabelle 6	100 92 68 35 8 0	0 100 ίο ¹⁰⁰° ¹⁰ 5000 10000 20000
	Methioninsulfoxid γ/πύ	Relatives Wachstum AJ 3475 = FERM-P 2109	AJ 3478 = FERM-P 2112

0	100
100	96
500	83
1000	70
2000	43
5000	28
10000	10
20000	8

Tabelle 7

100 98 92 82 66 38 12 3

Tabelle

100 90 80 65 40 25 10 2

Methionin
y/ml

Relatives Wachstum

AJ 3477

= FERM-P 2111

Äthionin y/ml

Relatives Wachstum

AJ 3476

= FERM-P 2110

500

1000

5000

10000

20000

50000

100

110

105

98

90

60

55

100 200 500 1000 2000 5000 10000

100

85

63

30

15

Tabelle 9

Methionin	Methionin	0	Relatives Wachstum	AJ 3481
y/m\	sulfoxid	100	AJ 3480	= FERM-P 2115
	y/m\	500	= FERM-P 2114	100
30000	1000	100	98
30000	2000	95	92
30000	5000	90	86
30000	10000	85	73
30000	20000	67	65
30000		55	42
30000	25	20
30000	6
	Beispiel 2

Jeder der in Tabelle 10 aufgeführten Mikroorganismen wurde unter 16 Stunden langem Schütteln bei 34° C η einem wäßrigen Kulturmedium gezüchtet, das 2 g

Glucose/dl, 0,5 g Hefeextrakt/dl, 0,1 g NaCl/dl, 20 mg Adenin/dl, 4 ml Soyaprotein-Säurehydrolysat/dl, 0,02 g KH₂PCVdI und 0,04 g MgSO₄ · 7 H₂O/dl enthielt.

Dann wurde ein wäßriges Fermentationsmedium hergestellt, das pro 100 ml
g Glucose,
1,5 g NH₄NO₃,
0,02 g KH₂PO₄,
0,04 g MgSO₄ · 7 H₂O,
0,2 mg Ferroionen,
0,2 mg Manganionen,
0,2 g CaCl₂ · 2 H₂O,
0,1 g RNS (aus Hefe abgetrennt),
ml Soyaprotein-Säurehydrolysatund

Tabelle 10

10 3 g CaCO₃ (gesondert sterilisiert) enthielt, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und mit Dampf sterilisiert.

20 ml-Anteile des Fermentationsmediums in 500 ml-Kolben wurden mit je 1 ml der vorher hergestellten Impfkulturen inokuliert.

Die Fermentation wurde bei 34°C unter Schütteln während 72 Stunden durchgeführt. Die Mengen an Guanosin in den Fermentationsbrühen wurden durch Papierchromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt.

Mikroorganismus Angereichertes (juanosin (g/l)

FERM-P

Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus

subtilis AJ 3473 subtilis AJ 3474 subtilis AJ 3475 subtilis AJ 3476 subtilis AJ 3477 subtilis AJ 3478 subtilis AJ 3479 subtilis AJ 3480 subtilis AJ 3481 subtilis AJ 3617 subtilis AJ 3618 pumilus AJ 3482 subtilis AJ 3483 pumilus AJ 3484 4,7 4,2 4,6 3,5 3,1 7,2 6,6 5,2 8,2 8,3 9,5 3,2 1,8 1,0

2107 2108 2109 2110 2111 2112 2113 2114 2115 2313 2314 2116

Bacillus subtilis AJ 3483 und Bacillus pumilis AJ 3484 sind adeninbenötigende und guanosinbildende Mutanten, aus denen die erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten durch Induzierung gebildet wurden.

1,5 Liter der Fermentationsbrühe von AJ 3481 = FERM-P 2115 wurden in entsprechender Weise, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Die Zellen wurden aus der Brühe durch Filtration abgetrennt, und danach wurde Guanosin mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes isoliert. Durch Zugabe von Aceton zu dem Eluat wurden 12,5 g rohes kristallines Guanosin ausgefällt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Guanosin durch Züchten einer guanosinbildenden Mutante des Genus Bacillus, die für ihr Wachstum Adenin benötigt, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium bis zur Anreicherung von Guanosin in dem Medium und Gewinnen des angereicherten Guanosins aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der Mutanten

Bacillus subtilis FERM-P 2313,

Bacillus subtilis FERM-P 2314,

Bacillus subtilis FERM-P 2107,

Bacillus subtilis FERM-P 2108,

Bacillus subtilis FERM-P 2109,

Bacillus subtilis FERM-P 2110,

Bacillus subtilis FERM-P 2111,

Bacillus subtilis FERM-P 2112,

Bacillus subtilis FERM-P 2113,

Bacillus subtilis FERM-P 2114,

Bacillus subtilis FERM-P 2115 oder

Bacillus pumilus FERM-P 2116
verwendet.

Wachstums auf einem die Verbindungen enthaltenden Medium zu dem Wachstum auf einem Medium, das frei von den Verbindungen ist

Die verwendeten Sulfa-Arzneimittel enthalten die Gruppe: