DE1695304C3 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure und S'-Guano-sinmono-,- di- und -triphosphat - Google Patents

Description

säure, asser, Kaliumhydroxjd oder Na- und zwar 24 Stunden lang bei 30^pC. Das Einsaat-

irimahydroxid,je nach dem verwendeten Näbrmedium, medium besitzt einen pH-Wert von 7,2.

eingestellt. Die entstandene EiasaatkuUur wird in einer Menge

5'-Xanthylsäure wird dem Nähnnedium in einer von 10 Volumprozent in das Fermentationsmedium

Mtngt von etwa 5,0 bis 30 mg/ml zugesetzt S eingeimpft. 20-ml-Anteae des Einsaat- oder Fermen- S'-Xanthylsäure kann als reines Produkt verwendet tationsmediums werden in 250-ml-ErJenmeyerkolben

werden, oder es können rohe 5'-Xanthylsäure, 5'-Xan- eingefüllt und nach Sterilisation (10 Minuten lang bei

thylsäure enthaltende Substanzen oder 5'-Xanthylsäure 120⁰C unter Druck) verwendet. Das Fermentations-

enthaltende Kuliurflüssigkeiten, die durch Fennen- medium besitzt folgende Znsammensetzung:

taiion erhalten worden sind, verwendet werden, wenn ι»

das Wachstum der genannten Mikroorganismen und 10% Glucose,

die Anreicherung von 5'-Inosinsäure oder der 5'-Guano- 0,6 % Harnstoff,

sinphosphate im Kulturmedium dadurch nicht nach- 1,0% KH₄PO₄,

triÜg beeinflußt werden. l,0< Κ^ΗΡΟ,,

Die 5'-Xanthylsäisre kann dem Nährmedium zu 15 1,0% MgSO₄- 7 H₁O. Beginn der Züchtung oder auch nach Beginn der 0,01%CaCl_s-2H_tO, Züchtung zugegeben werden. 30 μ g/l Biotin, Nach einer Ausgestaltung der Erfindung enthält 20 mg/I Adenin,

das Nährmedium außerdem ein oberflächenaktives S mg/ml Vitamin B₁,

Mittel. 20 10 mg/1 Calciumpantothenat,

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann bei- 1,0% Fleischextrakt, spielsweise die Bildung von Guanylsäure beeinträchtigt

werden, wenn Mn⁺*-lonen in dem Kulturmedium Der pH-Wert des Mediums wird mit verdünntem

vorhanden sind. Wenn das Mn "-Ionen enthaltende Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt 5'-Xdnthylsäure

Kulturmedium jedoch ein oberflächenaktives Mittel as (80% Reinheit ist vor Einimpfung des Einsaatstammes

enthält, wird Guanylsäure nahezu in einer solchen j_n das Fermentationsmedium in einer solchen Menge

Menge gebildet wie sie erzielt wird, wenn das Kultur- J_3x dem Fermentationsmedium hinzugegeben worden,

meJium keine Mn¹ Monen enthält. In den Fällen, daß iicb eine Endkonzentration von 25 mg/ml ergibt,

in denen billige natürliche Zusätze bzw. Nährstoffe, Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln

die Mn⁺⁺-Ionen enthalten, verwendet werden, ist es 30 der Kultur 120 Stunden lang bei 30⁰C durchgeführt,

daher vorteilhaft wenn dem Nährmedium ein ober- rj>_er pH-Wert des Mediums wird während der Züch-

flächenakthes Mittel zugesetzt wird. Die dem Nähr- t_UBg _mit verdünntem Ammoniakwasser auf 7,5 ernge-

medium zuzusetzenden oberflächenaktiven Mittel oder _steiit, beginnend 72 Standen nach Anfang der Züch-

Dispergiermittel können anionisch, kationisch oder tung und dann bis zur Beendigung. Nach Abschluß

nichtionisch sein. Solche Substanzen Und in der Tech- 35 der Fermentation werden 10,8 mg/ml 5'-Guanosin-

nik bekannt und umfassen allgemein Materialien, wie monophosphat 2,4 mg/ml S'-Guanosindiphosphat,

die Natriumsalze von höhermolekularen Alkylsulfaten 8,2 mg/ml 5'-Guanosintripfeosphat und 12,7 mg/ml

oder -sulfonaten, Pelyoxyäthylenglycolderivate, höhere 5'-lnosinsäurc in der KuUurflüssigkeit angereichert

Fettsäuren mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. gefunden. Außerdem finden sich kleine Mengin an Laurinsäur;, Myristinsäure, Palmitinsaure, Stearin- 40 5'-Xanthylsäure, Guanosin, Guanin und Hypoxanthin

säure oder ölsäure und organische Ester von höheren ebenfalls in der Kulturflussigkeit.

Fettsäuren, wie z. B. Sorbitnumooleat. Ein LKer des Filtrates, das man erhalten hat, indem Nach etwa 2· bis 8tägigem Züchten unter den auge- _man die Mikroorgaaismenzdlen von der Kultur-

gebenen Bedingungen werden wesentliche Mengen flüssigkeit abfiltrierte, wird mit Salzsäure auf einen

5'-lnosinsäure und S'-Guanosinmono-, -di- und tri- « pH-Wert von 2,0 eingestellt und an Aktivkohle adsor-

phosphat in der Kulturflussigkeit und in den Zellen biert. Die mit äthanolischem Ammoniak erhaltene

der Mikroc inismen gefunden. abfließende Lösung wird dann konzentriert. Danach

Nach B.o.viigung der Züchtung können die ge- wird der pH-Wert der konzentrierten Lösung auf 2,5

bildeten 5'-Guanosinphoshate und die 5'-lnosinsäure eingestellt und die Lösung durch ein Anionenaus-

entweder als einzelne Verbindungen oder im Gemisch $0 tauscherharz (Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat,

nach üblichen Verfahren gewonnen werden, z. B. Cl-Form) geschickt und mit Salzsäure eluiert. Es

durch Behandeln mit einem lonenaustauscherharz, werden Fraktionen erhalten, die 5'- Inosinsäure,

Extrahieren mit Lösungsmitteln, Ausfällen, Adsor- 5'-Guanosinmonophesphat, 5'-Guanosindiphosphat

bieren ode' Chromatographie. und 5'-Guanosintnphosphai enthalten. Die Lösungen,

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläute- 55 die diese Fraktionen enthalten, werden auf einen

rung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben, pH-Wert von 7,0 eingestellt und unter vermindertem

beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht Druck eingeengt. Äthanol wird hinzugefügt und das

pro Liter Wasser. Gemisch der Natriumsalze von 5'-Inosinsäure und

η »- c _n - »1 ι 5'-Guanosinphosphate abgetrennt Die Ausbeute be-

^{Beispiel l} 60 trtgt21,4g.

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21172 wird Das Gemisch der Natriumsalze wird wiederum

als Einsaatstamm verwendet. Dieser Stamm ist eine durch einen Anionenaustauscherharz (StyroUDivinyl-Mutante, die erhalten worden ist durch Behandlung benzol-Copolymerisat, Cl-Form) geschickt, und die von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 mit vier daran adsorbierten Verbindungen, 5'-Inosinsäure,

UV-Strahlen. Dieser mutante Sta.nm ist Adenin 65 S'-Guanosinmonophosphat, 5'-Guanosindiphosphat ' bedürftig. Das Einsaatbacterium wird in einem und 5'-Guanosintriphosphat werden fraktioniert eiu-

Medium gezüchtet, das 2% Glucose, 1% Pepton, iert und auf diese Weise voneinander getrennt

1% Hefeextrakt und 0,3% Natriumchlorid enthält, Der pH-Weit von jeder Fraklionslösung wird auf

5 ' 6

Τ,φ eingestellt, und die Lösungen werden unter ver- ergibL Der pH-Wert des Mediums wird während der

mindertem Druck konzentriert. Äthanol wird hinzu- Züchtung mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf

gefügt und jede der Verbindungen in Form des Na- 7,6 eingestellt

triumsalzes abgetrennt Die Ausbeute beträgt 8,7 g Nach Abschluß der Fermentation sind 8 mg/ml

S'-Inosinsäure, 8,2 g 5'-Guanosinmonophospnat, 1,8 g 5 5'-Inosinsäure, 4 mg/ml 5'-Guanosinmonophosphat

Guanosindiphosphat und 6,7 g Guanosintriphosphat. und 7 mg/ml 5'-Guanosintriphosphat in der Kulturflüssigkeit angereichert worden. Außerdem finden sich

Beispiel 2 kleine Mengen an 5'-Guanosindiphosphat, 5'-Xanthyl-

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21172 wird säure, Guanosin und Guanin in der Kulturflüssigkeit,

wiederum als Einsaatstaram verwendet Eine Einsaat- ¹⁰ R ' η i e 1 3

kultur wird unter Verwendung desselben Mediums Bei ρ

und derselben Bedingungen wie in Beispiel 1 erhalten. Der mutante Stamm Corynebacterium glutamicum

Die entstandene Einsaatkultur wird in einer Menge ATCC 21173 wird als Einsaatbacterium verwendet.

von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium Diese Mutante wird durch Behandlung von Coryne-

der folgenden Zusammensetzung eingeimpft: ¹S bacterium glutamicum ATCC 13032 mit Nitrosoguani-

din erhalten. Der mutante Stamm ATCC 21173 besitzt

15% Glucose, die spezielle Eigenschaft, daß sein Wachstum durch

0,6% Harnstoff, Adenin, Guanin oder Hypoxanthin erheblich beschleu-

0,5% KH₂PO₄, nigt wird. Eine Einsaatkultur dieses Stammes wird in

0,5% K₂HPO₄, ^2O einer Menge von 10 Volumprozent in ein Ferraen-

0,5% MgSO₄-7H₂O, tationsmedium der folgenden Zusammensetzung ein-

0,01 % CaCl₂ · 2 H₂O, geimpft:
10 mg/1 FeSO₄-7H₄O,

1 mg/1 ZnSO₄ · 7 H₂O, 13 % Glucose,

3 mg/ml MnCl₂ · 4 H ₂O, ²5 1,0 % KH₂PO₄,

5 mg/1 Vitamin B₁, 1,0 % K₂HPO₄,

10 mg/1 Calciumpanthenat, 1,0 % MgSO₄ · 7 H₂O.

30 mg/1 Adenin, 1,5% NH₄Cl,

30 μ g/l Biotin, 0,5 % Hefeextrakt,

1,0% Fleischextrakt. '" 3% CaCO₃.

Die Züchtung wird 72 Stunden lang bei 35° C durch- Das Fermentationsmedium besitzt einen pH-Wert

geführt Dann wird eine 5'-Xanthylsäure enthaltende von 7,3. Zum Zeitpunkt des Einimpfens der Einsaat-

Fermentationsflüssigkeit (enthaltend 30 mg/ml 5'-Xan- kultur in das Fermentationsmedium wird außerdem

thylsäure) in einer äquivalenten Menge der Fermen- 35 5'-Xanthylsäure in einer Menge von 20 mg/ml zuge-

tationsflüssigkeit des vorliegenden Beispiels zugegeben. fügt. Die übrigen Züchtungsbedingungen entsprechen

Außerdem wird ein oberflächenaktives Mittel, Alkyl- den in dem Beispiel 1 beschriebenen. Nach 120 Stunden

dimethylbenzylammoniumchlorid, dem Medium in der Züchtung sind 8,1 mg/ml 5'-Inosinsäure, 7,5 mg/ml

einer Menge von 3,0 mg/ml zugegeben. Die Züchtung 5'-Guanosinmonophosphorsäure und 8,4 mg/ml

wird dann weitere 48 Stunden lang durchgeführt. 40 5'-Guanosindiphosphorsäure in der Kulturflüssigkeit

Während der Züchtung wird eine Ammoniumchlorid- angereichert worden. Außerdem findet man kleinere

lösung in einer solchen Menge zu dem Medium hinzu- Mengen an 5'-Xanthylsäure, Guanosin und Guanin in

gefügt, daß sich eine Endkonzentration von 0,5% der Fermentationsflüssigkeit.

Claims (3)

1. mit Hole von in Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae) ^{; 5}^" Patentansprüche: enthaltenden Enzyrojen gewonnen.

   ^f * ^, Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt

   ^ 1. Verfahren zur Herstellung von S'-Inosinsäure es demgegenüber,. gleichzeitig 5'-Inosinsäure und

   ~' und S'-Ouaijosininono-,-di-und-triphosphat, d a- 5 S'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphat iai Rd'nmen

   durch gekenn zeich net, daß man Brevi- eines einzigen Verfahrens auf fermentativem Wege T'' bacterium ammoniagenes ATCC 21172 oder dadurch herzustellen, daß man Brevibacterium ammo-

   *""* Corynebacterium glutamicum ATCC 21173 unter niagenes ATCC 21172 oder Corynebacterium gluta-

   aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nähr- micum ATCC 21173 unter aeroben Bedingungen in medium, das etwa 5,0 bis 30 mg/ml S'-Xanthylsäure io einem wäßrigen Nährmedium, das etwa 5 bis 30 mg/ml enthält, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C 5'-Xanthylsäure enthält, bei einer Temperatur von Mnd einem ptfrWerf Wn et*4 5,5 bis 9,0 züchtet, 20 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9 5'-inosinsaure-und 5'kjuänosinmono-, -di- und züchtet, 5'-Inosinsäure und S'-Guanosinmono-, -di- -triphosphat in der entstehenden Kulturflüssigkeit und -triphosphat in der entstehenden Flüssigkeit anreichert und aus dieser gewinnt. 15 anreichert und aus dieser gewinnt
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Die als Ausgangsmaterial verwendete 5'-Xanthylzeichnet, daß man eine S'-Xantbylsäure enthaltende säure kann beispielsweise gemäß der britischen Kulturflüssigkeit dem Nähnnedium zugibt Patentschrift 1 170 970 in großen Mengen auf fermen-
3. 3. Verfahrennach Anspruch 1, dadurch gekenn- tativem Wege hergestellt werden und ist als relativ zeichnet, daß das Nährmedium außerdem ein 20 leicht zugänglich anzusehen,
   oberflächenaktives Mittel enthält. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren reichern

   sich sowohl 5'-lnosinsäure als auch S'-Guanosinmono-, -di- und triphosphat in dem Kulturmedium in,

   gegenüber bekannten Verfahren, hohen Anteilen an.

   ^a5 Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist entweder ein synthetisches oder ein natür-

   ■ Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung liches Nährmedium geeignet, solange es die für das yon 5'-lnosinsäure und S'-Guanosinmono-, -di- und Wachstum des verwendeten Stammes notwendigen -triphosphat. Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind in der

   S'-Guanosinnucleotide und 5'-lnosinsäure linden 3° Technik bekannt: zu ihnen gehören Substanzen wie eine verbreitete Verwendung als Wurzstoffe. Außer- eine Kohlenstoffquelle, eine Sticksioffquelle und andern haben sie auf dem Gebiet dtr Medizin Bedeutung. organische Substanzen, die durch den verwendeten

   Aus der französischen Patentschrift 1 465 166 ist Mikroorganismus in geeigneten Mengen ausgenutzt bekannt, 5'-lnosinsäure unter Züchten von Mikroorga- werden. So können ah Kohlenstoffquelle Kohlennismen, wie Brevibacterium ammoniagenes ATCC 35 hydrate, z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, 19183, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19184, Stärke, Stärkehydrolysate oder Melassen oder orga-Brevibacterium ammoniagenes ATCC i9185 und nische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure oder Microcoecus ghrtamicus ATCC 19186, in Gegenwart Glutaminsäure, genannt werden. Diese Substanzen von Biotin herzustellen. Nach den dortigen Ausfüh- können entweder einzeln oder in Gemischen zweier rangen wird unter Anwendung der genannten Mikro- 4o oder mehrerer verwendet werden. AU Stickstoffquelle Organismen 5'-Inoünsäure in einer Menge gebildet, können verschiedene Arten von anorganischen oder die je nach dem speziellen Mikroorganismus in dem organischen Salzen oder Verbindungen verwendet Bereich von 15,6 bis 19,6 mg/ml liegt» Außerdem wer- werden, wie z. B. Harnstoff, Ammoniak oder Ammoden bei dem bekannten Verfahren gegebenenfalls niumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammmiumsulfat, geringe Mengen Hypoxanthin gebildet. 45 Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat oder Ammo-

   5'-Guanosinsäurenucleotide sind aus der Ribo- niumphosphat, oder natürliche stickstoffhaltige Stoffe, nucleinsäure (RNS) von natürlichen Substanzen, wie z. B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischig z. B. von Mikroorganismen, gewonnen worden. Aus extrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolyder französischen Patentschrift 1 369 382 ist bekannt, sate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte und Reiskleie-RNS durch spezifisch wirkende Enzyme, z.B. unter 5° extrakt. Auch diese Substanzen können entweder allein Verwendung von Streptomyces aureus, in 5'-Guam>sin- oder als Kombination von /wei oder mehreren vermonophosphat zu spalten. Aus der französischen Pa- wendet werden. Anorganische Stoffe, die zu dem tentschrift 1 369 070 ist ferner bekannt, aus Hefe ge- Zuchtungsmedium hinzugefügt werden können, sind wonnenci Guanosin durch Phosphorylierung in z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kalium-5'-Guanosinmonophosphat zu überführen. 5'-Guano- 55 dihydrogenphospiiat, Kaliummonohydrogenphosphat, sinmonophosphat kann ferner durch Züchten be- Ei-.ensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumstimmter Mikroorganismen (z. B. Mutanten von chiorid und Zinksulfat.

   Bacillus megaterium de Bary) in üblichen Nährmedien Außerdem können dem Kulturmedium Amino-

   aus deren Kulturmedien gewonnen werden (franzö- säuren, Vitamine, Purine, Pyrimidine, Biotin und .».».. sische Patentschrift 1 372 054). ⁶° Pantothenat zugegeben werden. ^;

   Aus der französischen Patentschrift 1 440 633 ist ein Die Züchtung der genannten Mikroorganismen wird

   ... mikrobiologisches Züchtungsverfahren z. B. unter unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aerobem i;

   Verwendung von Brevibacterium ammoniagenes ATCC Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften £'<■ 6872 bekannt, nach dem Guanin in S'-Guanosindi- einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa c-:· undrtriphosphat überführt wird. Nach dem Verfahren 65 20 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9,0 *< der französischen Patentschrift 1343 794 werden durchgeführt. Oi

   ;- S'-Guanosindi- und ^triphosphat aus 5'-Guanosin- Der pH-Wert der Kulturflüssigkeit wird während ""

   monophosphat durch enzymatische Phosphorylierung des Züchtens mit Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphor- .«·■