DE2220508B2

DE2220508B2 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung cyclischer Adenosin-3',5'-monophosphorsäure

Info

Publication number: DE2220508B2
Application number: DE2220508A
Authority: DE
Inventors: Akira Kawasaki Furuya; Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Masayo Tokio Ukita
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1971-05-07
Filing date: 1972-04-26
Publication date: 1979-01-25
Also published as: US3816251A; DE2220508A1; DE2220508C3; FR2137511A1; FR2137511B1; GB1366451A

Description

Die biotechnische Herstellung von cyclischer Adenosin-3',5'-monophosphorsäure der Formel

HO

nachstehend als cAMP bezeichnet, ist z. B. aus der FR-PS 20 15 396 bekannt Gemäß dieser Patentschrift werden die Mikroorganismen-Stämme Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374 Arthrobacter ATCC 21 375 oder Microbacterium ATCC 21 376 in Gegenwart von Adenin, Adenosin, Hypoxanthin, Inosin, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribosid, Succinyladenin oder Succinyladenosin gezüchtet. In der Kulturbrühe werden durch Zusatz von 1 bis 3 mg/ml eines der vorgenannten Vorläufer zum Kulturmedium während der Züchtung 1 bis 3 mg/ml cAM P angereichert

Aufgabe der Erfindung war es, ein neues Verfahren zur Herstellung des als wichtiges Arzneimittel dienenden cAMP zur Verfügung zu stellen, das sich im industriellen Maßstab mit erhöhten Ausbeuten durchführen läßt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Hersteilung cyclischer Adenosin-3',5'-monophosphorsäure durch Züchtung von Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374, Arthrobacter sp. ATCC 21 375 oder Microbacterium sp. ATCC 21 376 in einem Nährmedium üblicher Zusammensetzung bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und pH-Werten von 4 bis 10, das dadurch gekennzeichnet ist daß man die Züchtung in Gegenwart eines Fluorids durchführt

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt es, cAMP auf einfache Weise in industriellem Maßstab mit hoher Ausbeute herzustellen.

Zahlreiche Untersuchungen bezüglich der Anreicherung von cAMP bei der Züchtung von Mikroorganismen ergaben, daß beträchtliche cAMP-Mengen angereichert werden, wenn einer der genannten Bakterien- stamme in einem ein Fluorid, wie Natrium- oder Kaliumfluorid, enthaltenden Nährmedium gezüchtet wird, wobei kein Adenin, Adenosin, Hypoxanthin, Inosin, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribosid, Succinyladenin oder Succinyl- adenosin zugesetzt werden muß. Die vorgenannten Verbindungen sind Vorstufen bei der Biosynthese von Purinnucleotiden und bei der Bildung von cAMP in lebenden Organismen (W. W. Umbreit, Metabolie Map, Bd. II [1060], Seite 201, Burgess Publishing Co,

Minnesota, V. St A.). Bei gleichzeitiger Anwesenheit eines Fluorids und eines Vorläufers von cAMP im Nährmedium während des Züchtens werden erhöhte cAMP-Mengen angereichert.

Fluoride, wie Natrium- und Kaliumfluorid, werden im

2^r> allgemeinen als Enzyminhibitoren (R. M. Höchster und ]. H. Quast el, Metabolie Inhibitor, Bd. ( und II [ 1963], Academic Press, New York, V. St A.) verwendet

Aus Biochem. J, Bd 120, (1970), S. 6P, geht zwar

hervor, daß Adenylcyclase aus Corpus Luteum von

jo Ratten durch Zusatz von Natriumfluorid aktiviert wird. In J. Biol. Chem., Bd. 244 (1969), S. 3468, wird beschrieben, daß die Aktivität der Adenylcyclase in Rattenfettzellen durch Zusatz von Fluoridionen gesteigert wird.

j) Andererseits ist jedoch bekannt, daß Natriumfluorid Adenylcyclase mikrowellen Ursprungs aus Escherichia coli hemmt (M. T a ο und F. L i ρ m a η, Proc. Natl. Acad. Sei, Bd 63 [1969], S. 86). Es war daher anzunehmen, daß die Bildung und Anreicherung von cAMP in Mikroorga nismen durch die Zugabe eines Fluorids gehemmt würde. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß im Falle der beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Mikroorganismen bei Zugabe eines Fluorids zum Nährmedium erhöhte cAMP-Mengen angereichert werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl synthetische als auch natürliche Nährmedien verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß sie geeignete Mengen einer Kohlenstoffquelle, einer organischen

-,ο oder anorganischen Stickstoffquelle, anorganische Salze und, falls notwendig, spezifische Nährstoffe enthalten. Als Kohlenstoffquellcn können z. B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannit, Galactose, Ribose, Stärke, Stärkehydrolysat-Lösung und Melasse, organischen Säuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Milchsäure und Essigsäure, Alkohole wie Glycerin, Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine und Kerosin, und Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Alanin, Glutamin und Asparagin, eingesetzt

bo werden. Als Stickstoffquellen können z. B. Ammoniak, anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff, stickstoffhaltige organische

b5 Materialien, wie Pepton, Caseinhydrolysat, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fischmehl oder abgebautes Fischmehl, und Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure und Alanin, eingesetzt werden. Als

anorganische Salze können z.B. Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Calcitimcarbonat eingesetzt werden.

Das Fluorid wird dem Nährmedium in Mengen von 1 bis 2000 mg/Liter zugesetzt Es kann dem Nährmedium bei dessen Herstellung, nach dem Beimpfen mit dem Mikroorganismus oder während des Zflchtens zugesetzt werden. Spezielle Beispiele von im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbarer Fluoride sind Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Calciumfluorid, Magnesiumfiuorid, Lithiumfluorid, Bariumfluorid, Ammoniumfluorid und Zinkfluorid.

Der Mikroorganismus wird vorzugsweise vor dem Animpfen des Kulturmediums in einem Anzuchtmedium gezüchtet Das Züchten der Anzuchtkultur wird unter günstigen Wachstumsbedingungen so lange durchgeführt, bis eitje geeignete Population gewachsen ist, wozu im Normailall 12 bis 24 Stunden eriorderlich sind. Die Anzucbtkultur wird dann in das Kulturmedium eingeimpft

Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Kulturmedium zusätzlich mit mindestens einem Vorläuger von cAMP, wie Adenin, Adenosin, Adenylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Inosinsäure, 5-Amino-4-imidazolcarboxamid, S-Amino^-imidazolcarboxamidribosid, 5-Amino-4-imidazolcarboxamidribotid, Succinyladenin oder Succinyladenosin, versetzt Der Vorläufer wird dem Kulturmedium in geeigneten Mengen, vorzugsweise in Mengen von 1 bis 20 g/Liter, beim Einimpfen des Mikroorganismus oder während des Züchtens zugesetzt.

Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen, z. B. in Schüttelkultur oder in belüfteter und gerührter Submerskultur durchgeführt

Die Züchtungszeit beträgt gewöhnlich 10 bis 120 Stunden, wobei eine beträchtliche cAMP-Menge in der Kulturbrühe angereichert wird. Nach beendeter Züchtung wird das cAMP aus der Kulturbrühe mittels eines Ionenaustauschers, wie im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben, isoliert Das cAMP kann auch durch Adsorption, Ausfällung und Extraktion isoliert werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Durch etwa 12stündiges Züchten von Mikrobacterium sp. ATCC 21 376 in einem 1 Prozent Glucose, 1 Prozent Pepton, 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeextrakt und 03 Prozent Natriumchlorid enthaltenden Anzuchtmedium bei 30⁰C w ird eine Anzuchtkultur hergestellt. Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat, 1 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 1 Prozent Magnesiumsulfat, 10 mg/Liter Kobalt(ll)-chlorid, 30μg/Liter Biotin, 100 mg/Liter Natriumfluorid, 0,5 Prozent Pepton und 1 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7,6 eingestellt wird. 30 ml des Kulturmediums werden in einem 250 ml fassenden konischen Kolben 10 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wird dann mit der Anzuchtkultur im Verhältnis von 10 Volumprozent beimpft. Nach 72stündigem Züchten bei 30° C in Schüttelkultur enthält die Kulturbrühe 3,3 mg/ml cAMP.

1 Liter Kulturfiltrat, das durch Abfiltrieren der Zeilen und der Niederschläge aus der Kulturbrühe erhalten wird, wird mit Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt und mit Aktivkohle versetzt. Dieses Gemisch wird gründlich gerührt, wobei das cAMP an der Aktivkohle adsorbiert wird. Die Aktivkohle wird abfiltriert, und das adsorbierte cAMP wird mit einem Ammoniak-Äthanol-Gemisch eluiert Das Eluat wird unter vermindertem Druck konzentriert Die konzentrierte Lösung wird über einen Ionenaustauscher (Dowex 1x2 in der Chloridform) gegebea Der Austauscher wird mit Wasser gewaschen und dann mit verdünnter Salzsäure eluiert Die cAMP enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert Das Konzentrat

ίο wird mit Äthanol versetzt, wobei 1,8 g Rohprodukt in kristalliner Form erhalten wird. Das Rohprodukt wird umkristallisiert Sämtliche bei der Elemantaranalyse erhaltenen Werte, die Bestimmung des Basen-, Zuckerund Phosphorsäuregehaltes, das UV- und das IR-Ab-Sorptionsspektrum und die bei der Papierchroma togra_: phie erhaltenen R₍-Werte zeigen, daß es sich bei der erhaltenen Verbindung um cAMP handelt.

Beispiel 2

Es wird eine Anzuchtkultur von Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374 hergestellt Ein 5 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat, 0,3 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1 Prozent Magnesiumsulfat, 1 Prozent Maisquellwasser, 0,3 Prozent

säurehydrolysiertes Casein, 200 mg/Liter Kaliumfluorid und 1,5 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium, dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt wird, wird mit dieser Anzuchtkultur beimpft. Das Züchten wird 60 Stunden bei 3O⁰C in Schüttelkultur

jo gemäß Beispiel 1 durchgeführt Nach dieser Zeit enthält die Kulturbrühe 2,3 mg/ml cAMP. Eine ohne Kaliumfluorid-Zusatz gezüchtete Vergleichskultur enthält lediglich 0,2 mg/ml cAMP.

Beispiel 3

Es wird eine Anzuchtkultur von Arthrobacter sp. ATCC 21 375 hergestellt. Das Züchten erfolgt gemäß Beispiel 1 in einem Kulturmedium mit der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium 24 Stunden nach Beginn des Züchtens mit 100 mg/Liter Natriumfluorid versetzt wird. Das Züchten wird 96 Stunden bei 32° C durchgeführt. Nach dieser Zeit enthält die Kulturbrühe 2,1 mg/ml cAMP. In einer ohne Natriumfluorid-Zusatz gezüchteten Vergleichskultur ist fast kein cAMP enthalten.

Beispiel 4

Das Züchten wird unter Verwendung des in Beispiel 1 so angegebenen Stammes 72 Stunden gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Natriumfluorid 100 mg/Liter Magnesiumfiuorid eingesetzt werden. Die Kulturbrühe enthält dann 3,0 mg/ml cAMP. In einer ohne Magnesiumfluorid-Zusatz gezüchteten Vergleichskultur ist fast kein cAMP enthalten.

Beispiel 5

Das Züchten wird unter Verwendung des in Beispiel 2 angegebenen Stammes 60 Stunden gemäß Beispiel 2 bo durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Kaliumfluorid 200 mg/Liter Lithiumfluorid eingesetzt werden. Die Kulturbrühe enthält dann 2,1 mg/ml cAMP. In einer ohne Lithiumfluorid-Zusatz gezüchteten Vergleichskultur ist fast kein cAMP enthalten.

Beispiel 6

Durch ein etwa 12stündiges Züchten von Microbacterium SD. ATCC 21 376 in einem 1 Prozent Glucose. 1

Prozent Pepton, 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent Natriumchlorid enthaltenenen Anzuchtrnedium bei 30⁰C wird eine Anzuchtkultur hergestellt Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat 1 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 1 Prozent Magnesiumsulfat, 10 mg/Liter Kobalt(II)-chloi id, 30μg/LiteΓ Biotin, 100 mg/Liter Natriumfluorid, 0,5 Prozent Pepton und 1 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen pH-Wert auf 7,6 eingestellt wird. 30 ml des Kulturmediums werden in einem 250 ml fassenden konischen Kolben 10 Minuten bei 120⁰C sterilisiert Das sterilisierte Kulturmedium wird dann mit der Anzuchtkultur in einem Verhältnis von 10 Volumprozent beimpft Das Züchten wird 72 Stunden bei 30⁰C in Schüttelkultur durchgeführt 20 und 40 Stunden nach Beginn des Züchtens wird das Kulturmedium mit Adenin versetzt so daß dessen Konzentration jeweils 2 mg/ml beträgt Nach beendetem Züchten enthält das Kulturmedium 9,7 mg/ml cAMP. Fine ohne Natriumfluorid-Zusatz gezüchtete Vergleichskultur enthält lediglich 2,1 mg/ml cAMP.

Beispiel 7

Es wird eine Anzuchtkultur von Microbacterium sp. ATCC 21 376 hergestellt. Das Züchten erfolgt gemäß Beispiel 6 in einem Kulturmedium mit der in Beispiel 6 angegebenen Zusammensetzung. Zum Vergleich wird eine Kultur ohne Natriumfluorid-Zusatz gezüchtet. In der Tabelle I sind die zugesetzten Vorläufer, deren Mengen, die Zugabezeiten und die nach 72stündiger Züchtung bei 30⁰C in der Kulturbrühe tnthaltenen cAMP-Mengen zusammengestellt. Die Abkürzungen AlCA und AICAR in Tabelle 1 bedeuten 5-Amino-4-imidazolcarboxamid bzw. 5-Amino-4-imidazoicarboxamidribosid.

Tabelle I

Vorläufer

Zugesetzte
Menge, mg/ml

OStd. 20Std.

cAMP

mit
NaF-Zusatz,
mg/ml

ohne
NaF-Zusatz,
mg/ml

Adenosin

Hypoxanthin

Inosin

AICA

AICAR

0 3 0 3 0

4 0 5 0 4

Beispiel 8

4,7
7,1
5,8
6,4
5,1

2,3
2,4
2,2
1,8
2,4

Es wird eine Anzuchtkultur von Arthrobacter sp. ATCC 21 375 hergestellt. Ferner wird ein 5 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Kaliumdihydrogenphosphat, 0,3 Prozent Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1 Prozent Magnesiumsulfat, 1 Prozent Maisquellwasser, 0,5 Prozent säurehydrolysiertes Casein und 1,5 Prozent Harnstoff enthaltendes Kulturmedium hergestellt, dessen kein pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt wird. Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium beim Beimpfen mit der Anzuchtkultur mit 200 mg/Liter Kaliumfluorid versetzt wird. Als Vergleich wird eine Kultur ohne Kaliumfluorid-Zusat7 gezüchtet.

In der Tabelle II sind die 7ugesetzten Vorläufer, deren Mengen, die Zugabezeiten und die nach 60stündiger Züchtung bei 30⁰C in der Kulturbrühe enthaltenen cAMP-Mengen zusammengestellt

Tabelle H	Zugesetzte	20 Std.	cAMP	ohne KF-
Vorläufer	Menge, mg/ml			Zusatz,
	OStd.		mit KF-	mg/ml
		3	Zusatz,	1,8
		4	mg/ml	1,6
	3	2	5,2	2,2
Hypoxanthin	0	2	4,8	1,7
Adenosin	2		5,7
Succinyladenin	2		4,3
Succinyl-
adenosin

Beispiel 9

Es wird eine Anzuchtkultur von Corynebactyrium murisepticum ATCC 21 374 hergestellt Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium 20 Stunden nach Beginn des Züchtens zusammen mit den in der Tabelle III aufgeführten Vorläufern mit 100 mg/Liter Natriumfluorid versetzt wird. Nach 90stündiger Züchtung bei 3O⁰C enthalten die Kulturbrühen die in der Tabelle III angegebenen cAMP-Mengen.

Tabelle HI

Vorläufer

Zugesetzte
Menge, mg/ml

cAMP

mit ohne

NaF- NaF-

Zusatz, Zusatz,

mg/ml mg/ml

Adenin
Adenosin
Hypoxanthin
Inosin
"5 AICA

5,3 4,7 5,5 4,3 4,3

2,2
2,1
1,8
2,1
1,9

Beispiel 10

Es wird eine Anzuchtkultur von Microbacterium sp.

ATCC 21 376 hergestellt. Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium 20 Stunden nach Beginn des Züchtens mit den in der Tabelle IV aufgeführten Vorläufern versetzt wird. Nach 72stündiger Züchtung bei 30⁰C enthalten die Kulturbrühen die in der Tabelle IV angegebenen cAMP-Mengen. Die Abkürzung AICARP bedeutet S-Amino^-imidazolcarboxamidribotid

Tabelle IV	cAMP mit NaF-Zusatz, mg/ml	ohne NaF- Zusatz, mg/ml
Vorläufer	2,3 1,8 1,7	0,4 0,6 0,5
5'-Inosinsäure 5'-Adenylsäure AICARP

Beispiel 11

Das Züchten wird gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Natriumfluorid 100 mg pro Liter Magnesiumfluorid eingesetzt werden. Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe 9,5 mg/ml cAMP. Eine ohne Magnesiumfluorid-Zusatz gezüchtete Vergleichskultur enthält lediglich 2,4 mg/ml cAMP.

Beispiel 12

Die Züchtung wird 72 Stunden gemäß Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Natriumfluorid 100 mg/Liter Lithiumfluorid eingesetzt werden. Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe 9,3 mg/ml cAMP. Eine ohne Lithiumfluorid-Zusatz gezüchtete Vergleichskultur enthält lediglich 2,2 mg/ml cA M P.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung cyclischer Adenosin-3',5'-inonophosphorsäure durch Züchtung von Corynebacterium murisepticum ATCC 21 374, Arthrobacter sp. ATCC 21 375 oder Mikrobactcrium sp. ATCC 21 376 in einem Nährmedium üblicher Zusammensetzung bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C und pH-Werten von 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart mindestens eines Fluorids durchführt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Nährmedium durchführt, das zusätzlich mindestens einen Vorläufer der cyclischen Adenosin-3',5'-monophosphorsäure enthält