DE1695305C3 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Guanosinmono-,-di-und-tripbosphat - Google Patents

Description

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Während des ZüchteiK ist es vorteilhaft, den pH- den lang bei 30⁰C in einem Kulturmedium gezüchtet,

Wert der Kulturflussigkeit auf einen schwach alka- welches 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt

lischen Zustand einzustellen, und zwar mit Ammoniak- _{und 0)}3% Natriumchlorid enthält. Der pH-Wert

wasser, einer Losung von Harnstoff oder Natrium- des Mediums beträgt 7 2

hydroxyd, insbesondere während des späteren Zeit- 5 Die Einsaatkultur wird in das Fermentationsraums der Züchtung. medium in einer Menge von 10 Volumprozent ein-

5-Xanthylsaure wird dem Nährmedium in einer geimpft. 20-ml-Anteile des Einsaat- oder Fermen-

Menge von etwa 5,0 bis 30 mg/ml zugefügt. tationsmediums werden in 250-ml-Erlenmeyerkolben

5'-Xanthylsaure kann als reines Produkt verwendet eingefüllt und nach der Sterilisation 10 Minuten lang

werden, oder es können rohe 5-Xanthylsaure, io unter Druck bei 120⁰C verwendet. Das verwendete

5'-Xanthylsäure enthaltende Substanzen oder 5'-Xan- Fermentationsmedium besitzt folgende Zusammen-

thylsäure enthaltende Kulturflüssigkeiten, die durch Setzung:

Fermentation erhalten worden sind, verwendet wer- in°/ <~i

den, wenn das Wachstum des Mikroorganismus oder η ao/u V

die Umwandlung in die 5'-Guanosinphosphate da- 15 !'ίν^ρη

durch nicht nachteilig beeinflußt wird. Die 5'-Xanthyl- J?'*(° £¹T*ί~*'

säure kann dem Züchtungsmedium entweder zum Zeit- [?'? ζ° JvV^_{7 H n}

punkt des Einimpfens des Mikroorganismus oder "'.L S r r\*' ·> u η

nach dessen Wachstum zugegeben werden. ¹^¹ ·< > LaCI,-2H,U,

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung enthält zo ff'^B!^otin·

das Nährmedium außerdem ein oberflächenaktives ^_n" "'

Mittel. Die dem Medium hinzuzufügenden ober- ' " ^PeP^ton·

flächenaktiven Mittel oder Dispergiermittel können Der pH-Wert des Mediums wird mit verdünntem anionisch, kationisch oder nichtionisch sein. Solche Natriumhydroxyd auf 7,8 eingestellt. 5'-Xanthylsäure Substanzen sind in der Technik bekannt und umfassen 25 (80% Reinheit) ist vor dem Einimpfen der Einsaatallgemein Materialien, wie die Natriumsalze von kultur in das Fermentationsmedium in einer solchen höhermolekularen Alkylsulfaten oder -sulfonaten, Menge zu dem Fermentationsmedium hinzugefügt Pclyoxyäthylenglycolderivate, höhere Fettsäuren mit worden, daß sich eine Endkonzentration von 20 mg/ml 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, z.B. Laurinsäure, ergibt. Die Züchtung wird dann unter aerobem Sch iit-Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure 30 teln der Kultur 96 Stunden lang bei 30⁰C durchgeu. dgl., organische Ester von höheren Fettsäuren, führt. Der pH-Wert des Mediums wird während der wie 7. B. Sobitanmonooleat. Züchtung mit verdünntem Ammoniakwasser auf 7,7

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die eingestellt, und zwar beginnend 48 Stunden nach

Bildung von Guanylsäure beeinträchtigt werden, wenn Anfang der Züchtung und dann bis zur Beendigung.

Mn*'-Ionen in dem Kulturmedium vorhanden sind. 35 Nach Abschluß der Fermentation sind 12,5 mg/ml

Wenn das Mn" -Ionen enthaltende Kulturmedium 5'-Guanosinmonophosphat, 2,3 mg/ml 5'-Guanosin-

jedoch ein oberflächenaktives Mittel enthält, wird diphosphat und 4,3 mg/ml 5'-Guanosintriphosphat

Guanylsäure nahezu in einer solchen Menge gebildet, in der Kulturflüssigkeit angereichert worden. Kleine

wie sie erzielt wird, wenn das Kulturmedium keine Mengen an 5'-XanthyIsäure, Guanosin und Guanin

Mn⁴⁴-Ionen enthält. Bei der Herstellung der ange- 40 finden sich ebenfalls in der Kulturflüssigkeit,

gebenen 5'-Guanosinphosphate im industriellen Maß- 1 I des Filtrates, das man durch Abfiltrieren der

stab können billige natürliche Zusätze bzw. Nähr- Mikroorganismenzellen von der Kulturflüssigkeit er-

stoffe in dem Kulturmedium verwendet werden. halten hat, wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert

Dabei ist eine Verunreinigung des Kulturmediums von 2,0 eingestellt und an Aktivkohle adsorbiert. Die

durch Mn "-Ionen meistens unvermeidlich. In diesen 45 mit äthanolischem Ammoniak erhaltene abfließende

Fällen ist es daher vorteilhaft, wenn das Kultur- Lösung wird dann konzentriert. Danach wird der

medium ein oberflächenaktives Mittel enthält. pH-Wert der konzentrierten Lösung auf 2,5 einge-

Nach etwa 8tägigem Züchten unter den ange- stellt und die Lösung durch ein Anionenaustauscher-

gebenen Bedingungen werden wesentliche Mengen harr (Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat, Cl-Form)

5'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphat in der 50 geschickt und mit Salzsäure eluiert. Es werden Frak-

Züchtungsflüssigkeit gefunden. tionen erhalten, die 5'-Guanosinmonophosphat,

Nach Beendigung der Züchtung können die ge- 5'-Guanosindiphosphat und 5'-Guanosintriphosphat bildeten 5'-Guanosinphosphate nach bekannten Ves- enthalten. Die Lösungen, die diese Fraktionen entfahren, wie z. B. durch Behandeln mit Ionenaur- halten, werden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt tauschern, Extrahieren mit Lösungsmitteln, Ausfällen, 55 und unter vermindertem Druck eingeengt. Äthanol Adsorbieren oder Chromatographie entweder einzeln wird hinzugefügt, und das Gemisch der Natriumsalze oder im Gemisch isoliert werden. der 5'-Guanosinphosphate wird dann abgetrennt. Die

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Er- Ausbeute beträgt 15 g.

läuterung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben, Das Gemisch der Natriumsalze wird an einem

beziehen sich alle angegebenen Prozenlgehalte auf das 60 Anionenaustauscherharz (Styrol-Divinylbenzol-Co-

Gewicht pro Liter Wasser. polymerisat, Cl-Form) adsorbiert. Drei Verbindungen,

_R . 11 nämlich S'-Guanosinmonophosphat, 5'-Guanosindi-

Ii e 1 s ρ 1 e l phosphat und 5'-Guanosintriphosphat, werden durch

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21170 wird fraktionierte Eluierung mit Salzsäure getrennt. Jede als Saatstamm verwendet. Der Stamm ist eine Mu- 65 der Lösungsfraktionen wird auf einen pH-Wert von tante, die durch Behandlung von Brevibacterium 7,0 eingestellt und unter vermindertem Druck konammoniagenes ATCC 6872 mit Nitrosoguanidin zentriert, wobei jede Fraktion in Form des Natriumerhalten wurde. Das Einsaatbacterium wird 24 Stun- salzes isoliert wird. Als Ergebnis werden getrennt

6,8 g S'-Guanosinmonophosphat, 1,2 g 5'-Guanosindiphosphat und 2,7 g 5'-Guanosintnphosphat erhalten.

Beispiel 2

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21170 wird wiederum als Einsaatmikroorganismus verwendet. Eine Einsaatkultur wird unier Verwendung desselben Mediums und derselben Bedingungen wie im Beispiel 1 erhalten.

Die entstehende Einsaatkultur wird in einer Menge von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung eingeimpft.

15% Glucose,

0,6% Harnstoff,

0,1% KH₂PO₄,

0,3% K₂HPO₄,

0,1% MgSO₄-7H₂O,

1,0% Maisquellflüssigkeit,

0,2%Pepton,

10 mg/l FeSO₄-7 H₂O,
10 mg/1 MnCl₂-4H₂O,
10 mg/1 ZnSO₄-7H₂O.

Die Züchtung wird dann 48 Stunden lang bei 35"C durchgeführt. Dann wird eine 5-Xanthylsäure-Fermentationsflüssigkeit (enthaltend 20 mg/ml 5'-Xanthylsäure) in einer äquivalenten Menge der Fermentationsflüssigkeit zugegeben. Außerdem wird ein

ίο oberflächenaktives Mittel, nämlich ein Polyoxyalkylenalkylamin, dem Medium in einer Menge von 2,0 mg/ml zugegeben. Die Züchtung wird dann weitere 48 Stunden lang durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert des Mediums mit einer 20%igen Harnstoff lösung auf 7,6 eingestellt.

Nach Beendigung der Fermentation sind in der Fermentationsflüssigkeit 3 mg/ml 5'-Guanosinmonophosphat und 5 mg/ml 5'-Guanosintriphosphat angereichert worden. Zusätzlich finden sich kleine Mengen 5'-Guanosindiphosphat, Guanosin und Guanin in der Kulturflüssigkeit.

Claims (3)

20 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis 9 Patentanprüche: züchtet, die genannten Produkte in der entstehenden Kulturflüssigkeit anreichert und aus dieser nach

1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Guanosin- üblichen Arbeitsweisen isoliert.

mono-, -di- und -triphosphat, dadurch ge- 5 Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Aus-

kennzeichnet, daß man Brevibacterium gangsmaterial verwendete 5'-Xanthylsäure kann bei-

ammoniage.nes ATCC 21170 unter aeroben Be- spielsweise nach der britischen Patentschrift 1 170 970

dingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das auf fermentativem Wege in großen Mengen herge-

etwa 5,0 bis 30 mg/ml 5'-XanthyIsäure enthält, bei stellt werden und ist als relativ leicht zugänglich an-

einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und einem io zusehen.

pH-Wert von etwa 5,5 bis 9,0 züchtet, 5'-Guanosin- Gemäß der Erfindung können gleichzeitig 5'-Guano-

mono-, -di- und -triphosphat in der entstehenden sinmono-, -di- und -triphosphat in guten Ausbeuten

Kulturflüssigkeit anreichert und aus dieser ge- hergestellt werden. Beispielsweise ist die Ausbeute an

winnt. 5'-Guanosinmonophosphat von 280 mg/1 nach Bei-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 15 spiel 1 der französischen Patentschrift 1372 054 zeichnet, daß man eine 5'-Xanthylsäure enthaltende wesentlich niedriger als die mit dem erfindungsge-Kulturflüssigkeit dem Nährmedium zugibt. mäßen Verfahren erzielbare Ausbeute von 12,5 mg/ml.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Ferner werden nach der französischen Patentschrift zeichnet, daß das Nährmedium außerdem ein 1 440 633 nur eine Spur 5'-Guanosindiphosphat und oberflächenaktives Mittel enthält. 20 0,57 mg/ml bzw. 2 mg/ml 5'-Guanosintriphosphat

(dortige Beispiele 4 und 5) gebildet, während nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie das nachfolgende

Beispiel 1 erläutert, 12,5 mg/ml 5'-Gruanosinmono-

phosphat, 2,3 mg/ml 5'-Guanosindiphosphat und

25 4,3 mg/ml 5'-Guanosintriphosphat hergestellt werden

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung können,

von 5'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphat. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen

5'-Guanosinmono-, -di- und -triphosphat finden Verfahrens ist entweder ein synthetisches oder ein eine verbreitete Verwendung als Würzstoffe. Außer- natürliches Nährmedium geeignet, solange es die für dem haben sie auf dem Gebiet der Medizin Bedeutung. 30 das Wachstum des genannten Mikroorganismus not-5'-Guanosinsäurenucleotide sind aus der Ribonuclein- wendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind säure (RNS) von natürlichen Substanzen, wie z. B. bekannt, zu ihnen gehören eine Kohlenstoffquelle, Mikroorganismen gewonnen worden. Aus der fran- eine Stickstoffquelle und anorganische Substanzen, zösischen Patentschrift 1 369 382 ist bekannt, RNS die durch den verwendeten Mikroorganismus in gedurch spezifisch wirkende Enzyme, z. B. unter Ver- 35 eigneten Mengen ausgenutzt werden. So können als wendung von Streptomyces aureus, in 5'-Guanosin- Kohlenstoff quelle beispielsweise Kohlenhydrate, wie monophosphat zu spalten. Aus der französischen Glucose, Furctose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärke-Patentschrift 1 369 079 ist ferner bekannt, aus Hefe hydrolysate oder Melassen oder organische Säuren, gewonnenes Guanosin durch Phosphorylierung in wie Essigsäure, Milchsäure oder Glutaminsäure ge-5-Guanosinmonophosphat zu überführen. 5'-Guano- 40 nannt werden. Diese Substanzen können entweder sinmonophosphai kann ferner durch Züchten be- einzeln oder in Gemischen zweier oder mehrerer stimmter Mikroorganismen (z. B. Mutanten von verwendet werden. Als Stickstoffquelle können ver-Bacillus megaterium de Bary) in üblichen Nähr- schiedene Arten von anorganischen oder organischen medien aus deren Kulturmedien gewonnen werden Salzen oder Verbindungen verwendet werden, wie (französische Patentschrift 1 372 054). 45 z. B. Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze,

Aus der französischen Patentschrift 1 440 633 ist wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoni-

ein mikrobiologisches Züchtungsverfahren z. B. unter umnitrat, Ammoniumacetat oder Ammoniumphos-

Verwendung von Brevibacterium ammoniagenes phat, oder natürliche stickstoffhaltige Stoffe, wie Mais-

ATCC 6872 bekannt, nach dem Guanin in 5'-Guano- quellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton,

sindi- und -triphosphat überführt wird. Nach dem Ver- 50 Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casamino-

fahren der französischen Patentschrift 1 343 794 werden säure, Fischpreßsäfte und Reiskleieextrakt. Auch

5'-Guanosindi- und -triphosphat aus 5'-Guanosin- diese Substanzen können entweder allein oder als

monophosphat durch Jenzymatische Phosphorylie- Kombination von zwei oder mehreren verwendet

rung mit Hilfe von in Bierhefe (Saccharomyces cere- werden. Anorganische Stoffe, die zu dem Züchtungs-

visiae) enthaltenen Enzymen gewonnen. 55 medium hinzugefügt werden können, sind z. B.

Es ist zwar z. B. aus »Die Pharmazie« 21 (1966), Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydro-S. 142 bis 160, bekannt, daß bei den Stoffwechsel- genphosphat, Kaliummonühydrogenphosphat, Eisenreaktionen in der Zelle 5'-Guanosinmonophosphat aus sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natrium-5-Xanthylsäure entsteht. Es ist dort jedoch nicht an- chlorid und Zinksulfat.

gegeben, daß Mikroorganismen von außen Xanthyl- 60 Außerdem können dem Kulturmedium Aminosäure aufnehmen, diese in 5'-Guanosinphosphate säuren, Vitamine, Purine, Pyrimidine, Biotin oder umwandeln und letztere nach außen abgeben können. Panthothenat zugegeben werden.

Demgegenüber wird nach der Erfindung 5'-Guanosin- Die Züchtung des genannten Mikroorganismus mono-, -di- und -triphosphat auf fermentativem Wege wird unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aeorobem dadurch gewonnen, daß man Brevibacterium ammonia- 65 Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Begenes ATCC 21170 unter aeroben Bedingungen in lüften einer Submerskultur bei einer Temperatur von einem wäßrigen Nährmedium, das etwa 5 bis 30 mg/ml etwa 20 bis 40°C unci einem pH-Wert von etwa 5,5 5'-Xanthylsäure enthält, bei einer Temperatur von bis 9,0 durchgeführt.