DE1695340A1

DE1695340A1 - Verfahren zur Herstellung von Adenosintriphosphat und Adenosindiphosphat

Info

Publication number: DE1695340A1
Application number: DE19671695340
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-11-17
Filing date: 1967-11-13
Publication date: 1971-04-08
Also published as: YU31713B; BE706490A; GB1191513A; NL6715411A; ES347095A1; YU220467A; CH471893A

Description

IHIIL(N 31 : :/;: Dr.-ing. HANS RUSCHKJ

w«ea*iGULAR

13. Nov.

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Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd., Tokyo / Japan Verfahren »ur Herstellung von Adenosintriphosphat und Adanosindlphosphat

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Adenoelntriphosphat und Adenoeindiphoiphat. Insbesondere bezieht sloh die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Adenoeintriphosphat und Adenoslndiphosphat duroh fieratntatlon. Qanz besonders fällt in den Rahasn der Erfindung din Verfahren zur Herstellung von Adenosintrlphosphat und Adenosindiphosphat durch Ferment»tion unter Verwendung von Mikroorg*nlein Gegenwart von Adenin oder Derivaten dieser Verbindung.

AdenosintrlphoepiäAt (Ä^P) und Adenoslndiphöspluit (ADF) sind rbiiidui.i?:an_# -Ί1* i:#l umn 3toffvia«h««l ,tu Ikill« apielön* Oiöä's !farbtndungäni

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biochemische Reagentien und hoch energetische PhoephoraÄure-Zusatzmittel sowie auf dem Gebiet der Medizin von Bedeutung.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von Adenosintriphosphat und Adenosindiphosphat, durch welches die Nachtelle und Mangel der bisher bekannten Methoden überwunden werden« Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein in wirksamer und einfacher Welse durchzuführendes Verfahren zur Herstellung von Adenosin· triphosphat und/oder Adenosindiphosphat duroh Fermentation. Dieses Verfahren IKUt sich auf billige Weise in industriellem Maßstab© durchfuhren, wobei hohe Produktauebeuten erzielt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß erhebliche Mengen an ATP und ADP in der KuIturflUeelgkeit angereichert werden, wenn Adenin oder Derivate dieser Verbindung oder natürliche Substanzen, welche Adenin oder dessen Derivate enthalten, einem Kulturmedium zugesetzt werden, in welchem eine Fermentation mit Mikroorganismen zur Erzeugung von ATP und ADP durchgeführt wird.

Mikroorganismen, ills bei dom "orflndungsgemäflan Verfahren eingesetzt werden, sind Baktarian» dia zu dan Gattungen

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Corynebacteriura, Miorococous und Arthrobaeter gehören. Ferner kommen Mikroorganismen in Betracht, die selbst Adenin oder Derivate dieser Verbindung erzeugen.

Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Zugabe von Adenin zu dem Kulturmedium während der Fermentation. Geeignete Derivate dieser Verbindung, wie beispielsweise Adenosin, Adenylsäure o.dgl., können ebenfalls in wirksamer Welse verwendet werden. Es ist ferner möglich, natürliche Substanzen einzusetzen, die Adenin oder dessen Derivate enthalten, da diese Substanzen das gleiche Ergebnis liefern.

Erfindungsgemäß ist sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches Nährmedium geeignet, sofern es die wesentlichen Nährmittel für das Wachstum des verwendeten Stammes enthält. Derartige Nährmittel sind bekannt. Sie enthalten beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen o.dgl.. Diese Nährmittel werden von den ein gesetzten Mikroorganismen in den entsprechenden Mengen verbraucht. Als Kohlenstoffquellen selen beispielsweise Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Fruchtzucker, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen o.dgl. sowie Olycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren o.dgl, erwähnt. Diese Substanzen können entweder als alleinige Kohlenstoffquelle oder

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in Mischung von zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen kommen verschiedene Arten.anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff oder Ammoniumsalze» z.B. Ammonium-Chlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat o. dgl.. Es können auch natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, verwendet werden, beispielsweise Maiewasser, Hefeextrakt. Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Fleiohbrühe, Caseinhydrolysate, Casamlnosäure, löslich· Fleohbestandteile, ReIskleleextrakt o.dgl.. Die Stlokstoffquelle kann ferner aus einer einzigen Substanz oder aus einer Kombination aus zwei oder mehreren Stickstoff-enthaltenden Materialien bestehen. Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphoephat, Eisensulfat, Manganohlorld, Calciumchlorid o.dgl..

Werden Mutantenstamme verwendet, die besondere Nährmittel erfordern, dann sollten natürlich die Substanzen, welche erforderlich sind, um diesen Wachstumsanforderungen zu genügen, dem Kulturmedium zugesetzt werden. Ferner wurde beobachtet, daß der Zusatz von Aminosäuren oder Vitaminec, beispielsweise Biotin, Thiamin, Pantothensäure oder von Verbindungen mit einer physiologischen Bedeutung, die mit der Bedeutung der-

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artiger Verbindungen Identisch ist (beispielsweise ß-Alanin oder Coenzym A für Pantothensäure) das Wachstum der Mikroorganismen sowie die erhaltene Fermentation stabilisiert und eine hohe Produktausbeute zur Folge hat.

Wird die Fermentation durch Zugabe von Adeninverbindungen zu einem Kulturmedium der vorstehenden Art durchgeführt, dann werden ATP, ADP und Adeny!säure (AMP) einzeln oder zusammen erzeugt.

Die erzeugten Mengen an ATP₉ ADP und AMP lassen sich durch Zugabe von ungefähr 0,4 Gew.£ oder mehr eines anorganischen Phosphate (in Form von PO^"*) zu dem Kulturmedium erhöhen. Ein Gehalt von ungefähr 0,4 bis 1,6 Qew.£ als PO^ wird bevorzugt und liefert gute Ergebnisse.

Die Menge an Adenin oder an Derivaten dieser Verbindung, wel_t ehe dem Kulturmedium zugesetzt wird, liegt in optimaler Welse bei ungefähr 1 bis 10 mg/ml Adenin oder eine· Äquivalents dieser Verbindung. Glucose oder andere Nährkomponenten können ■ ebenfalls dem Medium während der Gärung zugesetzt werden.

Die Gärung oder Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur.

BAD QBmMe\

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Man kann die Fermentation auch unter Belüftung und Rühren einer submersen Kultur bei einer Temperatur von ungefähr 20 bis 40⁰C und bei einem pH-Wert von ungefähr 5 bis 9 durchführen. Unter diesen Bedingungen werden nach einem ungefähr 36- bis 120-stündigen Züchten merklich große Mengen an ATP» ADP und AMP erzeugt. Die Ausbeute an ATF und ADP, inabeson- -dere an ATP, läßt sich durch Einstellen des pH-Werts der Kulturbrühe in der Weise, daß die KulturbrUhe nach der Zugabe von Adenin oder einem Derivat dieser Verbindung zu dem Kulturmedium neutral oder schwach sauer ist (pH 7,5 bis 5#5), marklich erhöhen.

Nach Beendigung des Züohtens können das erhaltene ATP und ADP aus der Fenaentations brühe nach Üblichen Methoden abgetrennt werden« beispielsweise durch Behandlung mit einem lonenaustausoherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln« Ausfällung, Adsorption o.dgl..

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht.

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Beispiel 1

Corynebaaterium sp. 3485 ATCC 21084 wird als Beimpfungsbacterium verwendet. Es wird bei 3O⁰C 24 Stunden lang in einem Kulturmedium gezüchtet, das aus 2% Glucose, 1% Pepton, IJi Hefeextrakt, 0,3# NaCl und 3Ö/Ug/l Biotin besteht.

Die erhaltene Impfkultur wird in einer Menge von 10$ (bezogen auf das Volumen) auf ein Fermentationsicediuin auf geimpft, das folgende Zusammensetzung besitzt:

100 g Glucose

6 g Harnstoff 10 g

10 g

10 g Hefeextrakt ' 30 zug Biotin 0,1 g CaCl₂.2H₂O

Die vorstehend angegebenen Bestandteile werden in 1 1 Wasser zur Herstellung des Fernentationsmediums gelöst. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 8,0 mittels NaOH wird die Lösung in einzelne Kolben gegossen und bei 1 kg/cm 10 Minuten lang in einem Autoklaven sterilisiert.

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20 ml-Portionen der Kombination aus dem BeImpfungsmaterial und den Fermentationsmedien werden In einzelne konische 250 ml-Kolben gegossen. Das Züchten wird anschließend unter aerobem Schütteln bei 30^pC durchgeführt.

Nach 72-stUndigem Züchten wird Adenin dem Fermentations-™ medium zur Einstellung einer Konzentration von 2 mg/ml zügesetzt. Das Züchten wird anschließend 24 Stunden lang fortgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums wird neutral oder sohwaoh sauer gehalten. Naoh der Beendigung des Züchtens beträgt der pH-Wert des Mediums 5,8. In der Kulturbrühe fallen 3,1 mg/ml ATP und 0,90 mg/ml ADP (jeweils gemessen als freie Säure) an.

Das naoh der Entfernung der Bakterienzellen von der Fermen- ^ tatlonsbrühe erhaltene FiItrat wird durch eine Säule geschickt, die ein stark basisches Anlonenaustausoherharz enthält, und zwar Dowex (X2), Chloridtyp. Entsprechende Fraktionen von ATP und ADP werden durch Eluierung unter Verwendung von Chlorwasserstoff säure erhalten. Die Fraktionen werden mit Natriumhydroxyd neutralisiert. Anschließend werden sie mit Kohlepulver behandelt, konzentriert und abgekühlt. Diese Behandlung hat die Bildung von Kristallen der entsprechenden Natriumsalze von ATP und ADP zur Folge.

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Beispiel 2 *

Corynebacterium mycetoides KY 3536 ATCC 21134 wird als Beimpfungsbakterium verwendet. Das Züchten wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Dabei fallen 1,5 mg/ml ATP, 0,8 mg/ml ADP und 1,3 mg/ml AMP an.

Beispiel 3

Es wird die gleiche Arbeitsweise, wie sie i-n Beispiel 1 be schrieben wird, eingehalten, wobei Corynebacterium sp. 3485 ATCC 21084 als Beimpfungsbakterium verwendet wird, mit der Ausnahme, daß die Konzentration der Glucose in dem Fermentationsmedium 3$ beträgt. Nach Beendigung der Fermentation fallen in der KulturbrUhe 0,4 mg/ml ATP und 0,3 mg/ml ADP an.

Beispiel 4 .

Micrococous sodonensls ATCC 15932 wird als Beimpfungsbakterium verwendet. Das Züchten wird in dem gleichen Kulturmedium unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen 72 Stunden lang durchgeführt. Anschließend wird Adenin der Fermentationsbrühe zur Einstellung einer Konzentration von 2 mg/ml zugesetzt. Das Züchten wird anschließend weitere 24 Stunden fortgesetzt. Dabei fallen 1,3 mg/ml ATP und 0,5 mg/ml ADP (jeweils gemessen als freie Säure) an. Nach dor Zugabe von Adenin wird

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der pH-Wert des Kulturmediums neutral oder schwach sauer gehalten . Nach Beendigung des Züchtens beträgt der pH-Wert 6,0.

Beispiel 5

_Ä Es wird die gleiche wie in Beispiel. 1 beschriebene Arbeitsweise eingehalten, mit der Ausnahme, daß Microcoocus sodonensis ATCC 15932 als Beimpf ungsbakterlum verwendet .wird und die Konzentration der Glucose in dem Fermentationsmedium auf J>%> eingestellt wird. Die Mengen an erzeugtem ATP- und ADF betragen 0,4 mg/ml bzw. 0,3 mg/ml.

Beispiel 6

Arthrobacter sp. 3486 ATCC 21085 wird als Beimpfungsbakterium verwendet. Es wird in dem gleichen Kulturmedium und unter den gleichen ZUohtungsbedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben werden, 72 Stunden lang gezüchtet. Anschließend wird der Fermentationsbrühe Adenin zur Einstellung einer Konzentration von 2 mg/ml zugesetzt, worauf das Züchten weitere 24 Stunden lang fortgesetzt wird. Nach der Zugabe von Adenin wird der pH-Wert des Kulturmediums neutral oder.schwach sauer genalten. Nach Beendigung des Züchtens betragt der pH-Wert 5»8. In der Kulturbrühe fallen 2,3 mg/ml ATP und 0,6 mg/ml ADP (Jeweils gemessen- als freie Säure) an.

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Beispiel 7

Es wird die gleiche Arbeitsweise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wird, eingehalten, mit der Ausnahme, daß Arthrobacter sp. 5486 ATCC 2IO85 als BeimpfungsbakteriunB verwendet wird und die Konzentration der Glucose in dem Fermentationsmedium auf yf> gehalten wird. Die Mengen an erzeugtem ATP und ADP betragen 0,8 mg/ml bzw. 0,25 mg/ml.

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Claims

- 12 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Adenos intri phos phat und Adenosindiphosphat, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus, der zu der Gattung Corynebacterium, Micrococcus oder Arthrobacter gehört, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen NMhrmedium gezüchtet wird, das als Additiv Adenin, Adeninderivate oder Substanzen, in denen Adenin oder dessen Derivate enthalten sind, enthält, in der erhaltenen KuIturbrUhe Adenosintrlphosphat und Adenosindiphosphat angesammelt werden und diese Verbindungen von der KulturbrUhe abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

als Adeninderivate Adenosin oder Adenylsäure verwendet werden.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv in dem Nährmedium zu Beginn des ZUchtens zugegen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv dem Nährmedium nach der Initiierung des ZUchtens zugesetzt wird.

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5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,, daß das Züchten bei einer Temperatur von ungefähr 20 bis 4O°C und bei einem pH-Wert von ungefähr 5 bis 9 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium wenigstens ungefähr 0,4 0ew.# PO^ als anorganisches Phosphat enthält.

7· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv dem Medium in einer solchen Menge zugesetzt wird» daß ungefähr 1 bis 10 mg/ml Adenin vorhanden sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« daß

der pH-Wert nach der Zugabe des Additivs zu dem Medium zwischen 5,5 und 7,5 gehalten wird«

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium Glucose enthält.

10. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus aus Corynebaeterium sp.

ATCC 21084« Corynebaoterlum mycetoldes ATCC 21134, Mlorooocoue eodoneneie ATCC 15932 oder Arthrobaoter sp. ATCC 21085 besteht.

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11. Verfahren zur Herstellung von Adenosintriphosphat und Adenosindlphosphat, dadurch gekennzeichnet, daß ein zu der Gattung Corynebacterium, Micrococcus oder Arthrobacter gehörender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von ungefähr 20 bis 40*C bei einem pH-Wert von ungefähr 5 bis 9 in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet wird, das ungefähr 0,4 als 1,6 Gew.% PO^ als anorganisches Phosphat und ein aus Adenin, Adeninderivaten oder Substanzen, die Adenin oder dessen Derivate enthalten, bestehendes Additiv enthält, Adenosintriphosphat und ,Adenosindlphosphat in der erhaltenen Kulturbrühe angesammelt werden und diese Verbindungen von der Kulturbrühe abgetrennt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv üem Nährmedium nach der Initiierung des ZUchtens zugesetzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet« daß der pH-Wert nach der Zugabe des Additivs zu dem Medium zwischen 5,5 und 7,5 gehalten wird.

l4. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Additiv dem Medium in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß ungefähr 1 bis 10 mg/ml Adenin in aera Medium enthalten sind. .

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-ISIS. Verfahren nach Anspruch lh, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus aus Corynebacterium sp. ATCC 21O8V Corynebacterium myeetoides ATCC 21134, Micrococous sodonensis ATCC 15932 oder Arthrobac-ter sp. ATCC 2IO85 besteht.

16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dafl die verwendeten Adenlnderlvate aus Adenosln oder Adenylsäure bestehen. -

17* Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dafi das Nähr medium Glucose enthält.

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