DE1695331A1

DE1695331A1 - Verfahren zur Herstellung 1 ss-D-Ribofuranosid-5'-phosphorsaeureestern von 1 H-Pyrazolo(3,4-d)pyrimidinen

Info

Publication number: DE1695331A1
Application number: DE19671695331
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-09-07
Filing date: 1967-09-05
Publication date: 1972-04-20
Also published as: FR1575532A; US3764472A; GB1169624A

Description

^ Patentanwälte -^-
Dr.-Ing. HAN'3 RUSCHKE
DipNmj. H JNZ AGULAR

β München Su, Pivinzenauerstr. 2

Patentanmeldung P 16 95 251.4-44
_{K 759}

Soh/Bl.

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., 4, Ohtemachi-1-chorae, Chiyoda-ku, Tokyo (Japan)

Verfahren zur Herstellung von lß-D-RIbofuranosid-5¹-phosphorsSureestern von lH-Pyrazolo(3,4-d)pyrimIdlnen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von lS~D-Rlbofuranosid~5'-phosphorsäureestern von lH-Pyrazolo-(3*4-d)pyrimidinderiväten durch Gärung.

lß-D-Ribofuranosid-5¹-phosphorsäureester von lH-Pyrazolo-(2,4-d)pyriroidinderivaten werden durch folgende Strukturformel wiedergegeben:

II

Unterlagen (Art / ^ l aus.2 Hr. 1 Satz 3 d«· Änd«nit«ages. v.4,8.

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worin R₁ und R₂ für aus H, OH oder NH₂ bestehende funktioneile Gruppen steht und

-P-OH OH

-P-O-P-OH t ο

OH OH

0 0 0 oder -P-O-P-O-P-OH

0 8

OH OH

bedeutet.

Diese Verbindungen sind strukturanaloge Verbindungen von Purinnukleotlden, welche die NukleinsHure bilden. Außerdem stellen sie Mukleotid-Antagonisten dar. Ferner nimmt man an» daß sie die tatsächliche in vivo-Porm von IH-Pyrazole (3, 4~d)-pyrimidln-derlvaten (Z) sind« welche Inhibitoren für Krebs-Neoplasmen und Tutnore darstellen:

In dieser Formel bedeuten R₁ und R₂ aus H, OH oder NH₂ bestehende funktionelle Gruppen, während R, für H oder

HOCH₂

steht.

lH-Pyrazolo(3,4-d)pyrimidinderivate, die durch die Formel I wiedergegeben werden, sind nicht nur Krebs-, Neoplasma- und

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Tumorinhibitoren. Bestimmte Glieder dieser Verbindungen, und zwar 4-Qxy-lH-pyrazolo{3,4-d)pyrimidin und 4,6-DioxylH-pyrazolo-(2,4-d)pyrimidin, sind wirksame Inhibitoren von Xanthinoxydase und eignen sich als therapeutische Mittel gegen Gicht.

Von den erfindungsgemäß hergestellten Ribotlden erwartet man, daß sie eine gleiche oder stärkere Wirkung der vorstehend beschriebenen Art besitzen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von lß-D-Ribofuranosyl-5'-phosphorsäureestern von lH-Pyrazolo(3,4-d)pyrimidinderivaten durch ein Gärungsverfahren in industriellem Maßstäbe. Bei diesem Verfahren werden diese Ester in hohen Ausbeuten gewonnen .

Es hat sich herausgestellt, daß, falls ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium in Gegenwart von Pyrazolopyrimidinderivaten, welche die durch die Formel I wiedergegebene Struktur besitzen, während einer bestimmten Zeitspanne gezüchtet wird, Ribotide der Verbindungen der Formel X, d. h. Verbindungen, deren Struktur der Fornel IX entspricht, gebildet und in den Kulturbrühen sowie in den Mikroorganismenzellen angereichert werden. Diese Erscheinung war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser überraschenden Erkenntnis.

Das wichtigste Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Verbindungen der Formel I in einem Kulturmedium hergestellt werden. Als zur Herstellung der Ester der Formel XI geeignete Mikr©organ!smenstMrame lassen sich eine Vielzahl natürlich vorkommender Stämme verwenden, beispielsweise Schlzomycetes und Eumycetes oder dergl. Erfindungsgemäß wird eine erhebliche Ansammlung der Ester der

.. 4 209817/1558

Formel IX auf mikrobiologischem Wege durch Gärung in einem Kulturmedium erhalten, das IH-Pyrazolo(3,4-d)pyrimidinderivate der Formel I enthält.

Erfindungsgemäß kann jedes Medium eingesetzt werden, solange es Pyrazolopyrimidinderivate der Formel I enthält. Es ist also möglich, das Ziel der vorliegenden Erfindung dadurch zu erreichen, daß ein Mikroorganismus in einer wäßrigen Lösung gezüchtet wird, in welcher nur eine Verbindung der Formel I zugegen ist, wobei während des Züchtens eine Verbindung der Formel II in der wäßrigen Lösung gebildet wird. Im allgemeinen enthält jedoch das wäßrige Medium eine Kohlenstoff quelle, beispielsweise Glukose, Stärkehydrolysat, Melassen und andere organische Verbindungen, Phosphorsäureverbindungen, wie beispielsweise Kaliumphosphat, Natriumphosphat, p-Pheny!phosphorsäure, Ribose-l-phosphorsäure, Xnosinsäure, Adeny!säure oder Guany!säure sowie andere anorganische Salze, außerdem Stickstoffquellen, wie beispielsweise Harnstoff, Ammoniumchlorid, Amrnoniumsulfat und Ammoniumnitrat sowie Stickstoff enthaltende natürliche Produkte, beispielsweise Hefeextrakt, Maiswasser, FIeischextraktpepton sowie Fischmehl.

Erfindungsgemäß kann das durch die Formel X wiedergegebene Pyrazolopyrimidin in einem Medium in Kontakt mit dem eingesetzten Mikroorganismus zu jedem Zeltpunkt während des Züchtens vorliegen. Dies bedeutet also, daß das Pyrazolopyrimidinderivat dem Medium zu Beginn der Züchtung zugesetzt werden kann oder dem Medium während der Züchtung beigegeben werden kann. Ferner kann man so verfahren, daß das Pyrazolopyrimidinderivat dem Medium in Intervallen in kXeinen Portionen zugesetzt wird.

Die Menge des durch die Formel 1 wiedergegebenen Pyrazolo-

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pyrimidinderivats, das einem Kulturmedium zugesetzt wird« kann innerhalb eines breiten Bereichs schwanken. Wird eine große Menge der Mikroorganismenzellen verwendet, wobei kein nennenswertes Wachstum des Mikroorganismus erfolgt, dann kann eine hohe Konzentration des Pyrazolopyrimidinderivats eingesetzt werden. Wird andererseits eine Züchtung durchgeführt, bei welcher der verwendete Mikroorganismus bei Zugabe des Pyrazolopyrimidinderivats zu dem Kulturmedium zu einem frühen Zeitpunkt des Züchtens wächst* dann wird das Pyrazolopyrimidinderivat vorzugsweise in Intervallen in kleinen Portionen zugesetzt, da auf diese Welse das Wachstum des Mikroorganismus Inhibiert wird.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können neben der Einhaltung der definierten spezifischen Züchtungsbedingungen Im allgemeinen auch gewöhnliche Züchtungsbedingungen eingehalten werden, wie sie zur Züchtung von Mikroorganismen angewendet werden. Ferner können übliche Methoden zur Isolierung der Rlbotlde der Formel ZX aus dem Medium und aus den Mikroorganismenzellen angewendet werden. Die Ribotide können also aus den Mikroorganismenzellen durch Extraktion mit Perchlorsäure, heißem Alkohol oder dgl. isoliert werden. Die in den Kulturbrühen enthaltenen Ribotide können nach der in Beispiel 1 gezeigten Methode gewonnen werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem Xonenaustauscherharz, Adsorption an Aktivkohle oder dergleichen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Belsplell

Eine Impfkultur wird durch Züchtung von Brevibaoterium ammoniagenes (ATCC 68?2) In einem Medium, das 2 # Glukose,

_ 6 -209817/1558

1 # Pepton, 1 % Hefeextrakt, 0,3% NaCl, bezogen auf das Volumen des Mediums, und 30/Ug/1 Biotin enthält, bei einer Temperatur von 30⁰C während einer Zeitspanne von 24 Stunden hergestellt. Das Gärungsmedium wird mit 10 Vol.-# dieser Impfkultur beimpft. Beide Medien werden dann verwendet, nachdem jeweils 20 ml-Portionen in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und sterilisiert worden sind. Das Gärungsmedium besitzt die nachstehend angegebene Zusammensetzung, wobei die Gärung unter Schütteln des Kulturmediums bei 30⁰C durchgeführt wird.

Zusammensetzung	Glukose	des Gärungsmediums:
Harnstoff	100 g
K₂HPO₄	6 g
KH₂PO₄	10 g
MgSO₄ . 7H₂O	10 g
CaCl₂ . 2HgO	10 g
Biotin	0,1 g
Calciumpantothenat	30Aig
Tftlwiii¹	2 mg
Pepton	5 nipL
5 g.

Die vorstehend angegebenen Mengen werden in Wasser gelöst, worauf die Lösung auf 1 Liter verdünnt wird. Nach dem Einstellen des pH des Mediums auf 8,0 mit NaOH und Sterilisierung In einem Autoklaven unter einem Druck von 1 kg/cm während einer Zeitspanne von 10 Minuten werden Portionen dieser Lösung in Kolben gegeben.

Nach 24 stündigem Züchten wird 4-Hydroxy-IH-pyrazole»0,4-d)~ pyrimidin der Oärlösung in einer solchen Menge zugegeben, daß die Konzentration 2 mg/ml beträgt. Nach weiterem Züchten

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während einer Zeitspanne von 48 Stunden sammelt sich 4-Hydroxy-IH-pyrazolo(5,4-d)pyrimidin-lß-D-ribofuranosid-5⁹-phosphorsäureester in einer Konzentration von 2,1 rag/ml in der Kulturbrühe an·

Das auf diese Weise gebildete Ribotid wird an einem stark basischen lonenaustauscherharz (auf Styrolbasis, Dowex-1, Warenzeichen der Dow Chemical Company, USA, Ameisensäure-Typus) absorbiert und anschließend mit Ameisensäure eluiert. Die das Ribotid enthaltende Eluatfraktion wird neutralisiert und an Aktivkohle absorbiert. Das an der Aktivkohle absorbierte Ribotid wird mit einer 50^-igen fithanollösung, die 5 % ΝΗήΟΗ enthält, eluiert. Das Lösungsmittel in dem Eluat wird durch Verdampfen unter Vakuum entfernt, wobei das Ribotid in Form eines Pulvers anfällt.

Beispiel 2

Die Züchtung wird in der gleichen Welse wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 4»ÄH3in©~lH~pyrazolo (3»4-d)-pyriraidin anstelle von 4-Hydroxy-lH-pyrazolo(3,4~d) pyrimidin verwendet wird. Dabei sammeln sich in der Kulturbrühe der ^!phosphorsäureester, Dlphosphorsäureester und Monophosphorsäureester von 4-Amino-lH-pyrazolo(3,4-d) pyrämidin-iB-D-ribofuranosld in Konzentrationen von i*5 mg/ml, 1,1 mg/ml bzw. 0,6 mg/ml an.

Beispiel ^

Die Züchtung vrird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 6-Amino~4-hydroxy-lH-pyrazolo-(3,4~d)pyrimidin anstelle von 4-Hydroxy~lH~pyrazolo (5,4~d)-pyrimidin eingesetzt wird. Dabei sammeln sich in der Kulturbrühe der ^!phosphorsäureester, Dlphosphorsäureestor und Monophosphorsäiireester von 6-Aialno~4-hydroxy-*lH-pyrazolo~C5*4~d)pyrifflidin-lß-D-ribofuranosid in Konzentrationen

- 8 209817/1558

- 8 -von 1,1 mg/ml, 0,6 mg/ml bzw. 0,3 mg/ml an.

Beispiel 4

5 g Brothefe (Gewicht der nassen Bakterienzellen) werden zu 25 ml einer wäßrigen Lösung zugesetzt, die 100 mg 4-Hydroxy-lH-pyrazolo (3> 4-d )pyriraidin-lß-D-ribof uranosid, 200 mg Glukose, 200 mg KHgPOj,, 200 mg p-Phenylphosphorsäure und 0,5 mg MgCIg enthält. Anschließend wird das unbewegte Kulturmedium 5 Stunden lang bei 30⁰C gezüchtet. Dann werden 25 ml einer kalten In-Perchlorsäure dem Kulturmedium (Kulturbrühe, welche Bakterienzellen enthält) zugesetzt, worauf in einem Wasserbad während einer Zeitspanne von 1 Stunde extrahiert wird. Dabei werden 62 mg 4-Hydroxy-lH-pyrazolo(3,4-d) pyrimidin-lß-D-ribofuranosid-5^e -phosphorsäure in dem Extrakt erhalten.

Beispiel 5

5 ml jeweils einer Reaktionsflüssigkeit (deren pH auf 7,0 eingestellt wird), die 25 mg 4-Hydroxy-lH-pyrazolo(3,4-d) pyrimidin, 50 mg KH₂PO^, 0,1 mg MgCl₂ und 500 mg jeweils lebender Bakterienzellen verschiedener Mikroorganismenarten enthält, werden 5 Stunden lang bei 30⁰C gezüchtet. Anschließend wird das jeweilige Kulturmedium durch Zugabe von 5 ml einer kalten In-Perchlorsäure extrahiert. Der Extrakt wird mit 10 η NaOH neutralisiert, worauf 0,1 g Aktivkohle zugesetzt wird. Nach 10 Minuten dauerndem Schütteln wird die Aktivkohle abfiltriert. Die Aktivkohle wird mit 20 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 5 ml einer gemischten Lösung aus Äthanol und Ammoniak (25 £~ig, 0,5 n) eluiert. Das Eluat wird auf 1 ml konzentriert. Das konzentrierte Eluat wird zur Bestimmung der Bildung und Anwesenheit von 4-Hydroxy-lH-pyrazolo(3,4-d)pyrimidin~lß-D-ribofuranosld-5⁰-phosphorsäureester einer Papierchromatographie unterzogen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle X zusammengefaßt (+ in der Tabelle bedeutet

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. 9 -eine Bildung der Substanz).

Tabelle I

Bildung von *-Hydrcxy-lH~pyrazolo(3,4-d)pyrimidin-lß-D-ribofuranosid-5*-phosphor- Mikroorganismus säure

Aerobacter aerogenes, ATCC 8308 + Arthrobacter ureafaciens, ATCC 15762 + Bacillus sphaerious, ATCC 10208 + Bacillus subtilis, ATCC 15952 +

Bacillus megaterium, ATCC 15177 + Brevibaoterium helvolura, ATCC 19390 ' +

Corynebacterium rathayi, ATCC I3659 + Corynebacterium michiganense, ATCC 10202 +

Plavobacteriun arborescens, ATCC 4?58 + Staphylococcus citreus, ATCC 4012 + Micrococcus luteuB, ATCC 398 + Micrococcus varians, ATCC 399 + Micrococcus aurantiacus, ATCC 15*53 + Pseudomonas boreopolis, ATCC 15*52 + Sarcina lutea, ATCC 15176 + Serratla marcescens, ATCC I9I80 + Xanthoraonas citri, ATCC 15923 + Escherichla coil, ATCC 10798 + Candida utilis, ATCC I632I + Candida utilis, ATCC 9950 + Saccharomyces cerevisiae, ATCC 15248 + Zygosaccharomyces major» ATCC 152*9 + Candida troploalis, ATCC 15114 + Streptomyces venezuelae, ATCC 10712 ψ Streptorayces aureus, ATCC 3309 + PeniciIlium chrysogennum, ATCC 152*1 +

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Beispiel 6

Die Züchtung wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Corynebacterlum ap. Nr. J485 (ATCC 21084) anstelle von Brevlbacterium anunoniagenes verwendet wird. Dabei sammelt sich in der KulturbrUhe 4-flördroxy-lH-pyrazolo- (3,4-d)pyrimidin-lß-D-ribofuranosid-5*-phosphorsäureester in einer Konzentration von 2,3 mg/ml an.

Beispiel 7

Die Züchtung wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, alt der Ausnahme, daß Arthrobacter sp. Nr. 3486 (ATCC 21085) anstelle von Brevlbaoterium anmoniagenes verwendet wird. Dabei sammelt sich in der KulturbrUhe 4-Hydroxy-lH-pyrazolo(3,4-d)pyrlmidin-lß-D-ribofuranosid-5¹-phosphorsäureester in einer Konzentration von 2,1 mg/ml an.

Beiapiel 8

Die Züchtung wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Welse durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Micrococcus sodonensis ATCC 15932 anstelle von Brevlbacterium anunoniagenes verwendet wird. Dabei sammelt sich in der Kulturbrühe 4-KtydroxylH-pyrazolo(3,4-d)pjrimldin-18>D-*rlbofuranosid~5*>phosphorsäureester in einer Konzentration von 1,3 mg/ml an.

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Claims

- 11 -Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Iß-D-Ribofuranosid-S¹-phosphorsMuree8ter8 eines lH-Pyrazolo(5,4-d)pyrimldiÄs, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus in einen Kulturmedium gezüohtet wird, welches ein lH-Pyrazolo(3,4-d) pyrimidinderivat der allgemeinen Fortsei

enthält, worin R₁ und Rg H, OH oder NH₂ bedeuten und R-für H oder

steht, wobei das Pyrialdinderirat in einen lß-D-Ribofuranosid-5¹-phosphorsäureester eines lH-Pyrazolo(5,4-d) pyrimidine der Formel

Neue Unter lagen ιαλ. ν s ι *a*.z u

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worin R₁ und Rg die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen und X für

0 -P-OH,

OH

0 0 t oder 0 0 0 0 β It M OH η η η OH OK P-O-P-OH -P-O-P-O-P-OH t β OH OH

steht, der sich in dem Kulturmedium ansammelt und aus diesem abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als lH-Pyrazolo(3,4-d)pyrimidinderivat 4-Hydroxy-lH-pyrazolo-(3,4~d)pyrlmidin verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

als IH-Pyrazolo (3, 4-d)pyr imidinderi vat 4-Amlno-lH-pyrazolo· (3,4-d)pyrimidin verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als IH-Pyrazolo(3,4-d)pyrImidinderivat 4-Hydroxy-6-amlno~ lH-pyrazolo~(3,4~d)pyrimidin verwendet wird.

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5· Verfahren nach Anspruch X, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Schizomycetes oder Eumycetes verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet» daß als Mikroorganismen Brevlbacterlum aomoniagenes, Aerobacter aerogenes, Arthrobacter ureafadens, Bacillus sphaericus. Bacillus subtilis, Bacillus roegaterlum, Brevibaoterium helvolum, Corynebacterium rathayi, Corynebacterlum michiganense, Flavobacterium arborescens, Staphylococcus citrous, Mlcrooocous luteus, Mlcrococous varians, Hicrocoocus aurantiacus, Hlcrococcus sodonensis· Pseudomonas boreopolls, Sarcina lutea, Serratla marcescens, Xanthomonas citri. Escherichia coli_# Candida utilis« Saecharonorces eerevisiae, Zygosaccharomyces major, Candida troploalls, Streptonyces venezuelae, Streptonyces aureus, Peneclllium chrysogennura, Corynebacterlum sp.

Nr. 3485 und Arthrobacter sp. Nr. 3486 verwendet werden·

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Züchtungsmedium eine Kohlenstoffquelle, Phosphorsäureverbindungen, anorganische Nährsalze sowie eine Stickstoff quelle enthält.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung eines lß-D-Ribofuranosid-5^e-phosphorsäureesters eines lH-Pyrazolo(3,4-d) pyrimidine ein IH-Pyrazole(3,4-d)pyrimidinderivat der Formel

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worin R₁ und R₂ H, OH oder NH₂ bedeuten und FL· für H oder

HOCH₂

steht, mit einen Mikroorganismus in einem wäSrigen Medium kontaktiert wird* wobei das Pyrimidinderivat in einen lÖ-D-Rlbofuranosid-5¹ -phosphorsäureester eines IH-Pyrazolo(5,4-d)-pyrifiüdins umgewandelt wird» und ansohliessend der Ester abgetrennt wird.

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