DE69116198T2 - Verfahren zur Herstellung von D-Isocitronensäure durch Fermentation - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von D-Isocitronensäure durch FermentationInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von d-Isocitronensäure durch Gärung und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von d-Isocitronensäure mit einem zur Gattung Candida gehörenden Mikroorganismus, der eine Resistenz gegen Monofluoressigsäure aufweist und nicht oder kaum in Gegenwart von d-Isocitronensäure als einziger Kohlenstoffquelle wachsen kann.
- D-Isocitronensäure ist als Medikament, Nahrungsmittelzusatz und ähnliches nützlich.
- Bisher war ein Verfahren zur Herstellung von d-Isocitronensäure durch Gärung unter Verwendung von Hefe bekannt [Nippon Nôeikagaku Kaishi (Journal of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry), 44 (11), 493-498 (1970); Britisches Patent Nr.1,199,700; Französisches Patent Nr.1,596,056]. Die GB-A-1334220 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Citronensäure und Isocitronensäure durch Gärung, das die Züchtung eines geeigneten Hefestamms umfaßt. Durch die Zugabe von Monofluoressigsäure konnte die Ausbeute der Citronensäure gesteigert werden, während sich die Ausbeute der Isocitronensäure sehr verringerte.
- Es wurde bereits ein Versuch unternommen, eine Fluoressigsäure-resistente Mutante von Candida lipolytica herzustellen, um einen Stamm mit einer hohen d-Isocitronensäure-Produktivität zu erhalten. Bei diesem Versuch wurde eine Mutante erhalten, die eine erhöhte Aconitaseaktivität aufweist, jedoch konnte die Mutante keine größere d-Isocitronensäuremenge produzieren [Nippon Nôeikagaku Kaishi (Journal of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry), 48 (10), 543-548, 549-554 (1974)].
- Außerdem gibt es bekannte Verfahren unter Verwendung von Hefe für die Gärung, wobei Itaconsäure zur Verbesserung der Ausbeute von d-Isocitronensäure zugegeben wird (Summary of Lectures at 1976 General Meeting of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, 348; veröffentlichte, geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 39194/1981), und ein Verfahren unter Verwendung von Candida zeylanoides, bei dem Kaliumferrocyanid zugegeben wird (J. Ferment. Technol. 52 (8), 542-550 (1974)].
- Jedoch sind diese bekannten Verfahren in Hinsicht auf die Produktivität von d-Isocitronensäure nicht zufriedenstellend und es bestand der Wunsch, ein Verfahren zur industriellen Herstellung von d-Isocitronensäure bei geringen Kosten zu entwickeln.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von d-Isocitronensäure, umfassen die Züchtung eines Mikroorganismus in einem Medium, bis sich d-Isocitronensäure in der Kultur angereichert hat, und Gewinnung der d-Isocitronensäure daraus, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Candida gehört, eine Resistenz gegen Monofluoressigsäure aufweist und nicht oder kaum in Gegenwart von d-Isocitronensäure als einziger Kohlenstoffquelle wachsen kann und d-Isocitronensäure produzieren kann.
- In der vorliegenden Erfindung kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, solange er zur Gattung Candida gehört, die gegenüber Monofluoressigsaure resistent ist und nicht oder kaum in Gegenwart von d-Isocitronensäure als einziger Kohlenstoffquelle wachsen kann und d-Isocitronensäure produzieren kann. Beispiele der Mikroorganismen sind jene der Arten Candida lipolytica, Candida zeylanoides, Candida guilliermondii, Candida albicans, Candida humicola, Candida parapsilosis und Candida brumptii. Candida zeylanoides H-7728 ist ein bevorzugter Stamm, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI), Japan, am 16. Februar 1990 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2756 hinterlegt wurde.
- Bei der vorliegenden Erfindung kann entweder ein Wildtyp-Mikroorganismus oder eine Mutante verwendet werden, mit der Maßgabe, daß der Mikroorganismus oder die Mutante die vorstehend angeführten Eigenschaften aufweist.
- Eine Mutante kann durch bekannte Verfahren erhalten werden, z.B. durch UV-Bestrählung und durch die Behandlung mit Chemikalien, wie N-Nitro-N'-methyl-N-nitrosoguanidin (NTG).
- D-Isocitronensäure kann durch die Züchtung eines der vorstehenden Mikroorganismen in herkömmlicher Weise in einem synthetischen Medium oder in einem natürlichen Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen, Wachstumsfaktoren und ähnliches enthält, bis sich d-Isocitronensäure in der Kultur angereichert hat, und Gewinnung der d-Isocitronensäure daraus erhalten werden.
- Als Kohlenstoffquellen können Kohlehydrate, wie Glucose, Saccharose, Melasse und Stärkehydrolysate; Alkohole, wie Ethanol und Glycerin; organische Säuren, wie Essigsäure; aliphatische Säuren, wie Oleinsäure; Fette und Öle, wie Sojabohnenöl und Fischöl; Paraffine, wie Tetradecan und Hexadecan; etc. verwendet werden. Ferner können auch organische Verbindungen abhängig von der Assimilierbarkeit des verwendeten Mikroorganismus eingesetzt werden.
- Als Stickstoffquellen können anorganische und organische Amnnoniumverbindungen, wie Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat; Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff und andere Stickstoff enthaltende Verbindungen; Stickstoff enthaltende organische Produkte, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser und Caseinhydrolysat; etc. verwendet werden. Nitrate können auch als Stickstoffquelle abhängig von dern verwendeten Mikroorganismus verwendet werden. Die vorstehend erwähnten Stickstoffquellen können allein oder in Verbindung miteinander verwendet werden.
- Als anorganische Verbindungen können Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat, etc. verwendet werden.
- Vitamine, Aminosäuren, etc., die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich sind, werden dem Medium ebenfalls zugegeben. Ihre Zugabe ist nicht erforderlich, wenn sie in den anderen, vorstehend erwähnten Komponenten enthalten sind.
- Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durch eine Schüttelkultur oder eine Belüftungskültur unter Rühren bei einer Temperatur von 20ºC bis 35ºC ausgeführt und der pH-Wert des Mediums wird im Bereich von 2,5-10 gehalten, vorzugsweise im Bereich von 3-8. Die d-Isocitronensäure hat sich nach 2 bis 7 Tagen in der Kultur angereichert. Danach wird das Präzipitat, wie Zellen, aus der Kultur durch Zentrifugieren, etc. entfernt und die d-Isocitronensäure kann aus dem Kulturüberstand durch gleichzeitige Anwendung einer Ionenaustauscherbehandlung, Konzentrierung, Aktivkohlebehandlung und ähnliches gewonnen werden.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
- Candida zeylanoides ATCC 15585, welcher d-Isocitronensäure produzieren kann, wurde in diesem Beispiel als Elterstamm verwendet. Der Stamm wurde in YM-Medium (3 g Malzextrakt, 3 g Hefeextrakt, 5 g Polypepton und 10 g Glucose in 1 Liter Wasser, pH auf 6, eingestellt) bei 30ºC für 20 Stunden gezüchtet. Die Zellen (10&sup8;&supmin;&sup9;/ml) wurden aus der Kultur gewonnen, mit 0,2 M Acetatpuffer (pH 5,0) gewaschen und in dem gleichen Puffer suspendiert. Der Suspension wurde NTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 30ºC für 1 Stunde, um die Mutangenese zu induzieren. Die so behandelten Zellen wurden mit dem gleichen Puffer gewaschen, auf einer Agarplatte von Minimalmedium [6,7 g/l Bacto Nitrogen Base (Difco), 2% Agar, pH 5,5] ausgestrichen, die 4 g/l Natriummonofluoracetat und 1 g/l L-Prolin enthielt, und bei 30ºC für 5-10 Tage gezüchtet. Die auf der Platte wachsenden Kolonien wurden als Monofluoressigsäure-resistente Mutanten abgetrennt. Unter ihnen wurden jene selektiert, die in dem 1% d-Isocitronensäure enthaltendem Minimalmedium wachsen können oder in dern Medium ein extrem geringes Wachstum im Vergleich zum Elternstamm zeigen, und eine von ihnen wurde als Candida zeylanoides H-7728 (FERM BP-2756) bezeichnet.
- Die Empfindlichkeit gegenüber Monofluoressigsäure und das Wachstum in Gegenwart einzelner Kohlenstoffquellen der Mutante H-7728 ist in Tabelle 1 im Vergleich zum Elternstamm ATCC 15585 aufgeführt.
- Die Empfindlichkeit gegenüber Monofluoressigsäure der Mutante H-7728 und des Elternstamms ATCC 15585 wurde durch Ausbreiten der Zellen auf einer Agarplatte des vorstehenden, 4 g/l Natriummonofluoracetat enthaltenden Minimalmediums und Züchten der Zellen bei 30ºC für 7 Tage bestimmt. Die auf dem gleichen Medium ohne Natriummonofluoracetat wachsenden Zellen wurden als Kontrolle verwendet.
- Das Wachstum in Gegenwart der einzelnen Kohlenstoffquellen wurde spektrophotometrisch durch die Bestimmung der Absorption des Mediums bei 660 run nach der Züchtung der Zellen bestimmt, die in YM-Medium gezüchtet, mit 0,85%iger Natriumchloridlösung gewaschen und in der gleichen Lösung suspendiert und in einem 2% Calciumcarbonat und 1% der zu testenden Kohlenstoffquelle enthaltenden Minimalmedium [6,7 g/l Bacto Nitrogen Base (Difco), pH 5,5] unter Schütteln bei 30ºC für 48 Stunden gezüchtet wurden. Tabelle 1 Natriummonofluoracetat (g/l)* Kohlenstoffquelle Stamm d-Isocitronensäure Glucose Essigsäure ATCC 15585 (Elternstamm) H-7728 (FERM BP-2756) Anmerkung:. 1) * Als Kohlenstoffquelle wurde L-Prolin (0,1%) verwendet. 2) + zeigt eine Resistenz gegen Monofluoressigsäure an und - eine Empfindlichkeit dagegen. 3) Das Wachstum des Stamms H-7728 in Gegenwart der einzelnen Kohlenstoffquellen wurde in Hinsicht auf den Stamm ATCC 15585 als Wachstum in % ausgedrückt.
- Candida zeylanoides H-7728 (FERM BP-2756), erhalten in Beispiel 1, wurde in einen 40 ml Impfmedium (5% Glucose, 0,2% NH&sub4;Cl, 0,05% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MGSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Maisquellwasser, 3,3% CaCO&sub3;, pH 5,5) enthaltenden 250 ml-Erlenmeyerkolben überimpft und bei 30ºC für 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 210 Upm inkubiert. Die erhaltene Impfkultur (4 ml) wurde in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben überimpft, der 40 ml eines Gärmediums der nachstehenden Zusammensetzung enthielt, und 7 Tage unter den gleichen Bedingungen wie bei der Impfkultur inkubiert.
- 5% n-Paraffin (ein hauptsächlich aus C&sub1;&sub2;- bis C&sub1;&sub5;-Parafflnen zusammengesetztes Gemisch, Nippon Mining), 0,4% NH&sub4;Cl, 0,05% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MGSO&sub4;.7H&sub2;O, 2 mg/l ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 2 mg/l MnSO&sub4;.4-6H&sub2;O, 5 mg/l FESO&sub4;.7H&sub2;O, 150 µg/l CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 100 µg/l Biotin, 5 mg/l Thiaminhydrochlorid und 3% CACO&sub3;, pH 5,5.
- Der Elternstamm ATCC 15585 wurde in einer ähnlichen Weise wie vorstehend inkubiert und als Kontrolle verwendet.
- Die Ausbeute der d-Isocitronensäure und die Menge des Nebenproduktes Citronensäure wurden durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Die Citronensäure wurde als Präzipitat des Calciumsalzes davon gebildet. Das Präzipitat wurde durch die Zugabe von 0,5 N HCl gelöst, gefolgt von einer Zentrifugation und der erhaltene Überstand wurde einer HPLC unterzogen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Menge der produzierten organischen Säure (g/l) Stamm d-Isocitronensäure Citronensäure ATCC 15585 (Eltemstamm) H-7728 (FERM BP-2756)
- Zwei Liter der Kultur des H-7728-Stamms wurden zentrifugiert und der von Zellen und Verunreinigungen freie Überstand wurde unter Verwendung von 0,5 Liter Diaion SK#-1B (H&spplus;-Form) (Mitsubishi Kasei) entionisiert. Nach der Einstellung des pH-Werts auf 3,6 durch die Zugabe von 10 N Kaliumhydroxid wurde der Überstand durch die Behandlung mit Aktivkohle entfärbt und unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml konzentriert, wodurch Monokalium-d-isocitrat auskristallisierte. Ausbeute 56 g; Reinheit 95%.
- Zehn Gramm der Kristalle wurden in 250 ml Wasser gelöst, mit 40 ml Diaion SK#-1B (H&spplus;-Form) (Mitsubishi Kasei) entionisiert und bei Raumtemperatur konzentriert, wobei eine Paste erhalten wurde, welche eine quantitative Menge der d-Isocitronensäure enthielt, die 8,35 g reiner d-Isocitronensäure entspricht. Die Paste wurde in 50 ml Wasser gelöst, auf 100ºC für 30 Minuten erwärmt und bis zur Trockene konzentriert, wobei 7,57 g (quantitativ) lactonisierte d-Isocitronensäure erhalten wurden.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von d-Isocitronensäure,
umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus in einem Medium,
bis sich d-Isocitronensäure in der Kultur angereichert
hat, und Gewinnung der d-Isocitronensäure daraus, wobei
der Mikroorganismus zur Gattung Candida gehört, eine
Resistenz gegen Monofluoressigsäure aufweist und nicht
oder kaum in Gegenwart von d-Isocitronensäure als
einziger Kohlenstoffquelle wachsen kann und
d-Isocitronensäure produzieren kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus zur
Art Candida lipolytica, Candida zeylanoides, Candida
guilliermondii, Candida albicans, Candida humicola,
Candida parapsilosis oder Candida brumptii gehört.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus
Candida zeylanoides H-7728 (FERM BP-2756) ist.
4. Biologisch reine Kultur von Candida zeylanoides H-7728
(FERM BP-2756).
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