KR940010304B1 - 발효법에 의한 d-이소구연산(d-isocitric acid)의 제조방법 - Google Patents

발효법에 의한 d-이소구연산(d-isocitric acid)의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

발효법에 의한 d-이소구연산(d-isocitric acid)의 제조법
본 발명은 발효법에 의한 d-이소구연산의 제조방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 모노후루오르 아세트산에 내성이 있고, 유일한 탄소원으로서 d-이소구연산 존재하에서 생육할 수 없으나 또는 단지 미약한 정도로만 생육할 수 있는 칸디다(Candida) 속에 속하는 미생물을 사용하여 d-이소구연산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
d-이소구연산은 의약품 또는 식품첨가물 등으로서 유용하다.
종래, 효모를 사용하는 발효법에 의하여 d-이소구연산을 제조하는 방법으로서 문헌[일본 농에 화학회지(Jurnal of Japan Society for Bidscience, Biotechnology and Agrochemistr), 44(11) ; 493-489(1970) ; 영국특허 1.199,700호, 프랑스 특허 1,596,056호 공보]에 기재된 것들이 있다.
d-이소구연산의 생산능력이 높은 균주를 얻기 위해서 칸디다 리폴리타카(Candida lipolytica)로부터 후루오르아세트산 내성 돌연이주를 얻으려는 노력이 시도된바 있다. 이 시도는 얻어진 돌연변이주는 아코니타아제(aconitase) 활성은 높아졌으나, d-이소구연산 생산능력은 증가되지 않았다. [일본농예 화학회지(Journal of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry), 48(10) ; 543-548, 549-554(1974)].
또한 효모를 사용한 발효법으로서, d-이소구연산율을 높이기 위해 이타콘산을 첨가하는 방법(참조문헌 : 이론 농예화학회 1976대회 요지집, p.348 ; 일본특공소 56-39194호 공보)과, 칸디다 제일라노이데스(Candida zwylanoides)를 사용하고, 황혈염(Potassium ferrocyanide)을 첨가하는 방법(J. Ferment, Technol., 52(8) ; 542-550(1794))이 알려져 있다.
그러나, 상기 방법들은 d-이소구연산 생산성이 불충분하여 염가로 d-이소구연산을 공업적으로 제조하는 방법의 개발이 요망되었다.
본 발명은 칸디다속에 속하고 모노후루오르아세트산에 내성을 가지며, 유일 탄소원인 d-이소구연산존재하에서 생육불능이거나 또는 미약한 정도로만 생육가능하고, d-이소구연산 생산능력을 갖는 미생물을 배양액중에서 배양하여 배양액중에 d-이소구연산을 축적시켜 배양액으로부터 d-이소구연산을 회수하는 것이 특징인 d-이소구연산 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 미생물은, 칸디다속에 속하고, 모노후루오르아세트산에 내성이 있고, 유일탄소원인 d-이소구연산 존재하에 생육불능 또는 미약한 정도로만 생육 가능하고, d-이소구연산 생산능력이 있는 것인한 제한이 없다. 이러한 미생물의 예를들면 키디다 리폴리티카, 칸디다 제일라노이데스, 칸디다기아몬디(Candida guilliermondii), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 휴미콜라(Cadida Humicola), 칸디다 파라실로시스(Candida Parapsilosis) 및 칸디다 블룸프티(Candida brumptil)종 등이 있다. 칸디다 제일라노이데스 H-7728이 바람직한 균주이며, 이것은 1990. 2. 16일부로 일본공업기술원 미생물 공업기술연구소(FRI)에 수탁번호 FERM BP-2756으로 기탁되었다.
야생 균주 또는 돌연변이주중 상기의 특성을 갖는 것이면 어느 것일라도 본 발명에서 사용가능하다.
돌연변이주는 UV조사, N-니트로-N'-메틸-니트로소구아니딘(NTG) 등의 약품으로 처리하는 공지의 방법에 의하여 얻을 수 있다.
상기 미생물들 중 하나를 탄소원, 질소원, 무기화합물, 생육인자등을 함유하는 합성배지 또는 천연배지중에서 통상의 방법으로 d-이소구연산이 배양액중에 축적될때까지 배양한 후, 배양액으로부터 d-이소구연산을 회수함으로써 d-이소구연산을 회수함으로써 d-이소구연산을 얻을 수 있다.
탄소원으로서는 글루코스, 슈크로스, 당일 및 전분 가수분해물 등의 탄수화물 ; 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류 ; 초산등의 유기산 ; 올레인산 등의 지방산 ; 대두유, 어유 등의 유지류 또는 테트라데칸, 헥사데칸 등의 파라핀계 탄화수소를 사용 할 수 있다. 또한 사용된 미생물의 자화성(assimilability)에 따라서 유기화합물등도 사용할 수 있다.
질소원으로서는 암모니아 또는 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 초산암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄 염류 또는 요소 및 기타질소함유 물질 및 펩톤, 육추출물, 효모추출물, 콘스팁액(corn steep liquor) 및 카제인 가수분해물등의 질소함유 유기물등을 사용할 수 있다.
또한 사용된 미생물에 따라서는 질산염을 사용할 수 있다. 이들 질소원들은 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 무기화합물로서는 인산 제 1 수소칼륨, 인산 제 2 수소칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간 및 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
미생물의 생육에 필요한 비타민, 아미노산원등은 상기와 같은 배지에 첨가한다. 이들이 상기 다른 성분들중에 함유된 경우에는 첨가할 필요가 없다.
배양은 20∼35℃에서 진탕배양 또는 통기교반 배양등의 호기적 조건하에서 행하며, 배지의 pH는 2.5-10, 바람직하게는 3-8의 범위로 유지한다. 2-7일후에 d-이소구연산이 배양액중에 축적된다. 다음 원심분리등에 의하여 배양액으로부터 균체등의 침전물을 제거한 후, 그 상층액으로부터 이온교환처리, 농축, 활성탄 처리등을 동시에 적용하여 d-이소구연산을 회수할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예들로써 설명한다.
[실시예 1]
(돌연변이주의 채취)
d-이소구연산의 생산능력이 있는 칸디다 제일라이노데스 ATCC 15585를 본 실시예의 모균주로서 사용했다. 이 균주를 YM배지(맥아추출물 3g, 효모추출물 3g, 폴리펩톤 5g 및 글루코스 10g을 물 1ℓ에 포함시킨 pH 6.0의 배지)에서 30℃에서 20시간 동안 배양했다. 그 배양액으로부터 균체(108-9/ml)를 회수하여 0.2M초산완충액(pH 5.0)으로 세정하고, 동일한 완충액중에 현탁했다.
이 현탁액중 최종 농도가 1mg/ml가 되게 NTG를 가한후 30℃에서 1시간 방치하여 돌연변이를 유발시켰다. 처리된 균체를 상기와 동일한 완충액으로 세정한 후, 모노후루오르아세트산나트륨 4g/l와 L-프롤린 1g/l을 함유한 평판한천 최소배지[박토 나이트로겐 베이스(Bacto Nitrogen Base(Difco사제) 6.7g/l, 한천 2%, pH 5.5]상에 도포하고, 30℃에서 5-10일간 배양했다. 이 평판상의 콜로니들을 모노후루오르아세트산 내성 돌연변이주로서 분리했다. 이들중에서 1% d-이소구연산을 함유하는 최소 배지에서 생육 불능이거나 또는 이 배지에서 상기 모균주에 비해서 극히 미약한 생육을 보이는 것들을 선별하고, 이들중 하나를 칸디다 제일라노이데스 H-7728(FERM BP-2756)로서 지정했다.
상기 돌연변이주 H-7728의 모노후루오르 아세트산 감수성과, 각종 탄소원 존재하의 생육을 그의 모균주 ATCC 15585와 비교하여 표 1에 나타냈다.
상기 돌연변이주 H-7728과 모균주 ATCC15585의 모노후루오르 아세트산 감수성은 모노후루오르 아세트산 나트륨 4g/l을 함유하는 상기 평판한천 최소배지상에 상기 균체들을 도포하고, 30℃에서 7일간 배양하여 평가했다. 모노후루오르 아세트산 나트륨이 첨가안된외에는 상기 배지와 동일한 배지상에서 생육된 균체를 대조용으로서 사용했다.
각종 탄소원 존재하의 성장은 상기 균체들을 YM배지에서 생육시키고, 0.85%의 염화나트륨용액으로 세정하고, 이 용액중에 현탁시킨 것을 탄산칼슘 2%와 시험대상 탄소원 1%를 함유하는 최소배지[박토나이트로젠 베이스(Difco사제) 6.7g/l pH 5.5]에서 30℃에서 48시간동안 진탕 배양한 후, 그 배지의 660nm 흡광도를 측정함으로써 비색정량적으로 평가했다.
[표 1]
Figure kpo00001
주 : 1) L-프롤린(0.1%)을 탄소원으로서 사용했다.
2) ++는 모노후루오르아세트산에 대한 내성, -는 그에 대한 감수성을 나타낸다.
3) 각종 탄소원 존재하의 H-7728균주의 생육상태는 ATCC15585균주에 대한 %로 생육도를 표시했다.
[실시예 2]
(d-이소구연산의 제조)
실시예 1에서 얻은 칸디다 제일라노이데스 H-7728(FERM BP-2756)을 종(seed)배지(5%-글루코스, 0.2% NH4Cl, 0.05% KH2PO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.1% 효모추출물, 0.1% 콘스팁액, 3.3% CaCO3, pH 5.5) 40ml를 함유한 250ml를 삼각플라스크 중에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 210rpm의 회전식 진동기(rotary shaker)상에서 진탕배양했다. 얻어진 종배양액(4ml)을 하기 조성을 갖는 발효배시 40ml를 함유하는 250ml삼각 플라스크 중에 접종하여, 상기종 배양과 동일한 조건하에서 7일간 배양했다.
[발효배지조성]
5% n-파라핀(C12-C15파라핀을 주성분으로 하는 혼합물, 니뽄 마이닝사제), 0.4% NH4Cl, 0.05%, KH2PO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 2mg/l MnSO4·4-6H2O, 5mg/l FeSO4·7H2O, 150㎍/l, CuSO4·5H2O, 100㎍/l 비오틴, 5mg/티아민 염산염, 3%CaCO3, pH 5.5
상기와 유사한 방법으로 모균주 ATCC 15585를 배양하여 이를 대조용으로 사용했다.
d-이소구연산의 수율과 부생물인 구연산의 양을 고속액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 측정했다. 구연산은 칼슘염으로 침전하므로 이 침전물에 0.5N HCl을 가하여 용해시키고, 원심분리한 후 얻어진 상층액을 HPLC의 시료로 사용했다. 결과를 표 2에 나타냈다.
[표 2]
Figure kpo00002
상기 H-7728의 배약액 2l를 원심분리한 후, 균체와 불순물이 제거된 상층액을 다이아이온(Diaion)SK#1B(H+형)(미쯔비시 가세이사제) 0.5l를 사용하여 탈이온화했다. 10N 수산화칼륨을 첨가하여 pH를 3.6으로 조정한 후, 활성탄 처리하여 상층액을 탈색하고 약 100ml까지 감압하여 농축하여 d-이소구연산 모노칼륨염을 석출시켰다.
수율 ; 56g ; 순도 ; 95%
상기 결정 10g을 250ml 수중에 용해하고, 다이아이온 SK#1B(H+형)(미쯔비시 가세이사제)40ml로 탈이온화하고, 실온에서 농축하여 계산량의 d-이소구연산을 함유하는 페이스트를 순수 d-이소구연산한산으로 8.35g을 얻었다. 이 페이스트를 550ml 수중에 용해하고, 100℃에서 30분간 가열하고, 농축건조하여 락톤환 된 d-이소구연산 7.57g(계산량)을 얻었다.

Claims (3)

  1. 칸디다속에 속하고, 모노후루오르 아세트산에 내성을 가지며, 유일 탄소원인 d-이소구연산 존재하에서 생육불능이거나 또는 미약한 정도로만 생육 가능하고, d-이소구연산 생산능력을 갖는 미생물을 배지중에서 배양액중에서 d-이소구연산이 축적될때까지 배양하고, 배양액으로부터 d-이소구연산을 회수하는 것이 특징인 발효법에 의한 d-이소구연산 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 리폴리티카, 칸디다 제일라노이데스, 칸디다 기아몬디, 칸디다 알비카스, 칸디다 휴미콜라, 칸디다 파라실로시스 또는 칸디다 브롬프티종에 속하는 것이 특성인 발효법에 의한 d-이소구연산의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 미생물이 칸디다 제일라노이데스 H-7728(FERM BP-2756)인 것이 특징인 발효법에 의한 d-이소구연산의 제조방법.
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