KR910004371B1

KR910004371B1 - 미생물에 의한 세팔로스포린c의 제조방법

Info

Publication number: KR910004371B1
Application number: KR1019890011702A
Authority: KR
Inventors: 현형환; 장준환; 손영선; 유명규; 이근철; 이윤기
Original assignee: 제일제당 주식회사; 안시환
Priority date: 1989-08-17
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1991-06-26
Also published as: KR910004812A

Abstract

내용 없음.

Description

미생물에 의한 세팔로스포린C의 제조방법

본 발명은 미생물 변이주에 의한 세팔로스포린C의 제조하는 방법에 관한 것으로 본 발명의 특징은 당, 땅콩분등을 주원료로 한 영양배지에 세팔로스포리움속의 특수한 변이주들을 호기적으로 배양하여 배양액중에 세팔로스포린C를 고수율로 축적시켜 생산하는데 있다.

세팔로스포린C는 그람양성 및 그람음성 세균에 다같이 효과적으로 작용하며 산에대해 안정성이 있을뿐 아니라 세팔로스포린을 포함한 페니실린 계열의 분해효소인 페니실리나제에 내성을 가지고 있는 물질이다.

세팔로스포린C의 그람양성, 음성세균에 대한 활성은 벤질페니실린의 0.1%밖에 되지 않는다. 그러나 세팔로스포린C는 각종 세균에 대해 넓은 스펙트럼을 가진 반합성 세팔로스포린 계열 항생물질등의 전구물질인 7-ACA (7-amino cephalosporanic acid)로 전환되어 사용되기 때문에 매우 중요한 물질이다.

종래 세팔로스포린C의 제조방법에는 페니실린으로부터 만들어 지는 화학적인 반합성과 미생물에 의한 발효법등이 알려져 있으나 페니실린으로부터의 반합성법은 일차적으로 페니실린 발효에 의해 페니실린을 생산하여 다시 화학적으로 합성하는데 따른 공정상의 경제적인 문제가 따르며 미생물에 의한 발효법은 이성화액당, 오일, 지방산등의 사용으로 수율이 증가하여 왔고 또한 유기 질소원으로 콘스팁리커의 사용, 무기질 소원으로 황산암모니움, 또한 아미노산이 메치오닌 등의 첨가로 세팔로스포린C 생산수율이 상당히 향상되었으나 공업적인 생산을 위해서는 아직도 부진한 편이다.

본 발명은 세팔로스포린C의 공업적인 생산을 위한 미생물의 생산수율 부진을 극복하기 위하여 당사에서 개발한 포도당에 의한 이화물질억제를 거의 받지않는 변이주 세팔로스포리움 스트레인 Yc122(KFCC 10016, 한국 특허공고 80-1588)에 자외선 및 N-메틸-n-나이트로-N-나이트로소구아니딘 등의 돌연변이원을 처리함으로써 세팔로스포린C의 생산량이 크게 향상된 변이주를 분리하여 공업적으로 대량 생산하는데 그 효과가 있다.

본 발명의 변이주 분리방법은 친주 세팔로스포리움 스트레인 Yc122의 포자현탁액(10⁶-10⁷포자/ml)에 자외선이나 N-메틸-n-나이트로-N-나이트로소구아니딘 등의 돌연변이원을 공지의 방법으로 처리하여 완전배지(주)에 도말하여 25-30℃에서 5-7일간 배양한 후 완전한 콜로니가 형성되면 세팔로스포린C에 성장이 억제되는 알칼리제니스 피컬리스 ATCC 8750의 배양액을 분주하여 37℃에서 하루 더 배양하여 나타나는 억제환의 크기가 대조구보다 큰 변이주들을 선택 분리하였다.

(주) 완전배지 조성

수용성전분 2.5%, 글라이신 0.1%, 폴리펩톤 0.5%, 효모엑기스 0.03%, 카사미노애시드 0.8%, 황산암모늄 0.5%, 인산칼리 0.1%, 황산마그네슘 0.05%, 한천 2.0%, 이렇게 선별된 변이주들에 대한 세팔로스포린C의 생산성조사는 실시예 2와 같은 방법으로 하였고, 삼각플라스크에서의 배양결과 세팔로스포리움 스트레인 Yc122보다 세팔로스포린C의 생산성의 우수한 세팔로스포리움 스트레인 CBL(세팔로스포린C 생성량 ; 15.2mg/ml)과 이의 변이주 세팔로스포리움 스트레인 1425(세팔로스포린C 생성량 ; 19.8mg/ml)를 선별하였다. 이러한 변이주들의 20계대 배양동안의 생산역가 비교실험결과 생산역가가 감소하지 않는 우수한 변이주들로 판명되었으며 배양방법 및 생산역가 측정방법은 실시예에 나타나있다.

본 발명의 변이주들은 돌연변이원 처리에 의해 유전적 변이가 일어난 세팔로스포린C의 전구물질로 유기황원이 메치오닌의 이용성이 증가하여 발효배지(주)중에 첨가되는 D,L-메치오닌의 최적농도가 점점 증가하는 경향을 보이고 있다. 이에 대한 비교는 표 1에 나타나있다.

[표 1]

(주) 발효배지 조성

콘스팁리커 3.0%, 땅콩분 2.5%, 글루텐밀 3.0%, 콘밀 1.5%, 황산칼슘 1.0%, 탄산칼슘 3.0%, 황산암모늄 1.0%, 이성화액당 3.3%, 혼합오일 6.5%, 소포제 0.07% 표 1에서 보듯이 친주 스트레인 Yc122 균주는 D,L-메치오닌 0.5% 첨가하였을때 12.8(mg/ml)로서 최대의 세팔로스포린C 생성량을 나타냈으며 그 이상의 첨가는 효과가 없었다. 이에 반해 변이주 스트레인 CBL과 1425균주들은 최대 세팔로스포린C 생성을 위해서 첨가되는 D,L-메치오닌의 농도가 0.8%와 1.5%로 증가한 결과를 보이고 있어 세팔로스포린C의 전구물질이 되는 메치오닌의 이용성이 증가하였고 또한 이에 따라 세팔로스포린C의 생성량도 증가한것을 알수 있다.

이것으로 신균주는 1425는 친주 Yc122와 이것의 변이주 CBL와 D, L-메치오닌의 이용성이 증가하여 결국 세팔로스포린C의 생산수율이 월등히 증가한 신균주이며 이것을 이용한 공업적인 생산이 가능하며 세팔로스포린C의 대량생산에 그 효과가 있다.

본 발명의 변이주들과 친주(세팔로스포리움 스트레인 Yc122)의 균주특성은 표 2에 나타나 있다.

[표 2]

변이주는(세팔로스포리움 스트레인 1425)의 형태적, 배양적, 생리학적 성질을 친주와 동일조건 아래에서 관찰한 결과는 다음과 같다.

가. 형태적 성질

1. 유백색에 가까운 균사체를 형성하며 균사는 격막이 드문드문 있고 분기되어 있다.

2. 발효조에서 호기적으로 배양시 균사, 분절포자, 분생포자, 발아의 4가지 형태학적 과정을 거친다. 생성물의 가장 높은 수율은 얇은 균사로부터 굵고 짧아진 분절포자로 거의 변화된 상태에서 얻어졌다.

3. 오트밀 한천배지에서 호기성 생장을 하면서 분생포자 및 분생포자병이 형성되며 분생포자병은 빳빳하고 그 크기가 110-150μ이며 분생포자의 색은 회백색을 띠고 있다.

4. 분생포자는 타원형으로 1-2.0 x3-7μ 정도의 크기이다. 분생포자병의 끝에서 단세포의 분생포자가 점액에 의해 서로 협쳐진 공(ball)상으로 되어 있다.

5. 유성생식을 위한 기관은 없다.

나. 배양적 성질

오트킬 한천배지, 맥아즙 한천배지, 감자 한천배지에서 생육은 매우 양호하며 거미줄 모양으로 호기성 균사가 퍼져나간다. 집락은 둥글고 약간 불규칙형으로서 방사형의 주름을 형성하여 특별한 색소는 생성하지 않으며 오트밀 한천배지에서 유백색을 연다.

다-1. 생리적 성질

1. 생육온도범위 : 5-40℃ 4. 생육 pH범위 : 4.0-9.0

2. 최적생육온도 : 25-30℃ 5. 최적생육 pH : 6.0-8.0

3. 산소요구성 : 호기성 6. 색소생성 : 없음

다-2. 항생물질 생성기작에 의한 생리적 성질

표 3에서 보듯이 세팔로스포린C의 이화물질에 의한 억제효과를 알아보기 위해 가장 좋은 이화물질인 포도당을 2%에서 8%까지 높여가면서 각 균주에 대해서 실험했을 때 친주 및 변이주 모두 발효배지중의 이화물질에 의한 억제를 거의 받지 않기 때문에 세팔로스포린C의 생성능력을 크게 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

[표 3]

세팔로스포린C의 생산에 사용된 배지조성으로 실시예 2에서 보는 바와 같이 탄소원, 질소원, 유기영양원 및 소량의 무기물을 함유한 합성배지를 이용할 수 있다. 탄소원으로는 포도당, 설탕, 당밀, 과당, 전분등이 양호하며 질소원으로는 황산암모늄등의 암모늄염이 사용될 수 있고, 이 밖에 유기영양원으로는 육즙, 효모즙, 맥아즙, 카재인가수분해물, 콘스팁리커, 대부분, 땅콩분, 참치즙, 펩톤등이 양호하고 무기물로는 황산마그네슘, 황산칼슘, 인산칼슘, 탄산칼슘등이 사용될 수 있다. 또한 메틸올리에이트와 미강유등의 지방산을 함유한 기름류와 메치오닌을 첨가하면 세팔로스포린C의 생산에 효과적이다.

배양조건은 호기적 조건하에서 배양온도는 25-31℃, pH는 배양시작시 중성부근으로 하며 배양중 pH가 떨어지는데 암모니아수로 pH 5.3-5.5로 조정한다.

세팔로스포린C의 회수는 기지의 방법에 따라 발효를 통하여 얻은 세팔로스포린C의 발효액을 크게 4단계 즉 전처리공정, 수지공정, 농축공정, 분말화공정을 통하여 분말형태의 세팔로스포린C로 만든다. 먼저 전처리공정에서는 발효액 회수작업이 이루어지고 수지공정에서는 양이온, 음이온, 탈색, 흡착수지를 이용하여 세팔로스포린C를 용출해 낸 다음 농축공정에서 역삼투막과 박막을 통한 농축이 이루어지고 분말건조과정을 거쳐 세팔로스포린C를 회수한다. 이와 같은 본 발명을 실시예에 의하여 좀더 상세하게 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

변이주 분리는 친주인 세팔로스포리움 스트레인 Yc122(KFCC 10016, 한국 특허공고 80-1588)에 생리식염수를 가하고 유리솜(glass wool)을 사용하여 균사체를 여과 분리시켜 포자현탁액을 조제한 후 이 포자현탁액에 자외선과 N-메틸-n-나이트로-N-나이트로소구아니딘을 사멸율이 각각 90%와 99.9%되게 처리하고 완전배지에 도말하여 25-30℃에 5-7일간 배양한 후 형성된 콜로니들에 알칼리제네스 피컬리스 ATCC 8750의 배양액을 분주하여 37℃에서 하루더 배양하여 억제환의 크기가 대조구보다 큰 변이주들을 분리하였다. 이 변이주들을 삼각플라스크 생산배지에서 역가를 측정하여 세팔로스포린C 역가가 우수한 세팔리스포리움 스트레인 CBL을 얻었다.

다시 세팔로스포리움 스트레인 CBL을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 자외선과 N-메틸-n-나이트로-N-나이트로소구아니딘을 처리하여 선별한 변이주들 가운데서 세팔로스포린C 의 역가가 우수한 세팔로스포리움 스트레인 1425을 얻었다.

[실시예 2]

사용균주 : 세팔로스포리움 스트레인 Yc122

세팔로스포리움 스트레인 CBL

세팔로스포리움 스트레인 1425

종균배양 1단 배지

대부분 3.0%, 콘스팁리커 0.75%, 설탕 2.5%, 포도당 1.0%, 탄산칼슘 0.5%, pH 7.0

종균배양 2단 배지

대부분 3.0%, 땅콩분 3.0%, 콘스팁리커 1.5%, 설탕 2.5%, 포도당 1.0%, 탄산칼슘 0.5%, pH 6.9

[발효배지]

땅콩분 2.5%, 콘스팁리커 3.0%, 클루텐밀 3.0%, 콘밀 1.5%, 적정량의 D, L-메치오닌, 황산칼슘 1.0%, 탄산칼슘 3.0%, pH 7.2

[배양방법]

상기조성의 종균배양 1단 배지 50ml을 500ml 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 30분간 가압살균한 다음 각균주를 식균하여 25-31℃에서 5일간 배양한다. 종균배양 2단 배지를 상기와 동일한 방법으로 살균한 후 1단 종배양액 0.02%를 접종하여 25-31℃에서 4일간 배양한다. 발효배지 18ml을 500ml 삼각플라스크에 넣어 121℃에서 30분간 가압살균한 다음 2단 종배양액과 이성화액당을 각각 0.05%, 황산암모늄 1.0%, 혼합오일을 0.07% 첨가하여 25-31℃에서 200RPM의 조건으로 통기교반하면서 배양하였고, 그 결과는 표 4와 같다. 이때 세팔로스포린C는 시그마사 세팔로스포린C(포타슘염 형태)를 표준물질로 사용하여 HPLC방법으로 정량하였다.

[표 4]

[실시예 3]

본 실시예의 사용균주, 배지조성, 종균배양방법, 세팔로스포린C 정량법등은 실시예 2와 동일하며 발효배지의 메치오닌 농도만 0.5%, 0.8%, 1.5%되게 첨가하였다. 실시예 2와 같은 방법으로 배양된 종배양액을 5ℓ의 발효배지로 채운 7ℓ 발효조에 4% 식균하고 25-21℃, 600-1000RPM, 0.5-1.0vvm(Aeration rate)의 조건에서 7일간 배양하였고 그 결과는 표 5와 같다.

[표 5]

[실시예 4]

사용균주 : 세팔로스포리움 스트레인 1425

본 실시예의 배지조성, 종균배양방법, 세팔로스포린C 정량법등은 실시예 2와 동일하다. 실시예 2와 같은 방법으로 배양된 종배양액을 7ℓ종모발효조에 0.3% 접종하여 배양한 종배양액을 21ℓ의 발효배지로 채운 31ℓ 발효조에 4%식균하고 25-21℃, 300-500RPM, 0.5-1.0vvm(Aeration rate)의 조건에서 7일간 배양하였고 그 결과는 표 6과 같다.

[표 6]

[실시예 5]

본 실시예의 사용균주, 배지조성, 종균배양방법, 세팔로스포린C 정량법등은 실시예 2와 동일하다. 실시예 2와 같은 방법으로 배양된 종배양액을 30ℓ종모발효조에 1% 접종하여 배양한 종배양액을 100ℓ의 발효배지로 채운 150ℓ 발효조에 8% 식균하고 25-31℃, 200-400RPM, 0.5-1.0vvm(Aeration rate)의 조건에서 7일간 배양하였고 그 결과는 표 7과 같다.

[표 7]

Claims

무격벽으로 길게 직립하여 회백색의 집락을 형성하며 세팔로스포린C의 생산능력이 우수한 세팔로스포리움 스트레인 CBL(KFCC 10679).
세팔로스포리움 스트레인 CBL(KFCC10679)을 탄소원, 질소원 및 기타 영양물질을 함유하는 배지에 배양하여 세팔로스포린C를 생성, 축적함을 특징으로 하는 세팔로스포린C의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 탄소원으로서 이성화액당이나 설탕(sucrose) 혹은 원당을 1-4%의 비율로 함유함을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 유기질소원 및 영양물질로서 콘스팁리커를 1-3.5%의 비율로 함유함을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 영양물질로서 메틸올리에이트와 미강유를 동일한 비율로 혼합한 혼합오일을 함유함을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 혼합오일을 5-8%의 비율로 함유함을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 혼합오일을 5-8%의 비율로 배양중간에 첨가함을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 황산암모늄을 0.5-1.0%의 비율로 배양중간에 첨가함을 특징으로 하는 방법.
세팔로스포린C의 전구물질인 유기황화합물 요구성인 세팔로스포리움 스트레인 CBL을 메치오닌, 시스테인, 시스틴, 호모시스테인, 호모시스틴, 시스타치오닌을 유기황화합물로서 함유하는 영양배지에 배양하여 세팔로스포린C를 생성, 축적함을 특징으로 하는 세팔로스포린C의 제조방법.
무격벽으로 길게 직립하여 유백색의 집락을 형성하며, 세팔로스포린C의 생산능력이 우수한 세팔로스포리움 스트레인 1425(KFCC 10678).
세팔로스포리움 스트레인 1425(KFCC 10678)을 탄소원, 질소원 및 기타 영양물질을 함유하는 배지에배양하여 세팔로스포린C를 생성, 축적함을 특징으로 하는 세팔로스포린C의 제조방법.
제11항에 있어서, 탄소원으로서 이성화액당이나 설탕(surcrose)혹은 원당을 1-4%의 비율로 함유함을 특징으로 하는 방법
제11항에 있어서, 유기질소원 및 영양물질로서 콘스팁리커를 1-3.5%의 비율로 함유함을 특징으로하는 방법.
제11항에 있어서, 영양물질로서 메틸올리에이트와 미강유를 동일한 비율로 혼합한 혼합오일을 함유함을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 혼합오일을 5-8%의 비율로 함유함을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 혼합오일을 5-8%의 비율로 배양중간에 첨가함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 황산암모늄을 0.5-1.0%의 비율로 배양중간에 첨가함을 특징으로 하는 방법.
세팔로스포린C의 전구물질인 유기황화합물 요구성인 세팔로스포리움 스트레인 1425을 메치오니, 시스테인, 시스틴, 호모시스테인, 호모시스틴, 시스타치오닌을 유기황화합물로서 함유하는 영양배지에 배양하여 세팔로스포린C를 생성, 축적함을 특징으로 하는 세팔로스포린C의 제조방법.