KR100200516B1 - 신규한l-루이신생산미생물인코리네박테리움글루타미컴(corynebacteriumglutamicum)ch35 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CH 25 (기탁번호: KFCC-10931)에서 유래한 L-스레오닌 부분요구성(leaky) 균주로서 L-루이신 발효농도가 모균주인 KFCC-10931에 비해 획기적으로 향상된 신규한 코리네박테리움 글루타미컴 CH35 (기탁번호: KFCC-10962) 및 이 미생물을 배양하여 배지내에 L-루이신을 축적시킴을 특징으로 하는 L-루이신의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 1996. 11. 28자 출원된 대한민국 특허원 제 96-58828 호 발명의 대상인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CH 25 (기탁번호: KFCC-10931)에서 유래한 L-스레오닌 부분요구성(leaky) 균주로서 L-루이신 발효농도가 모균주인 KFCC-10931에 비해 획기적으로 향상된 신규한 코리네박테리움 글루타미컴 CH35 (기탁번호: KFCC-10962) 및 이 미생물을 배양하여 배지내에 L-루이신을 축적시킴을 특징으로 하는 L-루이신의 제조방법에 관한 것이다.
L-루이신은 소수성 필수아미노산의 일종이며 수액제를 비롯한 의약품, 식품, 사료 및 공업약품 등에 광범위하게 사용되는 고가의 아미노산으로서 발효에 의한 제법으로 일본의 아지노모도, 협화발효 등의 회사에 의해 상품화되었고 국내에서는 제일제당과 세원이 발효기술을 보유하고 있는 것으로 알려져있다.
종래 L-루이신을 제조하는 방법으로는 미생물을 사용한 L-루이신의 제조방법(참조:대한민국 특허 공고 제 95-14462 호 및 대한민국 특허 공고 제 95-7222 호); 발효법에 의한 L-아미노산의 제조방법(참조: 일본국 특개평 제 1-235595 호 및 일본국 특개평 제 6-133788 호); 발효법에 의한 L-루이신의 제조방법(참조: 미합중국 특허 제 3.970.519 호); L-발린 요구성 변이주를 이용하는 방법(참조: 일본국 특개소 제 38-4395 호); L-이소루이신 및 L-히스티딘을 동시에 요구하는 코리네박테리움속 미생물에 의한 L-루이신의 제조방법(참조: 대한민국 특허 공개 제 93-21793 호); 및 L-아르기닌 하이드록사메이트에 대해 내성을 갖는 균주에 의한 L-루이신의 제조방법(참조: 대한민국 특허원 제 96-58828 호) 등을 언급할 수 있다.
한편, 미생물에 의한 L-루이신 합성에서 이소프로필 말레이트 합성효소(Isopropylmalate synthase)가 L-루이신에 의해 효소합성억제(feedback repression) 및 효소활성억제(feedback inhibition)를 받으며, 아세토하이드록시산 합성효소(Acetohydroxy acid synthase)가 L-발린, L-이소루이신 및 L-루이신에 의해 동시에 효소합성억제 및 효소활성억제를 받기 때문에 L-루이신 생산균주를 개발함에 있어서 이들 아미노산의 영양요구성 균주를 얻거나 이들 아미노산 유사체에 대한 내성주를 얻는 기술은 이미 널리 알려진 공지의 사실이다.
그러나, 이러한 기존의 L-루이신 제조방법들, 특히 L-발린, L-이소루이신 및 L-루이신 유사체에 대한 내성만을 부여함으로써 L-루이신 생산균주를 개발하는 방법은 발효농도의 향상에 한계가 있다. 또한, 본 발명자들에 의해 개발된 방법으로서 본 발명과 가장 밀접한 관련을 갖는 대한민국 특허원 제 96-58828 호 발명에서는 L-루이신을 생산하는데 노르루이신 및 α-아미노부티르산에 대해 내성을 나타냄과 동시에 L-아르기닌 하이드록사메이트에 대해서도 내성을 나타내는 L-루이신 생산 미생물, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미컴 CH25를 사용하고 있으나, 그 미생물에 의한 루이신의 발효농도에 있어서도 개발의 여지가 있다고 판단되었다.
이에 본 발명자들은 선행균주인 코리네박테리움 글루타미컴 CH25 (KFCC- 10931)을 모균주로하여 이로부터 보다 우수한 L-루이신 발효농도를 나타낼 수 있는 신규한 균주를 개발하기 위해 예의 연구하였으며, 그 결과 L-스레오닌 부분요구성을 갖는 본 발명에 따른 균주가 이러한 목적에 부합될 뿐아니라 기존의 특허 및 논문 등 어떤 공지문헌에도 개시되어 있지 않은 신규한 균주임을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 노르루이신, α-아미노부티르산 및 L-아르기닌 하이드록사메이트에 대해 내성을 가지며, L-스레오닌 부분요구성을 나타냄을 특징으로 하는 신규한 L-루이신 생산 미생물 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CH35 에 관한 것이다.
본 발명자들에 의해 모균주로서 선택된 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC- 10931은 어떠한 아미노산(또는 대사물질)에 대해서도 요구성을 갖지 않으며, 노르부이신 및 α-아미노부티르산에 대해 내성을 가질 뿐아니라, L-아르기닌의 유사체인 L-아르지닌 하이드록사메이트에 대해 내성을 갖는 미생물이다.
이러한 모균주로부터 L-스레오닌 부분요구성 균주를 획득하기 위해 본 발명자들은 모균주를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 처리하고 L-스레오닌이 함유되어 있는 배지에서 배양한 후 여기에서 나타난 미생물 군락(colony)들을 멸균된 이쑤시게를 사용하여 L-스레오닌이 50㎎/ℓ 함유된 한천최소배지 및 L-스레오닌이 함유되지 않은 한천최소배지에 동시에 이식하였다. 그 후, 24 시간동안 배양한 다음, L-스레오닌이 함유되지 않은 배지에서는 성장이 미약하지만 L-스레오닌이 함유된 배지에서는 성장이 왕성한 미생물 군락을 선별하는 과정을 수행하였다.
이러한 방법에 의거하여 선별된 균주 CH35 에 대해 본 발명자들은 L-스레오닌이 그 성장에 미치는 영향을 측정하고 그 결과를 모균주인 KFCC-10931 과 비교하였다. 비교결과, KFCC-10931이 최소배지 및 L-스레오닌 함유 최소배지에서 비슷한 성장정도를 나타내는 반면, 본 발명에 따른 균주 CH35는 L-스레오닌을 50㎎/ℓ 함유하는 최소배지에서는 높은 성장도를 보이지만 L-스레오닌을 함유하지 않는 최소배지에서는 L-스레오닌 함유배지에서의 성장도를 100%라 할 때 약 70% 이하의 성장도를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 균주 CH35는 L-스레오닌 부분요구성을 갖는 것으로 판단되었다.
또한, 균주 CH35에 대해 L-루이신 생산성 및 발효농도를 측정하고 이를 모균주인 KFCC-10931과 비교하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 균주 CH35가 모균주에 비해 월등히 우수한 발효농도 및 생산성을 지니고 있는 것으로 확인되었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
루리아버다니(LB) 액체배지에서 대수기 중반까지 자란 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10931 균주를 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 5×107cells/㎖ 밀도로 현탁시켰다. N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘의 최종농도가 500㎍/㎖로 되게하여 30℃에서 30분간 처리하고 포타슘포스페이트 완충액(pH 7.0)으로 4회 세척하였다. 이를 LB 액체배지에서 활성화시킨 후 L-스레오닌이 50㎎/ℓ 농도로 함유된 한천최소배지에 도말하였다. 30℃의 항온기에서 4일간 배양하고, 콜로니의 크기가 큰것부터 L-스레오닌이 함유된 한천최소배지와 L-스레오닌이 함유되지 않은 한천최소배지에 toothpicking한 다음, 전자의 배지에서는 세포가 왕성하게 성장하는 반면 후자의 배지에서는 세포의 성장이 미약한 군락을 선별하였으며 이를 액체최소배지에서 최종적으로 확인하였다. 확인된 미생물군락(colony)을 CH35라 명명하고 30℃, 230rpm의 배양조건에서 48시간동안 플라스크 발효배지를 수행하여 그 발효농도를 측정하였다.
본 실험에서 사용한 최소배지의 성분은 증류수 1ℓ당 글루코오스 10g, (NH4)2SO4 2g, 우레아 2g, KH2PO4 1.0g, K2HPO4 3.0g, MgSO4·7H2O 0.5g, FeSO4·7H2O 10mg, MnSO4·5H2O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 100㎍으로서 pH 7.0(살균전)이며, 한천배지의 경우는 한천 20g이 첨가된다.
하기 표 1에는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10931 및 본 발명에 따른 CH35 균주를 액체최소배지 및 L-스레오닌을 50㎎/ℓ 농도로 함유하는 액체최소배지중에서 각각 30℃의 온도로 16시간동안 배양한 후 562nm에서의 흡광도로 그 성장도를 측정한 결과를 나타내었다.
[표 1]
L-스레오닌이 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10931 및 CH35 균주의 성장에 미치는 영향
| 배 지균 주 | 흡 광 도 (562nm) | |
| 액체 최소배지 | L-스레오닌(50㎎/ℓ) 함유 액체 최소배지 | |
| CH35 | 0.32 | 0.51 |
| KFCC-10931 | 0.52 | 0.54 |
표 1의 결과로부터 확인되듯이, 모균주인 KFCC-10931 균주의 경우 최소배지 및 L-스레오닌을 함유하는 최소배지 모두에서 성장도가 비슷한 것으로 나타난 반면, 본 발명에 따른 CH35 균주의 경우 L-스레오닌을 50㎎/ℓ 함유하는 최소배지에서 함유하지 않는 배지에서보다 훨씬 높은 성장도를 나타내는 것으로 미루어 CH35는 L-스레오닌 부분요구성을 갖는 것으로 판단된다.
실시예 2
L-스레오닌 부분요구성 균주로서 실시예 1에서 수득한 CH35의 L-루이신 생산성을 정확하게 평가하기 위해 모균주인 KFCC-10931를 비교대상균주로하여 플라스크 발효배지(공정수 1ℓ당 설탕 100g, 효모엑기스 1g, (NH4)2SO4 15g, 우레아 4g, KH2PO4 0.6g, MgSO4·7H2O 0.5g, FeSO4·7H2O 10mg, MnSO4·5H2O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 100㎍ 및 CaCO4 40g, pH 7.0(살균후))에서 48시간동안 배양하였다. 그 후, L-루이신의 농도는 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)로 측정하고 당량은 버트란트(Bertrand) 법을 사용하여 정량한 후 그 결과를 표 2에 나타내었다. 단, 하기 표 2에서 대당수율(%)은 발효농도를 소모된 설탕량(g/ℓ)으로 나눈 후 100을 곱한 수치를 나타낸다.
[표 2]
코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10931 및 CH35의 플라스크 실험결과
| 항 목균 주 | 발효농도(g/ℓ) | 대당수율(%) | 잔당(%) | |
| CH35 | L-스레오닌(0.1g/ℓ) 첨가 | 15.1 | 15.1 | 0 |
| 무첨가 | 14.2 | 14.2 | 0 | |
| KFCC-10931 | L-스레오닌(0.1g/ℓ) 첨가 | 9.1 | 9.1 | 0 |
| 무첨가 | 9.2 | 9.2 | 0 |
표 2의 결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미컴 CH35 균주는 모균주인 KFCC-10931에 비해 L-루이신 발효농도가 획기적으로 향상되었다. 따라서, 본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미컴 CH35 균주가 L-루이신 생산성면에서 탁월한 효능을 갖는 신규 균주임을 확인하고, 1997. 3. 25. 자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하여 KFCC-10962의 기탁번호를 부여받았다.
실시예 3
코리네박테리움 글루타미컴 CH35 및 KFCC-10931 균주를 종배양배지(공정수 1ℓ당 원당 50g(별살), 펩톤 10g, 효모엑기스 10g, KH2PO4 1.5g, MgSO4·7H2O 0.5g, 우레아 5g, 바이오틴 50㎍, L-스레오닌 0.1g, pH 7.0(멸균전))를 함유하는 500㎖ 삼각플라스크에서 30℃, 230rpm의 배양조건하에 18시간동안 배양한 후 7ℓ 발효조에 접종하여 발효시켰다. 이때, 발효는 당밀(환원당으로서) 180g/ℓ, (NH4)2SO4 10g/ℓ, KH2PO4 1.0g/ℓ, MgSO4·7H2O 0.5g/ℓ, FeSO4·7H2O 10mg/ℓ, 바이오틴 300㎍/ℓ, 티아민·HCl 500㎍/ℓ, L-스레오닌 0.9g/ℓ, 소포제 3㎖/ℓ를 기준으로 추가당만을 발효중에 첨가하는 유가식발효(fed-batch fermentation)로서 수행하였으며, 발효조건은 30℃, pH 7.0, 교반속도 600rpm, 통기량 1vvm으로 유지하여 발효를 실시하였다. 발효를 실시한 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 단, 하기 표 3에서 생산성은 발효농도를 발효시간으로 나눈 값이다.
[표 3]
코리네박테리움 글루타미컴 CH35 및 KFCC-10931의 7ℓ 발효조 실험결과
| 항목균주 | 발효농도(g/ℓ) | 발효시간(hr) | 대당수율(%) | 총당(g/ℓ) | 생산성(g/ℓ/hr) |
| CH35 | 25.2 | 32.5 | 14.0 | 180 | 0.78 |
| KFCC-10931 | 19.1 | 31.5 | 10.6 | 180 | 0.61 |
상기 결과는 본 발명에 따른 신규 균주인 CH35가 모균주인 KFCC-10931에 비해 발효농도가 31.9% 향상되었음을 보여주는 것으로서 이로부터 CH35의 L-루이신 발효농도가 모균주에 비해 획기적으로 향상되었음을 확인할 수 있다.
이상 설명한 바와 같은 본 발명의 신규 균주 코리네박테리움 글루타미컴 CH35는 기존의 균주에 비해 발효농도가 현저히 향상되었을 뿐아니라 L-루이신 생산성이 우수하므로 이 균주를 이용하여 L-루이신을 산업적으로 제조하는데 매우 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (2)
- 노르루이신, α-아미노부티르산 및 L-아르지닌 하이드록사메이트에 대해 내성을 가지며, L-스레오닌 부분요구성을 나타냄을 특징으로 하는 L-루이신 생산 미생물 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CH35 (기탁번호: KFCC-10962).
- 제 1 항의 미생물을 배양하여 배지중에 L-루이신을 축적시킴을 특징으로하여 L-루이신을 제조하는 방법.
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